ANÁLISE MULTI-RESÍDUOS DE PESTICIDAS EM FRUTAS E VEGETAIS APLICAÇÃO DO MÉTODO QUECHERS, GC-ECD-NPD E GC-MS

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1 ANÁLISE MULTI-RESÍDUOS DE PESTICIDAS EM FRUTAS E VEGETAIS APLICAÇÃO DO MÉTODO QUECHERS, GC-ECD-NPD E GC-MS Sandrine da Ressurreição 1,2, Jorge M. T. B. Varejão 1,2, Sandra Dias Santos 1,2 e M. Conceição Costa 1,2 1 Unidade de Investigação de QRN do CERNAS, Escola Superior Agrária de Coimbra do Instituto Politécnico de Coimbra, sandrinematias@sapo.pt 2 Departamento de Ciências Exactas, Escola Superior Agrária de Coimbra do Instituto Politécnico de Coimbra, sds@esac.pt ABSTRACT The use of pesticides, because of their beneficial effects exerted at the level of agricultural productivity, has helped food production in recent decades. Continued growth of world population and consequent demand for food, have required a complex system of cultivation, storage, processing and transporting agricultural products. For optimum performance in each of these steps, and also for the control of vectors of various diseases, have been employed to different pesticides, although effective, may be toxic to humans and animals. Concerns about the quality of production and the uncertainty of the adverse effects of some pesticides, have led to the development of techniques to detect these residues. In this sense the Agrarian School of Coimbra in order to respond to various external stresses proceeded to implement a routine technique for the simultaneous analysis of multiple pesticides in food. The method involves steps of extraction and chemical analysis. The extraction method used is the method of QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe), which is a new method for the extraction of pesticide residues in fruits, vegetables and other foods. The methods previously used for the extraction of pesticide residues in food samples were time-consuming, costly and labor. The new method presented here simplifies the extraction process, allowing good results for the determination of these substances. The detection of pesticides in extracts carried in a gas chromatograph injection simultaneously on two coupled columns, respectively, to a halogenated substances detector (ECD) detector to the other substances that contain atoms of nitrogen and phosphorus (NPD). In cases where chromatographic bands are detected under these conditions, extracts undergo confirmation / identification of the results in a chromatograph coupled to a mass detector (GC-MS). Keywords: Analysis of multi-residue pesticides, GC-MS, GC-ECD-NPD RESUMO A utilização de pesticidas, em virtude dos seus efeitos benéficos exercidos a nível da produtividade agrícola, tem auxiliado a produção de alimentos das últimas décadas. O contínuo crescimento da população mundial e consequente procura por alimentos, têm exigido um sistema complexo de cultivo, armazenamento, processamento e transporte de produtos agrícolas. Para um maior rendimento em cada uma dessas etapas, e também para o controle de vectores de diversas doenças, têm sido empregues diferentes pesticidas que, embora eficientes, poderão ser tóxicos para o Homem e animais. As preocupações com a qualidade da produção bem como a incerteza dos efeitos nefastos por parte de alguns dos pesticidas, têm levado ao desenvolvimento de técnicas para a detecção destes resíduos. Neste sentido a Escola Superior Agrária de Coimbra com o intuito de responder a várias solicitações externas, procedeu à implementação de uma técnica de rotina para a análise simultânea de múltiplos pesticidas em produtos alimentares. O método envolve etapas de extracção e de análise química. O método de extracção utilizada é o método de QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe), que é um novo método para a extracção de resíduos de pesticidas em frutos, legumes e outros alimentos. Os métodos anteriormente utilizados para a extracção de resíduos de pesticidas em amostras de alimentos eram morosos, caros e trabalhosos. A nova metodologia aqui apresentada, simplifica o processo de extracção, permitindo bons resultados de determinação destas substâncias.

2 A detecção de pesticidas nos extractos efectua-se num cromatógrafo gasoso com injecção em simultâneo em duas colunas acopladas, respectivamente, uma a detector de substâncias halogenadas (ECD) a outra a detector de substâncias que contêm átomos de azoto e fósforo (NPD). Nos casos em que se detectam bandas cromatográficas nestas condições, submetem-se os extractos a confirmação/identificação dos resultados num cromatógrafo acoplado a um detector de massa (GC-MS). Palavras-chave: Análise multi-resíduos, pesticidas, GC-MS, GC-ECD-NPD 1. Introdução No mundo, as perdas anuais devido à acção de pragas na agricultura chegam a mil milhões de toneladas, correspondendo a uma redução de 20 a 30% na produção. Os pesticidas, desde o seu desenvolvimento, desempenharam um importante papel no crescimento da agricultura moderna. A utilização destes compostos químicos, que por um lado gera benefícios, mas por outro, foi responsável por atentados ambientais e à saúde pública; continua a ser responsável pela contaminação do solo, água e alimentos. Os riscos para a saúde humana, associados ao uso e à exposição a pesticidas e especificamente, o risco de cancro têm sido objecto de grande interesse científico ao longo destes anos. Assim, é importante a sua determinação, devido ao potencial risco que estes compostos oferecem à saúde, além da sua persistência no meio ambiente e tendência de bioacumulação (Prestes et al., 2009). A determinação de resíduos de pesticidas desempenha um papel importante para a estimativa da exposição humana e do meio ambiente a estes compostos, permitindo avaliar a conformidade da produção agrícola com as Boas Práticas Agrícolas, possibilitando decisões regulamentares comerciais visando garantir a segurança alimentar. Actualmente, acções governamentais e também do sector privado, estabelecem uma maior importância para a análise de resíduos de pesticidas, sendo que há uma pressão crescente para o aperfeiçoamento do desempenho analítico, exigindo aumento da eficiência e diminuição do custo e do tempo das análises (Lehotay, 2002). Nas últimas décadas, laboratórios públicos e privados vêm desenvolvendo métodos para a determinação de resíduos de pesticidas, nomeadamente em alimentos. Contudo, a maioria dos métodos oficiais de análise está longe do considerado ideal métodos de ampla aplicação, rápidos, sensíveis e com resultados confiáveis. Produtos agrícolas como frutas, vegetais e cereais são as matrizes mais analisadas em laboratórios de rotina, apresentando frequentemente resíduos de pesticidas de diversas classes. Assim, é de fundamental importância o desenvolvimento de métodos para a determinação de multiresíduos de pesticidas nestes tipos de alimentos. A diferença das propriedades químicas entre estes compostos e a diversidade de matrizes são algumas das adversidades a serem contornadas no desenvolvimento destes métodos, os quais frequentemente apresentam etapas penosas que necessitam de tempo, têm grande custo de material e geram grandes quantidades de resíduos tóxicos (Prestes et al., 2009). Neste sentido a Escola Superior Agrária de Coimbra (ESAC), nomeadamente o laboratório de Química e Bioquímica com o intuito de responder a várias solicitações externas, procedeu à implementação das técnicas de rotina de QuEChERS, GC-ECD-NPD e GC-MS para a análise simultânea de múltiplos pesticidas em produtos alimentares. O Laboratório de Química e Bioquímica já possui as técnicas analíticas adequadas a análise de uma gama de resíduos esse fim. 2. Material e Métodos Em 2001, no laboratório de Química e Bioquímica Escola Superior Agrária de Coimbra (ESAC), foi implementado o método de determinação múltipla de pesticidas organoclorados em água por SPME, GC-ECD (Santos, 2001) e, neste seguimento, em 2006, foi implementado o método de determinação múltipla de pesticidas organoclorados e organofosforados em frutas vegetais por SPME, GC-ECD-NPD (Marques, 2006). Esta técnica permitia a realização pontual de análises a pesticidas a frutas e vegetais, mas era demorada e não permitia ao laboratório fazer análises em grandes quantidades. Assim em 2010, decidiu-se implementar o método QuEChERS (Anastassiades et al, 2008), GC-ECD-NPD e GC-MS para permitir a realização de análises de rotina a multi-residúos de pesticidas em grandes quantidades. Para a montagem da técnica, procedeu-se à análise de 150 amostras de frutas e vegetais,

3 oito amostras de batata, cinco amostras de laranja e de pêra, três amostras de abrunho, alface, alho, alho francês, ameixa, beringela, beterraba, canónicos, cebola, cenoura, cereja, courgette, couve, espinafre, feijão-verde, kiwi, lima, limão, manga, melancia, meloa, morango, nabo, pepino, pêssego, pimento, tomate e uva e, duas amostras de alecrim, amendoim, carqueja, cerefólio, coentro, erva-cidreira, hortelã, manjericão, manjerico, orégão, pistache, poejo, rúcola, salsa, sálvia, segurelha, toranja e tremoço, obtidas em cuja amostragem foi realizada em diferentes supermercados, minimercados e produtores individuais do Concelho de Coimbra de Março de 2010 a Setembro de Método de Extracção: SPME A microextração em fase sólida (SPME) constitui um método de extracção e pré-concentração de analitos (Valente, Augusto, 2000). Esta técnica está baseada em dois estágios de separação: adesorção dos analitos por uma fibra de sílica modificada quimicamente, e posterior desadsorção térmica dos analitos num cromatógrafo gasoso. As extracções das amostras eram realizadas pesando uma determinada quantidade de amostra, adicionando-se 50 ml de água destilada e triturava-se. Transferia-se a mistura para um balão de 200 ml, aferindo-se o volume com água destilada. Em seguida, colocando 500 mg de NaCl, 5 ml da solução da amostra num vial juntamente com um magnete e era colocado a agitar durante 5 minutos. Em seguimento, introduzia-se directamente a fibra de SPME (previamente acondicionada durante 30 minutos a 250 ºC na solução aquosa durante 45 minutos em agitação e injectava-se a amostra no GC-ECD-NPD ou no GC-MS através da fibra de SPME. Nos ensaios realizados por SPME era utilizada um fibra de PDMS com uma espessura de 100 µm suportada por um dispositivo próprio fornecido pela Supelco (Marques, 2006). 1.2 Método de Extracção: QuEChERS O método de extracção utilizado foi o método de QuEChERS CEN (Figura 1). O método de QuEChERS original foi desenvolvido em 2003, por Anastassiades et al. com o objectivo de superar limitações práticas dos métodos multi-resíduo de extracção disponíveis na época, introduzindo um novo procedimento de preparação de amostras para extracção de resíduos de pesticidas em frutas e vegetais denominado QuEChERS. Esse método, que tem como vantagens ser rápido, fácil, económico, efectivo, robusto e seguro, explora as possibilidades oferecidas pela instrumentação analítica moderna. Durante o seu desenvolvimento, grande ênfase foi dada para a obtenção de um procedimento dinâmico, que pudesse ser aplicado em qualquer laboratório e sem grandes custos económicos. Em 2007, Lehotay propôs uma alteração ao método para colmatar falhas do método original, sendo que este método foi acreditado pela AOAC International AOAC Nessa sequência, também em 2007, Anastassiades et al. propuseram uma outra alteração ao método original, tendo este método sido acreditado pela European Committee Standardization (CEN) CEN Ambos os métodos são reconhecidos hoje em dia. O método QuEChERS envolve uma extracção inicial em acetonitrilo seguida de uma partição pela a adição de sais (salting-out), e uma etapa de limpeza utilizando extracção em fase sólida com absorvente disperso. Este método é hoje o método de extracção mais utilizado para a determinação de resíduos de pesticidas em amostras de alimentos, proporcionando percentagens de recuperações aceitáveis para pesticidas ácidos, neutros e básicos. Os métodos anteriormente utilizados para a extracção de resíduos de pesticidas em amostras de alimentos são demorados, caros e trabalhosos.

4 Figura 1 Método de QuEChERS CEN A metodologia QuEChERS possui como principais diferenças para amostras de frutas e vegetiais, em relação SPME, a redução do custo da extracção, a diminuição do tempo de análise, a eliminação ou redução do uso de solventes, a necessidade de pequena quantidade de amostra, mantendo boas percentagens de recuperação e reprodutibilidade. Para amostras de água continua a ser recomendado o uso da técnica SPME. 1.3 Cromatografia gasosa A Cromatografia gasosa é uma técnica analítica, utilizada para promover a separação de substâncias voláteis de uma amostra (mistura), através de seu arraste por meio de um gás (fase móvel) sobre uma coluna cromatográfica (fase estacionária). Após a separação dos componentes da mistura na coluna, e após a sua eluição, estes são conduzidos para o detector onde são identificados e quantificados. O sinal transmitido pelo detector é enviado para um computador (ou registador), onde são processados os dados e obtido o resultado na forma de um cromatograma. A cromatografia gasosa é a técnica que permite a identificação dos vários componentes presentes numa amostra através da comparação do tempo de retenção de um padrão com o tempo de retenção da amostra (Figura 2). Se um composto conhecido (padrão) possui o mesmo tempo de retenção de um determinado componente da amostra, então, em princípio, trata-se do mesmo composto. No caso particular dos pesticidas poderá significar que a amostra possui a mesma substância activa que o padrão utilizado para comparação.

5 A Figura 2 - Tempo de retenção (A) e comparação do tempo de retenção de um padrão com o tempo de retenção da amostra (B) (Fonte: B A detecção de pesticidas nos extractos realizou-se num cromatógrafo HP 6890 Series com injector Split/Splitless com injecção em simultâneo em duas colunas (Coluna 1: Teknokroma, TRB-5ms, 30m x 0,25mm. Coluna 2: JW Scientific, DB-5ms, 30x0,25μm), acopladas respectivamente a detectores ECD e NPD. Os cromatogramas obtidos foram registados e analisados segundo o programa JASCO-BORWIN versão 1.50 e interfase HERCULE Lite. Nos casos em que se detectam bandas cromatograficas nestas condições, submetem-se os extractos a confirmação/identificação dos resultados num cromatógrafo GC Varian 3900 acoplado a um detector de massa MS Varian Saturn 2100T. Os cromatogramas obtidos foram registados e analisados segundo o programa MS Workstation versão 6.41 da Varian. 1.4 Análise Quantitativa A análise quantitativa da técnica de cromatografia gasosa tem como princípio básico a integração dos sinais obtidos nos cromatogramas - picos, o qual tem como objectivo converter a intensidade do sinal emitido pelo detector numa medida relacionada com a quantidade de substância analisada de amostra, geralmente, a área dos picos. Neste método, é fundamental que a área dos picos seja a mais exacta possível a fim de minimizar possíveis erros. De uma forma geral, o valor da área dos picos considerados foram calculados automaticamente com o auxílio do programa JASCO-BORWIN versão A quantificação nas amostras positivas é efectuada recorrendo a padrões autênticos dos pesticidas (Mix A e Mix B da Supelco para os pesticidas organoclorados e Mix A e Mix B da Restek para os pesticidas organofosforados, e ainda Difenilamina e Cloroprofame da Fluka), num total de 50 substâncias activas (Aldrina, Azinphos methyl (guthion), α-bhc, β-bhc, γ-bhc, -BHC, Bolstar (sulprofos), Chlorpyrifos (Dursban), α- Chlordano, γ-chlordano, Coumaphos, Demeton O, Demeton S, Diazinon, Dichlorvos (DDVP), 4,4 -DDE, 4,4 -DDD, 4,4 -DDT, Decaclorobifenyl, Dieldrin, Dimethoate, Disulfoton, Endosulfan II, Endosulfan sulfate, Endrin, Endrin aldehyde, Endrin ketone, EPN, Ethoprophos, Fenchlorphos (Ronnel), Fensulfothion, Fenthion, Heptachlor epoxide (isomer B), Malathion, Merphos, Methoxychlor, Methyl parathion, Mevinphos (phosdrin), Monocrotophos, Naled, Parathion (ethyl parathion), Phorate, Stirofos (tetrachlorvinphos), Sulfotepp, TEPP (tetraethylpyrophosphate), Tetrachloro-m-xylene, Tokuthion (prothiofos), Trichloronate, Diphenylamine e Chlorpropham), que permitem a obtenção das rectas de calibração. 3. Resultados e Discussão Das 150 amostras analisadas, em apenas 11 foram encontrados de pesticidas. (Tabela 1). Os principais pesticidas encontrados foram a difenilamina em amostras de maçã e pêra, o clorprofame em amostras de batata e o clorpirifos em amostras de maçã e citrinos.

6 Amostra Tabela 1 Resultados da análise das amostras Resíduo de pesticida detectado Quantificação do resíduo (mg/kg) Limites máximos de resíduos (LMR)* (mg/kg) Amostra 19 (Maçã) Clorpirifos 0,2 0,5 Amostra 28 (Maçã) Clorpirifos 0,3 0,5 Amostra 43 (Pêra) Difenilamina 2,0 10 Amostra 57 (Lima) Clorpirifos 0,1 0,3 Amostra 66 (Laranja) Clorpirifos Vestigial 0,3 Amostra 93 (Batata) Clorprofame 1,0 10 Amostra 95 (Pêra) Difenilamina Vestigial 10 Amostra 102 (Pêra) Difenilamina Vestigial 10 Amostra 114 (Maçã) Difenilamina Vestigial 5 Amostra 133 (Batata) Clorprofame Vestigial 10 Amostra 147 (Laranja) Clorpirifos 0,1 0,3 * Fonte: EU Pesticides Database em Estes resultados mostram que a quantidade de resíduos de pesticidas estudados, encontrados nestas amostras, é baixo ou vestigial, sendo que em todas as amostras positivas a quantidade de resíduo é sempre inferior ao limite máximo de resíduos (LMR) permitidos pela legislação europeia e portuguesa. Este facto provavelmente deve-se a crescentes medidas de fiscalização e prevenção implementadas na União Europeia. 4. Conclusão e Considerações futuras Este trabalho permitiu-nos concluir que o método de extracção QuEChERS é muito mais adequado que os métodos tradicionais de preparação de amostra para determinação de resíduos de pesticidas em frutas e vegetais, entre as quais podemos referir: elevadas taxas de recuperação são obtidos para um grande número de compostos de diferentes polaridade e volatilidade (Prestes et al., 2009); o método é exacto e preciso e permite uma maior rapidez na excussão, é possível fazer a extracção 20 amostras em cerca de 60 minutos; utiliza um pequeno volume de solventes, um único técnico pode realizar a preparação da amostra; não requer a utilização de muitos materiais nem equipamentos, bem como espaço físico durante a execução do método. Em suma, o método de extracção QuEChERS é um método rápido, simples, de baixo custo, baixo consumo de solventes, não necessitando de equipamento especiais. Uns dos próximos objectivos de trabalho é alargar a utilização do método a pelo menos 200 substâncias activas, tentando assim abranger um maior número de

7 pesticidas passíveis de análise e tentando assim satisfazer os pedidos do meio exterior e a realização de trabalhos científicos. 5. Bibliografia Anastassiades, M. (2008). EN 15662: Determination of pesticide residues using GC-MS and/or LC-MS (/MS) following acetonitrile extraction/partitioning and cleanup by dispersive SPE - QuEChERS method. European Commitee for Standardization. Anastassiades, M., et al. (2003). Fast and easy multiresidue method employing acetonitile extraction/partitioning and dispersive solid-phase extraction for the determination of pesticide residues in produce. J. AOAC Int. 86, pp Gilbert-López, B., et al. (2009). Sample treatment and determination of pesticide residues in fatty vegetable matrices: A review. Talanta 79, pp Lehotay, S. (2002). Determination of pesticide residues in nonfatty foods by supercritical fluid extraction and gas chromatography/mass spectrometry: collaborative study. J AOAC Int 85, pp Lehotay, S. (2007). Determination of pesticide residues in foods by acetonitrile extraction and partitioning with magnesium sulfate: collaborative study. J. AOAC Int. 90, pp Marques, A. (2006) Determinação múltipla de resíduos de pesticidas em vegetais por SPME e GC-ECD-NPD. Escola Superior Agrária de Coimbra (relatório final bolsa de investigação) Prestes, O., et al. (2009). QuEChERS Um método moderno de preparo de amostra para determinação multi-resíduo de pesticidas em alimentos por métodos cromatográficos acoplados à espectrometria de massas. Quim. Nova 32, pp Santos, S. (2001). Pesquisa de pesticidas organoclorados em águas por SPME-GC-ECD. Escola Superior Agrária de Coimbra (relatório de estágio). Valente, A., Augusto, F. (2000). Microextração por fase sólida. Química Nova 23, 4, pp