DETERMINAÇÃO DE PATULINA EM MAÇÃS COMERCIALIZADAS EM FREDERICO WESTPHALEN/RS

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1 DETERMINAÇÃO DE PATULINA EM MAÇÃS COMERCIALIZADAS EM FREDERICO WESTPHALEN/RS R. C. Silva 1, J. D. Miotto 1, I. R. Pizzutti 2 e D. M. Souza 2 1-Departamento de Ciências da Saúde Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões, Campus de Frederico Westphalen, CEP: Frederico Westphalen RS Brasil, Telefone: 55 (55) (rosselei@uri.edu.br) 2-Departamento de Química, Universidade Federal de Santa Maria, Campus Santa Maria, CEP: Santa Maria RS Brasil, Telefone: 55 (55) (pizzutti@quimica.ufsm.br) RESUMO Composta por substâncias orgânicas, nutrientes e elevada quantidade de água, a maçã é propensa à contaminação por fungos, os quais podem produzir, durante seu metabolismo, substâncias tóxicas, mais conhecidas como micotoxinas. Dentre as micotoxinas existentes, uma das mais importantes é a patulina, a qual é produzida principalmente pelo fungo Penicillium expansum, e encontrada principalmente em maçãs maduras e em seus derivados. Experimentos em animais de laboratório demonstraram que esta micotoxina produz diversos efeitos nocivos, incluindo mutagenicidade, teratogenicidade e carcinogenicidade. Assim, esse estudo objetivou avaliar a presença de patulina em maçãs comercializadas nos supermercados do município de Frederico Westphalen/RS, empregando Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detecção por Arranjo de Diodos (CLAE- DAD). O limite de quantificação do método empregado foi de 40 µg kg - 1, e das 25 amostras analisadas, 28% ultrapassaram o Limite Máximo Tolerado de 50 g kg -1, preconizado pela legislação nacional vigente. ABSTRACT Apples are composed by organic substances, nutrients and high water content, being suscetible to contamination by fungus, which can produce mycotoxins during their metabolism. One of the most important mycotoxin is Patulin (PAT), which is produced mainly by the fungus Penicillium expansum, and found mainly in apples and their derivatives. Experiments performed in lab with animals have shown that this mycotoxin produces several adverse effects, as teratogenicity, mutagenicity and carcinogenicity. Thus, this study aimed to evaluate the presence of PAT in apples sold in supermarkets in the city of Frederico Westphalen/RS, using high-performance liquid chromatography with diode array detection (HPLC-DAD). The method quantification limit was 40 µg kg -1 and 25 samples were analyzed, which 28% exceeded the Maximum Tolerated Limit of 50 µg kg -1, established by the national legislation (ANVISA). PALAVRAS-CHAVE: maçã; micotoxina; patulina; CLAE-DAD. KEYWORDS: apple, mycotoxins, patulin; HPLC-DAD. 1. INTRODUÇÃO A maçã (Malus domestica) é uma das frutas mais consumidas no mundo, devido a sua facilidade no cultivo e na colheita, além de ser rica em vitaminas, sais minerais e fibras. Essa fruta é composta por substâncias orgânicas, inúmeros nutrientes e água, o que torna o meio favorável para o

2 crescimento microbiano. Se não houver um controle rigoroso de qualidade dessa fruta, a mesma se torna suscetível ao desenvolvimento fúngico, o qual poderá produzir, durante seu metabolismo, substâncias tóxicas (micotoxinas), as quais, se ingeridas, podem causar sérios riscos à saúde (MAHFOUD, 2003). Segundo a Organização das nações Unidas para Agricultura e Alimentação (FAO, 2003), as micotoxinas são toxinas produzidas por fungos filamentosos, as quais podem entrar nas cadeias alimentares, humana e animal, por meio de contaminação direta que ocorre quando o produto, o alimento ou a ração, se torna contaminado por um fungo toxigênico, com posterior formação de micotoxinas, ou pode acontecer indiretamente quando um ingrediente qualquer foi previamente contaminado por um fungo toxigênico. Mesmo que o fungo tenha sido eliminado durante o processamento, as micotoxinas ainda permanecerão no produto final, devido a isso se faz necessário um alerta para os possíveis riscos da ingestão de micotoxinas (FRISVAD, 2004). Segundo Mahfoud (2003), dentre as micotoxinas existentes, encontra-se a patulina, que é encontrada, principalmente, em maçãs maduras utilizadas na produção de suco de maçã concentrado ou derivados de maçã, e também pode estar presente em outras frutas como laranja e pêra, de acordo com Alves (2000). O fungo desenvolve-se em partes da fruta danificada mecanicamente ou por pragas, porém pode estar presente também em frutas visivelmente sadias (JACKSON, 2003). A patulina é produzida por diferentes gêneros e espécies de fungos (PITTET, 2001), como Penicillium, Aspergilluse Byssochylamys, mas principalmente pelo Penicillium expansum (CAST, 2003). Hefnawy e Abou-Zeid (2003) afirmam que o Penicillium spp é o fungo toxigênico de maior incidência em maçãs, considerado um parasita de ferimentos, cresce em meio com atividade de água entre 0,83 e 0,99, e tem a capacidade de tolerar até 80% de sacarose no meio de crescimento, causando podridão de coloração azul na parte externa da maçã, e bege ou marrom-clara no tecido, deixando o fruto aguado e mole. Vários estudos sobre a ocorrência de patulina em alimentos têm sido realizados, os quais indicam que essa micotoxina apresenta potencial carcinogênico, mutagênico e teratogênico. Assim torna-se necessário alertas para os possíveis riscos à saúde vinculados à ingestão diária dessa micotoxina por meio do consumo, principalmente, de maçãs e seus produtos derivados (SCHUMACHER, 2005). Devido à alta polaridade e a baixa estabilidade da patulina em soluções alcalinas, a sua determinação torna-se difícil, uma vez que existe a elevada probabilidade de degradação da micotoxina em cada etapa do processo analítico. Nesse estudo, a presença da patulina foi determinada por CLAE-DAD, que, conforme Aktas (2004), é uma técnica que proporciona bons resultados. Assim, a presente pesquisa propôs determinar a presença de patulina em maçãs comercializadas em cinco supermercados da cidade de Frederico Westphalen/RS e comparar os resultados frente à legislação nacional vigente RDC nº 07/2011 (BRASIL, 2011), a qual tolera concentrações de patulina em maçãs e derivados de até 50 µg kg MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Coleta As coletas foram realizadas entre os meses de março e maio do ano de 2012, quinzenalmente, em cinco supermercados do município de Frederico Westphalen, situado na região norte do Rio Grande do Sul, perfazendo um total de 5 coletas e 25 amostras. Foram coletados, aproximadamente, 2 kg da fruta por supermercado, em cada coleta. As frutas foram escolhidas conforme a espécie disponível e aleatoriamente, respeitando os critérios de amostragem, conforme Cecchi (2003).

3 As amostras foram armazenadas em local e temperatura semelhantes às dos supermercados até o momento da análise, a fim de reproduzir as mesmas condições em que as maçãs ficariam expostas nos estabelecimentos, até a aquisição dos consumidores. 2.2 Métodos As amostras de maçã foram trituradas a fim de promover uma mistura homogênea; em seguida foi realizada a etapa de extração da patulina, a qual consistiu em retirar uma porção de 10 g da amostra, colocá-la em um frasco de vidro, adicionar 10 ml de acetato de etila, 30 L de ácido acético e 4 g de Na 2 SO 4. Esse extrato foi deixado em repouso por 15 minutos, e depois centrifugado por 2 minutos, a 2000 rpm. Realizada a extração, foi feita então a purificação das amostras, onde se retirou 4 ml do sobrenadante centrifugado e adicionou-se 0,6 g de Na 2 SO 4 e 0,1 g de sílica. As amostras foram novamente centrifugadas por 2 minutos, a 2000 rpm. Posteriormente, retirou-se uma alíquota de 2 ml, a qual foi utilizada na etapa de evaporação do extrato no banho-maria à 40 ºC, utilizando N 2. Após, o resíduo foi ressuspendido com 500 µl de etanol e em seguida foi determinada a concentração de patulina por CLAE-DAD. O tempo de retenção da patulina foi de 5,3 minutos. A fase móvel utilizada foi água: acetonitrila 95:5 (v/v) com vazão de 1,5 ml min -1. O volume de injeção foi de 50 µl. Para a separação cromatográfica empregou-se coluna Xterra RP18 (5 µm, 4,6 mm x 250 mm, Waters). CLAE Merck Hitachi L-600A Pump com detector DAD-L-7450 (LaCrhom Merck-Hitachi). O comprimento de onda empregado foi de 277 nm. 3. RESULTADOS E DISCUSSÕES O limite de quantificação do método (LQ m ) empregado foi de 40 µg kg -1, o qual corresponde a menor quantidade do analito presente em uma amostra que pode ser detectado e quantificado sob as condições experimentais estabelecidas. Na Figura 1, tem-se o cromatograma obtido para amostra branco de maçã fortificada na concentração de 40 µg kg -1. Figura 1 Cromatograma obtido para amostra fortificada com patulina na concentração de 40 g kg -1. Desta forma, o LQ m obtido é satisfatório. Ademais, a concentração de 50 µg kg -1 foi validada, obtendo-se 97,7% de recupração (n=6) e RSD inferior a 20%.

4 Na Tabela 1 encontram-se os resultados obtidos durante o estudo. Comparando-se os resultados obtidos nesse estudo com o Limite Máximo Tolerado (LMT) pela legislação nacional, pode-se afirmar que as amostras provenientes dos supermercados 1, 2, 3 e 5 apresentaram concentrações de patulina acima dos níveis recomendados pela legislação, com exceção do supermercado 1, na 5ª quinzena do estudo. Também é possível observar, como mostrado na Tabela 1 que os resultados encontrados para os RSD% apresentaram uma excelente média de 7,5%, quando comparado ao Regulamento Técnico Nacional (BRASIL, 2003), o qual preconiza que para concentrações entre 20 e 50 µg kg -1 de patulina, o RSD% deve ser igual ou inferior a 20%. Tabela 1 Concentração de patulina e RSD% obtidos. Supermercado Concentração de patulina encontrada (µg kg -1 ) 1 a quinzena 2 a quinzena 3 a quinzena 4 a quinzena 5 a quinzena 1 ND ND 145,7 + 0,8 ND 44,5 + 9, ,8 + 15,1 ND ND ND 72,3 + 0,3 3 53,2 + 26,4 ND 299,5 + 1,2 ND 69,4 + 4,2 4 ND ND ND ND ND 5 ND 163,2 + 2,8 ND ND ND ND: não detectado Do total de amostras analisadas, 32% das amostras (8) apresentaram resultado positivo para patulina, e destas, 87,5% (que corresponde a 7 amostras do total) apresentaram concentrações acima do LMT estipulado pela legislação nacional. Quanto ao supermercado 4, não foi detectada a presença de patulina em maçãs obtidas durante os dias em que estavam sendo realizadas as coletas para esse estudo. A fim de aumentar a detectabilidade do método analítico, outros estudos estão sendo realizados para analisar maçã e suco de maçã empregando Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência, acoplada a Espectrometria de Massas (CLAE-ES). 4. CONCLUSÃO Estes resultados representam um grande avanço na área de controle de qualidade em alimentos no município de Frederico Westphalen/RS, pois a população frederiquense não possui conhecimento da existência da patulina e pode estar consumindo maçãs com concentrações de patulina acima do permitido pela legislação (28%), as quais podem causar toxicidade e danos à saúde. Devido a isso, se faz necessário alertas para os possíveis riscos à saúde vinculados à ingestão diária dessa micotoxina por meio do consumo de maçãs e seus derivados. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Aktas, A.H. (2004). Determinação de patulina em suco de maçã produzida em Isparta, na Turquia por HPLC com detecção por arranjo de diodos. Journal of Food and Drug Analysis, 12(3),

5 Alves, I., Oliveira, N. G., Laires, A., Rodrigues, A. S., & Rueff, J. (2000). Induction of micronuclei and chromosomal aberrations by the mycotoxin patulin in mammalian cells: role of ascorbic acid as a modulator of patulin clastogenicity. Mutagenesis, 15(3), Brasil, Ministério da Saúde (2003). Dispõe sobre o Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos (Resolução da Diretoria Colegiada RDC n 899 de 29 de maio de 2003). Diário Oficial da União. Brasil, Ministério da Saúde (2011). Dispõe sobre limites máximos tolerados (LMT) para micotoxinas em alimentos (Resolução da Diretoria Colegiada RDC nº 7 de 18 de fevereiro de 2011). Diário Oficial da União. Cast Council for Agricultural Science and Technology. (2003). Mycotoxins: economics and health risks. Ames: Iowa, USA. Task Force Report, 139. Cecchi, H. M. (2003). Fundamentos teóricos e práticos de análise de alimentos. 2 a ed. Campinas: Unicamp. FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations. (2003). World wide regulations for mycotoxins, Frisvad, J.C. (2004). Mycotoxins, drugs and other extrolites produced by species in Penicillium subgenus Penicillium. Studies in Mycology, 49, Hefnawy, M. A., & Abou-zeid, A. M. (2003). Differential adaptation of membranes of two osmotolerant fungi, Aspergillus chevalieri and Penicillium expansum to high sucrose concentrations. Acta Microbiologica Polonica, 52 (1), Jackson, L. S. (2003). Apple quality, storage, and washing treatments affect patulin levels in apple cider. Journal of Food Protection, 66(4), Mahfoud, R. (2003). A micotoxina patulina altera a função de barreira do epitélio intestinal: mecanismo de ação da toxina e efeitos protetores da glutationa. Toxicology and Applied Pharmacology, 181(3), Pittet, A. (2001). Ocorrência natural de micotoxinas em alimentos e rações: uma década em análise. Looyen, 159. Schumacher, D. M., Metzler, M., & Lehmann, L. (2005). Mutagenicity of the mycotoxin patulin in cultured Chinese hamster V79 cells, and its modulation by intracellular glutathione. Archives of Toxicology, 79(2),