Palavras-chave: cogumelo do sol, senescência, parede intestinal, células caliciformes.

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1 MORFOLOGIA DO COLO DISTAL DE RATOS SUPLEMENTADOS COM EXTRATO AQUOSO DE AGARICUS BLAZEI MURRILL DURANTE O PROCESSO DE ENVELHECIMENTO Luan Vitor Alves de Lima (PIBIC/Fundação Araucária), Raiane dos Santos Guidi, Indyanara Inacio Barreto, Ana Paula de Santi Rampazzo, Carla Possani Cirilo, Maria Raquel Marçal Natali, João Paulo Ferreira Schoffen (orientador) Centro de Ciências Biológicas - CLM - Universidade Estadual do Norte do Paraná luan_vitorr@hotmail.com / jpschoffen@uenp.edu.br Resumo O trato gastrointestinal sofre mudanças morfofuncionais com o envelhecimento. O basidiomiceto Agaricus blazei Murrill (ABM), por apresentar propriedades nutricionais e medicinais, tem sido utilizado como suplemento alimentar, podendo prevenir alterações decorrentes da idade. Este trabalho teve por objetivo avaliar o efeito da suplementação com extrato aquoso de ABM sobre a morfologia do intestino grosso de ratos em processo de envelhecimento. Ratos Wistar foram distribuídos em grupos controles com 7, 12 e 23 meses e grupos experimentais com 12 e 23 meses suplementados via gavagem diariamente com ABM a partir dos 7 meses. Após morte dos animais, amostras do colo distal foram destinadas à obtenção de cortes histológicos corados com hematoxilina-eosina (para análise morfométrica dos estratos da parede intestinal) e corados com Ácido Periódico de Schiff (para estimar a população de células caliciformes). Com o envelhecimento houve redução na espessura da túnica mucosa, na camada muscular da mucosa, profundidade das criptas e no número de células caliciformes. A dieta com o extrato de ABM mostrou-se capaz de reverter a atrofia evidenciada na túnica mucosa, com tendência protetora sobre os outros parâmetros alterados pela idade. A túnica muscular não sofreu alterações com o envelhecimento e nem com a suplementação. Conclui-se que ABM apresenta efeito protetor sobre a mucosa colônica distal, assegurando assim a manutenção de suas funções com o avançar da idade. Palavras-chave: cogumelo do sol, senescência, parede intestinal, células caliciformes. Fundamentação teórica O envelhecimento, sendo um processo natural, se caracteriza pelas alterações fisiológicas que ocorrem ao longo do tempo. Estudos relacionados com o trato gastrointestinal (TGI) mostram que a disfunção, resultante da progressão temporal, ocasiona desordens de motilidade intestinal, diminuição da absorção de nutrientes (WADE; COWEN, 2004). No intestino grosso, observam-se alterações morfofuncionais que incluem atrofia da mucosa, aumento do tecido conjuntivo e atrofia da camada muscular, que resultam em constipação intestinal (FIRTH; PRATHER, 2002). Conhecido popularmente como cogumelo do sol, Agaricus blazei Murril (ABM) tem sido utilizado mundialmente como suplemento alimentar (FIRENZUOLI et al., 2008). Este age como um potente imunoestimulador, atuando no combate a infecções e na prevenção de várias doenças como câncer, diabetes, hiperlipidemia, arteriosclerose e hepatites crônicas (TAKAKU et al., 2001). Também apresenta compostos antioxidantes,

2 que podem contribuir para amenizar os efeitos do estresse oxidativo (OLIVEIRA et al., 2007), além de capacidade neuroprotetora (SANTI-RAMPAZZO et al., 2015). Todavia, pouco se sabe sobre as repercussões deste suplemento alimentar sobre a morfologia dos órgãos do sistema digestório de animais envelhecidos (SANTI-RAMPAZZO et al., 2015), sobretudo do intestino grosso. O objetivo deste trabalho foi analisar os efeitos do envelhecimento e do extrato aquoso de ABM sobre aspectos morfoquantitativos da parede do colo distal de ratos Wistar. Materiais e métodos Animais e tratamento Foram utilizados 25 ratos Wistar (Rattus novergicus) com 7, 12 e 23 meses de idade, os quais foram mantidos em caixas de polipropileno com iluminação de claro e escuro de 12 horas e temperatura de 22 ± 2 ºC, sendo estes distribuídos em grupos controles de 7 meses (C7), 12 meses (C12) e 23 meses (C23), e grupos experimentais de 12 meses (CA12) e 23 meses (CA23). Os animais foram alimentados ad libitum com ração padrão para roedores durante todo período experimental. A partir dos 7 meses, os ratos pertencentes aos grupos CA12 e CA23 foram suplementados diariamente, via gavagem, com 1 ml de solução aquosa contendo 26 miligramas do liofilizado de ABM. A extração aquosa do cogumelo foi realizada a partir de metodologia modificada de Soares et al. (2009). Aos 7, 12 e 23 meses os animais foram anestesiados intraperitonealmente com tiopental sódico (Thionembutal ), e após laparotomia, amostras do colo distal foram retiradas e destinadas à processamento histológico para análise morfométrica dos estratos da parede intestinal e determinação do número de células caliciformes. Os procedimentos deste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da UEM. Processamento histológico Amostras do colo distal foram abertas na borda mesocólica, lavadas com solução salina, fixadas em Bouin, desidratadas em etanol, diafanizadas em xilol e incluídas em parafina para obtenção de cortes histológicos semi-seriados em micrótomo. Cortes de 6 m foram corados pelo método de Hematoxilina-Eosina (H.E.) para evidenciar os estratos da parede intestinal, e cortes de 5 m foram submetidos à técnica histoquímica com o Ácido Periódico de Schiff (P.A.S.), para evidenciar as células caliciformes (produtoras de mucinas neutras). Análise da parede intestinal e população de células caliciformes Em 10 cortes histológicos/animal corados com H.E. foram mensurados 100 pontos da túnica mucosa, muscular da mucosa, túnica muscular externa e criptas orientadas longitudinalmente a partir de imagens microscópicas capturadas da parede colônica em objetiva de 10X. A quantificação da população de células caliciformes, marcadas por P.A.S., ocorreu em 50 imagens microscópicas da túnica mucosa capturadas por animal, com objetiva de 40X. As análises foram realizadas com o software Image-Pro Plus 4.5. O software GraphPad Prism 5.0 foi utilizado para análise estatística de todos os dados obtidos, aplicando-se Análise de Variância (one-way ANOVA) seguido pelo teste de Tukey, com nível de significância de 5%, sendo os resultados expressos como média ± erro padrão. Resultados

3 Com o envelhecimento a espessura da mucosa, da muscular da mucosa e a profundidade das criptas apresentaram atrofia a partir dos 12 meses, na ordem de 22,33%, 34,82% e 21,23%, respectivamente (Fig. 1a,b,c). Redução destes parâmetros também foi verificado no jejuno dos mesmos animais (SANTI-RAMPAZZO et al., 2015). A atrofia observada ocorreria devido à diminuição no consumo de ração verificada com o envelhecimento, visto que a disponibilidade de nutrientes no lúmen intestinal comprovadamente atua como fator trófico. Redução na taxa de proliferação celular (MARCELINO et al., 2014), redução na intensidade da resposta imune com a idade (BELÉM et al., 2015), também poderiam ser responsabilizados por estes achados. Figura 1 Espessura da túnica mucosa (a), profundidade das criptas (b), camada muscular da mucosa (c), túnica muscular externa (d) e número de células caliciformes (e) do colo distal de ratos normoalimentados com 7, 12, 23 meses (C7, C12 e C23) e suplementados com extrato aquoso de Agaricus blazei (CA12 e CA23). Média ± erro padrão (n=5). (#) p<0,05 comparado a C7 e C12; (Ϯ) p<0,05 comparado a C23; (*) p<0,05 comparado a C7; ( ) p<0,05 comparado a C12. A dieta suplementada com o extrato aquoso de ABM demonstrou efeito positivo (p<0,05) sobre a mucosa colônica, sendo sua espessura elevada em 25,70% no grupo CA23 em relação a C23, encontrando-se semelhante a mucosa dos animais de 7 meses (Fig. 1a). Além disso, a suplementação com o cogumelo evidenciou tendência em aumentar (p>0,05) a profundidade das criptas em 22,64% e a espessura da muscular da mucosa em 17,25%, não diferindo o grupo CA23 do C7 (Fig. 1b,c). Tais resultados são contrários aos

4 encontrados no jejuno de ratos Wistar (SANTI-RAMPAZZO et al., 2015), e ocorreriam devido a diferença funcional entre os segmentos intestinais no aproveitamento dos aminoácidos recebidos pela suplementação de ABM. No jejuno os aminoácidos seriam absorvidos, não alterando a atrofia verificada na mucosa decorrente da idade, enquanto no colo distal, estes seriam incorporados aos elementos componentes da mucosa por meio da síntese de proteínas, fato que justificaria o aumento observado nesta túnica intestinal. Ressalte-se que o ABM é rico em proteínas, carboidratos e aminoácidos, além de possuir substâncias antioxidantes (SANTI-RAMPAZZO et al., 2015), e que dietas hipoprotéicas reduzem a espessura da túnica mucosa em ratos (NATALI et al., 2005). Aminoácidos como a glutamina, melhoram o TGI, tendo efeito benéfico na preservação e recuperação da mucosa intestinal, como também, melhora a função do sistema imune (XAVIER et al., 2009), promovendo aumento na espessura da túnica mucosa em ratos (RIBEIRO et al., 2004; TRONCHINI et al., 2013). Quanto à túnica muscular externa, nenhuma alteração significativa foi constatada na espessura deste parâmetro com o envelhecimento ou no tratamento com ABM (Fig. 1d). Este resultado pode ser justificado pela manutenção no número de neurônios miontéricos nesta porção do intestino grosso (PRIETO, 2015), já que a hipertrofia muscular é observada na desnervação mioentérica (SCHOFFEN et al., 2014). Santi-Rampazzo et al. (2015) corroboram com os nossos resultados durante o processo de envelhecimento, mas divergem na suplementação com ABM, pois verificaram aumento da túnica muscular devido ao suplemento de proteínas e aminoácidos ofertados na dieta, com diferença no aproveitamento tecidual dos aminoácidos conforme as necessidades do segmento intestinal, como mencionado anteriormente. As células caliciformes são responsáveis pela produção de mucinas, uma glicoproteína que serve como muco, atuando na proteção e lubrificação da superfície do epitélio intestinal. Com o envelhecimento, aos 23 meses, o número de células caliciformes apresentou redução de 23,74%, quando comparado ao grupo C7 (Fig. 1e), fato que pode alterar a expressão das mucinas e a proteção intestinal. A suplementação com ABM mostrou tendência em aumentar (p>0,05) o número destas células aos 23 meses (CA23XC23), sendo que seus valores não diferem dos animais mais jovens (CA23XC7) (Fig. 1e). Esta melhora, também observada no jejuno dos mesmos animais, explica-se novamente devido ao extrato aquoso de ABM fornecer um suplemento de aminoácidos e proteínas na dieta (SANTI-RAMPAZZO et al., 2015). Considerações Finais O extrato aquoso de ABM apresenta efeito protetor contra a atrofia da túnica mucosa colônica de ratos, minimizando a redução das criptas, da muscular da mucosa e a perda de células caliciformes com o avançar da idade, desta forma assegurando a manutenção de suas funções no TGI. Referências BELÉM, M.O. et al. Intestinal morphology adjustments caused by dietary restriction improves the nutritional status during the aging process of rats. Exp. Geront., v.69, p.85-93, FIRENZUOLI, F. et al. The medicinal mushroom Agaricus blazei Murril: Review of literature and pharmaco-toxicological problems. Evid. Based Complement. Alternat. Med., v.

5 5, n. 1, p. 3-15, FIRTH, M.; PRATHER, C. M. Gastrointestinal motility problems in the elderly patient. Gastroenterology., v. 122, n. 6, p , MARCELINO, C.G; et al. Análise morfométrica da parede do colo distal de ratos em processo de envelhecimento submetidos a restrição alimentar. In XXIII Encontro Anual de Iniciação Científica, Londrina, NATALI, M. R. M. et al. Morphoquantitative evaluation of the duodenal myenteric neuronal population in rats fed with hypoproteic ration. Biocell, 29:39-46, OLIVEIRA, O. M. M. F. et al. Antioxidant activity of Agaricus blazei. Fitoterapia, v. 78, p , PRIETO, L. R. População neuronal mioentérica do colo distal de ratos suplementados com extrato aquoso de Agaricus blazei Murrill durante o processo de envelhecimento f. Trabalho de conclusão de curso Universidade Estadual do Norte do Paraná, Bandeirantes, RIBEIRO, S. R. et al. Weight loss and morphometric study of intestinal mucosa in rats after massive intestinal resection. Influence of a glutamine-enriched diet. Rev. Hosp. Clin. Fac. Med. Sao Paulo, v. 56, n. 6, p , SANTI-RAMPAZZO, A. P. et al. Aqueous extract of Agaricus blazei Murrill prevents agerelated changes in the myenteric plexus of the jejunum in rats. Evid. Based Complement. Alternat. Med., v. 2015, p. 1-13, SCHOFFEN, J. P. F. et al. Food restriction enhances oxidative status in aging rats with neuroprotective effects on myenteric neuron populations in the proximal colon. Exp. Geront., v. 51, p , SOARES, A. A. et al. Antioxidante activity and total phenolic content of Agaricus brasiliensis (Agaricus blazei Murril) in two stages of maturity. Food Chem., v. 112, p , TAKAKU T. et al. Isolation of an Antitumor Compound from Agaricus blazei Murill and its mechanism of action. J. Nutr., v. 131, p , TRONCHINI, E. A. et al. Effect of l-glutamine on myenteric neuron and of the mucous of the ileum of diabetic rats. An. Acad. Bras. Ciênc, v. 85, n. 3, p , WADE, P.R.; COWEN, T. Neurodegeneration: a key factor in the ageing gut. Neurogastr. Motil., v. 16, p , XAVIER, H. et al. Relação do consumo de glutamina na melhora do trato gastrointestinal revisão sistêmica. O papel da glutamina no trato gastrointestinal. Revista Brasileira de Obesidade, Nutrição e Emagrecimento, v. 3, n. 18, p , 2009.