UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS- GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA JÉSSICA YONARA DE SOUZA

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS- GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA JÉSSICA YONARA DE SOUZA Validação da técnica de Avidez de IgG em amostras de sangue de recém-nascidos coletadas em papel filtro: valor prognóstico para indicação de infecção ativa pelo Toxoplasma gondii Goiânia 2017 ii

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3 JESSICA YONARA DE SOUZA Validação da técnica de Avidez de IgG em amostras de sangue de recém-nascidos coletadas em papel filtro: valor prognóstico para indicação de infecção ativa pelo Toxoplasma gondii Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título de Mestre em Medicina Tropical e Saúde Pública. Orientadora: Profª Drª Ana Maria de Castro Goiânia 2017 iv

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6 AGRADECIMENTOS Em primeiro lugar agradeço a Deus por sempre me conduzir e me colocar nos caminhos corretos me dando a oportunidade de crescer como estudante e profissional. Agradeço a minha orientadora Drª Ana Maria de Castro, por fazer desse um sonho possível, me orientando sempre com muito profissionalismo e uma doçura incomparável. Agradeço a toda minha família por sempre me apoiarem, Aos meus pais Isonilda de Souza e Antônio José de Souza Neto (In memoriam) ao meu esposo Lucas Rezende por tanta dedicação, zelo, carinho e paciência, as minhas filhas Sabrina e Liz por serem sempre o motivo de eu nunca ter desistido dos meus objetivos. A toda equipe do laboratório LAERPH do IPTSP pelo acolhimento, carinho e ensinamentos diários, José Clecildo, Joanna Herzog, Marina Clare, Eliana Isac. Aos meus amigos e parceiros de pesquisa, Hânstter Hálisson, Heloísa Storchilo e Taynara Gomes. Aos meus amigos do laboratório, Daniella de Sousa, Guaraciara Picanço, Jaqueline Ataíde, José Neto, Juliana Avelar, Nayana Ferreira. A direção e funcionários do Hospital das Clínicas, Hospital Maternidade Dona Iris e Cais Nova Era. Aos pais que aceitaram que seus filhos participassem da pesquisa. A fundação de amparo à pesquisa de Goiás (FAPEG) pela concessão da bolsa de mestrado e apoio financeiro ao presente projeto. A todos meus sinceros agradecimentos. vii

7 SUMÁRIO AGRADECIMENTOS... vi SUMÁRIO... viii TABELAS, FIGURAS E ANEXOS... ix RESUMO... x ABSTRACT... xii 1 INTRODUÇÃO Histórico do Toxoplasma gondii Biologia do parasito Taxonomia Morfologia Traquizoítos Bradizoítos Oocistos Ciclo do Toxoplasma gondii Toxoplasmose Prevalência Prevalência de gestantes infectadas por Toxoplasma gondii Prevenção Toxoplasmose congênita Diagnóstico Imunoglobulina G e avidez de IgG Programas de triagem neonatal - Teste do pezinho Tratamento JUSTIFICATIVA OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS METODOLOGIA RESULTADOS /DISCUSSÃO CONCLUSÕES SUGESTÕES E PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS: ANEXOS Anexo 1 Parecer do Comitê de Ética Anexo 2 Carta de submissão viii

8 TABELAS, FIGURAS E ANEXOS Figura1 Formas morfológicas do Toxoplasma gondii 04 Figura 2. Ciclo de vida do Toxoplasma gondii 06 Quadro 1. Prevalência sorológica em gestantes cronicamente infectadas pelo Toxoplasma gondii de diversos países do mundo 08 Quadro 2. Prevalência sorológica em gestantes cronicamente infectadas pelo Toxoplasma gondii nas regiões do Brasil 09 Quadro 3. Esquematização da técnica de Elisa 26 Tabela 1. Estratificação dos pacientes de acordo com os índices de IgG 28 Tabela 2. Concordância dos resultados sorológicos para toxoplasmose de amostras de sangue coletadas em papel filtro e de sangue periférico de recém-nascidos pelo teste de Elisa 30 Tabela 3. Comparação de resultados da sorologia em soro de mãe e filho 31 Gráfico 1. Relação de pacientes com baixa avidez de anticorpo IgG e pacientes com alta avidez de anticorpo IgG 33 Tabela 4: Comparação dos valores de Avidez de Imunoglobulina G anti- Toxoplasma gondii, obtidas pelo Teste de Elisa em amostras de soro e papel filtro coletados após três meses do nascimento 34 ix

9 SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS CNE ADN GO HC-UFG HDMI HC IgA IgM IgG LAERPH- UFG PCR Cais Nova Era Aparecida de Goiânia Ácido Desoxirribonucléico Goiás Hospital das Clínicas/UFG de Goiânia-GO Hospital Maternidade Dona Iris Hospital das Clínicas Imunoglobulina A Imunoglobulina M Imunoglobulina G Laboratório da Relação Parasito Hospedeiro da Universidade Federal de Goiás Reação em Cadeia da Polimerase µl Microlitro PE RN SUS Pernambuco Recém-nascido Sistema Único de Saúde T. gondii Toxoplasma gondii TCLE UFG Termo de Consentimento Livre e Esclarecido Universidade Federal de Goiás x

10 RESUMO A toxoplasmose congênita é uma doença infecciosa que resulta da transferência transplacentária do protozoário Toxoplasma gondii para o concepto e pode causar sérios danos fetais, o seu diagnostico e complexo, e quanto antes realizado melhora o prognóstico da infecção. A avaliação da Avidez da IgG é utilizada como indicador de infecção recente principalmente no acompanhamento de grávidas de risco, bem como até o momento não está estabelecido a sua utilização em amostras de sangue de recém-nascidos, e em amostras de sangue coletadas em papel filtro. O objetivo geral deste estudo foi avaliar a importância prognóstica do teste de avidez de IgG em soros e em sangue coletado em papel filtro de RN na indicação de infecção congênita pelo T. gondii. Foram coletadas amostras de sangue em papel filtro de RN atendidos no Hospital das Clínicas-UFG, Maternidade Dona Íris, Goiânia-GO e Cais Nova Era, Aparecida de Goiânia-GO, A triagem sorológica de anticorpos IgG e IgM foi realizada através do teste de Elisa (kit BIOLISA toxoplasmose IgG e IgM). Do total de 1277 amostras, foi detectada duas amostras IgM positivas, em 564 amostras (44,1%) detectou-se a presença de IgG, apresentaram índice de absorbância pelo teste de Elisa 3,0, 57,67% (327/567), foram realizadas 177 pares de recoletas de mãe e filho para confirmação dos resultados obtidos em papel filtro e avaliação da Avidez de IgG. Em 167 pares (94,36%) a detecção de IgG foi confirmada demonstrando boa sensibilidade do método, em 4 (2,40%) amostras a IgG do recém-nascido apresentou baixa avidez de anticorpo IgG que é um indicativo de infecção recente. Em 17 amostras a coleta foi realizada simultaneamente em papel filtro e de sangue periférico, afim de avaliar a eficácia da técnica de avidez em amostras de papel filtro, a concordância entre os resultados foi de 100%. A triagem dos RN com elevado título de IgG, associado ao teste de avidez, podem ser realizados em papel filtro e esse método pode contribuir no rastreamento e no diagnóstico precoce de toxoplasmose. xi

11 ABSTRACT Congenital toxoplasmosis is an infectious disease that results from the transplacental transfer of the protozoan Toxoplasma gondii to the concept and can cause serious fetal damage, its diagnosis and complex, and the sooner realized improves the prognosis of infection. The evaluation of IgG avidity is used as an indicator of recent infection mainly in the follow-up of pregnant women at risk, and to date it is not established for use in blood samples of newborns and in blood samples collected on filter paper. The general objective of this study was to evaluate the prognostic importance of the IgG avidity test in sera and in blood collected on RN filter paper in the indication of T. gondii congenital infection. Blood samples were collected on RN filter paper at the Hospital das Clínicas-UFG, Dona Íris Maternity Hospital, Goiânia-GO and Cais Nova Era, Aparecida de Goiânia-GO Serological screening for IgG and IgM antibodies was performed using the Elisa test (BIOLISA toxoplasmosis IgG and IgM kit). From the total of 1277 samples, two IgM positive samples were detected, in 564 samples (44.1%) the presence of IgG was detected, and the ELISA 3.0, 57.67% (327 / 567), 177 pairs of mother and child recolects were performed to confirm the results obtained on filter paper and IgG avidity evaluation. In 167 pairs (94.36%) IgG detection was confirmed by demonstrating good sensitivity of the method, in 4 (2.40%) samples the IgG of the newborn presented low avidity of IgG antibody that is indicative of recent infection. In 17 samples the collection was performed simultaneously on filter paper and peripheral blood, in order to evaluate the efficacy of the avidity technique in filter paper samples, the agreement between the results was 100%. Screening of high IgG NB associated with the avidity test can be performed on filter paper and this method may contribute to the early detection and diagnosis of toxoplasmosis. xii

12 1 INTRODUÇÃO 1.1 Histórico do Toxoplasma gondii A infecção por Toxoplasma gondii já foi reportada em quase todos os continentes desde o relato do protozoário em 1908 por Nicolle & Manceaux em uma espécie de roedor, o Ctenodactylus gundi na Tunísia-África, inicialmente os pesquisadores acreditaram se tratar de uma forma de Leishmania e chamaram de Leishmania gondii. Também nesse ano. Em 1909 os primeiros autores informaram à Academia de Ciências de Paris sua retificação, nomeando o parasito como Toxoplasma gondii, por conta de sua forma arqueada (MACIEL, 2004). Vários pesquisadores encontraram parasitos semelhantes morfologicamente ao T. gondii em diversos animais nos anos seguintes, os quais denominavam de acordo com o animal em que eram encontrados, como T. canis, T. gallinarum. Em 1939, Sabin realizou estudos que o levou a concluir que se tratava de uma única espécie (MACIEL, 2004). O primeiro caso de toxoplasmose humana foi descrito por Castellani, em 1913, em um menino com quadro febril e com esplenomegalia. (NICOLLE; MANCEAUX, 1909). Em 1923, na cidade de Praga, um oftalmologista chamado Janku descreveu protozoários morfologicamente idênticos ao T. gondii em cortes de tecido de olho de uma criança que apresentava hidrocefalia e microoftalmia, e em 1928 Levatidi reconheceu cistos no material biológico analisado e o relacionou a hidrocefalia com o T. gondii. No Rio de Janeiro, em 1927, Torres descreveu em cortes histológicos de cérebro e músculos de um recém-nascido que havia morrido com vinte e nove dias, microorganismos compatíveis com o protozoário, sugerindo a possibilidade de infecção congênita (MACIEL, 2004). 1.2 Biologia do parasito 1

13 1.2.1 Taxonomia T. gondii pertence ao filo Apicomplexa, Classe Sporozoea, ordem Eucoccida, Subordem: Eimeriina, Família Sarcocystidae e Sub-família Toxoplasmatinae, Gênero Toxoplasma, apresentando apenas uma espécie válida T. gondii, é um parasito intracelular obrigatório, realiza reprodução assexuada denominada de endodiogenia, e reprodução sexuada no epitélio intestinal de felídeos, denominada de esporogonia (REY, 2010; SACKS; SHER, 2002) Morfologia O protozoário apresenta três formas evolutivas e infectivas: taquizoíto, bradizoíto (em cistos teciduais) e esporozoíto (em oocistos), que serão descritas a seguir: Traquizoítos Os taquizoítos (Figura 1-A) possuem formato de lua crescente, intracelular, é uma forma de multiplicação rápida, encontrada dentro do vacúolo parasitóforo de vários tipos celulares, está presente nos líquidos orgânicos, mede 2 µm x 6 µm de tamanho. Multiplicam-se assexuadamente por endodiogenia provocando a ruptura da célula, esse processo leva a uma intensa reação inflamatória e destruição tecidual, causando as manifestações clínicas da toxoplasmose aguda. Após um número desconhecido de divisões passam para o estágio de bradizoítos, dentro dos cistos tissulares, a diferenciação ocorre por fatores endógenos e exógenos do hospedeiro, como sua imunidade, ph, temperatura e falta de nutrientes (DUBEY et al. 2004). 2

14 Bradizoítos Os cistos presentes nos tecidos do hospedeiro (Figura 1-B) variam de 5 µm a 70 µm e possuem uma membrana dupla elástica, contem poucos a várias centenas de bradizoítos que medem de 1,5 µm a 7 µm de tamanho. Os cistos são as formas de resistência do parasito, intactos e inofensivos podendo persistir ao longo da vida do hospedeiro. São mais prevalentes nos tecidos musculares e neural, incluindo o cérebro, olhos, músculo cardíaco e esquelético (DUBEY; FRENKEL, 1976; DUBEY; LINDSAY; SPEER, 1998). Os bradizoítos são infectantes quando ingeridos por algum hospedeiro seja ele intermediário ou definitivo. Quando esse hospedeiro for um felídeo (hospedeiro definitivo), esses bradizoítos podem penetrar nas células do intestino e iniciar as gerações assexuadas (esquizontes). Os merozoítos se diferenciam em gametas masculinos e femininos e realizam a reprodução sexuada com a formação de ooscistos não esporulados que são liberados na luz intestinal através da ruptura das células do epitélio intestinal (DUBEY, 2004) Oocistos Os oocistos (Figura 1-C) são esféricos, com diâmetro de 12 µm e dupla membrana, sendo esta a forma de resistência ambiental. São eliminados não esporulados para o meio ambiente, e dentro de cinco dias ocorre à esporulação dependendo de condições de aeração e temperatura. Cada oocisto esporulado contêm dois esporocistos elipsóides e dentro de cada um destes existem quatro esporozoítas, que são infectantes, medindo 2 µm de largura por 6 µm de comprimento (DUBEY; LINDSAY; SPERR, 1998). 3

15 A B C Figura 1: A-Taquizoíto de Toxoplasma gondii em lavado peritoneal de camundongos Balb/c, corados pelo Panótico. Visualizado no aumento de 1000 vezes em microscópio óptico (Foto LAERPH)B: Cisto de Toxoplasma gondii á fresco, visualizado no macerado de cérebro de um camundongo infectado com Toxoplasma gondii, CEPA ME49, ampliação de 400 vezes. C: Oocisto de Toxoplasma gondii esporulado em material a fresco, ampliação de 400 vezes, visualizado em microscopia óptica, régua micrométrica na escala de 10µm (REZENDE, 2015) Ciclo do Toxoplasma gondii O ciclo é heteroxeno facultativo, tendo como hospedeiros definitivos membros da família Felidae, se destacando os gatos domésticos, o homem e outros animais são hospedeiros intermediários. O ciclo do T. gondii possui duas fases distintas: a fase assexuada que ocorre nos tecidos de diversos hospedeiros intermediários e a fase sexuada que ocorre somente nos felídeos, estes se infectam naturalmente pela ingestão de oocistos esporulados presentes em solo contaminado, e pela ingestão de mamíferos ou pássaros que são caçados e muitas vezes, acham-se infectados pelo parasito na forma de cistos teciduais, além de carcaças e vísceras fornecidos pelo homem como forma de alimento. Os felinos podem eliminar cerca de 360 milhões de oocistos em um dia, sendo extremamente resistentes às influências do meio ambiente, como por exemplo sobreviver na água do mar por vários meses DUBEY et al. 1998; TENDER et al. 2000; KAWAZOE, 2003). T. gondii apresenta três estágios infectantes, podendo ser transmitido por meio das fezes (oocistos), pela via transplacentária (taquizoítos) e pelo carnivorismo (cistos com bradizoítos). Na fase assexuada um hospedeiro suscetível (homem, por exemplo) se infecta através da ingestão de bradizoítos presentes nos 4

16 cistos teciduais nas carnes, cruas ou mal cozidas (geralmente de porco, cordeiro, cabra, ou carne de caça); esporozoítos, presentes nos oocistos que contaminam o ambiente, alimentos e água não tratada; podendo se infectar ainda por meio de taquizoítos, os quais estão envolvidos principalmente na transmissão congênita, visto que esta forma do parasito é capaz de atravessar a placenta (COSTA 2012; JONES e DUBEY 2012; JONES et al. 2014). Ao ingerir as formas infectantes cistos e taquizoítos, estas penetram nas células do hospedeiro intermediário, formando o vacúolo parasitóforo, onde se inicia o processo de reprodução assexuada por endodiogenia em vários tipos diferentes de células hospedeiras. A multiplicação ocorre até que a célula se rompa, os traquizoítos são levados pela corrente sanguínea ou linfática penetrando em novas células (COSTA 2012; JONES e DUBEY 2012; JONES et al. 2014). O hospedeiro intermediário pode se contaminar também ao ingerir os oocistos maduros pela água ou comida contaminada, no intestino ocorre a ruptura do oocisto, esporozoítos são liberados, estes se multiplicam nas células intestinais e nódulos linfáticos, forma-se então os traquizoítos que se multiplicam de forma rápida dando continuidade ao processo, essa fase de intensa e rápida multiplicação é a fase aguda, onde os sintomas podem ser observados nos primeiros 5 a 15 dias de infecção (COSTA 2012; JONES e DUBEY 2012; JONES et al. 2014). A transmissão fetal ocorre quando o feto é infectado por taquizoítos que cruzam a placenta a partir da circulação materna durante a infecção primária. Porém, cistos teciduais dormentes de uma infecção anterior podem reiniciar o ciclo de vida do parasito em gestantes imunodeprimidas e, mais raro, em gestantes imunocompetentes. Recentemente tem sido observado casos de reinfecção, os riscos de transmissão materno-fetal e a gravidade das sequelas estão relacionados com a idade gestacional em que a soroconversão materna ocorre (REIS et al. 2006). A infecção fetal pode ser atenuada ou prevenida se houver tratamento da mãe, desde que o diagnóstico seja precoce. Em diferentes países, a frequência de aquisição de toxoplasmose durante a gravidez varia de 1 a 14 casos por gestações; no entanto, a infecção congênita ocorre em 0,2 a 2 em nascimentos (SPALDING et al. 2003). 5

17 Figura 4: Ciclo do Toxoplasma gondii (KAWAZOE, 2003). 1.3 Toxoplasmose Prevalência A toxoplasmose popularmente conhecida como Doença do Gato, é causada por um parasito intracelular obrigatório, T. gondii, cosmopolita, capaz de infectar qualquer espécie de animal de sangue quente (SOUZA, 2014). Mais do que um terço da população mundial está infectada com T. gondii, na Europa Central a soroprevalência é de 37-58% em mulheres e recém-nascidos e em países africanos a soroprevalência é de 54-77%. Nos Estados Unidos, a prevalência é de 10% a 50%, enquanto que na Austrália atingem 4% da população, 20% na Finlândia, 36% na Polônia, 37% na Áustria, 40% na Itália, 48% na Etiópia, 53% na Bélgica, 63% no Panamá, 71% na França e 75% em El Salvador (ROOS et al. 1993). Desmont e 6

18 colaboradores (1965) relacionaram a grande prevalência da infecção encontrada na França com o frequente hábito de ingestão de carne crua ou mal cozida. No Brasil a soroprevalência de infecção do T. gondii na população geral, atinge em torno de 50 e 80% na população adulta (BAHIA-OLIVEIRA et al. 2003). SOUZA et al. (2010), fizeram um levantamento bibliográfico no Brasil, que constatou a soroprevalência de grávidas entre 50% e 80%. No Recife, o índice foi de 64% e 79%; no Rio de Janeiro, de 79%; em Manaus, de 71%; em São Paulo, de 86%; e entre indígenas brasileiros, variou de 52% a 65%. Outros estudos encontraram valores entre 56,4 a 91,6%. No estado do Pará a prevalência foi de 73% (OLIVEIRA, 2002), 56,4% na Bahia (REBOUÇAS et al. 2011), 68,6% (SROKA et al. 2010), em Minas Gerais esse índice foi de 61,2% (CARELLOS et al. 2008), no Rio Grande do Sul foi de 67,3% (LAGO et al. 2009), no Paraná 67% (REICHE et al. 2000), em Goiânia 68,3 (SARTORI et al. 2011), em Mato Grosso do Sul a prevalência foi de 91,6 (FIGUEIRÓ-FILHO et al 2007). A infecção ocorre principalmente em regiões quentes, úmidas e de menor altitude, sendo a população de gatos, hospedeiros definitivos do parasito, importante para aumentar as chances de infecção da população. A infecção em humanos imunocompetentes é assintomática em 80 a 90% dos casos, quando sintomática, é autolimitada e apresenta-se como quadro febril, linfoadenopatia, hepatoesplenomegalia e eventual rash cutâneo. Em pacientes imunocomprometidos podem ocorrer encefalite, coriorretinite, pneumonite e miocardite (FIGUEIRÓ-FILHO. et al. 2007). Apesar desses valores elevados, as maiores preocupações são voltadas aos imunocomprometidos e às gestantes, devido à possibilidade de infecção congênita, que pode ser muitas vezes grave e até letal (MARGONATO et.al. 2007). A toxoplasmose adquirida durante a gestação apresenta especial relevância pelos danos causados ao desenvolvimento do feto. Em geral, o risco de adquirir toxoplasmose durante o período gestacional está relacionado a três fatores: a prevalência na comunidade, o número de contatos com uma fonte de infecção e o número de mulheres suscetíveis (não imunizadas por infecção prévia) na comunidade e nem sempre é proporcional à prevalência da infecção na população (SANTANA et al. 2003; ANDRADE, 2008). 7

19 1.3.2 Prevalência de gestantes infectadas por Toxoplasma gondii A prevalência de soropositividade em gestantes foi observada em estudos de diversos países, conforme Tabela 1: Quadro 1: Prevalência sorológica em gestantes cronicamente infectadas pelo Toxoplasma gondii de diversos países do mundo: País Prevalência Referência Estados Unidos 14,9 Jones et al Coréia 3,7 Han et al Gana 92,5 Ayi et al China 10,6 Liu et al França 43,8 Berger et al Malásia 49 Nissapatorn, et al Espanha 12 Ramos et al Egito 67,5 Deeb et al Etiópia 81,1 Zemene et al México 15,62 Galvan-Ramirez et al Áustria 33 Prusa et al Japão 10,3 Sakikawa et al Reino Unido 17,3 Flatt & Shetty 2013 Legenda: %: percentual A prevalência da infecção por T. gondii em gestantes no Brasil também varia de acordo com as regiões geográficas, como demonstradas na Tabela 2. 8

20 Quadro 2. Prevalência sorológica em gestantes cronicamente infectadas pelo Toxoplasma gondii nas regiões do Brasil Região Estado Cidade Prevalência (%) Referência Norte PA Belém 73 Oliveira 2002 TO Gurupi 68,7 Gontijo-Silva et al Nordeste SE Aracaju 69 InagakiI et al CE Fortaleza 68,6 Sroka et al BA Salvador 56,4 Rebouças et al MA Caxias 77,9 Câmara et al Centro-Oeste GO Goiânia 68,3 Sartori et al MS Campo Grande 91,6 Figueiró-Filho et al Sudeste SP São Paulo 68,8 Guimarães et al MG Belo Horizonte 61,2 Carellos et al SP SP São José do Rio Preto Região noroeste paulista. 64,4 Mattos et al ,27% Furini et al Sul RS Porto Alegre 67,3 Lago et al PR Região 59 Ferezin et al. Noroeste 2013 Legenda: %: percentual PR Medianeira 77,67% Pavan et al No Brasil estudos determinaram uma prevalência da toxoplasmose congênita de 3 a 20/ nascidos vivos (BAHIA-OLIVEIRA et al. 2001; NETO et al. 2000; LAGO, 2006; CAVALHEIRO et al. 2004). Cerca de 80% das crianças infectadas verticalmente não apresenta sintomas no nascimento, vindo a manifestar sinais da doença tardiamente com acometimento principalmente ocular e do sistema nervoso central. Estudos têm demonstrado que estes casos podem apresentar sequelas significativas quando não tratados no 9

21 primeiro ano de vida (WILSON et al. 1980). Nos lactentes com doença manifesta ao nascimento e não tratados, ou tratados por pouco tempo, espera-se uma morbidade substancial em longo prazo. Estudo colaborativo realizado em Chicago(EUA) mostrou, após um período médio de seguimento de 10,5 ± 4,8 anos, que o tratamento prolongado (12 meses) de 120 crianças com toxoplasmose congênita, no primeiro ano de vida, esteve associado a melhor prognóstico visual, auditivo e neurológico, quando comparado com controles históricos de crianças não tratadas ou tratadas por período de tempo muito breve (KOPPE et al. 1986) Prevenção Vários autores ressaltam alguns aspectos preventivos importantes na toxoplasmose. No que diz respeito às gestantes não imunes e suscetíveis, a educação sobre comportamentos preventivos é fundamental (SOUZA et al. 2010). A melhor forma para a prevenção da toxoplasmose congênita é utilizar medidas de prevenção primária com orientações das gestantes soronegativas (IgG e IgM não reagentes) para evitar a exposição dessas mulheres ao parasito. Mesmo sendo incapaz de impedir a mulher de se infectar, a prevenção primária reduz a taxa de soroconversão durante a gestação (FOULON; NAESSENS; DERDE, 1994). A prevenção primária envolve a promoção do conhecimento sobre os meios de evitar a infecção pelo T. gondii. As gestantes devem evitar o consumo de carne crua ou mal cozida, devem lavar as mãos ao manipular carne crua, evitar o consumo de água não filtrada e de leite não pasteurizado, assim como de alimentos expostos à moscas, ratos, baratas, formigas e outros insetos (COOK et al. 2000). Com relação aos felídeos, em especial aos de maior convívio com os humanos, os gatos, devem ser alimentados adequadamente, com ração ou outros produtos comerciais de qualidade. Em caso em que os gatos comem carne, devese utilizar somente se for bem cozida (66 C). Quando o animal recebe alimentação adequada, mesmo caçando, este não se infecta, pois se bem alimentados geralmente eles não comem suas presas. Caixas de areia devem ser lavadas diariamente com água fervente, ou ainda com amônia quartenária. A utilização de monensina (ionóforo carboxílico de Streptomycescinna monensis adicionado a refeição dos gatos) suprime a excreção de oocistos pelos animais. É indicado ainda 10

22 controlar pulgas e moscas para diminuir a chance de funcionarem como vetores mecânicos de oocistos (LANGONI, 2006). Proprietários de gatos devem ser orientados que animais que possuem acesso à rua podem adquirir o parasita, e que o indicado é manter seus gatos dentro de casa e coletar suas fezes diariamente para que se evite com que os oocistos esporulem e se tornem infectantes (DABRITZ e CONRAD, 2010). As fezes dos gatos também podem ser jogadas no vaso sanitário, queimadas ou enterradas profundamente (LANGONI, 2006). Os animais domésticos devem ficar isolados das áreas de preparação de alimentos (PEREIRA et al. 2010). 1.4 Toxoplasmose congênita A toxoplasmose congênita é uma doença infecciosa que resulta da transferência transplacentária de taquizoítas do T. gondii que cruzam a placenta para o concepto, decorrente de infecção primária da mãe, reinfecção ou por reagudização de infecção prévia das mães. O ciclo de vida do parasito pode ser reiniciado em cistos teciduais dormentes de infecções passadas, a infecção por T. gondii na gestante pode causar danos fetais, como aborto, crescimento intrauterino retardado, prematuridade e acometimento neurológico e oftálmico (PENA e DISCACCIATI, 2013). Após a infecção na gestante, o risco de infecção fetal é proporcional ao tempo de gestação, sendo o prognóstico inversamente preocupante. O tempo de gestação no qual a mulher se encontra quando adquire a infecção pelo parasito é muito importante para a patogenicidade da infecção. A incidência da infecção congênita quando a gestante adquire a toxoplasmose durante o primeiro trimestre é pequena (4,5%) e aumenta nos últimos dois trimestres (segundo trimestre, 17,3% e terceiro trimestre, 40-75%) (AMENDOEIRA et.al. 2010; PESSANHA. et.al. 2011). As complicações ao feto mais graves são descritas quando a transmissão vertical ocorre no início da gestação, pois o parasito nesse período pode afetar o processo de organogênese. O risco de desenvolvimento de complicações estimado foi de 61% quando a gestante foi infectada até a 13ª semana, diminuindo para 25% até a 26ª semana e 9% na 36ª semana gestacional (DUNN et al. 1999). 11

23 Quando a infecção ocorre no segundo trimestre da gestação, o bebê pode nascer prematuramente, mostrando sinais de encefalite com convulsões, pleocitose do líquor e calcificações cerebrais. Pode apresentar a tétrade de Sabin: microcefalia com hidrocefalia, coriorretinite, retardo mental e calcificações intracranianasno. No último trimestre da gravidez, o RN pode apresentar, principalmente, pneumonia, miocardite ou hepatite com icterícia, anemia, plaquetopenia, coriorretinite e ausência de ganho de peso, ou pode permanecer assintomático. A transmissão transplacentária ocorre em 10-80% das infecções adquiridas durante a gestação (DUNN et al. 1999). Há poucos relatos de casos de transmissão congênita da toxoplasmose resultante de reativação de infecção crônica em gestantes imunocompetentes por isso alguns autores relatam que gestantes IgG positivas não transmitem a toxoplasmose, exceto em casos raros de reagudização por imunodeficiência (DUNNet al. 1999; TENTER et al. 2000). Entretanto alguns relatos de casos contradizem esses estudos, como demonstrado por Avelar et al. (2015) em que uma gestante imunocompetente cronicamente infectada por T. gondii sofreu reativação ocasionando hidrocefalia e cardiopatia fetal, o qual evoluiu para óbito no inicio do terceiro trimestre de gestação, também há possibilidade de reinfecção com genótipos diferentes de T. gondii, como foi sugerido neste relato de caso. Também foi relatado por HIGA et al. (2010) o caso de uma gestante cronicamente infectada que apresentou reagudização ocular severa, porém durante o acompanhamento pré-natal não foi evidenciada anormalidades fetais. A maioria dos neonatos com toxoplasmose congênita tem doença subclínica ao nascer, podendo apresentar anormalidades da retina e do sistema nervoso central quando são submetidos a exames especializados, ademais apresentam riscos de sequelas oftalmológicas e neurológicas graves à longo prazo (AVELINO et.al. 2014; BOLLANI e STRONATI, 2014; COSTA et.al. 2014). Em torno de 15% dos recém-nascidos infectados as lesões oculares são o único sinal clínico, sendo a retinocoroidite, geralmente bilateral, a principal lesão observada. Esta pode acompanhar-se de outras alterações oculares: iridociclite, catarata, glaucoma, estrabismo, nistagmo e descolamento da retina. A afecção cerebral pode ser reconhecida pela microcefalia, que mostra quadro grave geralmente letal, hidrocefalia de tipo obstrutivo é a manifestação mais frequente (de 12

24 16 a 80%), e pode ocorrer isoladamente. Outros sinais e sintomas neurológicos são o retardo do desenvolvimento neuropsicomotor (DNPM), as calcificações intracranianas, crises convulsivas, opistótono e dificuldades de deglutição (DINIZ, 2006). 1.5 Diagnóstico O diagnóstico da infecção pelo T. gondii durante a gestação e nos recémnascidos, são especialmente importantes pela gravidade das lesões, que se não tratadas, podem ser definitivas, essa é uma das mais danosas doenças para o feto particularmente quando a gestante adquire a infecção nos dois primeiros trimestres da gravidez (CRUZ et al. 2014). O diagnóstico diferencial da toxoplasmose congênita deve ser feito com as infecções do grupo STORCH como a citomegalia, a rubéola, a doença de Chagas, a sífilis e a infecção pelo vírus herpes simples (DINIZ, 2006). Os métodos mais empregados para o diagnóstico da toxoplasmose são realizados por testes sorológicos e pela reação em cadeia da polimerase (PCR), sendo que o diagnóstico sorológico da infecção por T. gondii ocorre com a detecção de anticorpos específicos das classes IgG e IgM (PETRY et al. 1997). As técnicas de biologia molecular têm sido aplicadas com sucesso na detecção do DNA do parasito em líquido amniótico para confirmar a infecção fetal. O diagnóstico molecular tem se mostrado uma importante metodologia no diagnóstico direto da toxoplasmose, a técnica de PCR em líquido amniótico, obtido do exame de amniocentese possui alta especificidade e sensibilidade (97,4%), porém, devido à dificuldade na coleta do material biológico e ao fato de ainda ser limitada aos grandes centros, são empregados somente quando há diagnostico de infecção aguda materna (FIGUEIRO-FILHO et.al. 2007, SENSINI 2006; FRICKER- HIDALGO 2007; TAMMA e SERWINT 2007; MONTOYA e REMINGTON 2008; GARIBYAN e AVASHIA 2013). O diagnóstico materno baseia-se primeiramente na triagem sorológica para anticorpos imunoglobulina M (IgM) e imunoglobulina G (IgG), principalmente através do método Elisa (ensaio imunoenzimático), o qual vem sendo incluído nos exames 13

25 de rotina do pré-natal em quase todo o país, em caso de dúvidas no diagnóstico, outras classes de imunoglobulinas (IgA e IgE), devem ser solicitados, como também outras metodologias para confirmação do diagnóstico. Ainda quando o paciente apresentar IgM e IgG, sororeagentes, o fato de que níveis de anticorpos IgM podem permanecer reagentes no soro até mais de 18 meses após a infecção, não pode ser esquecido, assim métodos alternativos de auxílio diagnóstico devem ser utilizados(figueiro-filho et.al. 2007), nesses casos o ensaio de avidez da IgG pode ser uma importante metodologia pois tem demonstrado que a avidez do anticorpo IgG é baixa na fase aguda da infecção e vai aumentando com o tempo, podendo ser indicativa de uma infecção antiga ou recente (ISABEL et al. 2007). De acordo com FIGUEIRO-FILHO e colaboradores em 2007 com os resultados sorológicos da mãe pode-se determinar a situação clínica dessas gestantes e apresentar cinco propostas de manejo: 1- Gestante com IgG reagente e IgM não reagente: Trata-se de infecção pregressa, não necessitando de condutas adicionais, uma vez que, nessa situação, o risco de transmissão vertical é remoto e mãe/feto não se beneficiam com nenhuma terapêutica. 2- Gestante com IgM e IgG não reagentes: A paciente apresenta-se não imunizada. Deve-se rotineiramente realizar acompanhamento sorológico mensal ou, pelo menos, trimestral, orientando-a sobre higiene e alimentação, a fim de evitar a contaminação durante o pré-natal. 3- Gestante IgM reagente e IgG reagente com teste de avidez de IgG maior que 60% colhido antes da 12ª semana de gravidez, apesar da IgM estar presente, trata-se provavelmente de IgM residual, uma vez que a avidez dos anticorpos IgG mostram-se superior a 60%, indicando infecção ocorrida há mais de 12 semanas. A infecção ocorreu fora do período de risco para o feto, não havendo necessidade de tratamento da gestante. 4- Gestante com IgM reagente e IgG reagente com teste de avidez de IgG menor que 30% colhido antes ou após a 12ª semana de gravidez: Os anticorpos IgM e os valores reduzidos de avidez de anticorpos IgG indicam que a infecção ocorreu há menos de 12 semanas, sendo necessariamente o caso de toxoplasmose aguda materna. Neste caso, 14

26 iniciar o tratamento materno com espiramicina na dose de 3 g/dia ou 9 mui/dia e realizar a busca ativa da infecção fetal através da amniocentese para pesquisa da PCR no líquido amniótico, proceder diagnóstico no neonato. 5- Gestante IgM reagente e IgG reagente com teste de avidez maior que 30% e menor que 60%, colhido antes ou após a 12 ª semana de gestação: Os resultados nessas situações clínicas infelizmente ainda são inconclusivos, devendo cada caso ser analisado individualmente. No exposto acima, fica claro a falta de padronização e o viés existente nos programas de atenção a gestantes, carência essa que pode resultar em consequências graves para recém-nascidos que não são diagnosticados precocemente, infelizmente alguns países e em vários estados do Brasil não incluem toxoplasmose na lista das doenças investigadas durante o pré-natal (MARGONATO et al. 2007; CARELLOS et al. 2008; BRASIL, 2006). A imunoglobulina IgM diagnosticada no sangue fetal, através da cordocentese, utilizada como método diagnóstico de contaminação fetal, apresenta especificidade de 96,7%, sensibilidade de 52%, valor preditivo positivo de 48,8% e negativo de 97,4%. A IgM fetal pode estar presente de forma inconstante devido à imaturidade do sistema imunológico do feto, tornando-se difícil a interpretação do diagnóstico na presença isolada desse tipo de anticorpo, já a positividade de anticorpos da classe IgM, 10 dias após o parto, define ou confirma a infecção congênita (FIGUEIRO-FILHO et.al. 2007). A imunoglobulina IgG específica atravessa a placenta e a sua presença até hoje não é utilizada como um marcador de infecção congênita, já que quando adquirida passivamente pela mãe desaparecem dentro de 6 a 12 meses de idade. Por esta razão, a investigação sorológica do neonato hoje se concentra na detecção de ambas as imunoglobulinas específicas de T. gondii, IgM e IgA, porém cerca de 15-55% dos recém-nascidos infectados congenitamente não têm IgM específico detectável após o nascimento ou nos primeiros meses (GUY 2014, BOLLANI et al. 2013). Na ausência de qualquer sinal clínico, e com perfil sorológico das imunoglobulinas de resposta aguda negativo, o diagnóstico pode ser retardado até 15

27 que seja comprovada a observação de títulos de IgG específicos persistentes ou aumentados após vários meses de vida do recém-nascido (CAPOBIANGO et.al. 2016). 1.6 Imunoglobulina G e avidez de IgG IgG e IgM são anticorpos que o organismo produz quando entra em contato com algum tipo de microorganismo invasor (antígeno). A diferença entre eles é que o IgM é produzido na fase aguda da infecção, enquanto que o IgG, que também surge na fase aguda persiste por toda a vida do indivíduo. (ROITT e RABSON, 2003). O teste de avidez de anticorpos IgG analisa a força de ligação do complexo formado antígeno-anticorpo. Na fase aguda da doença, uma vez que a síntese de anticorpos é recente, a ligação do complexo antígeno-anticorpo (Ag Ac) é facilmente dissociável, concluindo que a IgG tem reduzida avidez pelo antígeno. Já na fase crônica, formam-se complexos Ag -Ac de difícil dissociação, representando resultado com IgG de elevada avidez, ou seja, síntese já tardia dos anticorpos (FIGUEIRÓ-FILHOet al. 2007). Na maioria dos casos os pacientes com infecção aguda apresentam um baixo índice de avidez (< 30%, e/ou de acordo com Kit utilizado), sugerindo que a infecção ocorreu dentro de cinco meses, enquanto aqueles com infecção tardia têm um alto índice de avidez (>30%, e/ou de acordo com Kit utilizado) (POUR ABOLGHASEM et al. 2011). 1.7 Programas de triagem neonatal - Teste do pezinho A triagem neonatal realizada no Brasil desde 2002 se dá por meio do programa teste do pezinho. Teste realizado em papel filtro e coletado logo nos primeiros dias de vida, tem o objetivo de rastrear e detectar patologias e vêm incluindo novos diagnósticos e métodos mais eficazes e capazes de identificar, 16

28 além de doenças metabólicas, outros tipos de patologias como as hematológicas, infecciosas e genéticas (BRASIL, 2002). A amostragem coletada em papel filtro apresenta pontos positivos, como a coleta e o armazenamento fácil, necessidade de pouca estrutura e recursos humanos, capacidade de gerar respostas rápidas (via internet e correio) e baixo custo. Ainda se mostrando melhor devido ao fato de que o transporte das amostras convencionais de sangue (via tubos de ensaio) pode alterar as características do sangue se não houver refrigeração adequada e ainda existem chances de ocorrer acidentes com o material. Com o papel filtro, o transporte pode ser feito até pelo correio, temperatura ambiente, sem alteração dos resultados (MINUZZI, 2008). Atualmente há três tipos de teste do pezinho disponibilizados no Brasil, entretanto o Sistema Único de Saúde (SUS) aplica apenas o teste do pezinho básico que é composto por seis diagnósticos: fenilcetonúria, hipotireoidismo congênito, anemia falciforme (e demais hemoglobinopatias), fibrose cística, deficiência de biotinidase e hiperplasia adrenal congênita. No teste do pezinho MAIS, além do que se detecta no teste básico, inclui mais quatro diagnósticos: deficiência de G-6-PD, galactosemia, leucinose e toxoplasmose congênita. O teste do pezinho SUPER inclui em seu painel, além das 10 doenças dos testes básico e MAIS, outros 38 diagnósticos de aminoacidopatias, defeitos do metabolismo dos ácidos graxos e das acidemias orgânicas, realizados através da avançada tecnologia de Espectrometria de Massas (APAE São Paulo-SP 2016). A toxoplasmose não faz parte da gama de doenças pesquisadas pelo plano básico, ofertado teste do SUS, a detecção precoce de crianças congenitamente infectadas por meio da identificação dos anticorpos específicos das classes IgG e IgM no teste do pezinho poderá auxiliar a minimizar os pontos negativos observados nos programas de pré-natal, bem como auxiliar no mais precoce e acertado diagnóstico neonatal podendo se mostrar uma importante medida de controle primário da toxoplasmose congênita. 1.8 Tratamento 17

29 Desde 1990 o tratamento padrão permanece o mesmo, focando em alterar o metabolismo de nucleotídeos do parasito. A terapia é fundamentada em uma combinação sinérgica de pirimetamina e sulfadiazina, medicamentos que promovem o bloqueio da síntese e diminuição dos níveis de ácido fólico nos taquizoítos (VAZ et al. 2010). O tratamento específico nem sempre é indicado nos casos em que o hospedeiro é imunocompetente, exceto em infecção inicial durante a gestação ou na vigência de comprometimento de outros órgãos, como coriorretinite e miocardite. Recomenda-se o tratamento em gestantes, recém-nascidos e pacientes imunodeprimidos (BRASIL, 2002). As gestantes que apresentarem suspeita de infecção por T. gondii adquirida durante a gestação devem ser imediatamente tratadas com espiramicina, que é ministrada para prevenir a transmissão do T. gondii para o feto. A etapa seguinte deverá investigar a infecção do feto pelo protozoário. Se a infecção toxoplásmica fetal for confirmada o tratamento específico da mãe com pirimetamina, sulfadiazina e ácido folínico deverá ser considerado(amendoeira, 2010). Durante o tratamento, as gestantes devem ser monitoradas com relação à toxicidade dos medicamentos. A pirimetamina é um inibidor da síntese de ácido fólico e, portanto, é uma droga tóxica para a medula; desse modo, a paciente deverá receber ácido folínico (nunca ácido fólico, que anula a ação terapêutica da pirimetamina) para prevenir alterações como neutropenia, trombocitopenia e anemia. Nos casos em que a infecção fetal não for confirmada, o tratamento com espiramicina poderá ser continuado durante toda a gestação (AMENDOEIRA, 2010). Os medicamentos empregados atuam somente nas formas taquizoítas, presentes na fase aguda da infecção não afetando os bradizoítas presentes em cistos teciduais que persistem no indivíduo durante a fase crônica o que dificulta o tratamento, pois não invibiabiliza possível reagudização da doença mesmo após o tratamento (MARTINS-DUARTE et.al. 2011). O diagnóstico precoce e o subsequente tratamento da criança infectada sintomática ou assintomática deve ser iniciado o quanto antes e prolongar-se até no mínimo um ano de idade, pois pode minimizar as repercussões auditivas e visuais e 18

30 melhorar o prognóstico (AMENDOEIRA, 2010). O esquema terapêutico proposto no ano de 1984 ainda é o mais difundido e consiste no emprego alternado de espiramicina com sulfadiazina e pirimetamina durante um ano, de acordo com o estado clínico. O esquema utilizado consiste na administração oral de sulfadiazina ( mg/kg/dia divididos em duas a quatro doses), associada a pirimetamina (1 mg/kg/dose em dias alternados durante o período neonatal, seguido de duas administrações diárias) e ácido folínico (3 mg/dia diariamente quando por via oral e três vezes na semana quando por via intramuscular). Quando houver coriorretinite ativa e/ou meningoencefalite associa-se prednisona (2-3 mg/kg/dia) até que as lesões estejam inativas (RODRIGUES, 2013). A detecção precoce de gestantes e de crianças infectadas congenitamente é de suma importância no tratamento e prognóstico dos pacientes com toxoplasmose, uma vez que o quanto antes o tratamento for iniciado menor serão as sequelas deixadas pelo parasito no indivíduo. 19

31 2 JUSTIFICATIVA Diante da elevada soroprevalência de toxoplasmose na população em geral entre 40 e 80% (MARGONATO, et al. 2007), e da probabilidade das gestantes não infectadas soroconverterem, o risco de infecção congênita é importante, e consequentemente as sérias complicações que a infecção congênita pelo T. gondii pode trazer ao neonato. A preocupação com as gestantes e com os RN se torna constante e crescente, assim como o diagnóstico e tratamento precoce do RN. O diagnóstico clínico da toxoplasmose congênita é complexo, e por vezes, impreciso, pois a maioria das gestantes são assintomáticas, e quando apresentam sintomatologia estas que podem ser confundidas com as causadas por outros agentes infecciosos como: Citomegalovírus, Herpes simples, Rubéola, HIV, Epstein Barr, Treponema pallidum, Listeria monocytogenes, Borrelia burgdorferi e Trypanosoma cruzi. Outras doenças também podem apresentar sinais clínicos semelhantes como a eritroblastose fetal e determinadas doenças degenerativas. O exame clínico apenas sugere a eventualidade dessa etiologia, mesmo na toxoplasmose sintomática (REY,2010). A confirmação da infecção fica geralmente a cargo de exames laboratoriais que identifiquem o parasito ou a presença de anticorpos específicos que não atravessam a barreira placentária (IgA, IgM ou IgE) no sangue do paciente. A imunoglobulina IgG, por ser um marcador de infecção crônica, não é utilizada como um marcador de infecção congênita. Entretanto, quando os níveis de IgG são diferenciados dos maternos podem sugerir a infecção (FERREIRA, 2001). Apesar da maioria dos estudos focarem no valor preditivo do teste de avidez de IgG em gestantes, o estudo de Buffolano et al. (2004) avaliou a relação deste teste com a detecção da toxoplasmose congênita em RN. Existem poucos trabalhos na literatura com enfoque da utilização da avidez no sangue de recém-nascidos, Buffolano et al. (2004), observaram baixos valores de avidez de IgG em neonatos infectados, os quais refletiam os valores maternos. Sob tais condições, a presença 20

32 de baixa avidez de IgG no recém-nascido poderia indicar infecção primária materna, com um considerável risco de transmissão vertical, uma vez que indicam infecção recente pode-se predizer que a gestante se infectou nos últimos meses de gestação ou também uma já produção de IgG de baixa avidez por parte do RN, o que em ambos os casos é de grande importância no diagnóstico e no mais precoce e acertado tratamento. Existe uma necessidade de dinamizar, obtendo um diagnóstico precoce e rápido utilizando um método de baixo custo e complexidade que permita aos laboratórios de referência para a toxoplasmose A avaliação da IgG bem como da avidez de IgG pode ser um método auxiliar na otimização desse diagnóstico. A utilização das amostras de sangue coletadas em papel filtro pode proporcionar um maior acesso a triagem de patologias em localidades de difícil acesso e com recursos escassos, pois é um meio com baixo custo de coleta e armazenamento de amostras, uma vez que estas são estáveis, não infectantes e não necessitam de acondicionamento específico. Devido à sua praticidade pode se tornar acessível permitindo a implementação dessa técnica em programas de saúde da rede pública, principalmente em um país como o Brasil, que possui elevada soroprevalência de toxoplasmose (MINUZZI, 2008). A detecção precoce de crianças congenitamente infectadas atraves da iclusão da sorologia para toxoplasmose ao teste do pezinho poderá auxiliar a minimizar os pontos negativos observados no programa vigente de pré-natal, podendo assim ser uma importante medida de controle secundário da toxoplasmose congênita. O presente estudo apresenta um caráter inovador por buscar a padronização da técnica de avidez de anticorpos IgG em soros e sangue coletados em papel filtro de RN, a utilização da técnica de avidez de IgG em papel filtro ainda não foi descrita na literatura, mesmo esse método de coleta sendo hoje bastante empregado, inclusive no diagnóstico da toxoplasmose em grupos considerados de risco: gestantes e RN. O presente estudo visa avaliar a utilização do teste de avidez de anticorpos IgG em RN, além da avaliação da sensibilidade do teste quando realizado em papel filtro, método diagnóstico até então não padronizado, buscando assim maior 21

33 aprimoramento para um mais ágil e eficaz diagnóstico clínico e laboratorial desses RN e contribuindo assim para o mais precoce e acertado tratamento melhorando o prognóstico desses pacientes. 22

34 3 OBJETIVOS 3.1. OBJETIVO GERAL Avaliação de anticorpos anti-t. gondii da classe IgM e IgG em em amostras de sangue coletadas em papel filtro e sangue periférico e o valor prognóstico do teste de Avidez da IgG, como indicativo de infecção congênita OBJETIVOS ESPECÍFICOS - Avaliar a eficácia da triagem de infecção congênita para toxoplasmose pela sorologia (IgM e IgG) em amostras de sangue coletadas em papel filtro. - Avaliar e comparar a testes sorológicos realizados dos recém-nascidos, a partir do sangue total coletado em papel filtro com a sorologia realizada em amostras coletadas com sangue periférico após três meses da primeira coleta. - Relacionar os resultados obtidos dos títulos de IgG em sangue dos recémnascidos com os resultados do sangue periférico obtidos de suas respectivas mães, coletados simultaneamente. - Comparar e avaliar a utilização do teste de avidez de IgG em soro e em papel filtro coletados de recém-nascidos com baixos índices de IgG (entre 0,9 e 1,5) como indicação de infecção recente. - Validar o teste de avidez de IgG em amostras de sangue coletadas em papel filtro. 23

35 4 METODOLOGIA 4.1 Local de estudo A pesquisa foi realizada de acordo com a Resolução 466/12 do Conselho Nacional de Saúde (CNS). O projeto foi inserido na Plataforma Brasil onde foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital das Clínicas-UFG (HC-UFG) com o número do parecer 943/941 em 11 de fevereiro de Todas as participantes da pesquisa, foram informadas sobre os objetivos da pesquisa onde foram incluídas na pesquisa as que concordaram e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido-tcle, sendo este o fator de inclusão, e de exclusão as que não concordaram em participar da pesquisa. Este estudo é prospectivo, foram avaliados sangues coletados em papel filtro de RNs advindos das maternidades do Hospital das Clínicas/UFG de Goiânia-GO (HC-UFG), maternidade Dona Iris (HMDI) do mesmo município e Cais Nova Era (CNE) em Aparecida de Goiânia. Essas unidades de coleta foram escolhidas por conveniência, HMDI e CNE e por realizarem um elevado número de testes do pezinho e no HC-UFG por atenderem pacientes de alto risco. 4.2 População de estudo Foram analisadas amostras de sangue periférico coletados em papel filtro, durante a realização do teste do Pezinho, e posteriormente, segundo critérios que serão descritos a seguir, procedeu-se a coleta de sangue periférico da criança e de sua respectiva mãe, todos os pacientes eram provenientes da rede pública de Goiânia no período de abril de 2016 a fevereiro de Obtenção de amostras 24

36 A primeira coleta foi realizada na lateral da região plantar do recém-nascido em papel filtro Wathman n 1, para isso os recém-nascidos ficaram em posição de arroto para uma boa circulação de sangue nos pés. Após o preenchimento dos círculos de papel filtro com amostras de sangue, foram identificados e posicionados em prateleiras em posição horizontal para evitar o contato com outras amostras de forma que pudessem secar adequadamente em temperatura ambiente, entre 15 a 20 C por cerca de três horas. Após a secagem as amostras biológicas foram encaminhadas ao Laboratório de estudos da Relação Parasito Hospedeiro da Universidade Federal de Goiás (Laerph-UFG). 4.4 Testes sorológicos Foram realizados os testes sorológicos das imunoglobulinas das classes IgM e IgG em papel filtro, utilizando o teste imunoenzimático (Elisa) com antígenos fixados em placas plásticas, o Kit utilizado foi o ImunotoxoBioclin-Quibasa S/A do Brasil. Em todas as amostras de RN com índices maior e/ou igual a três ( 3) foram solicitadas recoletas de sangue periférico de mãe e filho, para a pesquisa de anticorpos IgG para comparação de títulos bem como para a realização do teste de avidez de IgG do RN. Para o teste de avidez, utilizamos o mesmo Kit comercial citado acima, com modificações segundo RAHBARI et.al, Para determinação da reatividade foram utilizadas duas placas de forma simultânea A e B. As amostras de soros foram diluídas em 1/200 e adicionadas (100 microlitros/cavidade), após incubação a placa A foi lavada cinco vezes com tampão de amostra do Kit e a placa B foi lavada três vezes com tampão de amostra contendo uréia 6 Molar, posteriormente as placas foram tratadas de acordo com a bula do fabricante, conforme esquematizado no Quadro 1. 25

37 TÉCNICA PADRÃO Pipetagem de 100μl de diluente de amostra + 5μl de amostra Incubação por 30 minutos à 37 C Primeira lavagem com 300μl de solução de lavagem previamente preparada conforme bula do fabricante Pipetagem de 100μl de conjugado Incubação por 30 minutos à 37 C Segunda lavagem com 300μl de solução de lavagem previamente preparada conforme bula do fabricante Pipetagem de 50μl de substrato A e 50μl de substrato B Incubação por 10 minutos à 37 C Pipetagem de 50μl de solução stop Leitura nos filtros 450nm e 630nm TÉCNICA EM PAPEL FILTRO Picotagem com perfurador específico de 5mm de diâmetro + 100μl de diluente de amostra Incubação por 30 minutos à 37 C Retirada dos papéis filtro e primeira lavagem com 300μl de solução de lavagem previamente preparada conforme bula do fabricante Pipetagem de 100μl de conjugado Incubação por 30 minutos à 37 C Segunda lavagem com 300μl de solução de lavagem previamente preparada conforme bula do fabricante Pipetagem de 50μl de substrato A e 50μl de substrato B Incubação por 10 minutos à 37 C Pipetagem de 50μl de solução stop Leitura nos filtros 450nm e 630nm TÉCNICA DE AVIDEZ DE IgG Pipetagem de 100μl de diluente de amostra + 5μl de amostra Incubação por 30 minutos à 37 C Primeira lavagem com 300μl de solução de Ureia 6M previamente preparada Pipetagem de 100μl de conjugado Incubação por 30 minutos à 37 C Segunda lavagem com 300μl de solução de lavagem previamente preparada conforme bula do fabricante Pipetagem de 50μl de substrato A e 50μl de substrato B Incubação por 10 minutos à 37 C Pipetagem de 50μl de solução stop Leitura nos filtros 450nm e 630nm QUADRO 1: Descrição das técnicas de Elisa (Ensaio imunoenzimático) padronizadas in house e segundo protocolo de RAHBARI et.al, 2012 para realização do presente estudo. Legenda: μl: microlitros; nm: nanômetros; M: molar). Para validação da técnica utilizada e padronização do recorte de 5mm do papel filtro foram realizados testes em paralelo nas amostras coletadas em papel filtro em kit comercial Virion serion próprio para papel filtro, no kit ImunotoxoBioclin-Quibasa S/A do Brasil e em soros dos respectivos pacientes. 26

38 Após as leituras e validações técnicas, foi calculado o Cut-Off de cada placa e os índices de cada amostra. O índice de avidez em porcentagem foi calculado, através da divisão do resultado da absorbância de poços lavados com PBS-ureia (U+) pelas absorbâncias de poços lavados com PBS (U-) e multiplicada por 100, com base na fórmula; AI = Abs (U+) / Abs (U-) x 100 (RAHBARI et.al, 2012). 27

39 5 RESULTADOS /DISCUSSÃO 5.1- Resultados sorológicos em papel filtro: Foram coletadas amostras de sangue total em papel filtro de recémnascidos com idade entre três a sete dias, atendidos no Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás (HC-UFG), Hospital Maternidade Dona Íris (HMDI) e Cais Nova Era (CNE). Foi possível detectar em 0,16% (02/1277) das amostras a presença de anticorpos IgM anti-t. gondii, pelo teste de Elisa e em 44,1% (564/1277) das amostras a presença de anticorpos IgG anti-t. gondii. Das 567 amostras de sangue coletadas em papel filtro que foram reagentes para IgG, 57,67% (327/567) apresentaram índice de absorbância com valor 3.0 conforme representado na Tabela 1. Tabela 1: Soroprevalência da Imunoglobulina G anti-toxoplasma gondii, obtidas pelo Teste de Elisa em amostras de sangue total de recém-nascidos coletados em papel filtro, em três unidades básicas de saúde, duas em Goiânia e uma em Aparecida de Goiânia, Goiás, Brasil. Índices dos pacientes coletados Número de pacientes Sorologia negativa (índice < 0,9) 706 (55,29%) Sorologia indeterminada (índice de 0,9-1,1) 7 (0,55%) Sororeagentes (índice de 1,1-3,0) 237 (18,55%) Sororeagentes (índice 3,0) 327 (25,61%) Total de amostras 1277 (100%) Legenda: Nº: número absoluto; %: Percentual. A prevalência da infecção por T. gondii em gestantes no Brasil varia de acordo com as regiões geográficas entre 40 a 80%, em Goiânia-GO, Sartori et al. (2011) detectaram na população estudada uma prevalência de 68,3%, Avelar et al. (2013), encontraram uma prevalência de 51,9% de gestantes IgG positivas atendidas no Hospital das Clínicas-UFG e 42,3% na Maternidade Nossa Senhora de 28

40 Lourdes, Goiânia. Os dados encontrados neste trabalho (44,1% de amostras soropositivas), mesmo sendo inferidos pelos resultados encontrados na sorologia de papel filtro de recém-nascidos, corroboram com os estudos citados anteriormente, visto que o IgG atravessa a barreira placentária, podemos presumir a soroprevalência das mães dos recém-nascidos estudados. A detecção de um paciente IgM positivo sugere infecção congênita, como a população estudada foi de recém-nascidos que foram fazer o teste do pezinho, na primeira semana de vida, sem indicação/sintomatologia de infecção congênita e que as mães não foram consideradas de risco durante a gestação. Este resultado é importante por ser indicador de infecção congênita, bem como reflete a dificuldade na detecção de diagnóstico das gestantes durante o pré-natal, consequentemente dificultando a identificação e tratamento precoce das crianças infectados congenitamente. Estes dados demonstram o viés que temos nos programas de pré-natal vigentes e a necessidade da implementação do teste diagnóstico para toxoplasmose na triagem neonatal disponibilizado pelo SUS, visto que auxiliaria no viés dos testes pré-natal bem como no diagnóstico precoce do RN e mais acertado tratamento (AVELAR, 2013) Confirmação dos resultados obtidos nas amostras coletadas em papel filtro, com as amostras coletadas de sangue periférico dos Recémnascidos De acordo com a metodologia proposta, as amostras de sangue coletadas em papel filtro das crianças em que os títulos por Elisa foram 3, a mãe foi contatada, e foram realizadas coletas de sangue periférico da criança e de sua respectiva mãe, no final do primeiro trimestre de vida. Foi possível coletar 177 pares de amostras dos 327 RN, justificamos esse número devido à dificuldade de comunicação com os responsáveis das crianças e também a falta de interesse dos mesmos em permitir uma segunda coleta de sangue, pois as crianças eram aparentemente assintomáticas, salientamos que a falta de comunicação é um dos grandes problemas no diagnóstico da toxoplasmose congênita, pois o RN muitas vezes nasce assintomático e só apresenta sequelas meses ou até anos após o nascimento (KOPPE et al. 1986; MONTOYA e LIESENFELD 2004; DUBEY, 2010). 29

41 Das 177 amostras de sangue periférico de recém-nascidos coletadas após três meses referentes à primeira coleta, 167 (94,36%) apresentaram resultados concordantes com a sorologia realizada tanto em papel filtro quanto em sangue periférico. Em dez (5,64%) amostras, os resultados foram discordantes, esta discordância com os resultados obtidos em papel filtro. Este fato pode ser explicado pela sensibilidade do teste de Elisa, que é de 61,1 a 99.3%. Apesar desta pequena discordância, a utilização de sorologia em amostras coletadas em papel filtro, já foi padronizada, e é amplamente utilizada, com boa eficiência na reprodução da técnica (DUNN et al. 1999; NAESSENS et al. 1999; ZHANG et al. 2015). Houve uma elevada porcentagem de detecção concordante de anticorpos da classe IgG (94,36%) nas coletas de sangue periférico e em papel filtro. Conforme demonstrado na Tabela 2. Tabela 2. Concordância dos resultados sorológicos para toxoplasmose de amostras de sangue coletadas em papel filtro e de sangue periférico (após três meses de nascimento) pelo teste de Elisa. Relação de amostras Nº % PF e SP reagente IgG ,36% PF reagente e SP não reagente IgG 10 5,64% Total de amostras % Legenda: PF: papel filtro; SP: sangue periférico; IgG: Imunoglobulina G; Nº: número absoluto; %: Percentual. 30

42 5.3- Comparação da sorologia em amostras coletadas simultaneamente de sangue periférico dos lactentes e suas respectivas mães: Dos 177 pares de recoletas (mães e filhos) realizadas, todas apresentaram resultados negativos para IgM. Em 5 pares (2,82%), a sorologia da mãe foi positiva, mas a de sua respectiva criança, negativa. Em 167 pares (94,36%) de amostras tanto da mãe quanto do filho foi detectada a presença de anticorpos IgG anti-t. gondii. Vale resaltar que o fato de que em quatro casos a sorologia materna diferiu da sorologia do RN, podendo ser justificados pela diminuição dos níveis destes anticorpos específicos provenientes das mães. A IgG possui meia-vida de quatro semanas e a coleta de sangue periférico foi realizada em até três meses, após a coleta no papel filtro (DUNN et al. 1999; NAESSENS et al. 1999). Em 5 pares (2,82%) os resultados obtidos no papel filtro dos RN não foram concordantes com os resultados obtidos do sangue periférico, e a sorologia as amostras de mãe e filho, foram negativas, pelas técnicas utilizadas, como demonstrado na Tabela 3. Tabela 3: Comparação de títulos de Imunoglobulina G anti-toxoplasma gondii, obtidas pelo Teste de Elisa em amostras de soro das crianças e suas respectivas mães coletados após três meses do nascimento, em Goiânia, Goiás. Resultado Mãe Filho N % N % Reagente (IgM) Reagente , ,36 (IgG) Mãe reagente 5 2,82% 5 2,82% e filho Não reagente (IgG) Mãe e filho 5 2,82% 5 2,82% não reagentes (IgG) Total de amostras % % Legenda: IgM: Imunoglobulina M; IgG: Imunoglobulina G; Nº: número absoluto; %: Percentual 31

43 5.3- Teste de Avidez A afinidade funcional dos anticorpos IgG pelos antígenos é baixa na resposta antigênica primária e aumenta após o amadurecimento do sistema imunológico (PENA, 2013). O teste de avidez de anticorpos IgG analisa a força de ligação do complexo formado antígeno-anticorpo. Na fase aguda da doença, uma vez que a síntese de anticorpos é recente, a ligação do complexo antígeno-anticorpo (Ag Ac) é facilmente dissociável, concluindo que a IgG tem reduzida avidez pelo antígeno, sendo esses considerados de baixa avidez (< 30%, dependendo do Kit e protocolo utilizado). Já na fase crônica, formam-se complexos Ag Ac de difícil dissociação, representando resultado com IgG de elevada avidez, ou seja, síntese já tardia dos anticorpos, considerados de alta avidez (FIGUEIRÓ-FILHO et. Al. 2007). Das 167 amostras das crianças mantiveram-se IgG positivas após 3 meses e em concordância com a sorologia materna, foram realizadas teste de avidez de IgG com o intuito de investigar a força de ligação dessa imunoglobulina com o epítopo do antígeno, afim de verificar se a infecção se tratava de uma infecção recente ou de uma infecção pregressa da progenitora. Das 167 amostras IgG positivas analisadas, 163 (97,60%) das amostras das crianças apresentaram alta avidez de anticorpos, 4 (2,40%) das amostras apresentaram baixa avidez de anticorpo IgG conforme demonstrado no Gráfico 1 indicando uma infecção recente, salientando que a IgG passa pela barreira placentária, desta forma este resultado deve ser confirmado por outras metodologias. Estes dados sugerem probabilidade de transmissão congênita e que a triagem das crianças com elevado título de IgG, associado ao teste de avidez, pode contribuir no rastreamento e no diagnóstico precoce de toxoplasmose pósnatal. 32

44 Pacientes com IgG de alta avidez Pacientes com IgG de baixa avidez Gráfico 1: Comparação da avidez de IgG em amostras de soro coletadas de crianças aos três meses de vida, previamente triadas por sorologia em papel filtro. Apesar de a proposta inicial ter sido somente fazer avidez nas amostras que apresentassem altas concentrações de IgG, surgiu a dúvida se não seria interessante avaliar as amostras que também possuíam baixas concentrações de IgG, pois poderiam representar o início de produção desta imunoglobulina, assim o teste de avidez de IgG também foi realizado nas amostras de papel filtro coletadas juntamente com o teste do pezinho que obtiveram índices baixos e indeterminados (entre 0,9 e 1,5) das 28 amostras analisadas todas apresentavam avidez de IgG maior que 30% indicando não se tratar de uma produção recente de anticorpos IgG mas sim de uma infecção pregressa da progenitora. Validando a estratégia de se testar somente as amostras que apresentarem altas concentrações de IgG, na primeira coleta. Também com o objetivo de validar e comparar os resultados e validar a técnica de avidez de IgG em papel filtro, foi possível nas 177 recoletas, realizar em 17 amostras a coleta simultânea de sangue periférico e papel filtro da mesma criança). Nesta análise, uma (5,88%) das amostras testadas em duplicada apresentou baixa avidez de IgG e obteve concordância entre os resultados obtidos em soro e em papel filtro, 16 (94,12%) das amostras apresentaram alta avidez, com concordância de 100% entre os resultados obtidos em soro e em papel filtro, 33

45 conforme demonstrado na Tabela 4, evidenciando que a técnica de Avidez de IgG pode ser empregada em amostras coletadas em papel filtro dinamizando assim o diagnóstico de toxoplasmose. Tabela 4: Comparação dos valores de Avidez de Imunoglobulina G anti-toxoplasma gondii, obtidas pelo Teste de Elisa em amostras de soro e papel filtro coletados após três meses do nascimento, em Goiânia, Goiás. Amostras Avidez de IgG Soro Avidez de IgG Papel Filtro IgG - Soro (Índice/ELISA) IgG- Papel Filtro (Índice/ELISA) Paciente 1 26% 26% 3,52 3,31 Paciente 2 52% 56% 2,94 2,75 Paciente 3 48% 43% 2,65 2,37 Paciente 4 89% 89% 2,04 1,47 Paciente 5 61% 87% 1,51 1,71 Paciente 6 56% 73% 2,0 2,02 Paciente 7 87% 86% 1,27 0,99 Paciente 8 95% 77% 16,70 17,21 Paciente 9 76% 84% 1,24 1,56 Paciente 10 77% 88% 3,72 2,59 Paciente 11 81% 91% 5,13 4,60 Paciente 12 86% 73% 3,44 4,53 Paciente 13 52% 55% 3,86 3,54 Paciente 14 72% 81% 2,25 2,18 Paciente 15 94% 92% 1,88 1,83 Paciente 16 53% 99% 4,72 2,17 Paciente 17 52% 55% 3,86 3,54 Legenda: IgG: Imunoglobulina G; PF: Papel filtro; %: Percentual Canales e colaboradores em 2010 demonstraram que o teste de avidez de IgG pode ser útil para o diagnóstico de toxoplasmose aguda e tem 100% de 34

46 concordância com o teste de referência (IgM qualitativa + IgG quantitativa). Deshpandee e colaboradores em 2013 demonstraram que a distinção entre toxoplasmose aguda e crônica é possível por meio da determinação de avidez de IgG pela técnica de Western blot. Fonseca et al. (2016) demonstraram que RN expostos ao T. gondii apresentam aumento nos níveis séricos de IgM e IgG e com baixa avidez de IgG específicos exibem sintomas mais severos de toxoplasmose congênita. Adicionalmente, a elevada avidez de IgG no RN indica provável redução no risco de infecção por T. gondii. Os dados da literatura, associados aos encontrados neste trabalho evidenciam que o teste de avidez poderá ser mais um método valioso a ser utilizado no diagnóstico da toxoplasmose congênita em RN, salientando a facilidade e baixo custo de implementação desta metodologia. As amostras que apresentarem altas concentrações de IgG, detectadas no teste do Pezinho Básico do programa de pós-natal, oferecido pelo SUS, em âmbito nacional Relatos como o de Vieira em 2008 em Brasília-DF, de um caso de toxoplasmose congênita assintomático onde o RN ao nascer apresentou títulos de IgG elevados, e demais exames clínicos e laboratoriais negativos, para transmissão vertical, os anticorpos da classe IgG foram decrescentes durante os primeiros meses de vida, sendo compatíveis com a curva de queda de anticorpos passivos transmitidos da mãe ao feto. Porém, observou-se a ascensão tardia de anticorpos (após o quinto mês) se justificando pelo fato de que a transmissão materno-fetal ocorreu no fim da gestação, e a produção de anticorpos pelo RN iniciou-se mais tardiamente, e só foi detectada após o quinto mês de vida. Casos como este poderiam ter sido diagnosticados precocemente utilizando-se a avaliação de avidez de IgG pós-natal contribuindo assim para o precoce diagnóstico do RN. O teste de avidez de IgG específica para T. gondii constitui uma importante ferramenta diagnóstica para toxoplasmose durante o pré-natal, identificando os casos de infecção aguda e que realmente precisam de tratamento, o presente estudo acorda com a literatura no sentido de que o teste é de grande importância no diagnóstico de toxoplasmose também no grupo de pacientes abordados, os RN. O teste do pezinho é um programa que atua na prevenção de doenças genéticas, metabólicas e infecciosas, antes que os sintomas se tornem evidentes. O teste é seguro, simples, rápido e praticamente indolor (GARCIA et al. 2007). A importância do Teste Triagem Neonatal ( Teste do Pezinho ) é o rastreamento 35

47 neonatal de crianças portadoras de doenças que devem ser diagnosticadas e tratadas o mais precocemente possível a fim de evitar sequelas para o paciente, ou então, doenças com elevada morbi-mortalidade, que podem ser diminuídas através de alguns cuidados básicos de saúde, como no caso da Anemia Falciforme e de outras hemoglobinopatias e da Fibrose Cística (uso profilático de antibióticos, vacinação adequada; uso de ácido fólico) (MINISTÉRIO DA SAÚDE). A triagem para toxoplasmose dos RN com elevado título de IgG, associado ao teste de avidez, podem ser realizados em papel filtro, podendo assim serem acrescentados ao teste do pezinho vigente e esse método pode contribuir no rastreamento e no diagnóstico precoce de toxoplasmose. 36

48 6 CONCLUSÕES - A triagem sorológica de recém-nascidos para toxoplasmose por papel filtro se mostrou eficiente, foi possível detectar a presença de anticorpos específicos da classe IgM em 0,16% das amostras e IgG anti-t. gondii em 94,36% das amostras analisadas, o teste de avidez de IgG se mostrou eficiente pois foi possível detectar pacientes com baixa avidez de IgG em 2,40% das amostras analisadas, tendo se mostrado eficiente na determinação precoce da toxoplasmose congênita. - Os resultados obtidos por Elisa em amostras coletadas em papel filtro foram concordantes com os obtidos em amostras obtidas de sangue periférico, dos recém-nascidos. - Houve concordância em 94,36%, da sorologia em sangue periférico da criança com sua respectiva mãe demonstrando que a sorologia em papel filtro pode ser utilizada para seleção de crianças com suspeita de infecção congênita pelo T. gondii. - A utilização do teste de avidez de IgG em soro e em papel filtro coletados de recém-nascidos com baixos índices de IgG (entre 0,9 e 1,5) se mostrou desnecessária visto que todos os pacientes nessa faixa de concentração de IgG apresentaram alta avidez. 37

49 - O teste de avidez de IgG para T. gondii é de grande importância no diagnóstico de toxoplasmose congênita, pois foi possível detectar 4 RN com baixa avidez em 167 amostras analisadas. - A concordância do teste de avidez de IgG em soro e em papel filtro foi de 100%, evidenciando que a técnica de Avidez de IgG pode ser empregada em amostras coletadas em papel filtro aprimorando assim o diagnóstico de toxoplasmose. 7 SUGESTÕES E PERSPECTIVAS O presente estudo corrobora com os dados da literatura, evidenciando a importância do teste de avidez de IgG em recém-nascidos, bem como a avaliação dos índices dessa imunoglobulina em conjunto com o índice de sua respectiva mãe, dessa forma, o teste de avidez seria mais um método valioso a ser utilizado no diagnóstico da toxoplasmose congênita em RN. Neste contexto, a utilização do teste de avidez em papel filtro no programa pós-natal, teste do pezinho, em pacientes com altos índices de IgG é relevante no diagnóstico precoce de toxoplasmose congênita corroborando para o mais precoce e acertado tratamento desse grupo de pacientes, podendo com isso reduzir a gravidade da toxoplasmose congênita no estado de Goiás. 38

50 REFERÊNCIAS: AMENDOEIRA MRR, CAMILLO-COURA LF. Uma breve revisão sobre toxoplasmose na gestação. SciMed. 20: , ANDRADE GMQ. Triagem neonatal como estratégia para o diagnóstico e tratamento precoces da toxoplasmose congênita em Belo Horizonte, Minas Gerais [dissertação]. Universidade Federal de Minas Gerais; APAE São Paulo-SP. Teste do pezinho. Disponível em: < Paginas/testes.aspx>. Data de acesso: 10/09/2016. AVELAR JB. Toxoplasmose crônica em gestantes. Avaliação da prevalência, fatores de risco e acompanhamento de um grupo de recém-nascidos em Goiânia Goiás. Goiânia [Tese de Doutorado em Medicina Tropical e Saúde Pública IPTSP/UFG], AVELAR JB, REZENDE HHA, STORCHILO HR, CANDIDO RRL, AMARAL WN, AVELINO MM, CASTRO AM. Reativação da toxoplasmose durante o oitavo mês de gestação. Renome.4: 57-69, AVELINO MM, AMARAL WN, RODRIGUES IM.Congenital toxoplasmosis and prenatal care state programs Disponível em: < Acesso em: 24/1/2016. AYI I, EDU AS, APEA-KUBI KA, BOAMAH D, BOSOMPEM KM, EDOH D. Seroepidemiology of toxoplasmosis amongst pregnant women in the greater accra regions og Ghana. Ghana Med J 43: , BAHIA-OLIVEIRA LM, JONES JL, AZEVEDO-SILVA J, ALVES CC, OREFICE F, ADDISS DG. Highly endemic, water borne toxoplasmosis in North Rio de Janeiro State, Brazil. Emerg Infect Dis 9: 55-62, BAHIA-OLIVEIRA LMG, ABREU-OLIVEIRA AMW, AZEVEDO-SILVA J,ORÉFICE F. Toxoplasmosis in southeastern Brazil: an alarming situation of highly endemic acquired and congenital infection. Intern J Parasitol. 31:115-44,

51 BERGER F, GOULET V, LE STRAT Y, DESENCLOS J. Toxoplasmosis among pregnant women in France: Risk factors and change of prevalence between 1995 and Rev Epidemiol Sante Publique 57: , BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Assistência à Saúde. Departamento de Atenção Especializada Programa Nacional de Triagem Neonatal: Oficinas Regionais de Qualificação e Gestão p. BRASIL. Ministério da Saúde. Manual de normas técnicas e rotinas operacionais do programa de triagem neonatal. Brasília, BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Atenção à Saúde, Departamento de Ações Programáticas Estratégicas. Área Técnica de Saúde da Mulher. Pré-natal e Puerpério: atenção qualificada e humanizada-manual técnico. Brasília, BECK S, KONOPKA CK, SILVA AK, DIEHL FP. Importância do rastreamento sorológico da toxoplasmose em gestantes atendidas em ambulatório de pré-natal de alto risco. Revista Saúde. 36 (1): 29-36, BOLLANI L, STROCCHIO L, STRONATI M. Congenital toxoplasmosis. Early Hum Dev.89S4: 70-71, BOLLANI L, STRONATI M. II neonato con toxoplasmosi congenita: clinica, terapia e follow-up. Journal of Pediatric and Neonatal Individualized Medicine. 3: 1-7, BUFFOLANO W, LAPPALAINEN M, HEDMAN L, CICCIMARRA F, DEL PEZZO M, RESCALDANI R, GARGANO N, HEDMAN K. Delayed maturation of IgG avidity in congenital toxoplasmosis. Eur J ClinMicrobiolInfectDis. 23: , CÂMARA JT, GONTIJO DA SILVA M, CASTRO AM. Prevalência de toxoplasmose em gestantes atendidas em dois centros de referência em uma cidade do Nordeste, Brasil. Rev Bras Ginecol Obstet 37(2):64-70, CAPOBIANGO JD, MONICA TC, FERREIRA FP, MITSUKA-BREGANÓ R, NAVARRO IT, GARCIA JL, REICHE E MV. (2016). Evaluation of the western blotting method for the diagnosis of congenital toxoplasmosis. Jornal de Pediatria. [s.l.], p.1-8, CARELLOS EVM, ANDRADE GMQ, AGUIAR RALP. Avaliação da aplicação do protocolo de triagem pré-natal para toxoplasmose em Belo Horizonte, Minas Gerais, 40

52 Brasil: estudo transversal em mulheres pós-parto de duas maternidades. Cad Saúde Pública.24: , CARVALHEIRO CG, MUSSI-PINHATA MM, YAMAMOTO AY, SOUZA CBSD, MACIEL LMZ. Incidence of congenital toxoplasmosis estimated by neonatal screening: relevance of diagnostic confirmation in asymptomatic newborn infants. Epidemiol Infect.133 (3):485-91, COOK AJ, GILBERT RE, BUFFOLANO W, ZUFFEREY J, PETERSEN E, JENUM PA, FOULON W, SEMPRIN AE, DUNN DT. Sources of Toxoplasma infection in pregnant women: European multicentre case-control study. EuropeanResearch Network on Congenital Toxoplasmosis. BMJ. 321: , COSTA JGL. Diagnóstico e quantificação de Toxoplasma gondii através de PCR em tempo real em sangue periférico de recém-nascidos com toxoplasmose congênita no estado de Minas Gerais. Belo Horizonte [Dissertação de Mestrado em Parasitologia ICB/UFMG], COSTA ALF, MARTINS TGDS, MONCADA FJS, MOTTA MMDS. Hemorragia submacular secundária à toxoplasmose congênita. Einstein. São Paulo. 12 (1): , CRUZ AMF, ARAÚJO AMADF, FIT SSA, VIEIRA LCR, FELIX LCDSU, SOUSA DSD, CAMPUS XSP. Incidência e delineamento epidemiológico de gestantes com toxoplasmose, em uma unidade de referência de Santarém-Pará.Livro De Resumos Da Feira De Trabalhos Acadêmicos e Científicos Fetac2014. v p. DABRITZ, H. A.; CONRAD, P. A. Cats and Toxoplasma: Implications for Public Health. Zoonoses Public Health. 57: 34-52, DEEB HKE, SALAH-ELDINB H, KHODEER S, ALLAH AA. Prevalence of Toxoplasma gondii infection in antenatal population in Menoufia governorate, Egypt. Acta Tropica 124: , DESHPANDE PS, KOTRESHA D, NOORDIN R, YUNUS MH, SAADATNIA G, GOLKAR M.; IgGAvidity Western Blot Using Toxoplasma Gondii Rgra-7 Cloned From Nucleotides For Serodiagnosis Of Acute Toxoplasmosis. Rev Inst Med Trop São Paulo.55 (2):79-83, DESMONTS G,COUVREUR J,ALISON F, BAUDELOT J, GERBEAUX J,LELONG M. Étudeepidemiologiquesur la toxoplasmose: de l'influence de cuisson des viandes 41

53 de boucheriesur la frequence de l'infectionhumaine. RevueFrançaise d Étududes Cliniques et Biologiques. 10:952-8, 1965 DINIZ EMA. O diagnóstico da toxoplasmose na gestante e no recém-nascido. Pediatria.28: , DISCACCIATI MG, PENA LT. Improving the diagnosis of toxoplasmosis in pregnant women by using anti-toxoplasma gondii immunoglobulin G (IgG) avidity determination. Rev Inst Adolfo Lutz. 72(2): DUBEY J.P, FRENKEL JK. Cyst-Induced Toxoplasmosis in Cats*. The Journal Of Protozoology.19 (1): , DUBEY JP, FRENKEL JK. Feline toxoplasmosis from acutely infected mice and the development of Toxoplasma cysts. J. Protozool. 23: DUBEY JP. Advances in the life cycle of Toxoplasma gondii. International Journal Parasitology. 7: , DUBEY JP. Toxoplasmosis a waterborne zoonosis. Veterinary Parasitology. 126: 57-72, DUBEY JP. Toxoplasmosis of animals and humans. 2º edition. Beltsville, Maryland USA, DUBEY JP, LINDSAY, DS, SPEER CA. Structures of Toxoplasma gondiitachyzoites, bradyzoites, and sporozoites and biology and development of tissue cysts. Clinical Microbiology Reviews.11: , DUNN D, WALLON M, PEYRON F, PETERSEN E, PECKHAM C, GILBERT R. Mother-to-child transmission of toxoplasmosis: risk estimates for clinical counselling. Lancet. 353: , FEREZIN RI, BERTOLIN DA, DEMARCHI IG. Prevalência de sorologia positiva para HIV, hepatite B, toxoplasmose e rubéola em gestantes do noroeste paranaense. Rev Bras Ginecol Obstet 35(2): 66-70, FERREIRA A, WALTER A, SANDRA L. Diagnóstico Laboratorial das Principais Doenças Infecciosas e Autoimunes. Guanabara Koogan. Rio de Janeiro, FIGUEIRO-FILHO EA, SENEFONTE FR, LOPES AHA, MORAIS OO, SOUZA JÚNIOR VG, MAIA TL, DUARTE G. Frequencyof HIV-1, rubella, syphilis, 42

54 toxoplasmosis, cytomegalovirus, simple herpes virus, hepatitis B, hepatites C, Chagas disease and HTLV I/II infection in pregnant women of State of Mato Grosso do Sul. RevSocBrasMed Trop.40: , FLATT A, SHETTY N. Seroprevalence and risk factors for toxoplasmosis among antenatal women in London: a re-examination of risk in ethnically diverse population. Eur J Public Health 23: , FONSECA FC, RODRIGUES IMX, MELO NC, CASTRO AN, AVELINO MM. Importância do teste de avidez de IgG na toxoplasmose congênita. Rev Patol Trop. 45 (1): FOULON W, NAESSENS A, DERDE MP. Evaluation of the possibilities for preventing congenital toxoplasmosis. Am J Perinatol. 11:57-62, 1994 FRICKER-HIDALGO H, BRENIER-PINCHART MP, SCHAAL JP, EQUY V, BOST- BRU C, PELLOUX H. Value of Toxoplasma gondii detection in one hundred thirtythree placentas for the diagnosis of congenital toxoplasmosis. PediatrInfectDis J.26: , FURINI, Aac et al. Soroprevalência de Anticorpos anti-toxoplasma gondii em Amostras de Gestantes no Pré-Natal. Revista Brasileira de Ciências da Saúde, [s.l.], v. 19, n. 3, p , APESB (Associacao de Apoio a Pesquisa em Saude Bucal). GALVAN-RAMIREZ ML, TROYO R, ROMAN S, CALVILLO-SANCHEZ C, BERNAL- REDONDO R. A systematic review and meta-analysis of Toxoplasma gondii infection among the Mexican population. Parasit Vectors 5: 271, GARCIA MG, FERREIRA EAP, OLIVEIRA FPS. Análise da compreensão dos pais acerca do teste do pezinho. Revista Brasileira Crescimento e Desenvolvimento Humano. 17: GARIBYAN L, AVASHIA N. Polymerase Chain Reaction. J InvestDermatol.133, GONTIJO DA SILVA M, CLARE VINAUD M, DE CASTRO AM. Prevalence of toxoplasmosis in pregnant women and vertical transmission of Toxoplasma gondii in patients from basic units of health from Gurupi, Tocantins, Brazil, from 2012 to PLoS One. 10(11): e ,

55 GUIMARÃES ACS, KAWARABAYASHI M, BORGES MM, TOLEZANO JE, ANDRADE JRHF. Regional variation in toxoplasmosisseronegativity in the São Paulo metropolitan region. Rev Inst Med Trop S Paulo. 35: , 1993 GUY EC. Toxoplasmosis.Med.42: 1, HAN K, SHIN DW, LEE TY, LEE YH. Seroprevalence of Toxoplasma gondii infection and risk factors associated with seropositivity of pregnant women in Korea. J Parasitol 94: , HIGA LT, RAMOS J, SUETAKE H, ANTONIASSI P, MANTOVAN HF, CASTILHO- PELLOSO M, FALAVIGNA-GUILHERME AL. Relato de dois casos de toxoplasmose em gestantes atendidas no noroeste do Paraná, Brasil. Sci Med.20: , INAGAKII ADM, OLIVEIRA LAR, OLIVEIRA MFB, SANTOS RCS, ARAÚJO RM, ALVES JAB, PINHEIRO KS, GURGE RQ, MUSSI-PINHATA MM. Soroprevalência de anticorpos para toxoplasmose, rubéola, citomegalovírus, sífilis e HIV em gestantes sergipanas. Rev Soc Bras Med Trop 42(5): , ISABELTF, DA COSTAPI, SIMÕES MJ. Toxoplasmose em gestantes de Araraquara/SP: análise da utilização do teste de avidez de IgG anti. ScientiaMedica. 17 (2): 57-62, JONES JL, DUBEY JP. Foodborne toxoplasmosis. Clin Infect Dis.55: , 2012 JONES JL, PARISE ME, FIORE AE. Neglected Parasitic Infections in the United States: Toxoplasmosis. Am J Trop Med Hyg.90(5): , JONES JL, KRUSZON-MORAN D, WILSON M, MCQUILLAN G, NAVIN T, MCAULEY JB. Toxoplasma gondii infection in the United States: seroprevalence and risk factors. Am J Epidemiol 154: , KAWAZOE U.Toxoplasma gondii. In Neves DP, Melo AL, Genaro O, Linardi PM. Parasitologia Humana.10 ed. São Paulo: Atheneu, KOPPE JG, LOEWER-SIEGER DH, DE ROEVER-BONNET H. Results of 20-year follow-up of congenital toxoplasmosis. Am j Ophthalmol.101: , LAGO EG, CARVALHO RL, JUNGBLUT R, SILVA VB, FIORI RM. Screening for Toxoplasma gondii antibodies in 2,513 consecutive parturiente women and 44

56 evaluation of newborn infants at risk for congenital toxoplasmosis. Sci Med 19: 27-34, LAGO EG. Estratégias de controle da toxoplasmose congênita. Porto Alegre: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul; LANGONI, H. Doenças ocupacionais em avicultura. In: ANDREATTI FILHO, R. L. Saúde aviária e doenças. São Paulo: Roca, p LIU Q, WEI F, GAO S, JIANGA L, LIANA H, YUANA B, YUANA Z, XIAA Z, LIUD B, XUC X, ZHU X. Toxoplasma gondii infection in pregnant women in China. Trans R Soc Trop Med Hyg 103: , MACIEL, K. P. Inquérito sorológico para detecção de anticorpos de Toxoplasma gondii em caprinos (Capra hircus) criados nos municípios de Gravataí e Viamão, região da Grande Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil. Dissertação (Mestrado). Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Porto Alegre, MARGONATO FB, SILVA AMR, SOARES DA, AMARAL DA, PETRIS AJ. Toxoplasmose na gestação: diagnóstico, tratamento e importância de protocolo clínico. Rev Bras Saude Mater Infant.7: , MARTINS-DUARTEES, LEMGRUBER L, LORENTE SO. Evaluation of three novel azasterols against Toxoplasma gondii. Veterinary parasitology. 177 (1-2): , MATTOS CCB, SPEGIORIN LCJF, MEIRA CS, SILVA TC, FERREIRA AIC, NAKASHIMA F, PEREIRA-CHIOCCOLA VL,MATTOS LC. Anti-Toxoplasma gondii antibodies in pregnant women and their newborn infants in the region of São José do Rio Preto, São Paulo, Brazil. Sao Paulo Med J 129(4): , MEIRELLES-FILHO J. Toxoplasmose e gravidez: inquérito sorológico em gestantes e seus recém-nascidos na Maternidade-Escola da Universidade Federal do Rio de Janeiro. J Bras Ginecol.95(9): , 1985 MINUZZI ALM. Análise comparativa entre testes de Elisa convencional (soro) e papel filtro (sangue seco) para detecção de toxoplasmose IgM. Brasília [Dissertação de Mestrado em Ciências da Saúde UNB], MONTOYA JG, LIESENFELD O. Toxoplasmosis. Lancet.363: ,

57 MONTOYA JG, REMINGTON JS. Management of Toxoplasma gondii infection during pregnancy. Clin Infect Dis.47: , NAESSENS A, JENUM PA, POLLAK A. Diagnosis of congenital toxoplasmosis in the neonatal period: a multicenter evaluation. J Pediatr.135(6): , NASCIMENTO ILO, CARVALHO S, ASFORA S, FREIRE SM, SIMÕES JM, SCHAER R, et al. Estudo da prevalência de anticorpos anti-toxoplasma gondii em mulheres grávidas no Estado da Bahia. Rev Cienc Med Biol.1(1):12-5, 2002 NETO EC, ANELE E, RUBIM R, BRITES A, SCHULTE J, BECKER D, et al. High prevalence of congenital toxoplasmosis in Brazil estimated in a 3-year prospective neonatal screening study. International Journal of Epidemiology.29:941-97, NICOLLE; MANCEAUX. A SPLENDORE, Surun nouveau protozoaire parasite dulapin: deuxième note préliminaire. Bulletin de la Societe de Pathologie Exotique. 2: , NISSAPATORN V, SUWANRATH C, SAWANGJAROEN N, LING LY, CHANDEYING V. Toxoplasmosis-serological evidence and associated risk factors among pregnant women in southern Thailand. Am J Trop Med Hyg 85: , NÓBREGA MC, MAGALHÃES V, ALBUQUERQUE Y, MAGALHÃES C, ARCOVERDE C. Toxoplasmose em gestantes e em seus recém-nascidos, atendidos no Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Pernambuco. RBM Cad Ginecol Obstet.56:23-9, OLIVAL V, CORREIA A, BELLO A, CABUGUEIRA A, NUNES MJ. Ocular toxoplasmosisreactivationduringpregnancy Reativação ocular da toxoplasmose durante a gravidez. Acta Obstet Ginecol Port. 8(1), 82-83, OLIVEIRA BC. Toxoplasmose: perfil sorológico durante a gravidez e repercussões neonatais em maternidade pública de referencia na cidade de Belém do Pará. São Paulo [Dissertação de Mestrado em Medicina USP], PAVAN A.A, MERLINI L.S, BETANIN V. SOUZA E.O, CAETANO I.C.S, ROSA G. GONÇALVES D.D. Soroepidemiologia da toxoplasmose em gestantes do município 46

58 de medianeira, Paraná, Brasil. Arq. Ciênc. Saúde Unipar, Umuarama, v. 20, n. 2, p , maio PENA LT, DISCACCIATI MG. Importância do teste de avidez da imunoglobulina G (IgG) anti-toxoplasma gondii no diagnóstico da toxoplasmose em gestantes. Rev. Inst. Adolfo Lutz. 72(2): p , PEREIRA, K. S.; FRANCO, R. M. B.; LEAL, D. A. G. Transmission of toxoplasmosis (Toxoplasma gondii) by foods. Advances in Food and Nutrition Research. 60: 1-19, PESSANHA TM, CARVALHO MD, PONE MVS, GOMES JÚNIOR SC. Abordagem diagnóstica e terapêutica da toxoplasmose em gestantes e as repercussões no recém-nascido. Rev Paul Pediatr. 29(3): , PETRY LC, TESSARO MM, GUEDES CR, REIS MM. Análise dos resultados da sorologia para toxoplasmose em gestantes do Hospital Materno Infantil Presidente Vargas (HMIPV) em Porto Alegre, RS, utilizando a pesquisa de anticorpos específicos pelo Enzime Linked Fluorescent Assay (ELFA), Sistema Vidas, BioMérieux. News Lab 42, POUR ABOLGHASEM S, BONYADI MR, BABALOO Z, PORHASAN A, NAGILI B, GARDASHKHANI OA, SALEHI P, HASHEMI M, VARSHOGHI M, GAFFARI G. IgGaviditytest for thediagnosisofacutetoxoplasma gondii infection in earlypregnancy. Iran J Immunol.8: , PRUSA AR, KASPE DC, OLISCHAR M, HUSSLEIN P, POLLAK A, HAYDE M. Evaluation of Serological Prenatal Screening o Detect Toxoplasma gondii Infections in Austria. Pediatr Neonatol 103: 27-34, RAHBARI AH; KESHAVARZ H. SHOJAEE S, MOHEBALI M, REZAEIAN M. IgG avidity ELISA test for diagnosis of acute toxoplasmosis in humans. The Korean Journal of Parasitology. 50(2): , RAMOS JM, MILLA A, RODRÍGUEZ JC, PADILLA S, MASIÁ M, GUTIÉRREZ F. Seroprevalence of Toxoplasma gondii infection among immigrant and native pregnant women in Eastern Spain. Parasitol Res 109: , REBOUÇAS EC, SANTOS EL, CARMOS MLS, CAVALCANTE Z, FAVALI C. Seroprevalence of Toxoplasma infection among pregnant women in Bahia, Brazil. Trans Royal Coc Trop Med Hyg. 105: ,

59 REIS MM, TESSARO MM, D`ZEVEDO PA. Perfil sorológico para toxoplasmose em gestantes de um hospital público de Porto Alegre. Rev Bras Ginecol Obstet 28: , REMINGTON JS, MCLEOD R, DESMONTS G. Toxoplasmosis. In: Infection diseases of the fetus and newborn infant. ed. 4, p , REY L. Bases da Parasitologia Médica. Guanabara Koogan. Rio de Janeiro, REY, L. Toxoplasma gondii e Toxoplasmose. In: Parasitologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p , REZENDE HHAA. Prevalência de parasitos intestinais em gatos errantes em Goiânia Goiás: Ênfase no diagnóstico de Toxoplasma gondii e avaliação da acurácia de técnicas parasitológicas. Goiânia. [Dissertação de Mestrado Universidade Federal de Goiás] REICHE EMV, MORIMOTO HK, FARIAS GN, HISATSUGU KR, GELLER L, GOMES ACL, et al. Prevalence of American Trypanosomiasis, Syphilis, Toxoplasmosis, Rubella, Hepatitis B, Hepatitis C, Human Immunodeficiency Virus Infection, assayed through serological tests among pregnant patients, from 1996 to 1998, at the Regional University Hospital Norte do Paraná. Revista da Sociedade Brasileira de MedicinaTropical. 33: RODRIGUES IMX. Avaliação de componentes da resposta imunológica de recémnascidos expostos intraútero ao Toxoplasma gondii. [Tese de Doutorado em Medicina Universidade Federal de Goiás], ROITT I, RABSON, A. Imunologia básica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p. ROOS T, MARTIUS J, GROSS U, SCHROD L. Systematic serologic screening for toxoplasmosis in pregnancy: is it possible to simplify the diagnostic procedures? Journal of Obstetrics and Gynecology and Reproductive Biology. 22: , SACKS D, SHER A. Evasion of innate immunity by parasitic protozoa. Nature Immunology.[s.l.], 3(11): , SAKIKAWA M, NODA S, HANAOKA M, NAKAYAMA H, HOJO S, KAKINOKI S, NAKATA M, YASUDA T, IKENOUE T, KOJIMA T. Anti-Toxoplasma antibody 48

60 prevalence, primary infection rate, and risk factors in a study of toxoplasmosis in 4,466 pregnant women in Japan. Clin Vaccine Immunol 19(3): , SANTANA RM, ANDRADE FM, MORON AF. Infecções TORCH e gravidez. In: Prado FC, RAMOS J, RIBEIRO do VALLE J, ed. Atualização terapêutica. 21a ed. São Paulo: Artes Médicas; p SARTORI AL, MINAMISAVA R, AVELINO MM, MARTINS CA. Triagem pré-natal para toxoplasmose e fatores associados à soropositividade de gestantes em Goiânia, Goiás. Rev Bras Ginecol Obstet.33: 93-98, SKARIAH S, MCINTYRE MK, MORDUE DG. Toxoplasma gondii: Determinants of tachyzoite to bradyzoite conversion. Parasitology Research. 107: , 2010 SPALDING SM, AMENDOEIRA MRR, RIBEIRO LC, SILVEIRA C, GARCIA AP, CAMILLO-COURA L. Estudo prospectivo de gestantes e seus bebês com risco de transmissão de toxoplasmose congênita em município do Rio Grande do Sul. Rev Soc Bras Med Trop. 36(4):483-91, SENSINI A. Toxoplasma gondii infection in pregnancy: opportunities and pitfalls of serological diagnosis. Clin Microbiol Infect.12: , SOUZA CO, TASHIMA NT, RITAMADSA, TUMITAN P.Estudo transversal de toxoplasmose em alunas de um curso superior da região de Presidente Prudente, Estado de São Paulo. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 43(1): 59-61, SOUSA JAS. Toxoplasmose na gravidez: percepção de enfermeiros e gestantes no pré-natal da atenção básica.[dissertação. Mestrado em Saúde Universidade Federal do Maranhão], SOUZA-JÚNIOR VG, FIGUEIRÓ-FILHO EA, BORGES DC, OLIVEIRA VM, COELHO LR. Toxoplasmose e gestação: resultados perinatais e associação do teste de avidez de IgG com infecção congênita em gestantes com IgManti- Toxoplasma gondii reagente.scimed. 20: 45 50, SROKA S, BARTELHEIMER N, WINTER A, HEUKELBACH J, ARIZA L, RIBEIRO H, OLIVEIRA FA, QUEIROZ AJ, ALENCAR CJr, LIESENFELD O. Prevalenceandriskfactorsoftoxoplasmosisamongpregnantwomen in Fortaleza, NortheasternBrazil. Am J Trop Med Hyg.83: , TAMMA P, SERWINT JR. Toxoplasmosis. Rev Pediatrics. 28: ,

61 TENTER AM, HECKEROTH AR, WEISS LM. Toxoplasma gondii from animals to humans. International Journal for Parasitology. 30: , VAZ RS, THOMAZ-SOCCOL V, SUMIKAWA E, GUIMARÃES ATB. Serological prevalence of Toxoplasma gondii antibodies in pregnant women from Southern Brazil. Parasit Res.106: , VIEIRA MB. Toxoplasmose congênita-relato de um caso atípico e revisão bibliográfica. Distrito Federal. [Monografia de Residência médica Secretaria de Estado de Saúde do Governo do Distrito Federal], ZEMENE E, YEWHALAW D, ABERA S, SAMUEL TBA, ZEYNUDIN A. Seroprevalence of Toxoplasma gondii and associated risk factors among pregnant women in Jimma town, Southwestern Ethiopia. BMC Inf Dis 12: 337, ZHANG K, WANG L, LIN G, SUN Y, ZHANG R, XIE J, LI J. Results of the National External Quality Assessment for Toxoplasmosis Serological Testing in China. PLoS One. 10(6): e , WILSON CB, REMINGTON JS, STAGNO S, REYNOLDS DW. Development of adverse sequelae in children born with subclinical congenital Toxoplasma. Infection Pediatrics.66(5):767-74,

62 ANEXOS Anexo 1 Parecer do Comitê de Ética 51

63 52

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