Glasiella Gonzalez Perez da Silva

Transcrição

1 Glasiella Gonzalez Perez da Silva Efeito neuroprotetor do extrato purificado de Ginkgo biloba (EGb 761) sobre os neurônios entéricos do intestino delgado de ratos diabéticos induzidos por estreptozootocina Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Área de concentração - Biologia Celular e Molecular) da Universidade Estadual de Maringá, para obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas. Maringá-2009

2 Glasiella Gonzalez Perez da Silva Efeito neuroprotetor do extrato purificado de Ginkgo biloba (EGb 761) sobre os neurônios entéricos do intestino delgado de ratos diabéticos induzidos por estreptozootocina Profa. Dra. Nilza Cristina Buttow Orientadora

3 BIOGRAFIA Glasiella Gonzalez Perez da Silva, filha de Lino Gonzalez Perez e Edna Maria Gonzalez Perez, nasceu em Maringá, estado do Paraná no dia 21 de abril de Em dezembro de 2006 concluiu o curso de graduação em Ciências Biológicas pela Universidade Estadual de Maringá - UEM - Maringá, Paraná. Em março de 2007 iniciou o Curso de Pós Graduação em Ciências Biológicas (área de concentração - Biologia Celular e Molecular) em nível de Mestrado, na Universidade Estadual de Maringá, realizando estudos na área de Neurônios Entéricos. Em de 2009, submeteu-se a banca para obtenção do grau de mestre em Ciências Biológicas.

4 Sem sonhos, as perdas se tornam insuportáveis, as pedras do caminho se tornam montanhas, os fracassos se transformam em golpes fatais. Mas, se você tiver grandes sonhos... seus erros produzirão crescimento, seus desafios produzirão oportunidades, seus medos produzirão coragem. Por isso, meu ardente desejo é que você NUNCA DESISTA DOS SEUS SONHOS. (Augusto Cury)

5 AGRADECIMENTO ESPECIAL Antes de tudo, quero agradecer a Deus pelo dom da vida. É dele a vitória alcançada em minha vida. Pois dele, por Ele e para Ele são todas as coisas. A Ele seja a glória para sempre! Amém. Aos meus pais, Lino e Edna, por todo amor, carinho e apoio incondicionais. Amo muito vocês! Ao meu esposo, Armando Barrozo da Silva, pelo seu amor, incentivo e compreensão. Graças a sua presença foi mais fácil transpor os dias de desânimo. Te amo!!!

6 A minha orientadora, Nilza Cristina Buttow, pelos ensinamentos, paciência e pelo árduo trabalho de me orientar. AGRADECIMENTOS A todos que de alguma maneira contribuíram para a execução desse

7 trabalho, seja pela ajuda constante ou por uma palavra de amizade. Muito Obrigada! APRESENTAÇÃO Esta dissertação é composta por um artigo científico denominado: Efeito neuroprotetor do extrato purificado de Ginkgo biloba (EGb 761) sobre os neurônios entéricos do intestino delgado de ratos diabéticos induzidos por estreptozootocina. Em consonância com as regras do Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, o artigo foi redigido de acordo com a revista Journal of Gastroenterology (ISSN: print version) visando sua publicação. Glasiella Gonzalez Perez da Silva, Nilza Cristina Buttow. Efeito neuroprotetor do extrato purificado de Ginkgo biloba (EGb 761) sobre os neurônios entéricos do intestino delgado de ratos diabéticos induzidos por estreptozootocina/ Neuroprotective effect of purified Ginkgo biloba (EGb 761) extract on the small intestine enteric neurons of streptozotocin-diabetic rats. J Gastroenterol.

8 RESUMO GERAL: A neuropatia diabética (ND) é uma das complicações tardia muito comum nos portadores de Diabetes mellitus. A ND é responsável pela disfunção no Sistema Nervoso Entérico (SNE). Este sistema está presente nas paredes tubulares do trato digestório e é responsável pelo controle da motilidade, do fluxo sanguíneos e da secreção. As manifestações gastrointestinais da doença são esvaziamento gástrico atrasado, vômitos, náuseas, diarréias, dor abdominal, inchaço e constipação. O estresse oxidativo tem um papel importante nas alterações no SNE. A hiperglicemia tem sido apontada como agente principal na produção de espécies reativas de oxigênio e redução dos antioxidantes endógenos ocasionando o estresse oxidativo. Substâncias antioxidantes têm um potencial terapêutico amenizando as alterações provocadas pelo diabetes. Um suplemento natural muito utilizado em doenças neurodegenerativas é o extrato das folhas da árvore Ginkgo biloba, pois possui ação antioxidante e neuroprotetora. Com objetivo de analisar os efeitos do extrato padronizado da planta Ginkgo biloba (EGb 761) sobre os neurônios dos plexos mioentérico e submucoso no jejuno e no íleo de ratos diabéticos foram utilizados 15 ratos (Rattus norvegicus) machos da linhagem Wistar com 150 dias de idade. Os animais foram divididos em 3 grupos experimentais, cada grupo com 5 animais: grupo C: controle (normoglicêmicos); grupo D: diabéticos; grupo DT: diabéticos tratado com extrato de Ginkgo biloba (EGb 761). Para a indução do DM foi utilizada a droga estreptozootocina (35mg/Kg peso corporal). Utilizamos o método da glicose oxidase para confirmar o estabelecimento da doença nos ratos dos grupos D e DT. Somente os animais com glicemia superior a 200mg/dl foram mantidos nesses grupos. Os animais do grupo DT foram tratados por gavagem diariamente, além de sua dieta normal, com o extrato da planta Gingko biloba (EGb 761) com uma dose de 50 mg por kilograma de peso corporal até o final do experimento. Ao término do período experimental, 120 dias, todos os animais foram anestesiados com tiopental e após laparatomia foram coletados os segmentos do jejuno

9 e do íleo. Estes segmentos foram lavados com solução salina 0,9% e posteriormente fixados com a solução Periodato-Lisina-Paraformaldeído. Fragmentos do jejuno e do íleo foram desidratados em séries crescentes de álcoois (50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% I, 100% II), diafanizados em xilol e reidratados em séries decrescentes de alcoóis até 70%. Preparados de membranas do plexo mioentérico e do plexo submucoso foram obtidos através da dissecção mediante visualização ao microscópio esterioscópio e manipulação com pinças de relojoeiro e/ou espátula de madeira. Após obtenção dos preparados de membranas, os neurônios mioentéricos e submucosos foram identificados pela técnica imunohistoquímica utilizando o anticorpo anti-miosina V. As análises quantitativas dos neurônios entéricos foram realizadas em 40 campos aleatórios dos preparados de membrana. Para análise morfométrica foram capturadas imagens dos gânglios e realizadas as medidas das áreas (µm 2 ) de 100 neurônios de cada animal, num total de 500 neurônios. No jejuno a análise quantitativa revelou que houve redução significativa da densidade neuronal dos neurônios mioentéricos nos animais diabéticos (grupo D) quando comparado com os animais controles (grupo C). E os animais diabéticos tratados com EGb 761 (grupo DT) não apresentam diferença significativa quando comparado com os animais controles (grupo C) e com os animais diabéticos (grupo D). A densidade neuronal dos neurônios submucosos diminuiu significativamente nos animais diabéticos (grupo D) quando comparado com os animais controles (grupo C). E nos animais diabéticos tratados com EGb 761 (grupo DT) não houve diferença significativa na densidade neuronal quando comparado com os animais controle (grupo C). No íleo a densidade neuronal dos neurônios mioentéricos reduziu significativamente nos animais diabéticos (grupo D) quando comparado com os animais controles (grupo C). E quando comparamos os animais diabéticos tratados com EGb 761 (grupo DT) com os animais controles (grupo C) não houve diferença significativa. Não foi constatada redução significativa na densidade neuronal no plexo submucoso no íleo quando comparamos os três grupos. No jejuno a morfometria do corpo celular dos neurônios mioentéricos e submucosos foram similares nos animais controles e diabéticos. E quando comparamos os animais diabéticos tratados com EGb 761 (grupo DT) com os animais controles (grupo C) observamos que houve uma redução significativa na área do corpo celular dos neurônios mioentéricos e submucosos neste segmento. No íleo a morfometria do corpo celular dos neurônios mioentéricos e submucosos mostrou um aumento significante na área do corpo

10 celular neuronal dos animais diabéticos (grupo D) quando comparados com os animais controles (grupo C). E nos animais diabéticos tratados com EGb 761 (grupo DT) quando comparado com os animais controles (grupo C) apenas a área do corpo celular dos neurônios submucosos reduziu a valores semelhantes aos animais controles. Concluímos que a dose de 50 mg/kg de peso corporal do extrato padronizado de Ginkgo biloba (EGb761) apresenta efeito neuroprotetor sobre o plexo mioentérico do íleo e sobre o plexo submucoso do jejuno de ratos diabéticos induzidos por estreptozootocina. Palavras chave: Diabetes mellitus, Ginkgo biloba, plexo mioentérico, plexo submucoso, neuroproteção.

11 GENERAL ABSTRACT The diabetic neuropathy (DN) is one of the most common late complications in patients with diabetes mellitus. The DN is responsible for the Enteric Nervous System (ENS) dysfunction. This system is present in the tubular walls of the digestive tract and is responsible for the motility control, blood flow and secretion. The gastrointestinal manifestations of the disease are delayed gastric emptying, vomiting, nausea, diarrhea, abdominal pain, bloating and constipation. The oxidative stress plays an important role in the ENS changes. Hyperglycemia has been identified as the main agent in the production of reactive oxygen species and reduction of endogenous antioxidants causing the oxidative stress. Antioxidant substances have a therapeutic potential to minimize changes caused by diabetes. A natural supplement widely used in neurodegenerative diseases is the extract of the leaves of the Ginkgo biloba tree, for its antioxidant and neuroprotective action. In order to examine the effects of standardized extract of the Ginkgo biloba (EGb 761) on neurons of the myenteric and submucous plexuses in the jejunum and ileum of diabetic rats, 15 male Wistar rats (Rattus norvegicus), with 150 days of age, were used. The animals were divided into 3 experimental groups, each group with 5 animals: normoglycemic control group (C); diabetic group (D); diabetic-treated with Ginkgo biloba extract (EGb 761) group (DT). Streptozotocin (35mg/Kg body weight) was used to induce the DM. The glucose oxidase method was used to confirm the disease onset in rats of D and DT groups. Only animals with blood glucose higher than 200mg/dl were kept in the groups. Besides their normal diet, the DT group animals were daily treated with the Gingko biloba extract (EGb 761) with a dose of 50 mg per kilogram of body weight until the end of the experiment, through gavage. At the end of the 120-days trial period, all animals were anesthetized with thiopental. After a

12 laparatomy segments of jejunum and ileum were collected. These segments were washed with 0.9% saline solution and then fixed with periodate-lysineparaformaldehyde solution. Jejunum and ileum fragments were dehydrated in an increasing series of alcohols (50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% I 100% II), cleared in xylene and rehydrated in a decreasing series of alcohols up to 70%. Membrane wholemouts of myenteric and submucosal plexus were obtained by dissection under the stereoscope microscope and handled with the watchmaker tweezers and/or wooden spatula. After obtaining the membrane wholemounts, the submucosal and myenteric neurons were identified by the anti-myosin V immunohistochemical technique. The quantitative analysis of enteric neurons was performed in 40 random fields of membrane wholemounts. Images of ganglia were taken and area measurements (µm 2 ) of 100 neurons per animal, totalizing 500 neurons, were performed for morphometric analysis. The quantitative analysis in the jejunum showed that there was a significant reduction in the neuronal density of myenteric neurons in diabetic animals (group D) when compared to the control animals (C). The diabetic-treated with EGb 761 (group DT) showed no significant difference when compared to group C and D. The neuronal density of submucosal neurons decreased significantly in diabetic animals (group D) when compared to group C. The neuronal density in the DT animals showed no significant difference when compared to C. The neuronal density of myenteric neurons in the ileum decreased significantly in group D when compared to C. There was no significant difference when comparing the DT group to the controls. No significant reduction in neuronal density in submucous plexus in the ileum was observed when comparing the three groups. The cell body morphometry of myenteric and submucous neurons in the jejunum were similar in both diabetic and control animals. The DT group showed a significant reduction in the cell body of myenteric and submucosal neurons when compared to the controls (group C) in this segment. The body cell morphometry of myenteric and submucous neurons in the ileum showed a significant increase in the neuronal cell body of the diabetic animals (group D) when compared to controls. Only the cell body area of submucosal neurons of the DT group decreased to values similar to the controls. It can be concluded that the 50 mg/kg of body weight dose of standardized extract of Ginkgo biloba (EGb761) has a neuroprotective effect on the ileum myenteric plexus and on the jejunum submucous plexus of STZ-diabetic rats.

13 Keywords: Diabetes mellitus, Ginkgo biloba, myenteric plexus, submucous plexus, neuroprotection.