UNIVERSIDADE FEDERAL DE RORAIMA CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DEPARTAMENTO DE ZOOTECNIA ILNARA LAURINDO DA SILVA

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE RORAIMA CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DEPARTAMENTO DE ZOOTECNIA ILNARA LAURINDO DA SILVA CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E MICROBIOLÓGICA DE MÉIS DE RORAIMA BOA VISTA, RR 2016

2 ILNARA LAURINDO DA SILVA CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E MICROBIOLÓGICA DE MÉIS DE RORAIMA Trabalho de conclusão de curso apresentado ao Departamento de Zootecnia, como pré-requisito para a conclusão do curso de Bacharelado em Zootecnia, da Universidade Federal de Roraima. Orientadora: Profa. Dra. Gardênia Holanda Cabral BOA VISTA, RR 2016

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4 AGRADECIMENTOS A Deus, em primeiro lugar, que renova minhas forças a cada manhã. Aos meus familiares, que de alguma forma contribuíram para meu desempenho ao longo desses anos, principalmente minha mãe Itelvina Laurindo. Aos meus líderes espirituais, pelas palavras de força e orações. Ao meu namorado Diego Souza, pela ajuda em determinadas atividades, pelo seu amor e carinho, e principalmente pela paciência. À minhas amigas, Sheron e Arlecia, que sempre me ajudaram e incentivaram. À minha amiga Carina Domingos, pelo companheirismo desde a época de escola. A todos os amigos que conheci ao entrar na UFRR, principalmente aos da quarta turma, pelas ajudas e momentos de alegria e descontração. A minha orientadora profa. Dra Gardênia Holanda Cabral, pela sua orientação neste trabalho, pela paciência, pelo amor que tem no que faz, e pela determinação, sempre confiante que tudo ia dar certo, mesmo diante das dificuldades. Aos professores do DZO, que contribuíram para todo o conhecimento que obtive. A Andreia Alencar, por ter aceitado a me auxiliar na parte microbiológica do trabalho, por todo seu tempo dedicado a me ajudar, seu tempo precioso. A Elenilda, por ter aceitado participar da minha banca examinadora. Aos bolsistas do Laboratório de Microbiologia do PRONAT, Suena, Dani e Gizele, que se dispuseram a me ajudar na parte prática e compartilhar seus conhecimentos. A UFRR, que por alguns anos foi minha segunda casa, que me proporcionou o prazer em conhecer a Zootecnia e amar esse ramo da Ciência Animal.

5 Os seus ensinamentos são mais doces do que o mel, mais doces até do que o mel mais puro. (Sl 19:11b)

6 RESUMO A apicultura é uma atividade apreciada desde a antiguidade, sua evolução no Brasil vem ocorrendo desde o ano de O mel é um dos produtos apícolas mais utilizados mundialmente, e como é um alimento de origem animal sua fiscalização é realizada pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento. Este trabalho teve como objetivo caracterizar os méis das regiões de Roraima: Alvorada (Boa Vista), Serra da Moça (Amajari), Novo Paraiso (Rorainópolis) e Cauamé (Boa Vista). O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, composto por quatro tratamentos constituídos pelas amostras de mel (T1 = amostra da Alvorada; T2 = amostra da Serra da moça; T3 = amostra de Novo Paraíso e T4 = amostra do Cauamé). Foi realizada uma Análise de Variância entre as médias dos resultados e onde houve significância, os dados foram submetidos ao teste de Tukey (p<0,05). Os parâmetros físico-químicos analisados foram umidade, ph, cinzas e cor, segundo a metodologia do Instituto Adolf Lutz. A caracterização microbiológica foi realizada através da contagem de coliformes totais, além de bolores e leveduras, segundo a metodologia de semeadura em superfície. Observaram-se nas análises físicoquímicas realizadas os seguintes valores: umidade de 16,4 a 17,8%, ph de 2,91 a 3,93, cinzas ou resíduo mineral de 0,094 a 0,646% e coloração variando de branco a âmbar escuro. As análises microbiológicas detectaram para bolores e leveduras 7,75x10 UFC/g (Alvorada), 1,10x10 2 UFC/g (Serra da Moça), 1,68x10 2 UFC/g (Rorainópolis) e 6,24x10 UFC/g (Cauamé). Os resultados das análises físicoquímicas estavam de acordo com a legislação vigente. As análises microbiológicas foram comparadas com a Resolução nº 15/1994, sendo 50% das amostras (Alvorada e Cauamé) estavam de acordo com os padrões exigidos, mas os méis das regiões Serra da Moça e Novo Paraíso foram considerados impróprios para o consumo humano devido à contaminação por microrganismos. Palavras-chave: Umidade. Cinzas. ph. Bolores. Leveduras.

7 ABSTRACT Beekeeping is an activity enjoyed since ancient times, its evolution in Brazil is from the year Honey is one of the bee products most used worldwide, and how an animal source food its supervision is conducted by the Ministry of Agriculture and Livestock Supply. This study aimed to characterize the honeys of the regions of Roraima: Alvorada (Boa Vista), Serra da Moça (Amajari), Novo Paraíso (Rorainópolis) and Cauamé (Boa Vista). The experimental design was completely randomized, with four treatments consisting of the honey samples (T1 = sample Alvorada; T2 = sample of the Serra da Moça; T3 = sample Novo Paraiso and T4 = sample of Cauamé). One analysis of variance between the average of the results and where there was significance, the data were submitted to Tukey test (p <0.05) was performed. The physicochemical parameters analyzed were moisture, ph, ash and color, according to the methodology of the Adolfo Lutz Institute. Microbiological characterization was performed using total coliforms counts, as well as molds and yeasts, according to the seeding method in surface. Were observed in the physicochemical analyzes the following values: moisture 16,4 to 17,8%, ph 2,91 to 3,93, ash or mineral residue from 0,094 to 0,646% and color ranging from white to dark amber. Microbiological tests detected for yeasts and molds 7,75x10 CFU/g (Alvorada), 1,10x10 2 CFU/g (Serra da Moça), 1,68x10 2 CFU/g (Rorainópolis) and 6,24x10 CFU/g (Cauamé). The results of physicochemical analyzes were in accordance with current legislation. Microbiological analyzes were compared with Resolution No. 15/1994, 50% of the samples (Alvorada and Cauamé) were in accordance with the required standards, but the honeys of the regions Serra da Moça and Novo Paraíso were considered unfit for human consumption due to contamination by microorganisms. Keywords: Humidity. Cinzas. ph. Bolores. Leveduras.

8 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Localização das regiões amostradas Figura 2 - Determinação do grau Brix do mel utilizando um refratômetro de mão Figura 3 - Pesagem e determinação do ph do mel Figura 4 - Determinação de cinzas em amostras de mel Figura 5 - Distribuição do meio de cultura em placas de petri Figura 6 - Classificação da coloração de méis provenientes de Roraima Figura 7 - Figura 8 - Contagem de coliformes emplacas com meio Rha inoculadas com as amostras dos méis analisados Contagem de bolores e leveduras em placas com meio Sb inoculadas com as amostras dos méis analisados... 30

9 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Especificações estabelecidas pela legislação brasileira vigente para composição de mel apícola Tabela 2 - Análises físico-químicas de méis provenientes de Roraima Tabela 3 - Contagem padrão de bolores e leveduras (UFC/g), número mais provável de coliformes a 35º C (NMP/g), determinados em amostras de mel de Apis mellifera... 28

10 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO CARACTERÍSTICAS FISICO-QUÍMICAS DO MEL Umidade ph Cinzas Cor CARACTERÍSTICAS MICROBIOLÓGICAS DO MEL OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS MATERIAL E MÉTODOS ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS DO MEL Determinação da Umidade Determinação do ph Determinação de Cinzas Classificação da Cor ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS DO MEL Preparação dos meios Preparação das amostras Contagem de bolores e leveduras Contagem de coliformes ANÁLISES ESTATÍSTICAS RESULTADOS E DISCUSSÃO ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS Umidade ph Cinzas Cor ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS Coliformes... 28

11 4.2.2 Bolores e leveduras CONCLUSÕES REFERÊNCIAS ANEXOS... 38

12 10 1 INTRODUÇÃO No Brasil, a atividade apícola iniciou-se em 1839 quando o padre Antônio Carneiro trouxe algumas colônias de abelha da espécie Apis mellifera de Portugal para o Rio de Janeiro. Posteriormente, outras raças foram introduzidas através de imigrantes europeus. No entanto, em 1956 houve a introdução da abelha africana (Apis mellifera scutellata), as quais escaparam acidentalmente do apiário experimental e começaram a acasalar com as abelhas europeias, formando assim um hibrido, a abelha africanizada (SILVA, 2007). Em Roraima, as abelhas africanas chegaram na década de 70, sendo encontradas no norte de Roraima em Já na década de 80 foi fundada em São Luiz do Anauá a primeira associação de apicultores de Roraima, a Associação de Apicultores de São Luiz do Anauá - APISAL. Em 1992 foi criada a Associação Setentrional de Apicultores de Roraima - ASA e entre 2000 a 2004 foram fundadas duas novas associações: a dos Apicultores do Cantá - APISCANTÁ e a dos Apicultores do Mucajaí - ASAM. A criação de novas associações está relacionada, principalmente, com a implantação de projetos apícolas pelo Governo do Estado através do projeto Rainha em 2000 e pelo SEBRAE - RR em 2004 através do Projeto APIS (SILVA, 2007). Dentre os produtos provenientes da apicultura como a própolis, a geleia real, a cera, o pólen, rainhas e a apitoxina (veneno), o mel é o mais importante, sendo o principal objeto da exploração apícola brasileira (EMBRAPA, 2003). O crescimento da produção brasileira de mel alcançou 38,4 mil toneladas estimulada pelo aumento de demanda vinda do exterior. Como possui abelhas mais resistentes a doenças e devido sua produção orgânica, o Brasil se posiciona vantajosamente a frente de vários concorrentes. Sendo que as principais regiões produtoras de mel no Brasil são o Sul (49%), o Nordeste (18%) e o Sudeste (17%), representando 84% da produção nacional de mel. Em Roraima a produção de mel tem apresentado um crescimento significativo, ocupando o 20º lugar no ranking nacional, com produção de kg (IBGE, 2014). Por ser um alimento de origem animal, o mel é fiscalizado pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA), que atua como órgão normatizador e

13 11 fiscalizador. Atualmente, a produção e a comercialização do mel de abelhas Apis são regulamentadas pela Instrução Normativa nº 11, Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade do Mel, de 20 de outubro de 2000, do MAPA, onde o mel é definido como um produto alimentício produzido por abelhas melíferas (BRASIL, 2000). A definição dos padrões de identidade e qualidade do mel é de extrema importância. Por isso análises são necessárias, pois a legislação exige que o mel seja denominado segundo sua origem (floral ou melato), e comprovada à qualidade do produto. O mel não pode conter qualquer outro tipo de substancia diferente da sua constituição original, sendo proibida a adição de qualquer produto (BRASIL, 2000). No entanto, sua composição pode variar devido à flora visitada pelas abelhas e as condições climáticas (SODRÉ et al, 2003). O mel pode ser classificado de acordo com sua origem em floral ou de melato, em ambos os tipos as abelhas recolhem a matéria prima, transformam, combinam com substancias específicas, armazenam e deixam maturar nos favos da colmeia. Prioritariamente o recurso utilizado na produção do mel floral é o néctar, secreção das flores cuja composição contém vários açúcares que determinam o valor nutricional da planta para estes insetos. E na produção de mel de melato, as abelhas utilizam excreções de afídeos (ex. pulgões) ou exsudatos extraflorais (BRASIL, 2000). 1.1 CARACTERISTICAS FÍSICO-QUÍMICAS Os requisitos de qualidade físico-química do mel são estabelecidos pelo Ministério da Agricultura e Abastecimento através da Instrução Normativa 11, de 20 de outubro de Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade do Mel (BRASIL, 2000). Este regulamento estabelece como requisitos mínimos de qualidade físico-química para o mel a determinação dos parâmetros indicativos de maturidade (açúcares redutores, sacarose aparente e umidade), de pureza (sólidos insolúveis em água e minerais) e de deterioração (acidez, atividade diastásica e hidroximetilfurfural).

14 12 Uma das preocupações no meio apícola é relacionada ao risco de adulteração do mel. Devido ao receio de adquirir mel adulterado, os consumidores tentam identificar a pureza do mel através de meios populares, preferindo comprar o produto diretamente do produtor, devido à falta de confiança na qualidade do mel (VILCKAS et al., 2001). As características vão depender da composição do néctar da espécie vegetal produtora e da espécie da abelha que o produz, isso vai conferir as características específicas. As análises físico-químicas são realizadas com o intuito de comparar resultados obtidos com os padrões estabelecidos pelos órgãos oficiais nacionais ou internacionais, demonstrando assim a qualidade do mel produzido, e tornando possível a fiscalização. Os padrões físico-químicos de qualidade do mel podem ser observados na tabela 1. Tabela 1 - Especificações estabelecidas pela legislação brasileira para composição de mel apícola Parâmetros Especificação Mel floral Mel de melato Umidade Máximo 20% Açúcar redutores Mínimo 65% Mínimo 60% Sacarose aparente Máximo 6% Máximo 15% Sólidos insolúveis Máximo 0,1% Minerais Máximo 0,6% Máximo 1,2% Atividade diastásica Mínimo 8 na escala de Göthe Acidez Máximo 50 meq/kg HMF Máximo 60 mg/kg Fonte: Brasil (2000) Umidade A água é o segundo maior componente do mel em quantidade, variando de 15 a 21% dependendo do clima, da origem floral e da colheita antes de completar a desidratação. Essa característica pode ser alterada ao se retirar o mel da colmeia, devido às condições de armazenamento após a extração. Caso a umidade esteja abaixo de 17,1% não haverá fermentação do produto, pois as leveduras, em

15 13 qualquer quantidade, não conseguem se multiplicar. Porém, quando a umidade está elevada ocorrerá à fermentação (DENARDI et al., 2005). De acordo com Venturini, Sarcinelli e Silva (2007) a água é considerada uma das características mais importantes na composição do mel devido sua influência na viscosidade, peso específico, maturidade, cristalização, sabor, conservação e palatabilidade. O valor máximo permitido de umidade presente no mel é de 20g/100g (BRASIL, 2000). O método utilizado para determinar o teor de água no mel é a medida do índice de refração, obtido através de um refratômetro e a conversão para o teor de umidade através da Tabela de Chataway (ANEXO 1) ph Apesar da legislação brasileira não indicar os valores de referência de ph para o mel, este é útil como variável para auxiliar na avaliação da qualidade deste produto apícola (WELKE et al., 2008). O ph refere-se aos íons de hidrogênio presentes e pode influenciar na formação de outros componentes, como na produção do hidroximetilfurfural. Sua avaliação também é utilizada para revelar o estado de conservação do mel, indicando se há processos fermentativos ou adulteração (LEAL; SILVA; JESUS et al., 2001). Geralmente os méis são ácidos, pois são formados por ácidos orgânicos voláteis ou inorgânicos como o ácido fosfórico e clorídrico, entre outros (SIMAL; HUIDOBRO, 1984). Por ser ácido (em média de 3,9) o ph também é considerado um importante fator antimicrobiano, pois grande parte dos microrganismos patogênicos necessita para seu crescimento de um ph na faixa de 7,2 a 7,4 (NOGUEIRA-NETO, 1997). Além das considerações feitas anteriormente, o ph do mel é influenciado pela origem botânica, concentração dos diferentes ácidos presentes e minerais como cálcio, sódio, potássio e outros constituintes do produto (CRANE, 1985 apoud ABADIO FINCO; MOURA; SILVA, 2010)

16 Cinzas Um dos parâmetros mais utilizados para determinar a qualidade do mel é o teor de cinzas, pois demonstra a quantidade de minerais presentes (ARRUDA, 2003). No mel encontra-se a maioria dos elementos químicos essenciais para o organismo humano, portanto incluí-lo na dieta tem sido indicado para suprir a deficiência destes elementos. Já foram identificados nos méis K, Na, Ca, Mg, Mn, Ti, Co, Mo, Fe, Cu, Li, Ni, Pb, Sn, Os, Ba, Ga, Bi, Ag, Au, Ge, Sr, Be, Va e Zn (WHITE JUNIOR, 1979 apud SODRÉ, 2005). O teor de minerais nos méis está relacionado com sua origem botânica, sendo que a legislação indica que o mel floral possui menos cinzas, do que o mel de melato (BRASIL, 2000). Cinzas encontradas no mel expressam sua riqueza em minerais, porém teores acima do estabelecido pela legislação indicam adulteração por substancias inorgânicas, como por exemplo, areia, e pólen em excesso, entre outros (MARCHINI; MORETI; OTSUK, 2005). O limite máximo de cinzas no mel floral é de 0,6% e no mel de melato é de até 1,2%, segundo a IN nº11, de outubro de Cor Segundo a IN nº 11 de 2000, a cor do mel pode varia de incolor a pardo-escura, mas a coloração mais aceita no mercado é a clara, os mais escuros possuem essa coloração devido à quantidade elevada de minerais. É preciso ressaltar que durante o armazenamento do mel pode ocorrer o escurecimento do mesmo, e mudanças em suas propriedades organolépticas, que influenciam na qualidade e aroma original. A cor pode ser clara, avermelhada, dourada ou escura, o que irá influenciar e alterar o sabor e aroma, mas não o valor nutritivo (VENTURINI, SARCINELLI E SILVA, 2007). Pesquisas têm mostrado que, quanto mais escuro for o mel maior será a quantidade de minerais, podendo variar de branco aquoso até próximo a preto. Os méis mais escuros podem ter de quatro a seis vezes mais sais minerais que os

17 15 claros, com destaque para o manganês, potássio, sódio e ferro (COUTO; COUTO, 2006). 1.2 CARACTERÍSTICAS MICROBIOLÓGICAS A avaliação microbiológica do mel fornece informações necessárias para conferir as condições de processamento, armazenamento e distribuição para o consumo, vida útil de prateleira e riscos à saúde humana (FRANCO, 2008). A legislação brasileira vigente não considera as análises microbiológicas em mel, portanto não indica as características microbiológicas aceitáveis. Os únicos valores de referência constituem na contagem de bolores e leveduras, além da constatação da presença de coliformes a 35 C e a 45 C. Preconizando apenas as práticas de higiene na manipulação do produto (BRASIL, 2000). Deve-se destacar que as regulamentações que controlam a qualidade do mel consideram apenas este produto proveniente das abelhas (SOUZA et al., 2009). O mel apícola apresenta uma microbiota restrita, devido as condições desfavoráveis para o crescimento e desenvolvimento de fungos e bactérias, proporcionada pelos agentes antibacterianos (FRANCO, 2008). Caracteriza-se ainda, pelo tipo e níveis mínimos de micróbios, que estão associados às suas propriedades naturais e ao controle na indústria. No entanto, as leveduras, bactérias formadoras de esporos e fungos filamentosos podem estar relacionados a deterioração do mel, a produção de enzimas, a toxinas, a conversão metabólica do alimento e a produção de fatores de crescimento (vitaminas e aminoácidos) além de fatores de inibição por microrganismos competidores (SILVA et al., 2008). Quando em meio ácido e com elevada atividade de água e umidade torna-se um ambiente favorável para o desenvolvimento desses bolores e leveduras (FRANCO, 2008). Portanto, é importante observar que a umidade pode modificar a composição do mel, alterando a atividade de água e assim promover a deterioração do mel (DENARDI et al., 2005). Quando em condições de baixa umidade, os microrganismos que são próprios do mel não são patogênicos e nem interferem em sua qualidade. Embora possam

18 16 ser introduzidos no mel através de fonte primária ou secundária, ou seja, quando as abelhas o estão elaborando ou após a coleta do mesmo. A contaminação primária ocorre, por exemplo, através do pólen, do trato digestivo da abelha, da poeira, do ar e das flores (SNOWDON; CLIVER, 1996). A contaminação secundária pode acontecer através do contato com o homem, equipamentos, recipientes, poeira, insetos, animais e da água, da mesma forma como acontece com outros alimentos. Por se tratar de um alimento, a análise da presença de fungos, leveduras e bactérias no mel é importante, pois a quantificação desses microrganismos diz da qualidade microbiológica do mesmo em relação à vida de prateleira e da segurança alimentar, devido à possível presença de agentes patogênicos. Entre os trabalhos desenvolvidos para determinar os microrganismos inerentes ao mel destacam-se o de Martins et al., (2003), e o de Roll et al., (2003), entre outros. Atualmente, a IN nº11 de 2000 regulamenta a identidade e qualidade do mel, porém não estabelece um valor tolerável para presença de bolores, leveduras e coliformes. Deve-se ressaltar que estes são indicativos de má higiene na manipulação. Com o consumo a longo prazo os bolores podem produzir toxinas hepatotóxicas. E os coliformes fecais são considerados índices higiênico-sanitários por causar enfermidades. Em relação à qualidade microbiológica do mel, as legislações brasileiras (BRASIL, 1999; 2000; 2001) e internacionais não exigem a realização de análises microbiológicas, apenas que sejam utilizadas práticas de higiene na manipulação do mel.

19 17 2 OBJETIVOS Visando contribuir com o conhecimento sobre o mel apícola do estado foram elaborados os objetivos abaixo descritos. 2.1 OBJETIVO GERAL Caracterizar físico-química e microbiologicamente os méis apícolas de diferentes regiões do estado de Roraima. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Analisar as características físico-químicas: umidade, ph, cinzas e coloração; Avaliar microbiologicamente as amostras de méis; Relacionar os valores obtidos, com os padrões estabelecidos pelas normas nacionais, indicando a qualidade dos méis analisados.

20 18 3 MATERIAL E MÉTODOS Foram utilizadas quatro amostras de mel provenientes de apiários das seguintes localidades: Alvorada (Boa Vista), Serra da Moça (Amajari), Novo Paraiso (Rorainópolis) e Cauamé (Boa Vista), em Roraima (Figura 1). O mel amostrado foi doado pelos apicultores e proveniente de extração no local (Novo Paraíso e Serra da Moça) ou em Casa do mel (Alvorada e Cauamé) em fevereiro de Os méis foram colocados em potes de vidro esterilizados e cobertos com papel alumínio, para evitar a incidência da luz. Figura 1 - Localização das regiões amostradas Fonte: Google Earth, ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS

21 19 As amostras foram encaminhadas ao laboratório de Bioensaios do Programa de Pós-graduação em Recursos Naturais da UFRR - PRONAT, onde ficaram armazenadas a temperatura ambiente. Neste laboratório foram realizadas as análises físico-químicas: ph, umidade, cinzas e determinação da cor de acordo com IAL (2005) Determinação da Umidade A umidade foi determinada através do método refratométrico de Chataway (AOAC, 2000) realizado com refratômetro da Instrumtemp, com escala de 45 a 82% Brix e resolução de 0,5%. Este é um método indireto, onde se utiliza a medida do índice de refração da amostra, que será convertido em porcentagem de umidade, conforme pode ser visto na Tabela de Chataway (ANEXO 1). O índice de refração depende da temperatura ambiente, sendo geralmente os refratômetros regulados a para 20 C. Após a calibragem do refratômetro segundo seu fabricante, foi colocado uma gota de mel no prisma do equipamento e feita a leitura do grau Brix a 20 C (Figura 2). A partir desta determinação foi encontrado o índice de refração com o auxílio da tabela para conversão de Brix (%) para índice de refração (ANEXO 2). Em seguida se utilizou a tabela de Chataway e através do índice de refração, foi obtida a porcentagem de umidade nos méis estudados. Figura 2 - Determinação do grau Brix do mel utilizando um refratômetro de mão Fonte: MANUAL DE INSTRUÇÕES DO REFRATÔMETRO QUIMIS (2015).

22 Determinação do ph A medida do ph foi realizada com o auxílio do phmetro Tekna, modelo T-1000, previamente calibrado com soluções tampões de ph 4 e 7. O procedimento iniciou com a pesagem de 10 g de cada amostra de mel em triplicata, que foi diluída com auxílio de 25 ml de água destilada em um béquer de 50 ml. Agitou-se o conteúdo até sua homogeneização, que foi deixado em repouso por 10 minutos antes de se proceder a leitura (Figura 3). Figura 3 - Pesagem e determinação do ph do mel (a) (b) Fonte: Arquivo pessoal. Legenda: (a) = pesagem da amostra de mel em balança analítica; (b) = leitura do ph em phametro Determinação de Cinzas Inicialmente, pesou-se 5 g de cada amostra de mel (em triplicata) em um cadinho de porcelana previamente tarado. As amostras foram carbonizadas em chapa aquecedora e depois incineradas em mufla a 600ºC por 8 horas. Após os cadinhos resfriarem em dessecador até a temperatura ambiente, foram pesados para a determinação do resíduo mineral (Figura 4).

23 21 Cálculo: % cinzas: 100 x N = % cinzas m/m P Onde: N = cinzas (g); P = amostra (g). Figura 4 - Determinação de cinzas em amostras de mel (b ) (b ) (c) (a) (d) Fonte: Arquivo pessoal. Legenda: (a) = pesagem das amostras; (b e b ) = carbonização das amostras; (c) = incineração em forno mufla; (d) = resfriamento em dessecador Classificação da Cor A coloração de méis é estabelecida através de método fotométrico, onde a leitura é expressa em nm de acordo com a escala de Pfund (BRASIL, 1981). Porém, a classificação da cor do mel neste trabalho foi realizada mediante apenas a análise visual de cada amostra. Esta característica pode variar de incolor a pardo escuro, segundo a legislação (BRASIL, 2000). 3.2 ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS

24 22 No Laboratório de Microbiologia do PRONAT foram realizadas as análises microbiológicas, para determinar a presença de bactérias e fungos através da contagem de coliformes, bolores e leveduras, além da determinação do mel em gramas. Apesar da legislação atual não impor padrões microbiológicos, os resultados das análises microbiológicas foram comparados com os padrões estabelecidos pela Resolução nº 15/1994, onde é instituída uma quantidade máxima de 1,0x10 2 para a presença de bolores e leveduras, e a ausência de coliformes Preparação dos meios de cultura O meio de cultura Sabouraud Dextrose Agar (Sb) é usado para cultivo de fungos (bolores e leveduras) e bactérias acidúricas. Em relação aos produtos da sua composição, a peptona micológica fornece os componentes nitrogenados, a dextrose fornece energia e devido a sua alta concentração e ph baixo, favorece o crescimento dos fungos e inibição da contaminação por bactérias nas amostras. Para o preparo do meio Sb foi misturado 65 g deste em 1 L de água destilada. A mistura foi autoclavada a 121ºC durante 15 minutos e em seguida distribuída em placas estéreis (cerca de 20 ml/placa) (Figura 5). Após a solidificação do meio, foi realizado o teste de esterilidade, seguido do armazenamento das placas embaladas em sacos plásticos, em geladeira à temperatura entre 2-8ºC. O meio de cultura Agar Hicoliformes Rápido (Rha) é um meio cromogênico utilizado para a detecção e confirmação de Escherichia coli e coliformes totais, com base na reação substrato enzima de amostras de água, usando uma combinação de substratos cromogênicos e fluorogênicos. Este meio contem nutrientes indicadores que ao ser hidrolisado pelas enzimas específicas dos coliformes, provoca uma mudança de cor no meio. Neste caso os coliformes ficam verdes e as E. coli ficam fluorescentes na luz UV. Para o preparo do Rha foi misturado 31,03 g do meio em 1 L de água destilada, que foi autoclavado a 121ºC durante 15 minutos, em seguida distribuído cerca de 20 ml em placas estéreis (Figura 5). Depois de solidificado, foi realizado o teste de esterilidade no meio, seguido do armazenamento das placas embaladas em sacos plásticos, em geladeira à temperatura entre 2-8ºC.

25 23 Figura 5 - Distribuição do meio de cultura em placas de petri Fonte: Google, Preparação das amostras Os materiais utilizados no preparo das amostras (exceto as amostras) foram previamente autoclavados durante 15 minutos a 121 C. O procedimento foi realizado dentro da cabine UV para evitar contaminações externas. As amostras foram homogeneizadas e mantidas em temperatura ambiente. Inicialmente os eppendorfes foram pesados e seus valores anotados. Em seguida foi retirado, com auxílio de uma pipeta volumétrica, 1 ml de cada amostra de mel e pipetada nos eppendorfes, os quais foram pesados novamente para apos ser realizada a conversão do mel gramas, e então foram realizados os procedimentos para a análise microbiológica Contagem de bolores e leveduras Para a detecção de bolores e leveduras, foi retirado das amostras que estavam nos eppendorfes 0,1 ml de mel e inoculado em placas de petri com meio Agar Sabouraud (Sb). A amostra foi espalhada com auxílio de swab por toda a superfície do meio, pela técnica de esgotamento em superfície. As placas foram incubadas, em triplicatas, em estufa de crescimento microbiológico do tipo BOD a 25ºC por 5 dias.

26 24 Após o período descrito, a leitura foi realizada através da contagem de colônias, para determinar o número de unidades formadoras de colônia (UFC.g -1 ) de bolores e leveduras Contagem de coliformes Em placas contendo o meio Rapid Hicoliforme Agar (Rha) foi inoculado 0,1 ml de mel para observação da presença de coliformes. O inóculo foi estriado sobre a superfície do meio com auxílio de swab. As placas foram incubadas, em triplicata, em estufa bacteriológica a 35ºC por 48h com leituras a cada 24h. A leitura foi realizada pela contagem das colônias, conversão de UFC/mL para UFC/g, e enquadramento na legislação. 3.3 ANÁLISES ESTATÍSTICAS As análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa BioEstat 5.0. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, composto por quatro tratamentos constituídos pelas amostras de mel (T1= amostra da Alvorada; T2= amostra da Serra da moça; T3= amostra de Novo Paraíso e T4= amostra do Cauamé). Foi realizada uma Análise de Variância entre as médias dos resultados obtidos nas análises físico-químicas e microbiológicas. E quando houve significância, os dados foram submetidos ao teste de Tukey (p<0,05).

27 25 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados encontrados neste trabalho serão discutidos a seguir, baseandose no que é preconizado na legislação brasileira vigente e por vários autores que também estudaram o assunto. 4.1 ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS As análises foram realizadas em triplicata nos méis amostrados e podem ser observadas na tabela 2. Estes valores foram comparados aos exigidos pela Instrução Normativa 11, de 20 de outubro de Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade do Mel (BRASIL, 2000). Tabela 2 - Análises físico-químicas de méis provenientes de Roraima Amostras ph Cinzas (%) Grau Brix (ºC) Umidade (%) Índice de refração (%) Alvorada 2,91c ± ,094b ± b ±0 17,4b ±0 1,493328b ±0 Serra da Moça 3,10b ± ,122b ± a ±0 16,4c ±0 1,495966a ±0 Rorainópolis 3,93a ± ,646a ± ,5b ±0 17,8a ±0 1,492016b ±0 Cauamé 2,92c ± ,120b ± ,5b ±0 17,8a ±0 1,492016b ±0 Legenda: médias seguidas de letras iguais, na mesma coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de significância Umidade A umidade foi determinada indiretamente através do grau Brix, que não é exigido pela norma vigente para se avaliar a qualidade do mel, porém é utilizado para determinar a umidade (ANEXO 2). Os valores de grau Brix encontrados nas amostras de méis variaram de 80,5 Bx a 82 Bx (Tabela 2). Uma variação semelhante de 77,39 a 79,05 ºBx foi encontrada por Santos; Oliveira (2011) no Ceará.

28 26 A umidade dos méis variou de 16,4 a 17,8%. Portanto, nenhuma amostra encontra-se fora dos padrões exigidos pela legislação (<20%). Farias (2006) determinou a umidade de méis apícolas em Roraima e constatou valores superiores aos deste estudo, tendo variado de 17,2 a 20,8%, algumas amostras que não estavam de acordo com as normas foram coletadas em período chuvoso, com alta umidade relativa do ar ph Para esta característica não há um parâmetro estabelecido pela legislação, e os valores encontrados nas amostras estudadas variaram de 2,91 a 3,93. Uma variação entre 3,35 e 4,5 foi observado no trabalho de Abadio Finco; Moura; Silva (2010). Rodrigues et al., (2005) e Salgado et al., (2008) encontraram uma média de 3,85 e 4,22, respectivamente. Segundo Farias (2006) o ph encontrado em 20 amostras de méis analisadas em Roraima variou de 3,34 a 4, Cinzas Os teores de cinzas determinados nos méis estudados variaram de 0,094 a 0,646% e estão de acordo com a legislação brasileira, que estabelece um valor máximo de 0,6 g/100g para mel floral e até 1,2 g/100g para mel de melato. Farias (2006) também quantificou os teores de cinzas em amostras de mel de Roraima e os valores encontrados foram de 0,1 a 0,6%. Rodrigues et al., (2005) encontraram valores de cinzas no mel de diferentes regiões da Paraíba que variaram entre 0,17 a 0,20%, concluindo que estes valores próximos poderiam ser resultado de uma semelhança entre os solos. Outros autores obtiveram resultados semelhante ao nosso estudo, como Campos et al., (2001) com 0,13% de cinzas em mel floral e 0,28% em mel de bracatinga em Santa Catarina, Sodré et al., (2003) com 0,19% na Bahia e Arruda (2003) com 0,185%, no Ceará.

29 27 A quantidade de cinzas pode contribuir para o escurecimento do mel e está relacionada à sua origem botânica. No entanto, Moura et al., (2014) encontraram um menor teor de cinzas nos méis mais escuros e sugeriram que nos méis mais claros o maior teor de cinzas estaria relacionado a grande quantidade de sólidos insolúveis em água, devido a falhas nas boas práticas apícolas Cor A classificação da cor foi realizada através da comparação visual entre as amostras. A coloração das amostras dos méis analisados apresentou-se de acordo com as normas estabelecidas pelo Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade do mel, variando de incolor a pardo-escura. Ao observar os méis, a classificação da cor de cada amostra foi determinada como: branco (Alvorada), extra âmbar claro (Serra da Moça), âmbar escuro (Novo Paraíso) e âmbar claro (Cauamé) como podem ser visualizados na Figura 6. Figura 6 - Classificação da coloração de méis provenientes de Roraima Fonte: Arquivo pessoal. Seguindo a metodologia que utiliza a escala Pfund, Moreti et al. (2006) encontraram méis de cor âmbar claro em Santa Catarina, Bahia e Tocantins, e âmbar extra claro no Piauí. Vieira et al (2014) observaram várias classes de cores

30 28 em amostras da regiões Centro-sul e Sudeste no estado do Paraná, predominando as cores âmbar claro e âmbar escuro. 4.2 ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS Como a legislação brasileira vigente (BRASIL, 2000) não estabelece padrão para fungos filamentosos e leveduras, os resultados deste trabalho foram comparados com a Resolução nº 15/1994 (BRASIL, 1994), devido à grande importância desses parâmetros para a saúde humana. Os resultados das análises microbiológicas podem ser observados na tabela 3. Tabela 3 - Determinação de microrganismos em amostras de mel de Apis mellifera Amostras Fungos Bactérias (bolores e leveduras UFC/g) (Coliformes a 35 C NMP/g) Alvorada 7,75x10b ±0,58 Ausente Serra da Moça 1,10x10 2 ab ±2,08 Ausente Rorainópolis 1,68x10 2 a ±7,93 Ausente Cauamé 6,24x10b ±1.51 Ausente Legenda: médias seguidas de letras iguais, na mesma coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de significância Coliformes Em todas as amostras analisadas não foi encontrada a presença de coliformes (Figura 7), indicando uma boa prática de manipulação do mel, onde foram tomadas as precauções adequadas de higiene ao longo do processo. Portanto, a qualidade higiênico-sanitária apresentou-se de forma satisfatória quanto ao parâmetro avaliado, sendo considerado apropriado para o consumo humano direto. Estes resultados também podem ser explicados pela composição físico-química dos méis analisados, que apresentaram ph baixo, diminuindo a possibilidade de desenvolvimento desses microrganismos (ALVES et al., 2009). Portanto, a ausência de coliformes pode ter sido favorecida pela faixa de ph encontrada nas amostras, que variou de 2,91 a 3,93, ocorrendo a inibição da sua multiplicação.

31 29 Figura 7 - Contagem de coliformes em placas com meio Rha inoculadas com as amostras dos méis analisados Fonte: Arquivo pessoal. Resultados semelhantes foram constatados por Sodré et al., (2007b) que analisaram méis do Ceará e Piauí, por Silva et al., (2008a) ao avaliarem méis produzidos por pequenos apicultores e méis de entrepostos de Minhas Gerais, por Alves et al., (2009) que estudaram amostras de mel orgânico das ilhas do alto do rio Paraná, por Pires (2011) que verificou a qualidade microbiológica dos méis de abelhas Apis mellifera produzido no Piauí, por Schlabitz; Silva; Souza (2010) que realizou estudo no Rio Grande do Sul e por Santos et al. (2011), que analisou méis no Ceará. Em todas as pesquisas não foi detectada a presença de microrganismos do grupo dos coliformes Bolores e leveduras Em todas as amostras ocorreu o crescimento de pelo menos um dos microrganismos em questão (Figura 8). A amostra de Novo Paraiso apresentou o maior número de leveduras, totalizando 168,8 UFC/g. O desenvolvimento de leveduras no mel ocorre devido a sua tolerância ao meio ácido e altos níveis de sacarose (SODRÉ, 2005). As leveduras osmotolerantes podem levar o alimento à

32 30 fermentação, formando dióxido de carbono e etanol, este podendo ser oxidado em ácido acético e água. O crescimento de apenas leveduras nesta amostra pode ser explicado pelo fato de algumas espécies possuírem ação antagônica, impedindo o crescimento de bolores, que podem ser produtores de micotoxinas que provocam efeitos carcinogênicos e teratogênicos (RAMOS et al., 2010). Figura 8 - Contagem de bolores e leveduras em placas com meio Sb inoculadas com as amostras dos méis analisados Fonte: Arquivo pessoal. Observou-se que 50% das amostras analisadas foram consideradas dentro dos padrões da legislação (1,0x10 2 UFC/g), ou seja, os méis das regiões Alvorada e Cauamé apresentaram 7,75x10 UFC/g e 1,10x10 2 UFC/g, respectivamente. As amostras de méis de Serra da Moça e de Novo Paraíso apresentaram contagem de bolores e leveduras acima do preconizado pela legislação, com valores de 1,10x10 2 e 1,68x10 2 UFC/g, respectivamente. Estes valores são similares aos encontrados por Sereia (2011) na região do Paraná, onde obteve contagens de <10 a 3,8x10 em méis colhidos em boas condições de higiene e de 1,9x10 2 a 1,1x10 3 em méis colhidos sem higiene. Pezente (2011) analisou 29 amostras de méis de Roraima e alguns resultados para bolores e leveduras estavam entre 0 e >1,5x10², sendo encontrado em 12 amostras a presença destes microrganismos acima do padrão, com valores que variaram entre 1,2 a >1,5x10 2 UFC/g. Sodré (2005) também observou uma variação de 1,0x10 UFC/g e 1,7x10 4 UFC/g em 18 amostras de méis do Ceará e entre 1,0x10¹ UFC/g e 3,0x10² UFC/g em 29 amostras de méis do Piauí.

33 31 De acordo com Denardi et al., (2005) o grau de contaminação (>100 UFC/g) pode levar à fermentação do produto se a umidade for superior a 18%. Portanto, o maior problema relacionado com a presença de fungos e leveduras é a fermentação, que resulta do consumo dos açúcares pelas leveduras, com produção de numerosos subprodutos, que podem alterar o paladar e o aroma natural do mel, além de causar problemas a saúde humana. Apesar da Portaria nº 367 de 1997 (BRASIL, 1997) ter sido revogada pela Instrução Normativa nº 11 de 2000 (BRASIL, 2000), as análises microbiológicas foram realizadas tomando como base a Resolução nº 15/1994 (BRASIL, 1994), que estabelece padrões microbiológicos para o mel. De acordo com os resultados encontrados pode-se concluir que, os apicultores precisam melhorar as boas práticas apícolas, com os devidos cuidados higiênicos e sanitários durante todo o processo de manipulação do mel.

34 32 5 CONCLUSÃO As amostras dos méis analisados estavam de acordo com os padrões estabelecidos pela legislação vigente, Instrução Normativa nº 11 de 2000 em relação aos parâmetros físico-químicos. De acordo com a Resolução nº 15/1994, 50% das amostras (Alvorada e Cauamé) apresentaram valores de bolores e leveduras dentro dos padrões. Porém os méis das regiões Serra da Moça e Novo Paraíso foram considerados impróprios para o consumo humano, pois houve elevada contaminação.

35 33 REFERÊNCIAS ABADIO FINCO, F. D. B.; MOURA, L. L.; SILVA, I. G. Propriedades físicas e químicas do mel de Apis mellifera L. Revista Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 30, n. 3, p , jul./set ALVES, E. M. et al. Presença de coliformes, bolores e leveduras em amostras de mel orgânico de abelhas africanizadas das ilhas do alto rio Paraná. Ciência Rural, Santa Maria, v.39, n.7, p , out ARRUDA, C. M. F. Características físico-químicas e polínicas de amostras de méis de Apis melífera L., 1758 (Hymenoptera, Apidae) da região da Chapada do Araripe, município de Santana do Cariri, Estado do Ceará Dissertação (Mestrado em Ciências) - Escola Superior de Agricultura Luis de Queiroz, Universidade Estadual de São Paulo, Piracicaba p. AOAC. Official Methods of Analysis of AOAC International. 17. th. Arlington, v. II. BRASIL. Ministério da Agricultura. Secretaria Nacional de Defesa Agropecuária. Laboratório Nacional de Referência Animal (LANARA). Portaria n 01, de 07 de outubro de Métodos Analíticos Oficiais para Controle de Produtos de Origem Animal e seus Ingredientes: métodos físicos e químicos. Diário Oficial da União, Brasília DF, 13 de outubro de Disponível em: Acesso em: 05 mar BRASIL. Ministério da Agricultura e do Abastecimento. Resolução nº 15/94. Regulamento Técnico Mercosul de Identidade e Qualidade do Mel Disponível em: Acesso em: 14 mar BRASIL. Ministério da Agricultura e do Abastecimento. Resolução nº 56/99. Regulamento Técnico Mercosul de Identidade e Qualidade do Mel Disponível em: 9_RTM%20Identidade%20Qualidade%20Mel_Ata%203_99.PDF. Acesso em: 14 mar BRASIL. Ministério da Agricultura e Abastecimento. Instrução Normativa, nº 11, de 20 de outubro de Disponível em: < Acesso em: 14 mar BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC n.12, de 02 de janeiro de Regulamento técnico sobre padrões microbiológicos para

36 34 alimentos Disponível em: < RDC_12_2001.pdf?MOD=AJPERES>. Acesso em: 14 mar BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Portaria n 367, de 04 de setembro de Disponível em: < ultura.gov.br/arq_editor/file/ministerio/concursos/em_andamento/portarias/port% doc+&cd=1&hl=pt-BR&ct=clnk&gl=br> Acesso em: 14 mar CAMPOS, G. et al. Variação de alguns parâmetros do mel de melato em relação ao mel floral. Revista do Instituto Adolfo Lutz, n.60, v.1, p.59-64, COUTO, R. H. N.; COUTO, L. A. Apicultura: Manejo e produtos. 3. ed. Jaboticabal: FUNEP, 2006 p DENARDI, C. A. S. et al. Avaliação da atividade de água e da contaminação por bolores e leveduras em mel comercializado na cidade de São Paulo-SP, Brasil. Revista do Instituto Adolfo Lutz, v64: EMBRAPA MEIO-NORTE. Produção de Mel: sistema de produção. Versão Eletrônica Jul/2003. Disponível em: Acesso em: 05 mar FARIAS, L. R. Caracterização físico-química de méis de abelhas produzidos em cinco municípios do Estado de Roraima Monografia (Graduação em Química) - Universidade Federal de Roraima, Boa Vista, p. FRANCO, B. D. G. M. Critérios microbiológicos para avaliação da qualidade de alimentos. In: FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos alimentos. São Paulo: Atheneu, p IBGE. Pesquisa pecuária municipal Disponível em: < Acesso em: 30 de mar Instituto Adolfo Lutz. Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 4ª ed, v. 1, São Paulo: Ed. Adolfo Lutz, p. LEAL, V. M.; SILVA, M. H.; JESUS, N. M. Aspecto físico-químico do mel de abelhas comercializado no município de Salvador-Bahia. Revista Brasileira de Saúde e Produção Animal, Salvador, v. 1, n. 1, p , LIEVEN, M. et al. Avaliação da qualidade microbiológica do mel comercializado no extremo sul da Bahia. Revista Baiana de Saúde Pública, Salvador, v. 33, n. 4, p , out./dez

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40 ANEXOS 38

41 39 ANEXO 1 Tabela de Chataway Índice de Refração a 20 o C Umidade (%) Índice de Refração a 20 o C Umidade (%) Índice de Refração a 20 o C Umidade (%) 1, ,0 1, ,0 1, ,0 1, ,8 1, ,8 1, ,8 1, ,6 1, ,6 1, ,6 1, ,4 1, ,4 1, ,4 1, ,2 1, ,2 1, ,2 1, ,0 1, ,0 1, ,0 1, ,8 1, ,8 1, ,8 1, ,6 1, ,6 1, ,6 1, ,4 1, ,4 1, ,4 1, ,2 1, ,2 1, ,2 1, ,0 1, ,0 1, ,0 1, ,8 1, ,8 1, ,8 1, ,6 1, ,6 1, ,6 1, ,4 1, ,4 1, ,4 1, ,2 1, ,2 1, ,2 1, ,0 1, ,0 1, ,0 1, ,8 1, ,8 1, ,8 1, ,6 1, ,6 1, ,2 1, ,4 1, ,4 1, ,0 Fonte: A.O.A.C. (1995)

42 40 ANEXO 2 TABELA PARA TRANSFORMAR DE BRIX (%) PARA ÍNDICE DE REFRAÇÃO (ND) Fonte: MANUAL DE INSTRUÇÕES DO REFRATÔMETRO QUIMIS (2015).