Medidas profiláticas na larvicultura e pré-berçário do camarão branco do Pacífico

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DEPARTAMENTO DE AQUICULTURA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AQUICULTURA Medidas profiláticas na larvicultura e pré-berçário do camarão branco do Pacífico Dissertação submetida ao Programa de Pós-graduação em Aquicultura da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de Mestre em Aquicultura. Orientador: Felipe do Nascimento Vieira Coorientador: José Luiz Pedreira Mouriño Marcello Mendes dos Santos Junior Florianópolis, 2014.

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3 Medidas profiláticas na larvicultura e pré-berçário do camarão branco do Pacífico Por MARCELLO MENDES DOS SANTOS JUNIOR Esta dissertação foi julgada adequada para a obtenção do título de MESTRE EM AQUICULTURA e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Aqüicultura. Prof. Alex Pires de Oliveira Nuñer, Dr. Coordenador do Programa Banca Examinadora: Dr. Felipe do Nascimento Vieira Orientador Dr. Maurício Laterça Martins Dr. Sérgio Winckler da Costa Dr. Walter Quadros Seiffert

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5 Todo este trabalho é dedicado a minha família, que não me deixou a deriva em dias de vento e mar grosso.

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7 AGRADECIMENTOS Ao Grande Arquiteto do Universo, pela oportunidade de experimentar este plano espiritual; Aos meus pais, Marcelo e Rose, por todo carinho, amor, compreensão e apoio em todas as fases da minha vida; Aos meus irmãos, Maurício e Stephanie, por todo apoio e impaciência ; A minha amada Aline, por todo apoio e compreensão por minha ausência nas horas mais difíceis; Aos meus amigos Gabriel e Efrayn, a todo apoio, ajuda e incentivo; Ao meu primo Ubiraci e sua esposa Rosane, pela estadia e incentivo; A toda velha Guarda da microbiologia do LCM: Bruno, Gabi, Gabi Soltes, Norha, Mari, Marysol, Scheila e Marcela por todo o aprendizado e convívio pacífico; Ao meu professor orientador, Felipe Vieira, pela oportunidade e inestimável apoio para realização do trabalho; Ao meu amigo e professor José Luiz, pela oportunidade, apoio e parceria nos dias de surf; Ao professor Walter, pelo empenho na aquisição do material de estudo; A Esmeralda, que me auxiliou e documentou os experimentos em forma de foto; Aos funcionários e amigos do LCM, em especial David, Ilson, Carlos, Carlos Biólogo e Dimas, por toda ajuda e diversão na hora do trabalho duro; Ao Vitor Pontinha, ao Lucas e ao NEPAQ, pelo auxílio nas análises histológicas; Ao LAPMAR, pelo auxílio nas análises morfométricas; Aos meus amigos de surf, Carlos, Guilherme, Paulo e Daniel, por me ajudar a cuidar do corpo e da alma nos dias de altas ondas; A todos meus amigos da graduação, Gustavo, Marco, Denis, Lucas, Johnson, Nicolas, etc..., pelos almoços no R.U. do CCA; Ao Carlito, pela prestatividade na secretaria da PGAQI; A CAPES e CNPQ, pelo apoio financeiro para a realização dos estudos; Enfim, a todos que de alguma maneira contribuíram para a conclusão desta etapa da minha vida.

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9 Resumo Este trabalho visou avaliar diferentes métodos profiláticos para melhoria de desempenho em larvicultura e pré-berçário de camarão marinho Litopenaeus vannamei. Buscando abolir o uso de antibióticos, pesquisadores estudam métodos bióticos e orgânicos, como o caso de probiótico e sais orgânicos. Foi estabelecida uma dose segura de propionato de sódio para ser administrada de forma pontual na água de cultivo, nas diferentes fases de larvicultura, comparando-o com os efeitos do antibiótico enrofloxacino 15mg/L e uso diário de probiótico Lactobacillus plantarum, ao longo de todo cultivo junto à alimentação. Já no cultivo de pré-berçário, o butirato de sódio na concentração de 2% suplementado na ração, foi confrontado com probiótico L. plantarum na dose de 10 ml/g de ração, e a mistura dos dois tratamentos, visando obter um efeito sinérgico. Nos dois experimentos, além de avaliar parâmetros zootécnicos, foi avaliado a microbiota da água, larvas e póslarvas de camarão L vannamei ao longo do cultivo e integridade do intestino médio das pós-larvas 20. No experimento de larvicultura os tratamentos nas doses utilizadas não apresentaram efeitos e a inserção do butirato de sódio na ração fornecida para as pós-larvas do préberçário influenciou positivamente na sobrevivência final e não causou alteração na morfologia intestinal. Palavras-chave: Litopenaeus vannamei, Sais orgânicos, probiótico, antibiótico, profilaxia.

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11 ABSTRACT This study evaluated different prophylactic methods for improving performance in hatchery and pre-nursery marine shrimp Litopenaeus vannamei. Seeking to abolish the use of antibiotics, researchers studying biotic and organic methods, such as the case of probiotics and organic salts. A safe dose of sodium propionate was established to be administered in a timely fashion in the pond water at the various stages of larval rearing, comparing it with the effects of the antibiotic enrofloxacin 15 mg/l and daily use of probiotic Lactobacillus plantarum throughout with the growing food. Since the pre-nursery cultivation, sodium butyrate at a concentration of 2% in the supplemented diet was confronted with probiotic L. plantarum at doses of 10 ml/g of feed, and mixing the two treatments in order to obtain a synergistic effect. In both experiments, in addition to evaluating performance parameters, was evaluated microbiota water, larvae and post-larvae shrimp L.vannamei over cultivation and integrity of the midgut of post-larvae 20. Hatchery in experiment treatments at the doses used no effects were observed and the insertion of sodium butyrate in the diet provided for post-larvae of the pre-nursery positively influenced survival in the final and did not cause changes in intestinal morphology.. Keywords: Litopenaeus vannamei, organics salts, probiotics, antibiotics, prophilaxis.

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13 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Principais rotas de fármacos, destaque para a pequena contribuição proveniente da aquicultura Figura 2 Método de determinação in vitro de inibição de bactérias patogênicas por bactérias probióticas (Vieira, 2010) Figura 3 - Mecanismo de ação de ácidos orgânicos no interior das bactérias. (1) Atravessam a membrana plasmática, (2) dissociam-se no citoplasma e (3) obrigam o gasto de energia pela exportação de prótons. Adaptado de Defoirdt et al. (2009) Figura 4 Crescimento em unidades formadoras de colônia por mililitro (UFC/mL Log 10 ) de bactérias totais e vibrionáceas após 24 horas e ácido-láticas após 48 horas do na água da larvicultura dos tratamentos com Propionato de sódio 0,5mM/L, Enrofloxacino 15mg/L e Probiótico 10mL/g de ração em três coletas de água de cultivo após as principais metamorfoses. Letras diferentes indicam diferença estatística ao teste de Tukey (p<0,05) Figura 5 Crescimento em unidades formadoras de colônia por grama (UFC/g Log 10 ) de bactérias totais e vibrionáceas após 24 horas e ácido-láticas após 48 horas do no macerado de pós-larvas 5 tratadas com os tratamentos com Propionato de sódio 0,5mM/L, Enrofloxacino 15mg/L nas principais metamorfoses e Probiótico 10mL/g de raçãon ao longo de todo cultivo. Letras diferentes indicam diferença estatística ao teste de Tukey (p<0,05) Figura 6 Percentual de sobrevivência ao teste de estresse por salinidade de pós-larvas 20 de camarão Litopenaeus vannamei cultivados em pré-berçário e alimentados com ração suplementada de butirato de sódio 2%, probiótico Lactobacillus plantarum 1x108 UFC/g e butirato de sódio 2%+ probiótico L. plantarum 1x108 UFC/g, Figura 7 Cortes histológicos do intestino médio de pós-larvas 20 de camarão marinho sob microscopia óptica ao aumento de 100x, tratados com BUT=tratamento com butirato de sódio 2%; PRO=tratamento com probiótico Lactobacillus plantarum 1x10 8 UFC/g de ração; MIX=tratamento com butirato de sódio 2%+ probiótico Lactobacillus plantarum 1x10 8 UFC/g de ração e CTL=Controle. Epi=Epitélio intestinal e Mcl= Musculo Circular e Longitudinal com estrutura integra e Lum=Lúmem intestinal contendo alimento

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15 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Principais ácidos e sais orgânicos e seus efeitos, utilizados em carcinicultura marinha Tabela 2 - Manejo alimentar utilizado noexperimento de larvicultura de Litopenaeus vannamei. Níveis de Garantia INVE (SP+=Proteína Bruta 48%; Estrato etéreo: 3%; Umidade: 8%; Matéria fibrosa: 3%; Matéria mineral: 13%; Cálcio: 1,1%; Fósforo: 1%; ZM= Proteína Bruta 48%:;Estrato etéreo: 13%; Umidade: 8% ; Matéria fibrosa: 2,5% ; Matéria mineral: 13%; Cálcio: 0,7%; Fósforo: 1%; MPL= Proteína Bruta 48%:;Estrato etéreo: 9%; Umidade: 9% ; Matéria fibrosa: 2,5% ; Matéria mineral: 13%; Cálcio: 1,6%; Fósforo: 1%) Tabela 3 - Parâmetros zootécnicos da larvicultura de camarões marinhos da espécie Litopenaeus vannamei submetida aos tratamentos propionato de sódio 0,5mM/L, enrofloxacino 15mg/L, probiótico 10mL/g de ração e controle do estádio de náuplio 5 até pós-larva Tabela 4 - Dados zootécnicos e microbiológicos do cultivo em préberçário experimental de camarões marinhos da espécie Litopeneus vannamei alimentados com ração suplementada de butirato de sódio 2%, probiótico Lactobacillus plantarum 1x10 8 UFC/g e butirato de sódio 2%+ probiótico L. plantarum 1x10 8 UFC/g

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17 SUMÁRIO CAPÍTULO I INTRODUÇÃO Larvicultura Pré-berçário Mecanismos profiláticos contra bacterioses na carcinicultura marinha Uso de antibióticos na larvicultura e pré-berçário Uso de probióticos na larvicultura e pré-berçário de camarões marinhos Ácidos orgânicos e seus sais em cultivo de camarões marinhos JUSTIFICATIVA HIPÓTESE OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos FORMATAÇÃO DOS ARTIGOS CAPITULO II Resumo Abstract Introdução Material e métodos Material biológico e estabelecimento da dose do sal orgânico Delineamento experimental Análise microbiológica Teste de estresse Sobrevivência final e comprimento das larvas Análises estatísticas Resultados e Discussão Conclusão Referências CAPITULO III Resumo Abstract... 48

18 15 Introdução Material e Métodos Delineamento experimental Análise microbiológica Teste de estresse e parâmetros zootécnicos Análise microscópica Análises estatísticas Resultados e discussão Conclusão Referências considerações finais Referências da introdução anexo I: Anexo II: Anexo III Anexo iv Anexo V

19 19 CAPÍTULO I 1 INTRODUÇÃO A carcinicultura é um dos segmentos da aquicultura com grande crescimento nas últimas décadas. Para que este crescimento seja uniforme e sustentável, existe a necessidade de tecnificação e aumento de produção nas fases primárias da cadeia produtiva (ANDREATTA; BELTRAME, 2004). O processo de produção de camarões marinhos consiste em: manutenção do banco de reprodutores, maturação dos reprodutores, cópula e desova, incubação da desova e eclosão, larvicultura, préberçário, berçário, engorda, despesca e abate. Quase todas estas etapas sofrem com perdas provenientes de doenças, que podem ser causadas por vírus, bactérias intracelulares (rickettsial like bacteria), enterobactérias, fungos e protozoários (MORALES; CUELLAR-ANJEL, 2008). Porém, nos últimos anos, as viroses têm sido responsáveis pelas maiores perdas econômicas na carcinicultura mundial e brasileira. Como exemplos, a Síndrome de Taura (TSV, do inglês, Taura Syndrome Virus) que surgiu no Equador e a Síndrome da Mancha Branca (WSSV, do inglês, White Spot Syndrome Virus) que surgiu na Ásia, ambas no início dos anos 90 (LIGHTNER et al., 2012a). Atualmente, a carcinicultura tem enfrentado um novo problema que têm causado enormes prejuízos na Ásia. Este problema provém de uma doença conhecida como Síndrome da Mortalidade Precoce (EMS, do inglês, Early Mortality Syndrome), também caracterizada como Síndrome da Necrose Hepatopancreática Aguda (AHPNS, do inglês, Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome). Sendo primeiramente relatada na China em 2009, atravessou o oceano e foi identificada em mortalidades massivas no México (MAGALLÓN-BARAJAS, 2013 apud SILVA, 2014). Desde sua identificação, a etiologia desta doença era desconhecida, e, apenas em 2013, foi identificado seu agente patológico; uma cepa de Vibrio parahaemolyticus altamente patogênico, que libera toxinas que causam disfunções no hepatopâncreas e consequentemente as mortalidades de juvenis de Litopenaeus vannamei, 20 a 30 dias após o povoamento de pós-larvas nos viveiros (LIGHTNER et al., 2012b; TRAN et al., 2013). Outras bactérias do gênero Vibrio também são responsáveis por mortalidades nas larviculturas de camarões (VANDENBERGHE et al.,

20 ) e na intensificação de mortalidades quando associada às doenças virais, como a WSSV (PHUOC et al., 2009). Os víbrios estão presentes em grandes quantidades nos meios aquáticos e possuem grande representatividade na comunidade microbiana que coloniza o trato intestinal de camarões marinhos, podendo constituir cerca de 60% da microbiota bacteriana intestinal (LIU et al., 2011). Além dos víbrios, bactérias filamentosas, clamídias e Pseudomonas também são relatadas como causadores de mortalidade em larvicultura (MOURIÑO et al. 2008) Nas fases de larvicultura e pré-berçário, as enfermidades causadas por bactérias vibrionáceas, são as mais comuns. Para o controle destas enfermidades, a remediação com antibióticos é uma estratégia utilizada (BARBIERI JÚNIOR, 2001). Contudo, o uso de antibióticos na aquicultura tem uma relação de resistência por agentes patogênicos e podem causar toxidade aos animais (SOTO-RODRIGUEZ et al, 2006). Tendo em vista os aspectos negativos do uso de antibióticos, a indústria tem vislumbrado outros métodos de profilaxia e remediação. Os probiótico (NEWAJ-FYZUL et al., 2014) e ácidos orgânicos (ou seus sais) (SILVA et al., 2013) têm sido utilizados em diversas áreas da aquicultura, apresentando resultados promissores. Dentro dessa concepção, Gatesoupe (1999) relata que já foram estudados diversos probióticos com ação comprovada em aquicultura, inclusive em camarões marinhos, Ringo (1991), em um dos primeiros estudos com ácidos orgânicos, verificou o aumento do crescimento e conversão alimentar em salvelino-ártico (Salvelinus alpinus) alimentados com dieta suplementada com lactato de sódio. Em cultivo de camarões marinhos ainda são poucos os estudos realizados com ácidos orgânicos e seus sais, assim como probióticos, nas fases iniciais de cultivo, sendo necessário avaliar seus efeitos em larvicultura e pré-berçário. 1.1 Larvicultura O processo de larvicultura de camarões marinhos consiste no cultivo inicial dos animais, do estádio de náuplio 3/5 até o estádio de pós-larvas 5. São usados tanques com volume entre 10 a 30 m³ e fundo em formato de U para evitar o acúmulo de matéria orgânica. Os tanques possuem ainda coluna de água alta, baseado no fato de que os animais até a fase de pós-larva 5 (PL) possuírem hábito planctônico

21 21 (ANDREATTA; BELTRAME, 2004). A água utilizada nos cultivos é marinha (pelo menos 30ppt de salinidade), desinfectada, pré-aquecida e mantida em temperatura média de 28,5 ºC. O sistema mais utilizado é o autotrófico intensivo com adição diária de microalgas e a densidade média de 300 náuplios/l. Dentro dos tanques de larvicultura, as larvas sofrem metamorfoses: náuplio 5, protozoea 1, 2 e 3; misis 1, 2 e 3 e pós-larva 1, 2, 3, 4 e 5 (ANDREATTA; BELTRAME, 2004). No estádio de protozoea, as larvas se alimentam basicamente de microalgas, principalmente diatomáceas, que são repostas diariamente ao longo da larvicultura, de acordo com o consumo. Á partir disso, as larvas recebem, além das microalgas, alimentação formulada as necessidades de cada estádio (BARBIERI JÚNIOR, 2001). Para o controle da qualidade de água e diminuição de acúmulo de metabólitos e matéria orgânica, à partir do estádio de misis, são realizadas renovações de água diárias (com taxa que varia de 25 a 150%, de acordo com o estádio larval) (ANDREATTA; BELTRAME, 2004). Durante as metamorfoses, os animais sofrem grande estresse orgânico, o que os torna mais sensível a patógenos oportunistas. Dentre as doenças mais comuns estão as vibrioses e as Síndrome de Bolitas e de protozoea (BARBIERI JÚNIOR, 2001). Mesmo sem sofrer problemas, um ciclo de larvicultura tem a média de sobrevivência de 50%, logo qualquer artifício que aumente a sanidade e, consequentemente, a sobrevivência se torna importante (ANDREATTA, 2012). 1.2 Pré-berçário Para garantir uma maior sobrevivência dos animais provenientes da larvicultura, as pós- larvas (dependendo da região do cultivo podem ser entre PL5 e PL 10), são transferidas para os tanques de pré-berçário. Estes tanques usualmente possuem volume entre m³, com fundo plano de grande área, já que as larvas neste estádio adquirem o hábito bentônico (ANDREATTA, 2012). No sistema de cultivo tradicional autotrófico, as pós-larvas são povoadas de modo intensivo. Neste sistema, os tanques são préadicionados com microalgas (diatomáceas ou clorófitas) que podem ser de uma ou mais espécies. A transparência da água deve ser mantida entre 30 a 40cm para o sombreamento e conforto das larvas, que são fotossensíveis. Os tanques são mantidos em constante aeração e com temperatura controlada acima de 26ºC (SCHVEITZER, 2006).

22 22 Renovações de água são feitas quando a carga de matéria orgânica é muito grande ou parâmetros de água estão fora dos recomendados para a espécie. Normalmente o ciclo de pré-berçário finaliza quando os animais atingem o estádio de PL 20 (ANDREATTA; BELTRAME, 2004). Estudos apontam que entre PL 25 e 35 as larvas do camarão Farfantepenaeus duorarum atingem a máxima capacidade osmerregulatória (CRIALES et al., 2011), justificando o uso desse manejo para aumentar a produtividade na fase de berçário. 1.3 Mecanismos profiláticos contra bacterioses na carcinicultura marinha Com o incremento de matéria orgânica ao longo do ciclo de larvicultura e pré-berçário, a carga bacteriana aumenta exponencialmente, predispondo ainda mais o desequilíbrio do sistema. Mesmo mantendo-se medidas de boas práticas de manejo, pequenos distúrbios alimentares ou na qualidade de água podem beneficiar a proliferação de microrganismos saprófitas e oportunistas, causando patologias (MOURIÑO et al., 2008). Diante dos patógenos de origem bacteriana, a alternativa para evitar mortalidades é o uso de antibióticos, que aplicados de forma correta debelam a infecção (LIGHTNER et al., 2012b). Porém o uso contínuo e inadequado promove a seleção de bactérias resistentes que, além de afetarem o cultivo, podem transmitir resistência para patógenos bacterianos humanos. Seguindo o exemplo da União Europeia, diversos outros países tem abolido o uso de antibióticos na produção animal, sendo esta uma ação de tendência mundial (LÜCKSTÄDTS, 2006). Antibióticos são eficazes na redução de bactérias, porém podem gerar toxidade para as larvas (SOTO-RODRIGUEZ et al., 2006). Baticados et al. (1990) responsabilizam o uso de diversos antibióticos pelo aparecimento de deformidades em fases larvais de Litopenaeus vannamei, mostrando um dos pontos negativos desta prática. Adicionalmente, todo fármaco, inclusive antibiótico, tem chance de atingir o ambiente aquático (Figura 1). Os antibióticos podem se acumular em diversos organismos primários à cadeia trófica, podendo intoxicar animais que venham a consumi-los (REGITANO; LEAL, 2010). Além disso, seus compostos de degradação e frutos de seu metabolismo contidos nas excretas de humanos e animais de cultivo,

23 23 também podem ser tóxicos a diversos organismos (RODRIGUES- SILVA et al., 2014). Embora dose e espécie dependente, os antibióticos possuem um alto fator impactante ao ambiente, podendo gerar resistência pelas bactérias, inclusive patógenas (HOLMSTRÖM et al., 2003). Com o intuito de promover sustentabilidade e de minimizar impactos ambientais, outros métodos profiláticos têm sido desenvolvidos, como o uso de probiótico, prebiótico (RAMIREZ et al, 2013) e os mais recentes como bacteriófagos (CHRISOLITE et al. 2008), óleos essenciais de origem vegetal (RANDRIANARIVELO et al. 2010) e ácidos orgânicos e seus sais (MINE; BOOPHATY 2011). 1.4 Uso de antibióticos na larvicultura e pré-berçário. Diversas drogas têm potencial de inibição aos principais patógenos em larvicultura e pré-berçário de camarão marinho (BATICADOS et al., 1990). Soto-Rodriguez et al. (2006) observaram que enrofloxacino e florfenicol diminuíram a carga bacteriana de víbrios em um ciclo de larvicultura, porém em doses elevadas geravam toxidade. O enrofloxacino é um antibiótico de fácil acesso, com custo relativamente baixo, largamente utilizado em medicina veterinária e apresenta ação contra diversas bactérias patógenas relacionadas à aquicultura (SOTO-RODRIGUEZ et al., 2006). Pertencente ao grupo das quinolonas, o enrofloxacino tem espectro de ação contra uma extensa classe de bactérias como riquétsias, clamídias, micoplasmas como também para as bactérias gram-negativas e gram-positivas, incluindo as resistentes aos antibióticos β-lactâmicos e sulfonamidas (FRANÇA, 2004). Este antibiótico age inibindo a síntese da DNA-girase da bactéria, proporcionando a inibição do crescimento bacteriano (MANDELL; SANDE, 1990). Contudo, a utilização indiscriminada de antibióticos pode proporcionar resistência por algumas bactérias, inclusive patogênicas, dificultando a ação remediativa diante a uma doença (BATICADOS et al., 1990; KARUNASAGAR et al., 1994). Um estudo feito por Lima et al. (2006) demonstrou que diferentes isolados bacterianos em cultivo de tilápias, apresentavam resistência a pelo menos dois antibióticos. Além disso, contaminações ambientais com antibióticos provenientes de diversas vias (Figura 1), podem perpetuar de forma acumulativa em diversos indivíduos dos primeiros níveis tróficos,

24 24 causando consequências agudas e em longo prazo (REGITANO; LEAL, 2010). Outra problemática ao uso de antibióticos é a dificuldade de estabelecer doses seguras ao cultivo, onde muitas vezes a concentração letal 50 (CL50) é apenas duas vezes e meia a dose terapêutica (SOTO- RODRIGUEZ et al., 2006). Figura 1 Principais rotas ambientais de fármacos. Destaque para a pequena contribuição proveniente da aquicultura. Como preconizado pelo MAPA (2010), o único antibiótico permitido para uso em aquicultura no Brasil é o Florfenicol, porém, o Aquaflor está limitado aos cultivos de tilápias e trutas, de acordo com o seu fabricante. Logo, para o cumprimento da legislação vigente e o seguimento da tendência mundial, o desenvolvimento de mecanismos profiláticos alternativos é necessário, apresentando um desafio para pesquisadores no mundo todo.

25 Uso de probióticos na larvicultura e pré-berçário de camarões marinhos Os probióticos são usados há muito tempo no cultivo animal, incluindo a aquicultura. De acordo com a definição de Gatesoupe (1999), probiótico é qualquer microrganismo vivo que ao ser ministrado, coloniza o trato digestório dos animais de cultivo com o objetivo de melhorar a saúde destes animais. Esta definição ainda é ainda dividida em mais duas classes de microrganismos que podem beneficiar um cultivo: os biorremediadores que melhoram a qualidade de água e os biocontroladores que antagonizam o crescimento de patógenos sem colonizar o trato (GATESOUPE, 1999). Figura 2 Método de determinação in vitro de inibição de bactérias patogênicas por bactérias probióticas (Vieira, 2010). Dentre as bactérias com potencial probiótico, destacam-se, na carcinicultura marinha, os Bacillus, os Vibrios e as bactérias ácidoláticas. A inibição contra patógenos por parte de bactérias probióticas pode ser visualizada em ensaios in vitro (Figura 2), sendo essa uma excelente ferramenta inicial de seleção de cepas probióticas. A grande maioria das bactérias com potencial probiótico promove inibição de microrganismos patogênicos através da produção de diversas substâncias, entre elas ácidos orgânicos (VÁZQUES et al, 2005),

26 26 bacteriocinas (GILLOR et al., 2008), reuterim (TALARICO et al., 1998), peróxido de hidrogênio (SUGITA et al., 2007). Também são mecanismos a competição por nutrientes e fixação no substrato, além da produção de diversos outros componentes (VINE et al., 2006; KESARCODI-WATSON et al, 2008). Muitos são os efeitos benéficos do uso de probiótico nas fases iniciais de cultivo de camarões. Vieira et al. (2010) obtiveram, após o uso de probiótico em larvas de L. vannamei, uma maior sobrevivência à infecção experimental com Vibrio harveyi, diminuição da contagem de vibrionáceas e melhoria da atividade natatória. Também suplementando a dieta com L. plantarum durante 15 dias em L. vannamei, Buglione-Neto et al. (2008) encontraram aumento de quase 20% na sobrevivência ao teste de estresse e aumento de 14% após infecção experimental com Vibrio harveyi, em pós-larvas 20. O uso de Bacillus subtilis como probiótico promoveu diminuição de Vibrio spp. na água da larvicultura de L. vannamei, além de aumentar a expressão gênica de propo (pro-fenoloxidase) e sobrevivência ao teste de estresse (LIU et al. 2010). De acordo com Zhou et al. 2009, a suplementação de Bacillus coagulans pode aumentar a sobrevivência e a atividade de algumas enzimas digestivas ao longo da fase de larvicultura de L. vannamei. Guo et al. 2009, ao testarem três bactérias com potencial probiótico, observaram que mesmo apresentando forte inibição in vitro para Streptococcus iniae e Photobacterium damselae subsp. Piscicida, os tratamentos com aplicação de Bacillus cereus biovar toyoi apresentaram grande mortalidade em larvicultura de Penaeus monodon. Isto demonstra que a escolha de um probiótico também depende da ação sobre o espécime de cultivo, não se restringindo apenas ao poder de inibição de patógenos. 1.6 Ácidos orgânicos e seus sais em cultivo de camarões marinhos O método de ação dos ácidos orgânicos sobre as bactérias, principalmente Gram-negativas, consiste em penetrar, sob sua forma não ionizada na membrana citoplasmática e desequilibrar o balanço ácido básico no interior da célula, causando a morte bacteriana por exaustão (Figura 3) (LÜCKSTÄDTS, 2008, DEFOIRDT et al., 2009). Os ácidos orgânicos podem também diminuir a absorção de ferro pelas bactérias patogênicas por formarem complexos quelantes, inibindo seu crescimento (JONES, 1998; CARDOSO; NOGUEIRA, 2007).

27 27 Podem também influenciar na absorção de nutrientes e na ação de enzimas digestivas, pelo fato de diminuírem o ph da dieta, quando inclusos na ração, consequentemente diminuindo o ph no trato gastrointestinal (LÜCKSTÄDTS, 2008; NOLASCO, apud SILVA, 2014). Figura 3 - Mecanismo de ação de ácidos orgânicos no interior das bactérias. (1) Atravessam a membrana plasmática, (2) dissociam-se no citoplasma e (3) obrigam o gasto de energia pela exportação de prótons. Adaptado de Defoirdt et al. (2009). Ainda hoje há limitações de estudos e resultados do uso de ácido orgânico no cultivo de camarões marinhos (Quadro 1). Lückstädts (2008) relatou a existência de apenas dois trabalhos até o ano de Um deles relata a adição de 0,5% de citrato de sódio com lactobacilos inativados proporcionando o crescimento do camarão Masurpenaeus japonicus. Outro estudo sugere que uma dose de 0,25% de formiato de cálcio melhora a sobrevivência do Penaeus monodon em fazendas de Taiwan. Em estudos mais recentes com L. vannamei, o uso de potássio diformiato suplementado na dieta de juvenis proporcionou valores superiores de ganho em peso e sobrevivência, representando um aumento na produtividade (KÜHLMANN et al., 2011). Dos sais orgânicos testados por Silva et al. (2013), o butirato de sódio proporcionou maior atratividade e melhorou o consumo de ração por junvenis de L. vannamei. Os sais propionato e lactato de sódio proporcionaram uma redução nas contagens de bactérias vibrionáceas no intestino dos camarões.

28 28 Tabela 1 - Principais ácidos e sais orgânicos e seus efeitos, utilizados em carcinicultura marinha. Sal orgânico Espécie Efeito Autor Citrato de sódio (0,5%) Marsurpenaeus Aumento do Lückstädts japonicus crescimento. (2008). Formiato de cálcio (0,25%) Penaeus monodon Aumento da sobrevivência. Lückstädts (2008). Potássio diformiato (0,5%) Litopenaeus vannamei Aumento na produtividade. Kühlmann et al. (2011). Mudanças na Acetato, butirato, atratividade, Silva et al. citrato, formiato, L. vannamei consumo e (2013). propionato lactato (2%) digestibilidade. O propionato de sódio, além de possuir a mínima concentração inibitória (MIC) contra os microrganismos testados, proporcionou maior coeficiente de digestibilidade aparente de energia e fósforo em engorda experimental de camarão em água clara (SILVA, 2014). Outros dados referentes ao uso de sais orgânicos indicam que camarões alimentados com as dietas suplementadas com o propionato e o butirato apresentaram maior peso final e o ganho de peso semanal, e que a suplementação da dieta com 2% de butirato aumentou a eficiência alimentar e a sobrevivência dos camarões (SILVA, 2014). Além disso, Silva (2014) observou que os camarões alimentados com as dietas contendo 0,5% e 2% de butirato apresentaram maior produtividade final, retenção de nitrogênio e taxa de eficiência proteica. Adicionalmente, na análise do DGGE, doses acima de 0,5% de butirato e 1% de propionato causaram alterações na comunidade bacteriana intestinal. O butirato de sódio ainda proporcionou o aumento do título aglutinante do soro, quando comparados com os camarões do controle antes do desafio com Vibrio spp. Como o uso de ácidos orgânicos e seus sais ainda é um tema recente na fase de larvicultura e pré-berçário de camarões marinhos, ainda não se tem resultados expressivos e publicados, necessitando de investigações do uso nestas fases de cultivo. 2 JUSTIFICATIVA O uso inadequado de antibióticos na aquicultura resulta na seleção de bactérias resistentes, além de serem potenciais poluidores ambientais. Por conta destes fatores, há a necessidade de buscar métodos alternativos ao uso curativo e profilático de doenças. Sendo

29 29 assim, probióticos e sais orgânicos podem ser boas alternativas na substituição dos antibióticos em aquicultura. Probióticos já são conhecidos por aumentar sobrevivência em camarões infectados com diferentes patógenos (CASTEX et al., 2010; VIEIRA et al., 2010) e por melhorar a resposta imunológica (CHIU et al., 2007). Os sais orgânicos têm sido usados em aquicultura em algumas espécies de peixe e de crustáceos, demonstrando uma melhoria no desempenho dos animais e melhorando crescimento, digestibilidade de nutrientes ou sobrevivência (BARUAH et al., 2005,2007; RAMLI et al., 2005; SARKER et al., 2005; HOSSAIN et al., 2007; KÜHLMANN et al., 2011). A escolha do antibiótico e dos sais orgânicos teve base em testes de antibiograma e de mínima concentração inibitória, além de pré-testes in vivo. Contudo trabalhos com sais orgânicos em camarão são limitados. Estes sais poderiam ser utilizados como inibidores de crescimento bacteriano em larvicultura, ministrados diretamente na água e aspergido isoladamente ou em conjunto com probiótico na ração de larvas em préberçário, em dose estabelecida por mínima concentração inibitória in vitro, obtendo efeito semelhante a antibióticos ou melhorando a digestibilidade, porém sem agressão ambiental. 3 HIPÓTESE A inserção de sais orgânicos e probiótico influenciarão positivamente nos índices zootécnicos e concentrações de bactérias na larvicultura e pré-berçário do camarão Litopenaeus vannamei. 4 OBJETIVOS 4.1 Objetivo geral Fomentar informações sobre o uso de sais orgânicos nas fases de larvicultura e pré-berçário do camarão branco do Pacífico, contribuindo com a saúde do animal e visando diminuir o impacto ambiental causado por antibióticos sintéticos. 4.2 Objetivos específicos Avaliar os efeitos do uso de enrofloxacino, probiótico (Lactobacillus plantarum) e propionato de sódio na fase de larvicultura do camarão branco do pacífico quanto a:

30 30 o Sobrevivência e peso final das larvas; o Quantificação da microbiota da água e larvas; o Sobrevivência ao teste de estresse; o Comprimento final das larvas; Comparar os efeitos do uso de probiótico (L. plantarum), butirato de sódio e sua interação na fase de pré-berçário do camarão branco do pacífico quanto a: o Sobrevivência e peso final das larvas; o Quantificação da microbiota das larvas; o Qualidade larval e teste de estresse; o Comprimento final das larvas; o Morfologia do intestino médio sob microscopia óptica. 5 FORMATAÇÃO DOS ARTIGOS A dissertação esta dividida em três capítulos, onde o primeiro se refere à introdução e revisão de literatura e os demais referentes a dois artigos, formatados de acordo com a revista Acta Scientiarum Animal Sciences

31 31 CAPITULO II Utilização comparativa de enrofloxacino, probiótico (Lactobacilus plantarum) e propionato de sódio na larvicultura de camarão branco do Pacífico. Marcello Mendes dos Santos Junior 1 *; José Luiz Pedreira Mouriño 1 ; Felipe do Nascimento Vieira 1 1 Universidade Federal de Santa Catarina, Departamento de Aquicultura, Laboratório de Camarões Marinhos, Servidão dos Coroas número 503, Barra da Lagoa, , Florianópolis, SC, Brasil. *marcello.mendes@live.com *Artigo formatado de acordo com as normas da revista Acta Scientiarum- Animal Sciences

32 32 6 RESUMO O objetivo do presente trabalho foi avaliar métodos de controle e tratamento de bacterioses na larvicultura de Litopenaeus vannamei, avaliando o uso contínuo de probiótico e o uso pontual de enrofloxacino 15mg/L -1 e propionato de sódio 0,5 mm/l -1 nos momentos de metamorfose sobre os, parâmetros zootécnicos e microbiológicos das larvas e da água. Foram utilizadas 16 unidades de 60L, povoadas com 325 náuplios 5 por litro, divididos em três tratamentos: enrofloxacino, probiótico, propionato de sódio e controle. O enrofloxacino e propionato foram ministrados em protozoea 3, misis 3 e pós-larva 4 e o probiótico foi ministrado na ração ao longo de 15 dias. O probiótico aumentou as contagens de bactérias ácido-láticas em relação a todos tratamentos na água de cultivo (p=0,00001) e em relação ao enrofloxacino e proprionato nas larvas (p=0,0048). A água dos animais tratados com probiótico apresentou menor contagem de víbrios do que a tratada com enrofloxacino (p=0,0011) e a tratada com probiótico apresentaram menor contagem de víbrios que o propionato (p=0,0158). Contudo, não foi observada diferença nos índices zootécnicos. Assim, os aditivos na dose utilizada não alteram parâmetros zootécnicos da larvicultura de camarão L. vannamei da fase de náuplio 5 até pós-larva 5. Palavras-chave: Litopenaeus vannamei, vibriose, ácido orgânico, profilaxia, antibiótico.

33 33 7 ABSTRACT The objective of this study was to evaluate methods of control and treatment of bacterial diseases in Litopenaeus vannamei, evaluating the continued use of probiotic and timely use of enrofloxacin 15mg/L-1 and sodium propionate 0.5 mm/l-1 in moments morph on, zootechnical and microbiological parameters of larvae and water. enrofloxacin, probiotic, sodium propionate and control: 16 units 60L, stocked with nauplii per liter, divided into three treatments were used. The enrofloxacin and propionate were administered into protozoea 3 misis 3 and 4 and the post probiotic larva was administered in the diet throughout the experiment. The increased counts of probiotic lactic acid bacteria for all treatments in culture (p = ) and water relative to the propionate larvae and enrofloxacin (p = ). Water treatment with probiotic had lower counts of vibrios that enrofloxacin (p = ) and larvae treated with probiotic showed lower counts of vibrios that propionate (p = ). However, no difference was observed in the evaluated performance indexes. Thus, the additives in the dose used did not alter performance parameters of L. vannamei shrimp hatchery phase 5 to post-nauplius larva 5. Keywords: Litopenaeus vannamei, organics salts, prophilaxis, vibriosis, antibiotics.

34 34 8 INTRODUÇÃO A larvicultura de camarões marinhos é um importante elo da cadeia produtiva. Atualmente a produção mundial de camarões marinhos supera 3 milhões de toneladas (FAO-FISHSTAT, 2014) e praticamente todo o camarão cultivado provém da produção de larvas em laboratório. Após a fase de incubação, as larvas entre náuplio 3 e 5 são povoadas em tanques com adequada coluna de água com fundo em formato de U, em sistema intensivo autotrófico, com troca de água e aeração e aquecimento constante. Até atingirem a fase de pós larva, as larvas passam pelos estádios de náuplio, protozoea 1, 2 e 3 e misis 1, 2 e 3. A despesca, dependendo da região e época do ano, acontece entre 5 e 10 dias após os animais atingirem o estádio de pós larva (ANDREATA; BELTRAME, 2004). Devido à sensibilização orgânica causada pelas diversas fases de metamorfose, principalmente na troca de estádios de protozoea 3/misis 1 e misis 3/pós-larva 1, as bacterioses são, de forma primária ou secundária, causadoras das maiores mortalidades na larvicultura. Dentre estas, bactérias do gênero Vibrio são os principais agentes patogênicos, como é o caso da síndrome de protozoea e síndrome de bolitas (VANDENBERGHE et al., 1999). Os tratamentos a base de antimicrobianos sintéticos, como a tetraciclina, são eficazes, porém podem agredir o ambiente e selecionar bactérias resistentes, além de causar efeitos orgânicos adversos, tanto em animais domésticos como em humanos (SILVA, 1998). Em Pennaeus monodon o uso de oxitetraciclina, cloranfenicol e diversos outros antibióticos, resultou em deformidade no rostro, carapaça e cerdas (BATICADOS et al., 1990). De acordo com Soto- Rodriguez et al. (2006), doses de 20mg/L de enrofloxacino na água de cultivo teriam efeito inibitório contra V. campbellii, porém apresentaram toxidade para os estádios de protozoea 1 e 2 de Litopenaeus vannamei e ainda uma dose letal 50% (DL 50) com apenas um pouco mais que o dobro da dose medicamentosa. Atualmente, formas alternativas de prevenção e tratamento de bacterioses têm sido desenvolvidas, dentre elas o uso de imunoestimulantes, probiótico, prebióticos, fitoterápicos, bacteriófagos e ácidos orgânicos (MINE; BOOPATHY, 2011). Entre os probióticos, destacam-se as bactérias ácido-láticas. Estas produzem uma gama de compostos antimicrobianos, entre eles os ácidos orgânicos (MA, et al., 2009). Estudos com cepas de bactérias ácido-

35 35 láticas comprovaram que seu potencial de inibição contra bactérias patogênicas se deve muito pela produção de ácidos orgânicos, principalmente os ácidos acético e láctico (VAZQUEZ et al., 2005) Assim, o uso dos ácidos orgânicos poderia ter um efeito benéfico na larvicultura. Silva et al. (2013), avaliaram seis diferentes sais orgânicos e observaram que butirato de sódio, propionato de sódio e acetato de sódio tiveram os melhores resultados para inibição in vitro contra a V. alginolyticus, V. harveyi e V. anguilarum, com destaque para o propionato de sódio, que apresentou as menores mínimas concentrações inibitórias para todos os agentes patógenos testados. Tais resultados sugerem que o propionato de sódio seja um método de profilaxia e remediação contra microrganismos patógenos e oportunistas. Adicionalmente, além de proporcionar inibição bacteriana, probiótico, ácidos orgânicos e seus sais em camarões marinhos, podem melhorar a digestibilidade por meio do aumento ou da melhoria de ação de enzimas digestivas (ZHOU et al., 2009; NOLASCO apud SILVA et al., 2013). Também podem aumentar resistência ao teste de estresse por alteração de salinidade e ainda podem melhorar a condição imunológica, visto através do aumento da expressão gênica de profenoloxidase I e II e lizosima (LIU et al., 2010). O objetivo deste estudo foi avaliar diferentes mecanismos de controle e tratamento de bacterioses na larvicultura de L. vannamei, avaliando o uso contínuo de probiótico e o uso pontual de enrofloxacino 15mg/L -1 e propionato de sódio 0,5 mm/l -1 nos momentos de metamorfose sobre os parâmetros zootécnicos e microbiológicos das larvas e da água. 9 MATERIAL E MÉTODOS 9.1 Material biológico e estabelecimento da dose do sal orgânico O experimento foi realizado no laboratório de Camarões Marinhos da Universidade Federal de Santa Catarina LCM-UFSC, no período de 11 de Dezembro de 2013 a 24 de Dezembro de Para determinar uma dose segura, foi observada a sobrevivência de larvas nos estádios de protozoea 3, misis 3 e pós-larva 7 expostas ao sal orgânico propionato de sódio. Cada estádio larval foi exposto por 24

36 36 horas em triplicata nas concentrações de 0; 0,1; 0,5; 1; 5 e 10 mm/l de propionato de sódio. Foram utilizadas unidades cilindrocônicas com 1L de água marinha povoadas com 50 larvas cada, retiradas de tanques de larvicultura do LCM-UFSC, e adicionadas da microalga Chaetoceros mulleri na concentração de 5 x 10 4 cel/ml. As unidades continham aeração continua e aquecimento constante (28±1ºC). Ao longo das 24 horas do experimento, os animais foram alimentados três vezes com ração microparticulada comercial. Ao final do experimento, as larvas vivas foram contadas, calculando-se a sobrevivência final. 9.2 Delineamento experimental Foram utilizadas 16 unidades experimentais com fundo em U com capacidade de 60L, providas de aeração e aquecimento (Anexo I) Cada unidade foi povoada com náuplios V de Litopenaeus vannamei provenientes de linhagem livre de patógenos espcíficos (SPF, do inglês Specified Pathogen Free) provenientes da Aquatec Larvicultura de Camarão Marinho RN, em água previamente adicionada de microalgas Chaetoceros muelleri na concentração. O antibiótico enrofloxacino foi escolhido através de teste de antibiograma com cepas de Vibrio sp. isoladas em surtos de mortalidade no Laboratório de Camarões Marinhos e o sal orgânico escolhido através de resultados de testes mínima dose inibitória com cepas de Vibrio sp. do banco de cepas do setor de microbiologia do LCM-UFSC. Os tratamentos consistiam em alimentação suplementada com Lactobacillus plantarum (1x10 7 UFC/mL) adicionados na ração na proporção de 10mL/grama de ração, enrofloxacino 15mg/L na água de cultivo de forma pontual (protozoea 3, misis 3 e pós-larva 4), propionato de sódio 0,5 mm/l na água de cultivo de forma pontual (protozoea 3, misis 3 e pós-larva 4) e controle. As larvas foram alimentadas em quantidade e qualidade pertinente a cada fase larval (Tabela 2), com dietas comerciais microencapsuladas INVE (INVE Aquaculture Inc., Salt Lake City, UT, USA) (Anexo II).

37 37 Tabela 2 Manejo alimentar utilizado noexperimento de larvicultura de Litopenaeus vannamei. Níveis de Garantia INVE (SP+=Proteína Bruta 48%; Estrato etéreo: 3%; Umidade: 8%; Matéria fibrosa: 3%; Matéria mineral: 13%; Cálcio: 1,1%; Fósforo: 1%; ZM= Proteína Bruta 48%:;Estrato etéreo: 13%; Umidade: 8% ; Matéria fibrosa: 2,5% ; Matéria mineral: 13%; Cálcio: 0,7%; Fósforo: 1%; MPL= Proteína Bruta 48%:;Estrato etéreo: 9%; Umidade: 9% ; Matéria fibrosa: 2,5% ; Matéria mineral: 13%; Cálcio: 1,6%; Fósforo: 1%). SUB ESTÁDIO FITOPLÂNCTON (x cel/ml) ARTÊMIA CONGELADA (Náuplios / Póslarva) RAÇÃO (gramas / milhão de larva / dia) N 5 5 C. muelleri Alimento Quantidade Z 1 10 SP+ 25 Z 2 10 SP+ 30 Z SP+ 35 Z 3 10 SP+ 40 Z 3 / M 1 5 ZM 45 M 1 6 ZM 55 M 2 6 ZM 55 M 3 6 ZM 60 M 3 / PL MPL 65 PL MPL 65 PL MPL 70 PL MPL 70 PL MPL 75 PL MPL 75 A renovação de 50% do volume de água foi feita por sifonagem, e somente a partir da fase de misis, uma vez ao dia até o término do experimento. As análises de amônia total foram feitas através da técnica colorimétrica de APHA (1995), aplicada nas amostras de água coletada de cada tanque experimental no dia do início do experimento e 24 horas após a aplicação dos tratamentos.

38 38 A bactéria probiótica Lactobacilus plantarum (Vieira et al. 2013) foi repicada em dois tubos de ensaio contendo 20 ml de meio de cultura Man Rogosa e Sharpe (MRS) caldo e incubada a 35 C por 48hs. Em seguida, os dois tubos foram repicados para um frasco contendo 200 ml de meio de cultura alternativo para bactérias probióticas (30g/L de soro de leite, 20g/L sacarose e 30g/L de cloreto de sódio) e incubadas a 35 C por 24hs. Após atingir a concentração média de 1x10 7 UFC/mL através da leitura da absorbância, o probiótico, em volume de 10 ml/g, foi incubado por 24hs na ração diariamente, e então administrado para grupo probiótico. Para os grupos enrofloxacino e propionato de sódio, as substâncias foram diluídas em água salgada e administradas nas unidades em dose referente a concentração desejada nas fases de principal metamorfose (protozoea 3 e misis 3) e de estresse de transferência para o pré-berçário (pós-larva 4). 9.3 Análise microbiológica Em misis 1, pós-larva 1 e pós-larva 5, frações de água foram coletadas em tubo estéril para analise microbiológica em diluições de 10-1 até 10-5 semeadas em meio de cultura Ágar Marine (contagem total de bactérias), Ágar Tiossulfato Citrato Bile Sacarose (TCBS, para Vibrio spp.) e Ágar de Man Rogosa e Sharpe (MRS, para bactérias ácido-láticas). As placas após serem semeadas foram incubadas a 30ºC. Quando as os animais atingiram o estádio de pós-larva 5 uma amostra de larvas foi macerada e também semeada utilizando a mesma metodologia utilizada nas amostras de água (Anexo III). As colônias bacterianas crescidas em 24hs (TCBS e Marine) e 48hs (MRS), foram aferidas em unidades formadoras de colônia (UFC) e ajustadas para UFC/mL no caso da água do cultivo e em UFC/g no caso do macerado de larvas. 9.4 Teste de estresse Para o teste de estresse foram recrutadas 50 pós-larvas cinco por unidade e desafiadas em salinidade 19 ppt por 30 minutos em béqueres de 1L contendo 500 ml de água, devolvidas à salinidade de 35 ppt por mais 30 minutos em béqueres de mesmo volume. Após este período, foi computada a mortalidade.

39 Sobrevivência final e comprimento das larvas Na despesca final o volume total de larvas foi pesado, uma alíquota de 100 larvas retirada para biometria úmida e então extrapolada a quantidade total de larvas de cada unidade experimental (Anexo V). Um total de trinta larvas foram medidas através de estereomicroscópio NIKON SMZ-745 com lente com escala micrométrica (Anexo IV), e ao aumento de 1x, no Laboratório de Peixe Marinho LAPMAR - UFSC. 9.6 Análises estatísticas Os dados de sobrevivência foram transformados em arcoseno e os dados de contagem bacterianas transformados em Log 10. Todos os dados foram analisados, após as premissas de normalidade e homocedasticidade (Levene), por análise de variância (ANOVA), suplementadas pelo teste de Tukey de separação de médias, ambos ao nível de significância de 5%. 10 RESULTADOS E DISCUSSÃO No teste para estabelecimento de dose do sal orgânico, a mortalidade foi significativa apenas em protozoea 3 com doses de propionato de sódio a partir de 0,5 mm/l (p=0,0110). Os parâmetros de qualidade de água se mantiveram com oxigênio dissolvido acima de 5mg/L, temperatura média de 28±1ºC e amônia tóxica próximo de zero, ou seja, valores aceitáveis para a espécie cultivada (BOYD; GAUTIER, 2000). As contagens de bactérias ácido-láticas na água de cultivo do tratamento com probiótico foram maiores em relação aos outros tratamentos (p=0,000015) (Figura 4). Já a contagem presuntiva de bactérias vibrionáceas foi menor na água dos animais tratados com probiótico quando comparada com o tratamento com enrofloxacino com p=0,011503, porém, permanecendo igual aos demais tratamentos (Figura 4). Como o probiótico foi fornecido diariamente, as contagens de bactérias ácido-láticas na água foram possíveis, inclusive porque L. plantarum é aerotolerante e embora não apresente crescimento significativo, ainda consegue manter funções fisiológicas básicas (MADIGAN et al., 2004). Já o crescimento de bactérias vibrionáceas elevado na água do tratamento com enrofloxacino, pode ter ocorrido pela eliminação de

40 40 bactérias sensíveis e, por consequência, diminuição de competição e crescimento das mais resistentes, no caso, crescimento de vibriões. Adicionalmente, o enrofloxacino pode ter interferido na comunicação bacteriana dos vibriões. Isto porque, móleculas classificadas como quinolonas estão relacionadas com o mecanismo de quorum sensing (SOLA et al., 2012). Figura 4 Crescimento em unidades formadoras de colônia em por mililitro (UFC/mL Log 10 ) de bactérias totais e vibrionáceas após 24 horas e ácido-láticas após 48 horas do na água da larvicultura dos tratamentos com Propionato de sódio 0,5mM/L, Enrofloxacino 15mg/L e Probiótico 10mL/g de ração em três coletas de água de cultivo após as principais metamorfoses. Letras diferentes indicam diferença estatística ao teste de Tukey (p<0,05) O enrofloxacino é uma droga antibiótica integrante do grupo das fluorquinolonas, capaz de interferir na síntese de DNA-girase. De acordo com Knapp et al. (2005), após exposição de 100% de luz o enrofloxacino tem meia vida no ambiente aquático de 0,8 dias, transformando-se em ciprofloxacino que degrada-se também na presença de luz. Compostos provenientes da degradação do ciprofloxacino não são bem conhecidos e difíceis de caracterizar, podendo ser em alguns casos tóxicos ao ambiente (RODRIGUES-SILVA et al., 2014). Estes compostos poderiam ser semelhantes ou análogos às quinolonas do sistema de quorum sensing, promovendo ou facilitando o crescimento de determinado grupo bacteriano.

41 41 Tendo em vista que o ph da água de cultivo ficou em média 7,6 e a ação dos sais orgânicos é mais efetiva em ph ácido, talvez a dose utilizada não tenha sido efetiva na inibição de crescimento bacteriano, já que o tratamento com propionato não proporcionou diminuição na contagem de bactérias vibrionáceas. Em testes de inibição in vitro, doses de propionato de sódio quatro vezes menores foram efetivas contra Vibrio anguillarum ATCC 19264, V. alginolyticus BCCM 2068, V. harveyi ATCC em ph 6,2, porém, doses maiores que 0,5 mm/l são necessárias para causar efeito inibitório em ph 7,1 (SILVA et al., 2013). Também foram observadas maiores contagens de bactérias ácidoláticas no macerado de larvas, porém, apenas em relação aos tratamentos propionato de sódio e enrofloxacino (p=0,00485) (Figura 5). Maiores contagens de bactérias ácido-láticas proveniente do macerado de larvas no tratamento contendo probiótico condizem com o estudo feito por Vieira et al. (2010), que encontraram maiores contagens de bactérias ácido-láticas em macerado de larvas alimentadas com ração suplementada de L. plantarum. No macerado de larvas tradadas com probiótico também foi visualizado menor crescimento de vibriões, porém, apenas quando comparado as larvas tratadas com propionato (p=0,0158). Contudo, o tratamento com probiótico L. plantarum diminuiu a concentração de víbrio no trato de camarões adultos estando de acordo com Ramirez et al. (2013) e na água de cultivo de larvicultura, como observado por Liu et al. (2010). Em nosso estudo isso não foi visualizado, já que não houve diferença em relação ao controle. Figura 5 Crescimento em unidades formadoras de colônia em por grama (UFC/g Log 10 ) de bactérias totais e vibrionáceas após 24 horas e ácido-láticas após 48 horas do no macerado de pós-larvas 5 tratadas com os tratamentos com

42 42 Propionato de sódio 0,5mM/L, Enrofloxacino 15mg/L nas principais metamorfoses e Probiótico 10mL/g de ração ao longo de todo cultivo. Letras diferentes indicam diferença estatística ao teste de Tukey (p<0,05) Todos os tratamentos apresentaram contagens de vibrionáceas na água superiores a 1x10 4 UFC/mL (Figura 4), porém, não foi observada diferença na sobrevivência final (Tabela 3). De acordo com Mouriño et al. (2007) contagens de vibriões acima de 1x10 4 UFC/mL proporcionam alterações na qualidade larval e morte larval, o que não foi observado em nosso trabalho. Tabela 3 - Parâmetros zootécnicos da larvicultura de camarões marinhos da espécie Litopenaeus vannamei submetida aos tratamentos propionato de sódio 0,5mM/L, enrofloxacino 15mg/L, probiótico 10mL/g de ração e controle do estádio de náuplio 5 até pós-larva 5. Controle Propionato de sódio Probiótico Enrofloxacino p-valor Sobrevivência (%) Teste de estresse (%) Biometria úmida (mg) Biomassa (g) Tamanho da larva (mm) 60,19 ±18,14 95,00 ±1,00ab 0,59 ±0,09a 6,83 ±1,72 5,19 ±0,28 29,13 ±14,34 94,97 ±2,25ab 0,64 ±0,12ab 3,89±2,17 5,05 ±0,28 42,80 ±7,92 96,05 ±1,63a 0,63 ±0,08ab 5,16 ±0,47 5,04 ±0,10 44,41 ±17,90 91,03 ±1,78b 0,77 ±0,14b 6,30 ±1,59 5,32 ±0,21 0,1865 0,0268 0,0190 0,2075 0,4571 As letras diferentes indicam diferença significativa nas médias pelo teste Tukey (p<0,05). Diversos outros autores demonstram as vantagens do uso de diversas cepas probióticas em larvicultura. Entre estas vantagens estão o aumento de produtividade em até 15% em relação ao controle (GUO et al., 2009), melhora da produção de enzimas digestivas (ZHOU et al., 2009) e diminuição da carga de vibrionáceas na água (LIU et al., 2010). Contudo, neste trabalho estes resultados não foram observados. Ao teste de estresse, o tratamento com probiótico obteve melhor índice de sobrevivência em relação ao enrofloxacino (Tabela 3), porém

43 43 nenhuma diferença em relação aos outros tratamentos, inclusive o controle. 11 CONCLUSÃO O uso de probiótico, enrofloxacino e propionato de sódio na dose utilizada não influencia nos parâmetros zootécnicos e na microbiota da água e do camarão L. vannamei na fase de náuplio 5 a pós-larva REFERÊNCIAS ANDREATTA, E.R; BELTRAME, E. Cultivo de camarões marinhos. In: Poli, CR.; Poli, A.T.B.; Andreatta, E.R.; Beltrame E. Aqüicultura: Experiências brasileiras. Multitarefa Editora Ltda.: Florianópolis, SC, APHA, "WEF. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Association." Inc. AWWA.,1995. BATICADOS, M. C. L. et al. Studies on the Chemical Control of Luminous Bacteria Vibrio harveyi and Vibrio splendidus Isolated from Diseased Penaeus monodon Larvae and Rearing Water. Diseases of Aquatic Organisms, v. 9, n. 2, p , BOYD, C.E.; GAUTIER, D. Effluent composition and water quality standards. Global Aquaculture Advocate, v. 3, p.61 66, FAO Fisheries and Aquaculture Information and Statistics Service. Disponível em: < webapps/figis/temp/hqp_ xml&outtype=html >. Acesso em: às 12:00hs. GUO, J.J. et al. Selection of probiotic bacteria for use in shrimp larviculture. Aquaculture Research, v.40, , KNAPP, C.W. et al. Fate and Effects of Enrofloxacin in Aquatic Systems under Different Light Conditions. Environmental Science Technology, v.39, n. 23, pp , 2005.

44 44 LIU K.F. et al. Effects of the probiotic, Bacillus subtilis E20, on the survival, development, stress tolerance, and immune status of white shrimp, Litopenaeus vannamei larvae. Fish & Shellfish Immunology, n. 28, p , MA, C.W.; CHO Y.S.; OH K.H. Removal of pathogenic bacteria and nitrogens by Lactobacillus spp. JK-8 and JK-11. Aquaculture, n. 287, p , MADIGAN, M.; MARTINKO, J.M.; PARKER, J. Brock biology of microorganisms. Upper Saddle River, MINE, S.; BOOPATHY, R. Effect of organic acids on shrimp pathogen, Vibrio harveyi. Current Microbiology, v. 63, n. 1, p. 1-7, MOURIÑO, J.L.P. et al. Uso de hidróxido de cálcio no controle de vibrionáceas em viveiros de cultivo do camarão Litopenaeus vannamei em Santa Catarina. Boletim do Instituto de Pesca, n. 34, p , RAMIREZ N.B. et al. Dieta suplementada com prebiótico, probiótico e simbiótico no cultivo de camarões marinhos. Pesquisa agropecuária brasileira. v.48, n.8, p , RODRIGUES-SILVA, C.; MANIERO, M.G.; PERES M.S; GUIMARÃES J.R. Ocorrência e degradação de quinolonas por processos oxidativos avançados. Química Nova, v. XY, n.. 00, p.1-18, SILVA, B. C. et al. Salts of organic acids selection by multiple characteristics for marine shrimp nutrition. Aquaculture, v , p , SILVA, P. Farmacologia. 5. ed.: Guanabara Koogan, 1314p SOLA, M.C. et al. Mecanismos de Quorum Sensing e sua Relevância na Microbiologia de Alimentos. Enciclopédia Biosfera, Centro Científico Conhecer, v.8, n.14; p , 2012.

45 45 SOTO-RODRIGUEZ, S.; ARMENTA, M.; GOMEZ-GIL, B. Effects of enrofloxacin and florfenicol on survival and bacterial population in an experimental infection with luminescent Vibrio campbellii in shrimp larvae of Litopenaeus vannamei. Aquaculture, v. 255, n. 1-4, p , VANDENBERGHE, J. et al. Vibrios associated with Litopenaeus vannamei larvae, postlarvae, broodstock, and hatchery probionts. Appl Applied Environmental Microbiology, v. 65, n. 6, p , VAZQUEZ, J.A.; GONZALEZ, M.P.; MURADO, M.A. Effects of lactic acid bacteria cultures on pathogenic microbiota from fish. Aquaculture. n.245, p , VIEIRA, F.N. et al. Effect of probiotic supplemented diet on marine shrimp survival after challenge with Vibrio harveyi. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaria e Zootecnia, v. 62, n. 3, p , VIEIRA, F.N. et al. In vitro selection of bacteria with potential for use as probiotics. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.48, n.8, p , ZHOU, X. X.; WANG, Y. B.; LI, W. F. Effect of probiotic on larvae shrimp (Penaeus vannamei) based on water quality, survival rate and digestive enzyme activities. Aquaculture, v. 287, n. (3-4), p , 2009.

46 46 CAPITULO III Uso de probiótico (Lactobacilus plantarum) e butirato de sódio na alimentação de camarão branco do pacífico em pré-berçário Marcello Mendes dos Santos Junior; José Luiz Pedreira Mouriño; Felipe do Nascimento Vieira 1 Universidade Federal de Santa Catarina, Departamento de Aquicultura, Laboratório de Camarões Marinhos, Servidão dos Coroas número 503, Barra da Lagoa, , Florianópolis, SC, Brasil. *marcello.mendes@live.com *Artigo formatado de acordo com as normas da revista Acta Scientiarum- Animal Sciences.

47 47 13 RESUMO Este estudo avaliou o uso suplementar de butirato de sódio, probótico (Lactobacillus plantarum) e sua interação, na dieta de pós larvas de camarão branco do pacífico em fase de pré-berçário. Foram adicionados nas dietas, durante todo o experimento, os tratamentos: probiótico 10mL/g, butirato de sódio 2% + meio de cultura, probiótico 10mg/g + butirato de sódio 2% e meio de cultura 10mL/g. Foram utilizadas 16 unidades de 60L cada com fundo em formato U, povoadas com pós-larva 5. A dieta adicionada de tratamento foi incubada com os tratamentos overnight,e ministrada 7 vezes ao dia. Após quinze dias, indiferentemente da presença ou não do probiótico, os tratamentos com butirato obtiveram maior sobrevivência (p=0,0039) e menor peso seco individual (p=0,0043). A suplementação com butirato de sódio na concentração de 2% aspergido na ração aumenta a sobrevivência no cultivo de pós-larva 5 até pós-larva 20 do camarão marinho L. vannamei sem causar alterações morfológicas no intestino médio das pós larvas 20. Palavras-chave: sal orgânico, pós-larva, teste de estresse, profilaxia, vibrio.

48 48 14 ABSTRACT This study evaluated the addition of sodium butyrate, probótico (Lactobacillus plantarum) and their interaction, in the diet of post-larvae of the Pacific white shrimp in pre-nursery. Probiotic 10mL/g, sodium butyrate + 2% medium, probiotic 10mg/g + 2% sodium butyrate medium and 10mL/g culture: The treatments were applied in the diet throughout the experiment. 16 units 60L each bottom U-shape was used, populated with 2,880 larvae after 5. Feeding was incubated overnight with treatments, is administered 7 times a day. Fifteen days later, regardless of the presence or absence of the probiotic, treatment with butyrate had higher survival (p = ) and lowest individual dry weight (p = ). No morphological changes were observed in the gut of post-larvae in any treatment. Supplementation with sodium butyrate at a concentration of 2% sprinkled in the feed increases the survival in culture of post-larval 5 to 20 post-larvae of marine shrimp L. vannamei without causing morphological change in the midgut of 20 post-larvae. Keywords: post-larvae, stress test, organics salts, vibriosis, prophilaxis

49 49 15 INTRODUÇÃO Para a expansão do cultivo de camarões, é necessário que exista o desenvolvimento de toda cadeia produtiva, desde a maturação e larvicultura, até as fases finais de engorda. Em regiões mais frias, como o sul do Brasil, existe a necessidade de adaptação de alguns manejos de produção. Uma destas adaptações é a utilização de uma fase intermediária entre larvicultura (náuplio a pós-larva 5 ou 10) e berçário (pós-larva 20 a ± 1g). Esta fase é denominada pré-berçário, que compreende um período de 10 a 15 dias para que as formas jovens atinjam a melhor capacidade de adaptação ao viveiro escavado (ANDREATTA; BELTRAME, 2004). Nesta fase é importante a manutenção da transparência entre 30 e 40cm sob o teste de disco de Secci, através da inserção de microalgas, pois as pós-larvas ainda são fotossensíveis. A água de cultivo sofre renovações periódicas para que ocorra diluição dos compostos nitrogenados e matéria orgânica, que em excesso podem desestabilizar o sistema de cultivo e predispor as póslarvas a doenças (PRABHU et al. 1999). Tais doenças são, na sua maioria, de origem bacteriana, tendo os vibriões como os principais patógenos causadores de mortalidade na fase de pré-berçário. Com a proposta de aumentar a produtividade, pesquisadores tem procurado encontrar métodos, principalmente profiláticos, para diminuir: a mortalidade por doenças, aumentar a sanidade dos animais, diminuir consumo de água e efluentes, e ainda melhorar a digestibilidade e conversão alimentar (LIM et al., 2010; ENCARNAÇÃO, 2010). Dentre estas novas tecnologias estão, a utilização de imunoestimulantes, probióticos, fitoterápicos e ácidos orgânicos (MINE; BOOPATHY, 2011). O uso de probiótico já é bastante difundido em todos os ramos de produção animal, inclusive em aquicultura (MOURINÕ et al. 2012; RAMIREZ et al., 2013; BUGLIONE-NETO et al. 2013). Na larvicultura de camarão marinho o uso de probiótico Lactobacillus plantarum tem sido promissor. Em estudo desenvolvido por Vieira (2010) larvas de Litopenaeus vannamei alimentadas com dietas suplementadas com a bactéria probiótica apresentaram maior índice de sobrevivência, maior atividade natatória e menor presença de necroses durante a larvicultura.

50 50 O uso dos ácidos orgânicos isolados na alimentação, com o propósito de manutenção da sanidade intestinal de animais aquáticos, se justifica pela ação inibitória de ácidos acético e lático produzidos por uma bactéria do gênero Lactobacillus contra bactérias patogênicas no trato gastrointestinal de linguado Scophthalmus maximus (VASQUEZ et al., 2005). Em avicultura e suinocultura o potássio diformiato (KDF) já é utilizado com frequência, sendo a primeira substância promotora de crescimento não-antibiótica aprovada pelo Conselho Europeu (NG et al., 2009). Os ácidos orgânicos e seus sais, além da ativa inibição do crescimento, principalmente de bactérias Gram-negativas (DEFOIRDT et al., 2009), podem ter efeitos sobre o metabolismo, influenciando na produção e ação de enzimas digestivas (LÜCKSTÄDTS, 2008) e melhorando a absorção de minerais pelo intestino (HOSSAIN et al., 2007). Silva (2014) comprovou em testes in vitro e in vivo em sistema de engorda de camarão branco do pacífico Litopenaeus vannamei, a eficácia de sais orgânicos no aumento de atratividade do alimento, da produção de enzimas digestivas ou melhoria na ação das mesmas, na inibição do crescimento de bactérias vibrionáceas e no aumento da digestibilidade de nutrientes. Dentre os sais testados na alimentação, o que apresentou melhores foi o butirato de sódio. O objetivo do presente estudo foi avaliar os parâmetros zootécnicos e observar a integridade morfológica do trato intestinal de pós-larvas de camarões cultivados em sistema convencional de préberçário alimentadas com ração suplementada com probiótico Lactobacillus plantarum, butirato de sódio e a soma de probiótico e butirato de sódio. 16 MATERIAL E MÉTODOS 16.1 Delineamento experimental O experimento foi conduzido na sala de experimentos de larvicultura e pré-berçário do Laboratório de Camarões Marinhos LCM-UFSC, no período entre 06/11/2013 e 20/11/2013. Foram utilizados 16 tanques com fundo em U e capacidade útil de 60L, providos de aeração e aquecimento.

51 Cada unidade experimental foi povoada com pós-larvas 5, em água previamente adicionada de microalga Nannochloropsis oculata na concentração de 10x10 4 cel/ml. Os parâmetros de oxigênio e temperatura foram aferidos duas vezes ao dia com oxímetro (YSI, modelo Pro 20) e potencial hidrogeniônico (ph) uma vez ao dia com peagâmetro (YSI, modelo Professional Plus). As renovações foram feitas com água marinha com volume de 50% nos dias 4, 7 e 10 de cultivo e a amônia total medida periodicamente pelo método colorimétrico de APHA (1995). Os parâmetros de qualidade de água ficaram dentro dos níveis aceitáveis para a espécie, sendo, amônia toxica próximo de zero, temperatura média 28ºC ±1, ph médio 8±0,5 e oxigênio dissolvido acima de 5mg/L (BOYD; GAUTIER, 2000). Os tratamentos consistiam: alimentação suplementada com 2% de butirato de sódio, alimentação suplementada com L. plantarum 1x10 8 UFC/g de ração, alimentação suplementada com 1x10 8 UFC/g de ração de probiótico + 2% de butirato e alimentação sem suplementação. A bactéria probiótica Lactobacilus plantarum (Vieira et al. 2013) foi repicada em tubo de ensaio contendo 9mL de meio de cultura Man Rogosa e Sharpe (MRS) caldo e incubada a 35 C por 48hs. Em seguida repicada em frasco com 90mL de meio de cultura alternativo para bactérias probióticas (30g/L de soro de leite, 20g/L sacarose e 30g/L de cloreto de sódio) e incubadas a 35 C por 24hs. Após atingir a concentração média de 1x10 7 UFC/mL através da leitura da absorbância o probiótico foi reservado em câmara fria por no máximo 24 horas para serem utilizados na concepção dos tratamentos. O butirato de sódio foi diluído em meio de cultura e implantado na ração com 10mL/g. O tratamento com interação de probiótico e butirato foi concebido através da diluição do butirato de sódio em solução de probiótico. A ração controle foi adicionada com 10mL/g de ração de meio de cultura. Os tratamentos foram aspergidos na ração que foi seca em dessecador sem sílica por 4 a 6 horas sob vácuo. Em seguida passou pelo processo de fermentação, incubada em estufa a 35ºC por 12 horas e então aspergida com óleo de peixe na concentração de 40mL/Kg de ração e novamente submetidos a vácuo por 4 a 6 horas. Todo volume de ração tratada foi armazenada sob refrigeração em frascos de borosilicato. As larvas foram alimentadas nove vezes ao dia com ração e dose pertinente ao tempo larval, preparadas com os tratamentos. Foram feitas três remessas de ração ao longo do experimento. 51

52 Análise microbiológica Para a análise microbiológica, alíquotas de pós- larvas 20 foram retiradas, contadas, pesadas, lavadas com água destilada, maceradas e semeadas em meio de cultura Ágar Marine (contagem total de bactérias), Ágar Tiossulfato Citrato Bile Sacarose (TCBS, para Vibrio spp.) e Ágar de Man Rogosa e Sharpe (MRS, para bactérias ácidoláticas). Após incubadas a 30ºC, as colônias bacterianas crescidas em TCBS e Marine por 24hs e MRS por 48hs foram contadas em unidades formadoras de colônia (UFC) e ajustadas para UFC/g de pós-larvas. Para o teste de viabilidade da bactéria probiótica na ração, utilizou-se 1gr de ração macerada semeada em meio MRS e incubada a 35ºC por 48 horas Teste de estresse e parâmetros zootécnicos Para o teste de estresse foram recrutadas 50 pós-larvas por unidade e desafiadas em salinidade 0 ppt por 45 minutos, devolvidas à salinidade de 35 ppt por mais 45 minutos e contabilizada a sobrevivência. A sobrevivência final foi calculada através de uma biometria úmida de pelo menos 100 larvas e multiplicada pelo peso total de larvas despescada de cada tanque, subtraindo da quantidade de larvas povoadas no início do experimento. Para o peso seco foram utilizadas placas de Petri previamente secas e pesadas, onde foram colocadas 100 larvas. Estas larvas foram secas em estufa de secagem à temperatura de 100º C por uma hora e pesadas em balança de precisão BEL SSR 3000 S. Um total de trinta larvas por unidade experimental foi medido através de estereomicroscópio NIKON SMZ-745 com lente reguada ao aumento de 0,6x, no Laboratório de Peixe Marinho LAPMAR - UFSC Análise microscópica Os tecidos foram fixados em solução de Davidson marinho por h e transferidos para a solução de álcool 70%. A cabeça e os últimos segmentos abdominais foram seccionados com navalha e então, foram submetidas ao procedimento padrão de histologia, com desidratação, diafanização e inclusão em parafina.

53 53 Os blocos resultantes foram cortados com 5 µm de espessura para posterior coloração com hematoxilina de Harris e Eosina (HOWARD et al., 2004; KIM et al., 2006) e observadas em microscópio Análises estatísticas Os dados de sobrevivência e mortalidade foram transformados em arco seno e os dados de contagem bacterianas transformados em Log 10. Os dados foram analisados, após as premissas de normalidade e homocedasticidade, por análise de variância bifatorial, suplementadas pelo teste de Tukey de separação de médias, ambos ao nível de significância de 5%. 17 RESULTADOS E DISCUSSÃO Embora tenha havido crescimento de bactérias ácido-láticas na ração, com magnitude de 5,94x10 6 UFC/g (com butirato) e 4,22x10 6 UFC/g (sem butirato) após dois dias de armazenamento, não houve crescimento de bactérias ácido-láticas na cultura de macerado das póslarvas 20 em MRS, em nenhum dos tratamentos. As contagens de bactérias totais e presuntivas de vibriões não diferiram entre os tratamentos (Tabela 3). A ausência de crescimento de bactérias ácido-láticas no macerado de larvas tratadas com probiótico pode ser a causa de não encontrarmos diferença no crescimento de vibriões, já que diversos trabalhos indicam a eficácia da suplementação com probiótico para este fim. Em juvenis de Farfantepenaeus brasiliensis, três probióticos comerciais apresentaram menor contagem de vibriões após administrados na água de cultivo por 30 dias em sistema de troca zero de água (SOUZA et al., 2012). Ramirez et al., 2013 comprovaram que o uso de L. plantarum suplementado na ração por seis semanas em juvenis de L. vannamei, diminui a contagem de vibriões no trato gastrintestinal e aumenta o título aglutinante do soro contra Vibrio alginolyticus. O comprimento entre o ápice do rostro e o ápice do télson não foi diferente entre os tratamentos. O grupo tratado com a suplementação de probiótico na ração obteve menores índices de sobrevivência ao teste de estresse (Figura 7) e não corrobora com os trabalhos já publicados. Buglione-Neto et al. (2008) demonstraram que, pós larvas de L vannamei alimentadas com dieta suplementada com L. plantarum em pré-berçário, obtiveram melhor sobrevivência ao teste de estresse e a infecção experimental em relação ao tratamento controle.

54 54 Em larvicultura de L. vannamei alimentada com dieta suplementada com L. plantarum, pós-larvas 5 apresentaram melhor sobrevivência à infecção experimental com Vibrio harveyi (VIEIRA, 2010). A sobrevivência das larvas foi superior nos grupos alimentados com ração suplementada com butirato 2%, porém o peso seco médio foi menor nesse grupo (Tabela.3). Isso pode ser explicado porque havendo maior densidade, há maior competição pelo alimento, já que as refeições foram ofertadas em quantidade igual em todas unidades experimentais, não considerando a mortalidade ao longo do cultivo. Este resultado corrobora os resultados de Silva et al. (2013), que demonstraram que dietas suplementadas com sais orgânicos aumentam a sobrevivência de camarões marinhos na fase de engorda. Figura 6 Percentual de sobrevivência ao teste de estresse por salinidade de póslarvas 20 de camarão Litopenaeus vannamei cultivados em pré-berçário e alimentados com ração suplementada de butirato de sódio 2%, probiótico Lactobacillus plantarum 1x10 8 UFC/g e butirato de sódio 2%+ probiótico L. plantarum 1x10 8 UFC/g. Letras distintas indicam diferença significativa nas médias pelo teste de Tukey (p<0,05). Em contrapartida, o uso do probiótico proporcionou a mesma sobrevivência que o controle, diferente dos resultados de Zeaied-Nejad et al. (2006), onde a administração de Bacillus spp. melhorou a

55 sobrevivência de pós-larvas de Fenneropenaeus indicus que receberam o probiótico diretamente na água entre PL30-PL120. A análise qualitativa dos cortes histológicos da porção média do trato intestinal das pós-larvas, mostrou que as estruturas encontradas foram semelhantes às encontradas em animais adultos (BELL e LIGHTNER, 1988) (Figura 7). 55

56 Sobrevivência (%) 73,30±2,14b 89,30±0,70a 65,05±2,75b 81,03±10,27a 0,1040 0,0040 0,8836 Teste de estresse (%) 90,35±1,28a 92,05±1,38a 84,11±6,04b 82,99±2,99b 0,0149 0,9105 0, Tabela 4 - Dados zootécnicos e microbiológicos do cultivo em pré-berçário experimental de camarões marinhos da espécie Litopenaeus vannamei alimentados com ração suplementada de butirato de sódio 2%, probiótico Lactobacillus plantarum 1x10 8 UFC/g e butirato de sódio 2%+ probiótico L. plantarum 1x10 8 UFC/g. Controle Butirato de sódio Probiótico Probiótico+ Butirato p do probiótico p do butirato p da interação Biometria Seca Individual (mg) Contagem de vibriões (UFC/g) Contagem de bactérias totais (UFC/g) Tamanho da larva (mm) 1,52±0,13a 1,34±0,2b 1,51±0,16a 1,37±0,05b 0,4259 0,0043 0,5153 1,01x10 6 6,08x10 5 8,51x10 5 3,05x10 ±1,58x10 6 ±1,96x10 5 ±7,28x ±4,92x10 5 0,7826 0,9380 0,0306 2,38x10 7 3,14x10 7 3,42x10 7 4,38x10 7 ±1,12x10 7 ±3,21x10 7 ±1,44x10 7 ±3,53x10 7 0,0445 0,4112 0, ,28±0,54 12,49±0,99 11,99±0,44 12,29±0,41 0,4640 0,4375 0,8939 Letras distintas indicam diferenças pelo teste de Tukey de separação de médias (p<0,05).

57 57 Figura 7 Cortes histológicos do intestino médio de PL 20 de camarão marinho sob microscopia de luz, tratados com BUT=tratamento com butirato de sódio 2%; PRO=tratamento com probiótico Lactobacillus plantarum 1x10 8 UFC/g de ração; MIX=tratamento com butirato de sódio 2%+ probiótico L. plantarum 1x10 8 UFC/g de ração e CTL=controle. Epi=Epitélio intestinal e Mcl= Musculo Circular e Longitudinal com estrutura íntegra e Lum=Lúmem intestinal contendo alimento. 18 CONCLUSÃO A suplementação com butirato de sódio na concentração de 2% aspergido na ração aumenta a sobrevivência no cultivo de pós-larva 5 até pós-larva 20 do camarão marinho L. vannamei sem causar alteração morfológica em intestino médio das pós larvas 20, não sem apresentar iteração com o uso de probióticos. 19 REFERÊNCIAS ANDREATTA, E.R; BELTRAME, E. Cultivo de camarões marinhos. In: Poli, CR.; Poli, A.T.B.; Andreatta, E.R.; Beltrame E. Aqüicultura: Experiências brasileiras. Multitarefa Editora Ltda.:, 2004.

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61 61 20 CONSIDERAÇÕES FINAIS A dificuldade na padronização de métodos experimentais que imitem situações reais de cultivo é grande, proporcionando um desafio a mais nos estudos da ciência animal. Dificuldade essa que se torna maior quando utilizados animais de pequeno tamanho e técnicas ainda desconhecidas. Neste trabalho foram reunidas as dificuldades, e buscouse efetua-lo da melhor maneira possível. Resultados referentes à utilização de ácidos orgânicos e seus sais em carcinicultura marinha são escassos, principalmente em larvicultura e pré-berçário, o que dificulta a discussão sobre o assunto. Este trabalho possui pioneirismo e mais estudos devem ser feitos para responder perguntas a este novo artifício para o cultivo de camarões marinhos. O uso do propionato na larvicultura podia ser testado aplicado na dieta, aumentando sua frequência de administração e diminuindo a quantidade de propionato a ser usada. Esta ação poderia melhorar a produtividade e diminuir a contagem de bactérias vibrionáceas no intestino das póslarvas. Apesar da eficácia de inibição de crescimento de vibriões em testes in vitro, veículos, doses e forma de aplicação de sais orgânicos devem ser investigadas, pois estas variáveis podem ser a diferença na busca do efeito esperado sem causar danos a produção. O uso de probióticos por sua vez já é sacramentado como excelente ferramenta de controle de agentes patogênicos e melhoria na produção, porém, a bactéria probiótica, sua concentração e a forma e a duração da aplicação não são padrão para todas as regiões e tipos de cultivo, requerendo também estudos frequentes e intensivos nas fases de larvicultura e pré-berçário de camarões marinhos. Em contrapartida, o uso de antibióticos é cada vez menos recomendado pelos pesquisadores, já que pode trazer danos ao ambiente e resultados semelhantes ao seu uso podem ser obtidos pelos métodos supracitados.

62 62 21 REFERÊNCIAS DA INTRODUÇÃO ANDREATTA, E.R; BELTRAME, E. Cultivo de camarões marinhos. In: Poli, CR.; Poli, A.T.B.; Andreatta, E.R.; Beltrame E. Aqüicultura: Experiências brasileiras. Multitarefa Editora Ltda.: Florianópolis, SC, ANDREATTA, E.R. Comunicação pessoal, BARBIERI, R. C. J.; OSTRENSKY, A. N. Camarões marinhos Reprodução, maturação e larvicultura. Viçosa: Aprenda Fácil. 255p, BARUAH, K. et al. Dietary protein level, microbial phytase, citric acid and their interactions on bone mineralization of Labeo rohita (Hamilton) juveniles. Aquaculture Research, v. 36, p , BARUAH, K. et al. S. Interactions of Dietary Microbial Phytase, Citric Acid and Crude Protein Level on Mineral Utilization by Rohu, Labeo rohita (Hamilton), Juveniles. Journal Of The World Aquaculture Society, v. 38 (2), p , BATICADOS, M. C. L. et al.. Studies on the Chemical Control of Luminous Bacteria Vibrio harveyi and Vibrio splendidus Isolated from Diseased Penaeus monodon Larvae and Rearing Water. Diseases of Aquatic Organisms, v. 9, n. 2, p , Oct BUGLIONE NETO, C. et al. Avaliação de bacterina e Lactobacillus plantarum frente à infecção experimental por Vibrio harveyi em póslarvas de Litopenaeus vannamei. Brazilian Journal of veterinary Research and Animal Science, v. 45, suplemento, p , CARDOSO, E. J. B. N.; NOGUEIRA, M. A. A rizosfera e seus efeitos na comunidade microbiana e na nutrição de plantas. In: Silveira, A. P. D.; Freitas, S. S. (org.). Microbiota do solo e qualidade ambiental. Campinas: Instituto Agronômico, p.78-96, 2007 CASTEX, M. et al. Effect of probiotic Pediococcus acidilactici on antioxidant defences and oxidative stress of Litopenaeus stylirostris

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69 69 ANEXO I: Sala de experimento e as unidades experimentais com aeração e aquecimento constante.

70 70 ANEXO II: Distribuição da dose diária de alimento para as unidades experimentais.

71 71 ANEXO III Maceramento, diluição e plaqueamento das larvas para análise microbiológica.

72 72 ANEXO IV Método de medição de pós-larvas em estereomicroscópio.

73 73 ANEXO V Despesca e coleta de dados para análise.