Laboratórios Integrados 5B Microbiologia

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1 Laboratórios Integrados 5B Microbiologia Sónia Martins Rita Pacheco Magda Semedo Amin Karmali

2 TÉCNICAS MORFOLÓGICAS, BIOQUÍMICAS E GENÉTICAS DE IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS E FUNGOS. OBJECTIVO Analisar a morfologia das colónias de diferentes estirpes de microrganismos. Realização de testes bioquímicos a duas culturas bacterianas (E.coli e B.subtilis): vermelho de metilo, hidrólise da gelatina, detecção da catalase, hidrólise do amido e metabolismo fermentativo/oxidativo da glucose. Isolamento do DNA de fungos (Coriolus versicolor, Grifola frondosa, Lentinula edodes, Ganoderma lucidium e Cordyseps sinensi) e análise do produto obtido após amplificação por PCR. INTRODUÇÃO Neste trabalho pretende-se avaliar o tipo de crescimento, a forma das culturas e as substâncias, resultantes do metabolismo dos microrganismos em determinadas condições físico-químicas. Estes dados são de grande importância taxonómica e possuem inúmeras aplicações. A identificação de microrganismos tem grande interesse prático nas análises clínicas e no isolamento de microrganismos, para isso são efectuados alguns testes que assentam em diferenças ao nível do metabolismo dos microrganismos em estudo. Estas técnicas não sendo exaustivas ou definitivamente conclusivas podem e devem ser complementadas com outros tipos de ensaios de natureza morfológica, imunológica e genética, quando é necessário maior rigor. As técnicas de Biologia Molecular constituem ferramentas poderosas na identificação eficiente e rápida de estirpes bacterianas e de fungos basidiomicetes. Desta forma, os métodos baseados na reacção de polimerização em cadeia (PCR, polymerase chain reaction ) têm sido introduzidos como procedimento complementar aos testes morfológicos. A técnica de polimerização em cadeia permite a amplificação de uma sequência específica de nucleótidos numa molécula de DNA. Para tal, é necessário usar iniciadores ( primers ) que são oligonucleótidos homólogos às regiões da molécula de DNA que se pretende amplificar. A amplificação consiste em três etapas envolvendo vários ciclos: Etapa 1 - Os iniciadores ( primers ), DNA cromossomal (dupla hélice), deoxi-nucleósidos trifosfatos (dntps) e taq DNA polimerase são misturados. A mistura é aquecida a 94ºC provocando a desnaturação do DNA e a separação das duas cadeias de DNA; 2

3 Etapa 2 - A mistura é arrefecida, permitindo a ligação dos iniciadores (em competição com a cadeia única de DNA cromossomal complementar) às regiões homólogas do DNA cromossomal de dupla hélice; Etapa 3 - A mistura é aquecida a 75ºC e a Taq DNA polimerase catalisa o prolongamento dos iniciadores na direcção 5 3 usando DNA (cadeia única) como molde e incorporando os dntps. Cada ciclo efectivamente duplica o número de moldes. Portanto, após 30 ciclos, a amplificação da região entre os iniciadores hibridizados é enorme. O produto da amplificação por PCR pode ser analisado por electroforese em gel de agarose determinando-se o seu tamanho em Kb. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL Meios de Cultura - Agar Nutriente (A.N. ) - Potato Dextrose Agar (P.D.A.) - Agar nutritivo com amido - Meio de cultura MR-VP - Gelatina nutritiva a 15% (p/v) - Meio de cultura com glucose Microrganismos - Escherichia coli (E.C.) - Bacillus subtilis (B.S.) - Penicillium chrysogenum (P.C.) - Saccharomyces cerevisiae (S.C.) - Pó de biomassa de Coriolus versicolor, Grifola frondosa, Lentinula edodes, Ganoderma lucidium e Cordyseps sinensi Materiais - Caixas de Petri e tubos de ensaio - Tampão de lise C1 - Tampão C4 (C3:C2; 1:4) - Tampão de lavagem CW - Tampão de lavagem C5 - Coluna NucleoSpin 3

4 - Oligonucleótido ITS-4: 5 -TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3 - Oligonucleótido ITS-86: 5 -GTG AAT CAT CAT CGA ATC TTT GAA C-3 - Tampão de PCR (10x concentrado) - Mistura de deoxi-nucleósidos trifosfatos - Taq DNA polimerase - Agarose a 2 % (p/v) - H 2 0 desmineralizada estéril - Fita adesiva - Luvas cirúrgicas Caracterização morfológica das colónias das estirpes inoculadas Proceder à caracterização morfológica das colónias das estirpes fornecidas. Com o auxílio de uma lupa ou de um microscópio, proceda à caracterização morfológica das colónias e do tipo de crescimento das culturas microbianas utilizando os seguintes critérios e terminologia: Forma: puntiforme, circular, irregular. Margem: inteira, ondulada, dentada. Tamanho: grande (aprox. 5 mm), mediana (2-3 mm), pequena (1-2 mm). Superfície: lisa, rugosa. Aspecto: mucosa, seca, opaca, brilhante, transparente. Cor: branco, amarelo, vermelho, etc. Realização de testes bioquímicos de identificação de microrganismos Realize os seguintes testes às estirpes de E. coli. e B.subtillis. Identifique previamente os tubos e caixas de Petri a utilizar. Teste vermelho de metilo a) Inocule as estirpes bacterianas em estudo nos tubos de ensaio contendo meio MR-VP (5ml). b) Incube na estufa a 37ºC, durante 2 dias. c) Adicione algumas gotas de vermelho de metilo a cada um dos tubos. Este teste visa detectar a formação de ácido visualizável pelo aparecimento da cor vermelha a ph inferior a 4.5 (teste positivo). A cor amarela indica uma reacção negativa e portanto, a ausência de ácidos. 4

5 Hidrólise da gelatina a) Inocule as estirpes bacterianas em estudo nos tubos de ensaio contendo gelatina nutritiva a 15% (p/v), por picada central com a ansa (mantendo a ansa com o inóculo na posição vertical e de cima para baixo). b) Incube à temperatura ambiente os tubos inoculados e um tubo controlo contendo apenas o meio, durante 2 a 7 dias. c) Após incubação, observe se ocorreu liquefacção do meio de cultura (teste positivo), certificando-se que no tubo controlo o meio se apresenta sólido. Caso tenha dificuldade em observar a liquefação do meio de cultura, conserve todos os tubos de ensaio no frigorífico a 4ºC, durante 20 a 30 minutos. A liquefacção do meio de cultura deve-se à hidrólise da gelatina, pela acção de proteases importantes no diagnóstico diferencial das bactérias. Detecção da catalase a) Retire com uma ansa um pedaço da cultura em estudo, em meio sólido, e misture com uma gota de água oxigenada (10 volumes) num vidro de relógio. b) Observe e registe atentamente a reacção. A catalase catalisa a hidrólise da água oxigenada em água e oxigénio. Assim, poderá observar a libertação de bolhas de ar no local da mistura na presença de catalase. Hidrólise do amido a) Inocule as estirpes bacterianas em estudo nas placas de Petri contendo agar nutritivo com amido, usando a técnica do risco. b) Incube na estufa a 37ºC, durante 2 dias. c) Após incubação, deite soluto de lugol sobre a cultura cobrindo a totalidade da placa. d) Observe e registe atentamente a reacção. As zonas claras indicam a degradação (hidrólise) do amido pela acção da β-amilase bacteriana, ao passo que as zonas azuladas correspondem à presença do amido. Estudo do metabolismo fermentativo/oxidativo da glucose a) Inocule as estirpes bacterianas em estudo em tubos de ensaio contendo o meio de cultura e a glucose, por picada central. b) Incube numa estufa a 37ºC, durante 1 a 2 dias. c) Após incubação, observe atentamente e registe se ocorreu mudança de cor no tubo. 5

6 A fermentação da glucose resulta na produção de ácido e por conseguinte na alteração do ph. A alteração do ph é caracterizada pela mudança de cor do indicador, obtendo-se uma cor amarelada, azulada ou esverdeada. Por outro lado, é possível que observe bolhas gasosas no interior do meio, nomeadamente nas bactérias que executam o seu metabolismo em condições anaeróbias. Registe os resultados obtidos após os dias previstos para o seu crescimento e transfira todas as culturas para o frigorífico a 4ºC. Extracção e Purificação do DNA 1. Pesar 200 mg de pó de biomassa de cada microrganismo para tubos eppendorf estéreis e lavar com etanol absoluto, deixando em repouso 1 h. 2. Após remoção do etanol adicionar a cada eppendorf 150 mg de esferas de vidro e 200 µl de tampão C1. Homogeneizar no vortex durante 10 min. 3. Adicionar 100 µl de tampão C1 e agitar no vortex durante mais 10 min. 4. Adicionar 300 µl de tampão C1 e 2 µl de RNAse de bovino e agitar no vortex durante 10 min. 5. Juntar 100 µl de clorofórmio, agitar no vortex durante 10 s e centrifugar a rpm durante 5 min. 6. Recolher a fase superior para um eppendorf e incubar a 60 ºC durante 30 min. 7. Centrifugar a mistura a rpm, durante 5 min e transferir o lisado para um novo tubo. 8. Adicionar 300 µl de tampão C4 e 200 µl de etanol. Homogeneizar no vortex durante 30 s. 9. Pipetar o lisado para uma coluna NucleoSpin previamente colocada num tubo eppendorf de 2 ml. Centrifugar a rpm, 1 min. 10. Adicionar 400 µl de tampão CW à coluna NucleoSpin e centrifugar 1 min a g. 11. Adicionar 700 µl de tampão C5 à coluna NucleoSpin e centrifugar 1 min a g. 12. Adicionar 200 µl de tampão C5 à coluna NucleoSpin e para remover completamente o tampão C5 centrifugar 2 min a g e secar a membrana. 13. Para eluir o DNA puro, colocar a coluna NucleoSpin dentro de um novo tubo eppendorf de 1,5 ml e pipetar para a coluna 100 µl de tampão de eluição CE (pré-aquecido a 70 ºC). 14. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min e centrifugar 1 min a rpm. 15. Analisar a pureza das amostras de DNA por espectrofotometria U.V.-Vis. 6

7 Amplificação do DNA por PCR 1. Adicione as seguintes soluções num tubo eppendorf : - Tampão de PCR (10x concentrado) 10 µl - Mistura de dntp 8 µl - F-Primer 2 µl - R-Primer 2 µl - H 2 0 desmineralizada 57 µl - DNA puro 20 µl - Taq DNA polimerase 1 µl 2. Microcentrifugue durante 10 s. 3. Introduza o tubo eppendorf no aparelho de PCR com a seguinte programação: 1 min a 94ºC 1 min a 55ºC 1 min a 72ºC repetição deste ciclo 35 vezes 6 min a 72ºC 4. Quando a amplificação terminar (cerca de 2h30m), retire o tubo eppendorf do aparelho e deixe-o à temperatura ambiente para que arrefeça durante cerca de 5 min. 5. No sentido de examinar o produto e o seu tamanho, faça uma corrida electroforética em gel de agarose: misture 8 µl do produto de cada amostra e 2 µl de tampão de aplicação. Aplique as amostras num gel de agarose a 2 % (p/v) e uma amostra de marcadores (2,5 µl de marcadores + 2,5 µl de tampão de aplicação). Faça a corrida electroforética num tampão contendo brometo de etídio durante 50 min. a 75 V. Examine o gel no transiluminador de U.V. e registe os resultados. TRATAMENTO DE RESULTADOS 1. Determine o tamanho do produto de amplificação por PCR em Kb usando os marcadores fornecidos. 2. Compare os seus resultados com a previsão do computador em relação ao tamanho do seu produto. 7

8 BIBLIOGRAFIA 1. Aquarone, E., Borzani, W., Lima, U.A., (1975), Tópicos de Microbiologia Industrial vol 2, Editora Edgard Blucher, Lda., S.Paulo. 2. Balows, A., Hausler, W.J., Herrmann, K.L., Isenberg, H.D., Shadomy, H.J., (1991), Manual of Clinical Microbiology, 5 th edition, Section II 16, Section IV 26, American Society for Microbiology, Washinton, D.C. 3. Bradshaw,L.J., Laboratory Microbiology, (1992), 4 th edition, Saunders College Publishing. 4. Collins, C.H., Lyne, P.N., Grange, J.M., (1989), Microbiological Methods 5 th Edition, Butterworth & Co. Ltd., London. 5. Cruickshank, R., Duguid, J.P., Marmion, B.p., Swain, C.H.A., (1975), Microbiologia Médica, 4ª edição, Vol.I, Parte 1 cap 4, Fundação Calouste Gulbenkian. 6. O Leary, W., (1990), Practical Handbook of Microbiology, 2 nd edition, CRC Press, Boston 7. Pelczar, M.J., Chan, E.C.S., Krieg, N.R., (1993), Microbiology. Concepts and Application, McGraw-Hill. 8. Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A., (1993), Microbiology, 2 nd edition, WCB Publishers. 9. Primrose, S.B., Warlaw, A.C., (1982), Sourcebook of experiments for the teaching of Microbiology, Academic Press. 10. Karcher, S.J. (1995) Molecular Biology A project approach Academic Press. 11. Old, R.W. and Primrose, S.B. (1991) The Principles of Gene Manipulations Blackwell Scientific Publications, 4th edition. 8

9 FACTORES (ph, TEMPERATURA E COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTURA) QUE AFECTAM A CINÉTICA DE CRESCIMENTO MICROBIANO. OBJECTIVO Análise da influência da temperatura de incubação, do ph e da composição do meio de cultura na cinética de crescimento da estirpe pkk AI3 de Escherichia coli. INTRODUÇÃO A bactéria E.coli é um dos microrganismos mais investigados e conhecidos em Biotecnologia. Para além do conhecimento do seu comportamento normal, determinado pela respectiva informação genética, esta bactéria é hoje em dia utilizada em processos aplicados em escala industrial, nos quais por modificação genética do cromossoma, por exemplo, através do recurso a plasmídeos, se produz interferão alfa aplicado em terapêutica do cancro e na produção de insulina humana ou ainda da enzima amidase. No crescimento de uma cultura de células em meio apropriado, em regime descontínuo, tem todo o interesse a determinação da taxa específica de crescimento, obtida a partir da tangente à curva do crescimento na fase exponencial em que as células se encontram a crescer com o seu máximo desempenho. Efectivamente este parâmetro cinético apresenta-se como um indicador que permite optimizar as condições das variáveis ou factores que interferem no crescimento, optimizando-se assim o processo em escala laboratorial, o que permitirá a passagem à escala piloto onde serão optimizadas as condições hidrodinâmicas do processo tais como a agitação e por semelhança geométrica e dinâmica passar à escala industrial da produção. Sendo o acompanhamento do crescimento por medição da densidade populacional um procedimento muito moroso, torna-se bastante prático seguir a evolução do crescimento por medição directa e rápida da densidade óptica ou absorvância, grandeza esta que se encontra directamente relacionada com a densidade populacional através da Lei de Lambert e Beer. 9

10 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL Meios de Cultura - Luria Bertani (LB): triptona (10 g/l), extracto de levedura (5 g/l) e NaCl (10 g/l), ph 7,5 (meio 1); - meios LB modificados: triptona (10 g/l), extracto de levedura (5 g/l) e NaCl (10 g/l), ph 6,0 (meio 2); triptona (0,5 g/l), extracto de levedura (5 g/l) e NaCl (10 g/l), ph 7,5 (meio 3); triptona (10 g/l), extracto de levedura (0,25 g/l) e NaCl (10 g/l), ph 7,5 (meio 4); triptona (10 g/l), extracto de levedura (5 g/l) e NaCl (0,5 g/l), ph 7,5 (meio 5). - todos os meios são suplementados com 125µg/ml de ampicilina. Microrganismos - Estirpe recombinante de Escherichia coli (pkk AI3) Materiais - Pipetas estéreis de 2ml - Células (cuvetes) para espectrofotómetro - Espectrofotómetro UV-Vis. - Incubadora de agitação orbital - Cronómetro 1. Inocule assepticamente cada balão erlenmeyer, contendo o meio de cultura, com 10 ml de inóculo de Escherichia coli (pkk AI3), previamente crescido no mesmo meio e nas mesmas condições. 2. Imediatamente (a tempo zero) retire uma pequena amostra do meio de cultura, previamente agitado, e registe a absorvância a 540 nm obtida contra uma amostra branco (meio de cultura estéril). 3. Incube os balões nas incubadoras de agitação orbital a 200 rpm e às seguintes temperaturas: 25 ºC (balão erlenmeyer contendo meio 1) 30 ºC (balão erlenmeyer contendo meio 1) 37 ºC (balões erlenmeyer contendo meio 1, 2, 3, 4 e 5). 4. Siga o crescimento microbiano nos diferentes balões registando a absorvância (a 540nm contra uma amostra branco) de 20 em 20 minutos. 10

11 TRATAMENTO DE RESULTADOS Construa as curvas de crescimento de Escherichia coli (pkk AI3) e determine a taxa específica de crescimento e o tempo de geração/duplicação para cada condição. a) Indique justificando as fases da curva de crescimento atingidas para cada condição. b) Analise o efeito de cada parâmetro estudado nas constantes cinéticas de crescimento. c) Discuta a cinética de crescimento microbiano proposto pela equação de Monod. BIBLIOGRAFIA 1. Bailey, J.E., Ollis, D.F., (1986), Biochemical Engineering Fundamentals, 2ª ed., McGraw- Hill International Editions. 2. Brown, P.R., Tata, R., (1987), J. Gen. Microbiol.. 133, Gregoriou, M.,Brown, P.R., Tata, R., (1977), J. Bacteriol. 132, Lehninger, (1977), Bioquímica, vol.1, Edgar Blucher Lda. 5. Pacheco, R., (1997), Tese de licenciatura em Bioquímica, FCUL, Lisboa. 6. Stanbury, P.F., Whitaker, A., (1984), Principles of Fermentation Technology, Pergamon Press, New York. 11