INCIDÊNCIA DE OCRATOXINA A EM CAFÉ TORRADO E MOÍDO E EM CAFÉ SOLÚVEL CONSUMIDO NA CIDADE DE BELO HORIZONTE, MG 1

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1 INCIDÊNCIA DE OCRATOXINA A EM CAFÉ TORRADO E MOÍDO E EM CAFÉ SOLÚVEL CONSUMIDO NA CIDADE DE BELO HORIZONTE, MG 1 Guilherme PRADO 2,*, Marize Silva de OLIVEIRA 2, Fabiana Moreira ABRANTES 3, Luciana Gonçalves dos SANTOS 3, Thaís VELOSO 3, Rita Elaine de Souza BARROSO 4 RESUMO A ocorrência de ocratoxina A foi verificada em amostras de café solúvel e café torrado e moído, comercializados em Belo Horizonte/MG, no período de outubro/1998 a maio/1999. O método usado para a determinação de ocratoxina A foi a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) em combinação com cromatografia de imunoafinidade. Os valores de recuperação e coeficiente de variação de ocratoxina A foram superiores a 73% e inferiores 15%, respectivamente. As amostras de café solúvel e café torrado e moído,

2 continham níveis de ocratoxina A entre 0,31 e 1,78ng/g e 0,99 e 5,87ng/g, respectivamente. Os resultados revelaram que o café não apresenta níveis de contaminação significativos. Palavras-chave: ocratoxina A; café; cromatografia líquida de alta eficiência. SUMMARY INCIDENCE OF OCHRATOXIN A IN ROAST AND GROUND COFFEE AND SOLUBLE COFFEE CONSUMED IN THE CITY OF BELO HORIZONTE, MG. The occurrence of ochratoxin A was measured in soluble coffee samples and roast and ground coffee, market in Belo Horizonte / MG, between october/1998 and may / The method used for determining ochratoxin A was high performance liquid chromatography combined with immunoaffinity chromatography. Recoveries and coefficients of variation of ochratoxin A demonstrated levels above 73% and lower than 15%, respectively. Samples of soluble coffee and roast and ground coffee contained ochratoxin A at levels between 0,31 and 1,78ng/g and 0,99 and 5,87ng/g, respectively. The results showed that the contamination levels found in the coffee were not significant. Keywords: ochratoxin A; coffee; high performance liquid chromatography.

3 1 INTRODUÇÃO A ocratoxina A é um metabólito secundário freqüentemente encontrado como contaminante em alimentos e ração animal. Sua produção ocorre principalmente por Aspergillus ochraceus e Penicillium verrucosum na faixa de 4-31ºC e 12-37ºC, respectivamente, e em atividade de água superior a 0,85 [11]. Um método de controle da contaminação em condições de armazenamento envolve redução do teor de umidade dos grãos ( 15%), diminuindo o crescimento de fungos e a produção de micotoxina [1]. Estudos têm demonstrado que a ocratoxina A tem ação nefrotóxica, teratogênica, carcinogênica, imuno- supressora e está relacionada com a nefropatia endêmica dos Balcãs, doença degenerativa dos rins que afeta exclusivamente população adulta rural. Mais recentemente, foram descritos evidências de uma possível correlação entre ocratoxina A e desenvolvimento de tumores do trato urinário de seres humanos na Bulgária [4, 13, 16]. A ocorrência da ocratoxina A tem sido relatada em uma grande variedade de alimentos: carne de porco e aves [6], cerveja [18], trigo, cevada, aveia, centeio [7, 21], condimentos [14], vinho e suco de uva [29], café verde, torrado e moído, solúvel e bebidas de café [5, 6, 9, 12, 13, 19, 20, 21, 22, 26]. Como esses alimentos fazem parte da dieta normal das populações, a ocratoxina A tem sido detectada em fluidos biológicos como leite humano e plasma [8, 10, 23].

4 Em alguns países da Europa, níveis máximos de ocratoxina A de 5µg/Kg em cereais e 1µg/Kg para alimento destinado à população infantil tem sido sugerido como forma de orientação [25, 27]. No Brasil não existe uma legislação específica para ocratoxina A. A ocorrência natural de ocratoxina A em café verde tem sido relatada em concentrações na faixa de 0,2 a 360µg/Kg [3]. Devido a fatores como distribuição não homogênea da toxina no café, forma de contaminação (inoculação de cepa toxigênica x adição de padrão), níveis de ocratoxina A, metodologia analítica empregada e condições de torrefação, os relatos da estabilidade da ocratoxina A variam de 0 a 100%, provocando uma grande preocupação no consumo dos produtos de café [17, 28]. Considerando a importância econômica desse cereal para o Brasil e o efeito na saúde da população pelo seu consumo, o objetivo desse trabalho foi verificar os níveis de ocratoxina A em café solúvel e café torrado e moído, consumidos em Belo Horizonte/MG, no período 1998/ Amostras 2 MATERIAL E MÉTODOS Amostras de 10 marcas comerciais de café solúvel e de 47 de café torrado e moído foram coletadas durante o período de outubro/1998 a maio/1999 em supermercados da cidade de Belo Horizonte/MG. A partir de 200g 1000g de cada

5 amostra homogeneizada, sub-amostras de 5g 100g foram separadas para análise. 2.2 Padrão de ocratoxina A Foi utilizado padrão da marca Sigma (St. Louis, MO), e determinada a concentração conforme descrito nos métodos de análise da AOAC [2]. Para elaboração da curva de calibração utilizada na quantificação, transferiu-se exatos 200ng de ocratoxina A e diluiu-se para 10mL com fase móvel para cromatografia líquida de alta eficiência: 450mL acetonitrila: 550mL solução 4mM de acetato de sódio / ácido acético (19:1), obtendo-se 0,02ng/µL de ocratoxina A. A partir dessa solução, preparouse, por diluições sucessivas, soluções 0,01, 0,005, 0,0025 e 0,00125ng/µL de ocratoxina A em fase móvel. Todas essas soluções foram passadas em uma unidade de filtração de celulose regenerada de 15mm de diâmetro e 0,45µm de poro, sendo recebidas em frasco âmbar. 2.3 Colunas de imunoafinidade Foram utilizadas as colunas Ochratest da Vicam Inc. (USA), dentro do prazo de validade estabelecido (1 ano) e conservadas a 2 8 C até 30 minutos antes da análise, adaptadas a uma seringa de vidro e conectadas a um sistema de vácuo. 2.4 Determinação de ocratoxina A O método utilizado foi o descrito por PITTET et al [15]. A ocratoxina A foi extraída com metanol : bicarbonato de sódio

6 3% (1:1) e o extrato filtrado em papel de filtro de microfibra de 55mm de diâmetro (vácuo). Seguiu-se uma purificação em coluna de imunoafinidade em um fluxo de 2-3mL/minuto. Após lavagem da coluna com 10mL de água destilada, a ocratoxina A foi eluída com 4mL de metanol. Seguiu-se evaporação até resíduo, em atmosfera de nitrogênio, e resuspensão imediata em 1000µL de fase móvel. Agitou-se em ultrasom por 1 minuto e filtrou-se em membrana de celulose regenerada de 0,45µm de poro. Injetou-se, então, 100µL da amostra (duplicata) e 100µL de cada solução padrão de ocratoxina A (2 repetições). A partir do cálculo da área do pico da ocratoxina A do extrato da amostra e das soluções padrão, foi calculado o teor de ocratoxina A na amostra. 2.5 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) A separação e quantificação da ocratoxina A foi conduzida em um sistema de Cromatografia Shimadzu com detetor de fluorescência (exitação:330nm e emissão: 470nm) e com coluna Shim-pack CLC-ODS RP-18, 5µm 4,6 x 250mm, precedida de pré-coluna Shim-pack G-ODS 5µm 4,6 x 25mm. A coluna foi eluída isocraticamente, à temperatura ambiente, em um fluxo de 1mL/minuto de fase móvel (ver item 2.2). Nestas condições, o tempo de retenção foi aproximadamente 15,6 minutos. Todos os solventes utilizados foram os recomendados para cromatografia líquida e a água foi purificada pelo sistema de ultrafiltração (Barnstead). Durante toda a análise foi borbulhado gás hélio na fase móvel. Para evitar variações no tempo de retenção de ocratoxina A, a fase móvel foi preparada na véspera da análise e deixada durante a noite em um fluxo de 0,2mL/minuto. O ph da fase móvel variou de 3,3 a 3,4.

7 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO A Figura 1 ilustra a alta seletividade da limpeza através da utilização de coluna de imunoafinidade, onde não se observa interferentes próximos ao tempo de retenção da ocratoxina A, permitindo uma quantificação exata e precisa. Dessa forma, confirma-se o mais importante desenvolvimento dos últimos anos na área de procedimentos de limpeza e na quantificação de micotoxinas, que são as colunas de imunoafinidade [24].

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9 Os resultados dos valores de recuperação e coeficientes de variação em café solúvel e café torrado e moído, após adição de ocratoxina A, são mostrados nas Tabelas 1 e 2. As recuperações obtidas variaram de 76,5 87%, na faixa de 1,5 a 10,0ng/g de ocratoxina A adicionada em café solúvel (média 82%). Em café torrado e moído, valores de 73 e 86% de recuperação (média de 80%) foram alcançados quando a concentração de ocratoxina A adicionada era de 8,4 e 4,2ng/g, respectivamente. PITTET et al [15] utilizando a mesma metodologia deste trabalho, encontraram valores de recuperação de % e %, para café torrado e moído e café solúvel, respectivamente, na faixa de 0,5 a 5,0ng/g. TRUCKSESS et al [21] relataram recuperações de 75 a 81% na faixa de 1-4ng/g de ocratoxina A em café torrado, utilizando também cromatografia líquida de alta eficiência e coluna de imunoafinidade. Os valores de coeficientes de variação foram sempre inferiores a 14%. Resultados semelhantes foram descritos por PITTET et al [15].

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11 Os limites de detecção de ocratoxina A em café torrado e moído e café solúvel foram de 0,25ng/g e 0,10ng/g, respectivamente, que são comparáveis aos relatados por NAKAJIMA et al [12] e PITTET et al [15], de 0,10ng/g e 0,20ng/g, respectivamente, para café torrado e moído, utilizando a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e coluna de imunoafinidade como técnica de purificação. As Tabelas 3 e 4 apresentam os resultados da incidência de ocratoxina A em café solúvel e café torrado e moído. Os níveis não foram corrigidos pela recuperação encontrada.

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13 Para café solúvel a faixa de ocratoxina A foi de 0,31-1,78ng/g, com média entre valores positivos de 0,73ng/g. PITTET et al [15] observaram em 75 das 101 amostras analisadas procedentes de diferentes países, níveis de ocratoxina A em café solúvel, na faixa de 0,2-6,5ng/g e média de 1,0ng/g. Na Inglaterra, PATEL et al [13], detectaram em 64 das 80 amostras de café solúvel, valores de ocratoxina A na faixa de 0,1-8,0ng/g. STEGEN et al [19] analisaram 149 amostras de café instantâneo de diversos países da Europa, e a faixa de ocratoxina A detectada foi de ND-27,2ng/g e média de 1,0ng/g. Observa-se que os níveis de ocratoxina A das amostras de café solúvel produzidas e consumidas no Brasil, comparados aos resultados descritos na literatura são relativamente menores, revelando que as industrias têm

14 adotado práticas visando ao controle da qualidade da matéria prima utilizada. No café torrado e moído foi detectada ocratoxina A em 41 das 47 amostras analisadas, em uma faixa de 0,99-5,87ng/g e média de 1,75ng/g. TRUCKSESS et al [21] encontraram ocratoxina A em 9 das 13 amostras de café torrado e moído dos Estados Unidos, na faixa de 0,1-1,2ng/g e média de 0,41ng/g e JORGENSEN [6] detectou ocratoxina A em 10 das 11 amostras analisadas da Dinamarca, em uma faixa de 0,21-3,20ng/g e média de 0,51ng/g. STEGEN et al [19] em um total de 445 amostras de café torrado e moído e 39 de café torrado e moído descafeinado da Inglaterra, verificaram que os níveis de ocratoxina A variaram de ND-8,2ng/g e média de 0,8ng/g. Verifica-se pelos resultados encontrados e comparados com trabalhos similares, que os níveis de ocratoxina A de café torrado e moído consumido no Brasil estão no mesmo nível de países de referência tecnológica. O Joint FAO/ WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA) recentemente reavaliou a toxicidade de ocratoxina A e estimou um nível seguro aceitável de ocratoxina A de 100ng/peso corpóreo / semana [13,19]. Para uma pessoa de 60Kg isso significa 857ng/dia. Se considerarmos o consumo de 4 xícaras de café por dia (24g de café torrado e moído ou 8g de café solúvel) que é o consumo per caput total nos países europeus [19], e o valor médio encontrado de ocratoxina A neste trabalho para café solúvel e café torrado e moído, de 0,73ng/g e 1,75ng/g, respectivamente, a ingestão de ocratoxina A corresponderia a 5,84ng/dia e 42ng/dia. Dessa maneira o consumo de café solúvel e café torrado e moído iria contribuir apenas com cerca de 0,68% e 4,9%,

15 respectivamente, da fonte de ocratoxina A na dieta. Esses resultados indicam que os produtos de café no Brasil não são também, como na Inglaterra [13,19], a maior fonte na dieta de ocratoxina A. 4 CONCLUSÕES Os níveis de ocratoxina A detectados em café solúvel e café torrado e moído não são expressivos em termos de contaminação. Entretanto, esses alimentos devem estar sujeitos a um monitoramento constante pelas autoridades governamentais e indústrias alimentícias. 5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1] ALLDRICK. A.J. The effects of processing on the occurrence of ochratoxin A in cereals. Food Addit. Contam., v. 13, Suppl. p , [2] ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. "Official Methods of Analysis", 16 th ed. Arlington, Virgínia, v. 2, cap. 49, p , [3] BLANC, M.; PITTET, A.; MUNOZ-BOX, R.; VIANI, R. Behavior of ochratoxin A during green coffee roasting and soluble coffee manufacture. J. Agric. Food Chem., v. 46, p , 1998.

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20 1 Recebido para publicação em 28/10/99. Aceito para publicação em 03/07/00. 2 Fundação Ezequiel Dias - Núcleo de Micologia e Micotoxinas. Rua Conde Pereira Carneiro, 80. Gameleira - Belo Horizonte-MG gui@funed.mg.gov.br 3 Bolsistas do CNPq. 4 Farmacêutica - Estagiária da Faculdade de Farmácia / UFMG. * A quem a correspondência deve ser enviada.