COMPARAÇÃO DE MÉTODOS DE PCR EM DIFERENTES AMOSTRAS CLÍNICAS PARA O DIAGNÓSTICO DA LEISHMANIOSE VISCERAL EM CÃES ASSINTOMÁTICOS

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1 Comissão Nacional de Energia Nuclear CENTRO DE DESENVOLVIMENTO DA TECNOLOGIA NUCLEAR Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e Materiais COMPARAÇÃO DE MÉTODOS DE PCR EM DIFERENTES AMOSTRAS CLÍNICAS PARA O DIAGNÓSTICO DA LEISHMANIOSE VISCERAL EM CÃES ASSINTOMÁTICOS VIRGÍNIA MENDES CARREGAL Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e Materiais, como requisito parcial à obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Ciência e Tecnologia das Radiações. Orientador: Dr. Antero Silva Ribeiro de Andrade. Belo Horizonte 2011

2 DEDICATÓRIA Dedico este trabalho aos meus pais pelo constante apoio, incentivo e inspiração.

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4 AGRADECIMENTOS Aos meus pais pela presença, incentivo, exemplo, apoio e amor incondicional. Ao Prof. Dr. Antero por acreditar na minha capacidade, pela oportunidade de aprendizado, confiança, dedicação e sempre disposição. Aos amigos de laboratório Nino, Rodrigo, Márcia, Camila, Cris e Aline pela amizade, boa vontade em ensinar e pela colaboração no trabalho. À Profa. Dra. Virgínia Soares Lemos por me introduzir no ramo da pesquisa e pelo constante incentivo e amizade. Aos amigos do Laboratório de Fisiologia e Farmacologia Cardiovascular (ICB/UFMG) e ao Prof. Dr. Steyner Côrtes pela convivência, aprendizado e amizade. Aos amigos Andreza e Daniel pelo constante apoio e amizade. Aos colegas da Radiobiologia pelos bons momentos compartilhados. Aos amigos Gustavo, Wal, Lauren, Geisa, Leo, Flávia, Frances, Luís, Rafaela, Marley e Douglas pelo carinho e compreensão, e que mesmo distante estiveram muito presentes, sempre incentivando e apoiando a finalização deste trabalho. Aos colegas de turma, principalmente Bela, Tiago, Gra, Bruno e Vitão, pela convivência, amizade, discussões científicas e pelos bons momentos compartilhados durante o curso. Aos colegas das outras turmas pelas boas conversas. Ao pessoal da secretaria de Pós-graduação do CDTN/CNEN, Roseli, Cerisa e Helena, sempre dispostos a ajudar. À Organização Panamericana de Saúde (OPAS) e Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) pelo apoio financeiro. À Comissão Nacional de Energia Nuclear (CNEN) e a Coordenação de Aperfeiçoamemento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelas bolsas concedidas.

5 A mente que se abre a uma nova idéia jamais volta ao seu tamanho original. (Albert Einstein)

6 VI COMPARAÇÃO DE MÉTODOS DE PCR EM DIFERENTES AMOSTRAS CLÍNICAS PARA O DIAGNÓSTICO DA LEISHMANIOSE VISCERAL EM CÃES ASSINTOMÁTICOS RESUMO Virgínia Mendes Carregal A leishmaniose visceral (LV) é um grave problema de saúde pública no Brasil. Na área urbana o cão é a principal fonte de infecção e o controle da LV no Brasil envolve a eliminação de cães infectados. Testes sorológicos são utilizados para os levantamentos rotineiros, mas estes apresentam problemas de especificidade e sensibilidade. Os métodos moleculares como a PCR são úteis tanto no diagnóstico como na identificação das espécies de Leishmania. São capazes de detectar animais infectados soronegativos e são mais sensíveis e específicos, particularmente no diagnóstico de cães assintomáticos. Um dos maiores obstáculos na implementação de ensaios moleculares é a falta de padronização. Mais de 400 publicações sobre o diagnóstico molecular da leishmaniose foram realizadas desde 1989, porém pouquíssimas compararam a eficiência das diversas técnicas disponíveis. O objetivo deste trabalho foi comparar diferentes métodos de PCR em diferentes amostras clínicas para o diagnóstico de leishmaniose visceral canina (LVC) em cães assintomáticos. Amostras clínicas de medula óssea, sangue periférico, swab conjuntival e biópsias de pele foram analisadas pelos métodos kdna PCR hibridização, kdna semi nested PCR (kdna snpcr), Leishmania nested PCR (LnPCR) e Internal Transcribed Spacer 1 nested PCR (ITS-1 npcr). Foram utilizados 30 cães assintomáticos positivos na sorologia e no exame parasitológico. Seis cães não infectados foram utilizados como controles. A extração de DNA a partir dos swabs foi realizada pelo método do Fenol-Clorofórmio. Para as amostras de sangue, medula e biópsias de pele foram utilizados kits comerciais. As análises pelo método kdna PCR hibridização detectaram 5/30 (16,7%) cães positivos para as amostras de sangue periférico, 17/30 (57%) para pele, 19/30 (63,3%) para medula e 21/30 (70%) para swab conjuntival. Utilizando-se o método kdna snpcr, foram encontrados 7/30 (23,3%) cães positivos para sangue periférico, 17/30 (57%) para pele, 12/30 (40%) para as amostras de medula e 24/30 (80%) para amostras de swab conjuntival. Através de método LnPCR foram detectados 9/30 (30%) cães positivos para as amostras de sangue periférico, 15/30 (50%) para medula, 13/30 (43,3%) para as amostras de pele e 19/30 (63,3%) para swab conjuntival. As análises pelo método ITS-1 npcr das amostras de sangue periférico detectaram 19/30 (63,3%) cães positivos, 19/30 (63,33%) para pele, 29/30 (97%) para medula óssea e 29/30 (97%) para swab conjuntival. Quando comparados os métodos com base no somatório das positividades obtidas para todas as amostras clínicas, o método ITS-1 npcr obteve 96/120 resultados positivos, o kdna PCR hibridização 62/120, o kdna snpcr 60/120 e o LnPCR 56/120. Na comparação da amostras com base na positividade obtida para todos os métodos o swab conjuntival apresentou 93/120 resultados positivos, a medula 68/120, a pele 63/120 e o sangue 40/120. Os resultados deste estudo indicam o swab conjuntival associado ao método ITS 1 npcr como a melhor opção, entre os métodos e amostras testados, para o diagnóstico molecular da leishmaniose visceral canina em animais assintomáticos. Palavras-chave: Leishmaniose Visceral canina; Reação em Cadeia da Polimerase (PCR); Diagnóstico.

7 VII COMPARISON OF PCR METHODS IN DIFFERNT CLINICAL SAMPLES FOR VISCERAL LEISHMANIASIS DIAGNOSIS IN ASYMPTOMATIC DOGS SUMMARY Virgínia Mendes Carregal Visceral Leishmaniasis (VL) is a serious public health problem in Brazil. In the urban area the dog is the main source of infection and VL control in Brazil involves the elimination of infected dogs. Serological tests are used for routine surveys, but they present problems of specificity and sensitivity. Molecular methods as the PCR are useful in the diagnosis and identification of Leishmania species. PCR is able to detect seronegative animals and is more sensitive and specific, particularly in the diagnosis in asymptomatic dogs. One obstacle on the implementation of molecular assays is the lack of standardization. More than 400 articles on the diagnosis of leishmaniasis had been pubhished since 1989, however a few studies had compared the efficiency of the diverse available techniques. The aim of this work was compare different methods of PCR in different clinical samples for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis (CVL) in asymptomatic animals. Bone marrow, peripheral blood, conjunctival swab and skin biopsies had been analyzed by the methods kdna PCR - Hybridization, kdna semi nested PCR (kdna snpcr), Leishmania nested PCR (LnPCR) e Internal Transcribed Spacer 1 nested PCR (ITS-1 npcr). Thirty positive asymptomatic dogs for serology and parasitology examination had been used. Six not infected dogs had been used as controls. The DNA extration from swabs was performed by Phenol-Chloroform method. Commercial kits had been used for DNA extraction of peripheral blood, bone marrow and skin biopsies. The kdna PCR - Hybridization detected 5/30 (16.7%) positive dogs for peripheral blood, 17/30 (57%) for skin, 19/30 (63.3%) for bone marrow and 21/30 (70%) for conjunctival swab. Using the method kdna snpcr had been found 7/30 (23.3%) positive dogs for peripheral blood, 17/30 (57%) for skin, 12/30 (40%) for bone marrow and 24/30 (80%) samples of conjunctival swab. Through LnPCR method 9/30 (30%) positive dogs for the samples of peripheral blood had been detected, 15/30 (50%) for bone marrow, 13/30 (43.3%) for the samples of skin and 19/30 (63.3%) for conjunctival swab. The ITS-1 npcr analyse showed 19/30 (63.3%) positive dogs for peripheral blood, 19/30 (63.33%) for skin, 29/30 (97%) for bone marrow and 29/30 (97%) for conjunctival swab. The ITS-1 npcr was superior to other methods based on the positivities obtained using the summatory of all clinical samples. The ITS-1 npcr obtained 96/120 positive results, kdna PCR-hibridization 62/120, kdna snpcr 60/120 and LnPCR 56/120. The conjunctival swab presented the best result considering the summatory of the positivities obtained by all methods. The conjunctival swab obtained 93/120 positive results, medula 73/120, skin biopsies 68/120 and blood 40/120. The results of this study indicated the conjunctival swab associated to ITS-1 npcr as the best option for the molecular diagnosis of visceral leishmaniasis in asymptomatic dogs, among the methods and samples analysed. Keywords: Canine Visceral Leishmaniasis; Polymerase Chain Reaction (PCR); Diagnosis.

8 VIII LISTA DE FIGURAS Figura 1: Autorradiograma dos resultados obtidos pelo método kdna PCR-hibridização para as amostras de sangue periférico...59 Figura 2: Autorradiograma dos resultados obtidos pelo método kdna PCR-hibridização para as amostras de pele Figura 3: Autorradiograma dos resultados obtidos pelo método kdna PCR-hibridização para as amostras de medula óssea Figura 4: Autorradiograma dos resultados obtidos pelo método kdna PCR-hibridização para as amostras de swab conjuntival Figura 5: Porcentagem de cães positivos obtidos pelo método kdna PCR-hibridização para as amostras de sangue periférico, pele, medula óssea e swab conjuntival Figura 6: Gel de agarose dos produtos da 2ª reação de PCR obtidos pelo método kdna snpcr referente às amostras de sangue periférico Figura 7: Gel de agarose dos produtos da 2ª reação de PCR obtidos pelo método kdna snpcr referente às amostras de pele Figura 8: Gel de agarose dos produtos da 2ª reação de PCR obtidos pelo método kdna snpcr referente às amostras de medula óssea Figura 9: Gel de agarose dos produtos da 2ª reação de PCR obtidos pelo método kdna snpcr referente às amostras de swab conjuntival Figura 10: Porcentagem de cães positivos obtidos pelo método kdna snpcr para as amostras de sangue periférico, pele, medula óssea e swab conjuntival Figura 11: Gel de agarose dos produtos da 2ª reação de PCR obtidos pelo método LnPCR referente às amostras de sangue periférico Figura 12: Gel de agarose dos produtos da 2ª reação de PCR obtidos pelo método LnPCR referente às amostras de pele Figura 13: Gel de agarose dos produtos da 2ª reação de PCR obtidos pelo método LnPCR referente às amostras de medula óssea Figura 14: Gel de agarose dos produtos da 2ª reação de PCR obtidos pelo método LnPCR referente às amostras de swab conjuntival Figura 15: Porcentagem de cães positivos obtidos pelo método LnPCR para as amostras de sangue periférico, pele, medula óssea e swab conjuntival Figura 16: Gel de agarose dos produtos da 2ª reação de PCR obtidos pelo método ITS1 npcr referente às amostras de sangue periférico... 72

9 IX Figura 17: Gel de agarose dos produtos da 2ª reação de PCR obtidos pelo método ITS1 npcr referente às amostras de pele Figura 18: Gel de agarose dos produtos da 2ª reação de PCR obtidos pelo método ITS1 npcr referente às amostras de medula óssea Figura 19: Gel de agarose dos produtos da 2ª reação de PCR obtidos pelo método ITS1 npcr referente às amostras de swab conjuntival Figura 20: Porcentagem de cães positivos obtidos pelo método ITS1 npcr para as amostras de sangue periférico, pele, medula óssea e swab conjuntival Figura 21: Comparação da positividade dos quatro métodos de PCR estudados para as amostras de sangue periférico, pele, medula óssea e swab conjuntival Figura 22: Positividade total dos métodos de PCR Figura 23: Positividade total das amostras clínicas avaliadas...84

10 X LISTA DE TABELAS Tabela 1: Casos confirmados de Leishmaniose Visceral, Brasil, Grandes Regiões e Unidades Federadas, 1990 a Tabela 2 : Casos humanos de Leishmaniose Visceral ocorridos no município de Belo Horizonte/MG, por Distrito Sanitário de Residência Fonte: PBH, Tabela 3: Ações de controle da LV realizadas pela Prefeitura de Belo Horizonte até o momento, no ano de Tabela 4: Resultado das amostras clínicas de sangue periférico analisadas pelos quatro métodos de PCR avaliados Tabela 5: Resultado das amostras de biópsias de pele analisadas pelos quatro métodos de PCR avaliados...80 Tabela 6: Resultado das amostras de medula óssea analisadas pelos quatro métodos de PCR avaliados...81 Tabela 7: Resultado das amostras de swab conjuntival analisadas pelos quatro métodos de PCR avaliados...82

11 XI LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS CCZ DAT Centro de Controle de Zoonozes Teste de aglutinação direta datp Desoxi-adenina trifosfato dctp DDT Desoxi-citosina trifosfato Dicloro-Difenil-Tricloroetano dgtp ddh2o Desoxi-guanina trifosfato Água deionizada e destilada DNA Desoxyribonucleic Acid (Ácido Desoxirribonucléico) dntp Desoxi-ribonucleotídeos trifosfato dttp Desoxi-timina tri-fosfato EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid (Ácido etilenodiaminotetracético) ELISA IgE IgG IMIQ Enzyme Linked Immunosorbent Assay Imunoglobulina E Imunoglobulina G Imunoistoquímica ITS1 Internal transcribed spacer 1 (região espaçadora interna transcritível 1) ITS1 npcr Internal transcribed spacer 1 nested PCR Kb Kilobase kdna DNA de cinetoplasto LC Leishmaniose cutânea LnPCR Leishmania nested PCR LSU rrna Large subunit ribosomal RNA LV Leishmaniose visceral LVC Leishmaniose visceral canina 32 P Fósforo trinta e dois PB PBS PCR RBC RFLP RIFI Pares de base Phosphate buffer saline Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase) Red Blood Cell Restriction Fragment Lenght Polymorphism Reação de Imunofluorescência Indireta

12 XII RNA rrna SDS SSC SSU rrna TBE TE Ácido ribonucléico Ácido ribonucléico Sulfato dodecil de sódio Solution of Sodium Citrate (Solução de citrato de sódio) Small subunit ribosomal RNA (subunidade ribossômica menor do RNA ribossômico) Tris Borato EDTA Tris EDTA

13 XIII LISTA DE SÍMBOLOS β ºC cm Beta Graus Celsius Centímetro fg Fentograma g h Gravidade Hora J M Joules Molar MeV Megaeletronvolt min Minutos ml Mililitros mm mg Milimolar Miligrama m/v m2 nº massa/volume Metro quadrado Número pg Picograma ph Potencial Hidrogeniônico pmol Picomoles s Segundos V Volt v/v volume/volume µg Micrograma µl Microlitros ηg Nanograma

14 SUMÁRIO RESUMO... VI ABSTRACT...VII LISTA DE FIGURAS... VIII LISTA DE TABELAS... X LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS... XI LISTA DE SÍMBOLOS... XIII 1) INTRODUÇÃO ) REFERENCIAL TEÓRICO ) O agente etiológico e o ciclo de transmissão ) O impacto da doença ) A Leishmaniose Visceral ) A epidemiologia da Leishmaniose Visceral ) O tratamento ) A Leishmaniose Visceral Canina ) O controle da doença ) Métodos de Diagnóstico ) kdna PCR - Hibridização ) kdna semi nested PCR ) Leishmania nested PCR (LnPCR) ) Internal transcribed spacer 1 nested PCR (ITS1 npcr) ) JUSTIFICATIVA ) OBJETIVOS ) Objetivo Geral ) Objetivos específicos ) MATERIAIS E MÉTODOS ) Animais ) Coleta das amostras ) Extração de DNA ) Métodos de PCR ) kdna PCR - Hibridização ) PCR ) Dot blot e Hibridização... 52

15 5.4.2) kdna semi nested PCR (kdna snpcr) ) Leishmania nested PCR (LnPCR) ) ITS1 nested PCR (ITS1 npcr) ) Análise estatística ) RESULTADOS ) Avaliação da sensibilidade do método kdna PCR - hibridização utilizando-se o DNA de amostras clínicas ) Avaliação da sensibilidade do método kdna snpcr utilizando-se o DNA de amostras clínicas ) Avaliação da sensibilidade do método LnPCR utilizando-se o DNA de amostras clínicas ) Avaliação da sensibilidade do método ITS1 npcr utilizando-se o DNA de amostras clínicas ) Comparação da sensibilidade dos métodos de PCR por amostra clínica ) Comparação dos métodos de PCR utilizando-se o somatório da positividade de todas as amostras clínicas ) Avaliação da positividade total das diferentes amostras clínicas utilizando-se o somatório das positividades de todos os métodos de PCR ) DISCUSSÃO ) CONCLUSÕES ) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 99

16 1) INTRODUÇÃO

17 17 A leishmaniose visceral (LV) é uma doença de grande impacto mundial, de característica transmissível, classificada como uma antropozoonose, que recentemente vem se expandindo para as áreas urbanas de médio e grande porte, especialmente devido a alterações no ambiente natural. O Brasil vem apresentando um grande aumento no número de casos de LV desde o ano de 1999 (WHO, 2011). Dados do Ministério da saúde relatam um crescente aumento no número de óbitos causados pela doença, aumentando de 155 no ano de 2000 para 216 no ano de (MS, 2011). Os cães errantes são o principal reservatório para a infecção (WHO, 2011) e no Brasil a leishmaniose visceral canina (LVC) coexiste com a doença humana em todos os focos conhecidos atualmente. A LVC precede a ocorrência da doença humana (GONTIJO, C. & MELO, M., 2004; DANTAS-TORRES et al., 2006), sendo que muitos casos são assintomáticos, mas estes contribuem também para a infecção dos insetos vetores e manutenção do ciclo de transmissão da doença para outros cães ou humanos (BANETH, G. & AROCH, I., 2008). Uma das medidas de controle da LVC estabelecidas pelo Ministério da Saúde é a eutanásia dos cães infectados, em cumprimento ao Decreto nº de 14 de março de Contudo, em relação ao diagnóstico apresenta pelo menos três exames deixando uma lacuna sobre o melhor e mais eficaz método a ser utilizado entre eles. O diagnóstico laboratorial pode ser feito através do exame parasitológico direto, por meio de métodos imunológicos como a imunofluorescência indireta (RIFI) ou ensaios imunoenzimáticos (ELISA - Enzyme-linked immunosorbent assay), pela imunohistoquímica e, mais recentemente, através de métodos moleculares de amplificação gênica como a PCR (do inglês Polimerase Chain Reaction ) e PCR em tempo real.

18 18 O Ministério da Saúde atualmente recomenda como técnicas sorológicas para os inquéritos caninos a RIFI e o ELISA, utilizadas de rotina nos laboratórios de saúde pública, sendo o ELISA utilizado como técnica para a triagem e a RIFI aplicada para a confirmação das amostras reagentes pelo ELISA (MS, 2003). O exame parasitológico é baseado na procura da Leishmania sp. em aspirado de lesões cutâneas, medula óssea, linfonodo, baço ou raspado das bordas das lesões, onde é feita a pesquisa direta das formas amastigotas do parasito. Trata-se de um teste de alta especificidade, ou seja, uma vez visualizado o parasito não há dúvidas quanto à positividade da amostra. Todavia, o exame parasitológico direto está sujeito a resultados falso-negativos, especialmente nos casos em que a carga parasitária é muito baixa e/ou quando a coleta e o material coletado são inadequados, e também exige pessoal treinado para a realização da técnica. É um método invasivo, significando a ocorrência de riscos para o animal e também impraticável em programas de saúde pública (MS, 2003). A sorologia (RIFI e ELISA) baseia-se na detecção de anticorpos anti-leishmania, não avaliando a carga parasitária, mas a resposta imunológica do animal contra o agente. Podem, portanto, acontecer resultados falso-negativos e falso-positivos. Além de serem técnicas laboriosas, também podem ocorrer reações cruzadas com outros tripanosomatídeos. A melhor forma de aumentar a sensibilidade e a especificidade do diagnóstico é a realização combinada de dois testes, ELISA e RIFI, em vez de realizar apenas a RIFI, teste considerado o padrãoouro pelo Ministério da Saúde (MS, 2006). A PCR é altamente específica e mais sensível do que os métodos clássicos utilizados para o diagnóstico da LVC (ASHFORD et al., 1995; SANCHES et al., 2001). A utilização da PCR permite a detecção e a identificação da Leishmania. A PCR pode ser utilizada em várias amostras biológicas, incluindo pele, sangue, biópsia de linfonodo, medula óssea e swab conjuntival. Outra vantagem da PCR, devido à sua alta sensibilidade, é a possibilidade de detecção de animais soronegativos infectados e cães assintomáticos. (SINGH et al., 1999; LACHAUD et al., 2000; XIAO-SU et al., 2000; FERREIRA et al., 2008; PILATTI et al, 2009; LEITE et al., 2010).

19 19 A Organização Mundial de Saúde (OMS) considera as leishmanioses doenças emergentes ou não-controladas, onde o foco de pesquisa está na aquisição de novos conhecimentos sobre métodos de diagnóstico e drogas terapêuticas e no planejamento de estratégias para seu controle (QUARESMA et al., 2009). Muitos avanços têm ocorrido nos últimos anos, mas a despeito do grande número de testes disponíveis para o diagnóstico da LVC, nenhum apresenta 100% de sensibilidade e especificidade. O diagnóstico molecular da LV em humanos pode ser considerado extremamente eficiente (MATHIS, A. & DEPLAZES, P., 1995; LACHAUD et al., 2000;), porém o diagnóstico por PCR da LVC continua a ser um desafio, devido, por exemplo, às dificuldades encontradas na preparação do DNA, à falta de padronização de técnicas e de uma amostra ideal para um diagnóstico preciso da doença. O diagnóstico precoce, em humano e cães, se faz necessários por se tratar de uma doença que pode ser fatal para o ser humano, e por ser necessária a adoção de medidas de controle específicas sobre o reservatório doméstico da doença, incluindo seu sacrifício quando este se encontra infectado (MS, 2003). Este trabalho tem como objetivo comparar em diferentes amostras clínicas a sensibilidade de métodos de PCR empregados na identificação de Leishmania, com o propósito de indentificar os métodos mais sensíveis e amostras clínicas mais adequadas para o diagnóstico da LVC.

20 2) REFERENCIAL TEÓRICO

21 21 A leishmaniose é um nome coletivo para um número de doenças causadas por protozoários flagelados do gênero Leishmania, os quais possuem diversas manifestações clínicas (WHO, 2004). As leishmanioses são doenças parasitárias, endêmicas em 88 países, 22 no Novo Mundo e 66 no Velho Mundo, e afetam principalmente as populações pobres e marginalizadas. Os animais silvestres e domésticos, e os próprios humanos podem agir como reservatórios da infecção (WHO, 2011). As leishmanioses são causadas por várias espécies de protozoários flagelados encontrados em muitas áreas do mundo, particularmente na África, América Latina, Ásia do Sul e Central, na bacia do Mediterrâneo e no Oriente Médio. Em suas formas mais severas, a doença pode causar desfiguração bem como a morte. A OMS estima a prevalência mundial sendo de aproximadamente 12 milhões de casos, com uma mortalidade anual de O tamanho da população de risco é de cerca de 350 milhões. A transmissão mais freqüente é a zoonótica: onde os parasitos são transmitidos a partir de um animal (pequenos roedores, cães) pela picada do flebotomíneo. Ela também pode ser antroponótica, onde o parasito é transmitido pelo mosquito a partir de um hospedeiro humano infectado (FERDINAN, 2005). A doença pode apresentar uma grande variedade de sintomas clínicos, os quais podem ser cutâneos, mucocutâneos ou viscerais. A leishmaniose cutânea (LC) é a forma mais comum, porém a leishmaniose visceral (LV) é a forma mais grave, na qual os órgãos vitais do corpo são afetados (WHO, 2010). A leishmaniose está associada à desnutrição, migrações da população, moradias precárias, analfabetismo, discriminação de gênero, fraqueza do sistema imunológico e falta de recursos. A leishmaniose está também ligada a mudanças ambientais tais como desflorestamento, construção de barragens, novos esquemas de irrigação e urbanização (WHO, 2010).

22 O agente etiológico e o ciclo de transmissão O ciclo de vida das espécies de Leishmania é ligeiramente diferente, mas há pontos comuns. São libertadas no sangue do hospedeiro junto com a saliva de flebotomíneos. Os hospedeiros vertebrados incluem uma grande variedade de mamíferos, sendo os mais comuns os roedores e canídeos, mas também encontramos edentados, marsupiais, procionídeos, ungulados primitivos, primatas e, entre estes, o homem. Os hospedeiros invertebrados são exclusivamente as fêmeas de insetos hematófagos conhecidos como flebotomíneos (Diptera: Psychodidae da subfamília Phlebotominae) (NEVES, 2006). Existem cerca de 800 espécies de flebotomíneos conhecidas, mas somente cerca de 30 delas são conhecidas por transmitir a leishmaniose. As fêmeas dos flebotomíneos necessitam de sangue para o desenvolvimento de seus ovos, e se tornam infectadas com a Leishmania quando elas sugam o sangue de uma pessoa ou animal infectado. Em um período entre 4 a 10 dias, os parasitos se desenvolvem no flebotomíneo. Quando a fêmea infectada precisa se alimentar de uma fonte fresca de sangue, ela inocula a pessoa ou o animal com o parasito, injetando também sua saliva que é um faciliador importante para a infecção, e o ciclo de transmissão se completa (WHO, 2010). Para que a infecção se estabeleça é necessário que essas formas penetrem no interior de células mononucleares do sistema fagocítico e se transformem em formas amastigotas. As amastigotas inicialmente se multiplicam dentro dos macrófagos da pele, onde ocorreu a inoculação do parasito. Posteriormente elas se disseminam através da corrente sanguínea para os órgãos internos, podendo desencadear alterações patológicas (FERDINAN, 2005). Os agentes etiológicos das leishmanioses são protozoários tripanossomatídeos da ordem Kinetoplastida, que apresentam como característica o DNA associado à mitocôndria, chamado de cinetoplasto (kdna). O gênero Leishmania apresenta espécies que se agrupam em complexos. A Leishmania chagasi, foco de interesse neste trabalho, pertencente ao

23 23 complexo Leishmania donovani (NEVES, 2006). Os complexos por sua vez são agrupados em dois subgêneros: Leishmania e Viannia. 2.2 O impacto da doença Até recentemente, o impacto da leishmaniose na saúde pública foi grosseiramente subestimado. Durante os últimos 10 anos, as regiões endêmicas foram se espalhando e tem havido um aumento acentuado no número de casos da doença. Além do mais, ocorre um número substancial de casos não relatados, pois a notificação da doença é obrigatória em somente 32 dos 88 países afetados. Aproximadamente dois milhões de novos casos, sendo destes correspondentes a LV ocorrem anualmente (WHO, 2010). Mais recentemente a LV tem emergido como uma infecção oportunística associada com o vírus HIV. Em áreas endêmicas para LV, muitas pessoas apresentam a infecção do tipo assintomática. Os métodos de diagnóstico indiretos da LV tais como os exames sorológicos frequentemente falham, e os métodos diretos como os aspirados de medula óssea, linfonodo ou baço são confiáveis, porém invasivos. Além disso, os pacientes co-infectados podem servir como reservatórios humanos, abrigando uma grande quantidade de parasitos em seu sangue e se tornando uma fonte de infecção para o inseto vetor (WHO, 2010). 2.3 A Leishmaniose Visceral A leishmaniose visceral (LV) ou calazar é uma infecção zoonótica no Novo Mundo e também antroponótica no Velho Mundo, que afeta animais e o homem. Inicialmente, era uma doença de ambientes silvestres ou rurais, e atualmente muitos casos já ocorrem em centros urbanos, em áreas residenciais. Na América Latina a doença já foi descrita em pelo menos 12 países sendo que 90% dos casos ocorrem no Brasil, especialmente na Região Nordeste (MS, 2010). A LV é causada no Novo Mundo pela Leishmania (Leishmania) chagasi. A L. (L.) chagasi já foi considerada distinta da L. (L.) infantum, mas de acordo com Mauricio et al.

24 24 (2000), estudos moleculares de caracterização indicam que esses patógenos são indistinguíveis. Na área urbana, o cão (Canis familiaris) é a principal fonte de infecção. Os casos caninos têm precedido a ocorrência de casos humanos e a infecção em cães tem sido mais prevalente que no homem. No ambiente silvestre os reservatórios são as raposas (Dusicyon vetulus e Cerdocyon thous) e os marsupiais (Didelphis albiventris) (MS, 2005). No Brasil, duas espécies de flebotomíneos, até o momento, estão relacionadas com a transmissão da doença, Lutzomyia longipalpis e Lutzomyia cruzi. A primeira é considerada a principal espécie transmissora da L. (L.) chagasi, mas o L. cruzi também foi incriminada como vetor no estado do Mato Grosso do Sul. São insetos conhecidos popularmente como mosquito palha, tatuquiras, birigui, entre outros. Em nosso país, a distribuição geográfica de L. longipalpis é ampla e parece estar em expansão. Esta espécie é encontrada em quatro das cinco regiões geográficas: Nordeste, Norte, Sudeste e Centro-Oeste. A L. longipalpis adaptase facilmente ao peri-domicílio, podendo ser encontrado no interior dos domicílios e em abrigos de animais domésticos. A Lutzomyia longipalpis apresenta um ciclo de vida que varia de 32 a 40 dias, dependendo da temperatura, umidade e disponibilidade de alimento (FORATTINI, 1973). Há indício de que o período de maior transmissão da LV ocorra durante e logo após a estação chuvosa, quando há aumento da densidade populacional do inseto. A atividade dos flebotomíneos é crepuscular e raramente noturna. No intra e peri-domicílio, o L. longipalpis é encontrado, principalmente, próxima a uma fonte de alimento. Durante o dia, estes insetos ficam em repouso, em lugares sombreados e úmidos, protegidos do vento e depredadores naturais (MS, 2005). A transmissão ocorre enquanto houver o parasitismo na pele do hospedeiro. Alguns autores admitem a hipótese da transmissão entre a população canina através da ingestão de carrapatos infectados e, mesmo, através de mordeduras, cópula e ingestão de vísceras contaminadas, porém não existem evidências sobre a importância epidemiológica destes mecanismos de transmissão para humanos. Não ocorre transmissão direta da LV de pessoa a pessoa no continente americano (MS, 2005).

25 25 O período de incubação é bastante variável tanto para o homem como para o cão; no homem, é de 10 dias a 24 meses, com média entre 2 a 6 meses; no cão, varia de 3 meses a vários anos, com média de 3 a 7 meses. As crianças e idosos são mais susceptíveis. Existe resposta humoral detectada através de anticorpos circulantes, que parecem ter pouca importância como defesa (MS, 2005). O Brasil teve um aumento agudo no número de casos de LV desde Anteriormente, as epidemias rurais foram vistas em ciclos de 10 anos. Agora, a doença está aparecendo também em áreas urbanas. Ondas de seca, falta de terras disponíveis, e a fome levaram à grande migração da população das áreas rurais para os subúrbios da periferia das grandes cidades, criando assentamentos de alta densidade populacional com deficiência em infra-estrutura e saneamento. Nesses assentamentos, o parasito recentemente introduzido encontra um vasto número de hospedeiros não-imunizados, que às vezes estão desnutridos e conseqüentemente mais vulneráveis. As crianças abaixo de 15 anos de idade são o grupo mais gravemente afetado (WHO, 2010) A epidemiologia da Leishmaniose Visceral No período de tempo compreendido entre 2003 a 2009 foram registrados casos de LV no país, sendo que a região Nordeste representou 47,5% dos casos, seguida pelas regiões Norte (19,2%), Sudeste (17,4%), Centro-Oeste (7,4%) e Sul (0,2%). Atualmente a LV está distribuída em 21 Unidades Federadas, atingindo as cinco regiões brasileiras, sendo mais freqüente no sexo masculino (63,9%) e em crianças menores de 10 anos (48,9%) (MS, 2011). A TAB. 1 representa o número de casos confirmados de LV no Brasil, classificados de acordo com as grandes regiões e Unidades Federadas, no período compreendido entre 1990 a 2009.

26 Tabela 1: Casos confirmados de leishmaniose visceral, Brasil, Grandes Regiões e Unidades Federadas, 1990 a Fonte: MS,

27 27 De acordo com a tabela acima, Minas Gerais é o segundo estado com o maior número de casos de LV no Brasil (464 casos registrados no ano de 2009). Casos de LV em Minas Gerais vêm ocorrendo desde 1940, quando os primeiros casos humanos foram detectados no norte do estado. Atualmente 84% dos casos confirmados em Minas Gerais são de pacientes residentes em zonas urbanas, sendo que em 1989 a doença passou a ser notificada na região metropolitana de Belo Horizonte, ocorrendo o primeiro caso em Sabará, seguido em 1991 da notificação da doença em Belo Horizonte. Os municípios de Belo Horizonte, Montes Claros, Ribeirão das Neves, Janaúba, Santa Luzia e Paracatu corresponderam a 56% das notificações no estado. Entre 2004 e 2006, a SES/MG notificou à Secretaria de Vigilância Saúde/Ministério da Saúde (SVS/MS), o número mais alto de pacientes com LV grave entre os estados brasileiros (RESENDE, 2007). A TAB. 2 ilustra o número de casos de leishmaniose visceral humana registrado pela Prefeitura de Belo Horizonte, no período compreendido entre 1994 a 2010.

28 28 Tabela 2: Casos humanos de leishmaniose visceral ocorridos no município de Belo Horizonte/MG, por Distrito Sanitário de Residência Fonte: PBH, 2010.

29 29 A urbanização da LV tem sido relacionada a modificações ambientais ou ações antrópicas, pelo rápido processo migratório, pela interação e mobilização de reservatórios silvestres e cães infectados para áreas sem transmissão, e pela adaptação do vetor L. longipalpis ao peri-domicílio (MAIA-ELKHOURY et al., 2008). A distribuição da LV é notável em escolares de idade inferior ou igual a 10 anos. A susceptibilidade dessa faixa etária se deve, possivelmente, ao contato mais freqüente das crianças com animais, em comparação com adultos; além disso, os escolares apresentam as maiores taxas de carência nutricional e têm seu estado imunológico ainda em formação (CHAPPUIS et al., 2007). 2.4 O tratamento As drogas de primeira escolha para o tratamento da leishmaniose são os antimoniais pentavalentes, os quais permanecem caros, necessitando de injeções repetitivas e o seu uso na clínica tem diversas limitações. Os seus componentes devem ser administrados parentalmente, diariamente, por no mínimo três semanas. A terapia antimonial é às vezes acompanhada por efeitos colaterais sistêmicos, necessitando de supervisão médica cuidadosa. Os efeitos colaterais típicos incluem náusea, vômito, fraqueza e mialgia, cólica abdominal, diarréia, rashes cutâneos e hepatotoxidade, junto com o mais importante deles, a cardiotoxicidade. A ocorrência de resistência à droga é outro importante problema no tratamento dessa doença. Drogas de segunda linha (pentamicina e anfotericina B) são também limitadas por vários efeitos colaterais e por necessidade de administração parenteral (FRÉZARD et al., 2009). O controle dos reservatórios e vetores pode ser útil em certas condições, mas não é aplicável em todo ambiente epidemiológico. Requer infra-estrutura e vigilância além da capacidade de muitos países endêmicos. A vacinação, portanto, permanece a melhor esperança para o controle de todas as formas da doença. Mas ainda não há nenhuma vacina para a prevenção de qualquer forma de leishmaniose em humanos. (WHO, 2004).

30 A Leishmaniose Visceral Canina Em novembro de 1992, o Laboratório de Parasitologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (ICB/UFMG) fez os primeiros diagnósticos de calazar canino, sendo que os primeiros casos de leishmaniose visceral humana apareceram no ano de A epidemia de leishmaniose em Belo Horizonte teve sua origem provável a partir de focos inicialmente diagnosticados em Sabará, sendo que a epidemia canina precedeu temporal e espacialmente a epidemia humana (GONTIJO, C. & MELO, M., 2004). A LVC não apresenta manifestações patognomônicas. Os seus sinais clínicos mais comuns são alterações cutâneas, linfoadenomegalia local ou generalizada, aumento do baço e fígado, glomerulopatia, lesões oculares, epistaxe, onicogrifose e claudicação. As formas atípicas incluem gamopatia monoclonal, colite crônica, alterações hemodinâmicas e desordens dos sistemas cardiovascular, respiratório e músculo-esquelético. Essas alterações são frequentemente confundidas com alterações de outras doenças caninas (BLAVIER et al., 2001). O diagnóstico diferencial para a LVC inclui demodicose, sarna sarcóptica, dermatite de pulgas, neoplasias cutâneas, dermatite infecciosa e imunomediadas, tumor venéreo transmissível, erliquiose, riquetsiose e babesiose (REIS et al., 2006). Atualmente, os cães são os principais mantenedores e disseminadores da L. chagasi no meio urbano. A LVC se caracteriza por apresentar um largo espectro de lesões que varia desde a infecção inaparente até uma forma clínica grave, que normalmente leva à morte do animal. (SILVA, et al, 2006). A classificação segundo os sinais clínicos (MS, 2003) apresentados nesses animais pode ser verificada conforme demonstrado a seguir:

31 31 Cães assintomáticos: ausência de sinais clínicos sugestivos da infecção por Leishmania. Cães oligossintomáticos: presença de adenopatia linfóide, pequena perda de peso e pêlo opaco. Cães sintomáticos: todos ou alguns sinais mais comuns da doença como as alterações cutâneas (alopecia, eczema furfuráceo, úlceras, hiperqueratose), onicogrifose, emagrecimento, ceratoconjuntivite e paresia dos membros posteriores. Alguns cães desenvolvem a doença clínica, visto que outros permanecem assintomáticos, carregando a infecção para os insetos vetores e podendo conseqüentemente transmitir a doença a outros cães ou humanos. (BANETH, G. & AROCH, I., 2008). De acordo com Ciaramella, P. (1997), a pele dos cães apresenta importantes características, as quais estão intimamente relacionadas à LV, pois ela é o primeiro contato entre o parasito e o sistema imune do hospedeiro, além de ser o local onde se manifestam os sinais clínicos e se encontra uma grande quantidade das formas infectantes, as formas amastigotas. Em Belo Horizonte a LVC tem-se expandido mesmo com uso de expressivos recursos financeiros e humanos no seu controle. Durante seu recente histórico na cidade a doença alcançou altos coeficientes de morbidade e letalidade nas populações atingidas (SILVA, 2006). A TAB. 3 ilustra as ações de controle da LV realizadas pela Prefeitura de Belo Horizonte até o momento, no ano de 2010.

32 Tabela 3: Ações de controle da LV realizadas pela Prefeitura de Belo Horizonte até o momento, no ano de Fonte: PBH,

33 33 Nenhumas das drogas utilizadas atualmente para o tratamento da leishmaniose provaram ser capazes de induzir uma cura parasitológica em cães. Os cães tratados que vivem em áreas endêmicas estão constantemente expostos ao parasito e podem ser re-infectados e infectantes (NOLI, C. & AUXILIA, S., 2005). O tratamento de cães pode induzir resistência dos parasitos; portanto, os medicamentos utilizados para tratamento humano não devem ser usados no tratamento canino, a fim de evitar o desenvolvimento de cepas resistentes, o que dificultaria ainda mais o tratamento da doença no ser humano (MS, 2003). De acordo com o Ministério da Saúde, o tratamento da LV em cães infectados ou doentes, com produtos de uso humano ou produtos não-registrados no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) é proibido, e os cães soropositivos para LV deverão ser eutanasiados, em cumprimento ao Decreto nº de 14 de março de O controle da doença Os principais programas de controle da LV empreendidos pela SUCAM (Ministério da Saúde) nos estados do Ceará, Minas Gerais e Rio de Janeiro incluem: Detecção ativa e passiva de casos humanos para tratamento específico; Detecção sorológica e eliminação de cães infectados (Decreto nº de 14 de março de 1963); Pulverização de abrigos de animais e habitações humanas (interna e externamente) para o controle do L. longipalpis.

34 34 Outras medidas que podem ser empregadas para o controle da doença são o saneamento ambiental (como a limpeza de quintais, terrenos e praças públicas), a eliminação de fonte de umidade, não permanência de animais domésticos dentro de casa e ações de educação em saúde (MS, 2003). O controle vetorial e de reservatórios representam os maiores desafios para o controle da doença, dado a necessidade de melhor conhecer o comportamento do vetor no ambiente urbano, as dificuldades operacionais e o alto custo de execução. Nos últimos anos, o Ministério da Saúde tem investido em pesquisas sobre diagnóstico laboratorial humano e canino, tratamento dos pacientes, avaliação da efetividade das estratégias de controle, bem como de novas tecnologias que possam contribuir na implementação das ações de vigilância e controle da LV no Brasil. (MAIA-ELKHOURY et al., 2008). Das ações de vigilância e controle da LV, as relacionadas ao reservatório doméstico (cão) são consideradas, do ponto de vista social, as mais polêmicas, devido à indicação da eutanásia de cães infectados e a contra-indicação do tratamento canino como ferramentas para bloqueio da transmissão vetorial (SVS, 2009). Mas estudos indicam que a doença nos cães antecede o aparecimento em casos humanos e que a probabilidade de infecção em humanos aumenta em áreas de alta taxa de prevalência de infecção canina. Quinnell, R. & Courtenay O. (2009), afirmam que o grau de infecção aumenta com a gravidade da doença, mas que a infecciosidade de cães assintomáticos é suficiente alta para que seja necessário o controle de cães sintomáticos e assintomáticos. 2.7 Métodos de Diagnóstico O diagnóstico clínico da LVC é muitas vezes um problema para o veterinário. Há um amplo espectro de sinais clínicos, desde animais aparentemente saudáveis, passando por oligossintomáticos, até estágios severos da doença. Uma característica importante é a permanência da doença clinicamente inaparente por longos períodos. Dependendo da fase da doença e das condições imunológicas, muitos cães infectados se apresentam assintomáticos. Entretanto, já foi demonstrado que cães infectados, mesmo assintomáticos, são fonte de infecção para os flebotomíneos e, conseqüentemente, têm papel ativo na transmissão da

35 35 Leishmania. Estudos dos fatores de risco para a LVC no Brasil até o momento não evidenciaram predisposição sexual, racial ou etária relacionada com a infecção. Entretanto, acredita-se que as raças miniaturas sejam menos afetadas por viveram dentro dos domicílios (GONTIJO, C. & MELO, M., 2004). Os métodos de diagnóstico recomendados pelo Ministério da Saúde utilizados são o ELISA o qual é utlizado para a triagem em inquéritos caninos e a RIFI aplicada para a confrimação das amostras reagentes pelo ELISA (MS, 2003). O exame por microscopia é um diagnóstico conclusivo que pode ser feito através da observação microscópica de amastigotas de Leishmania em esfregaços corados de tecidos ou órgãos, tais como a medula óssea, linfonodos, pele ou sangue periférico. Em sua maioria os procedimentos são invasivos e geralmente de difícil aplicação em cães assintomáticos. A microscopia de esfregaços de amostras de medula óssea e linfonodos têm uma sensibilidade que varia de 60 a 75% e 30 a 50% respectivamente (ALVAR et al., 2004). A imunohistoquímica (IMIQ) é utilizada como uma ferramenta complementar para confirmar o diagnóstico por microscopia, principalmente em órgãos os quais apresentam baixa carga parasitária, quando os parasitos são de difícil identificação ao microscópio e quando o padrão histológico é sugestivo para a doença (MAIA, C. & CAMPINO, L., 2008). As desvantagens da microscopia são o número variável de organismos em cada amostra clínica, o grande tempo dedicado a observação e aos campos microscópicos avaliados, os quais são importantes para aumentar a sensibilidade da técnica. A cultura in vitro de tecidos pode melhorar a sensibilidade de detecção do parasito, mas nem todas as espécies de Leishmania crescem ao mesmo tempo em todos os tecidos e órgãos diferentes do mesmo cão podem apresentar diferentes cargas parasitárias. É necessária uma inoculação em replicata de vários tubos para se aumentar a sensibilidade da técnica. Os parasitos começam a ser visualizados na primeira semana e em geral a cultura é considerada negativa após quatro subculturas sucessivas negativas (EVANS, 1989).

36 36 As desvantagens da cultura são o atraso na entrega do resultado, a susceptibilidade à contaminação, a dependência da carga parasitária e a pobre adaptação do isolado ao meio, esses fatos conflitam com a especificidade de 100% da técnica. As vantagens residem no fato de que a cultura é necessária para se obter um número suficiente de parasitos para identificação isoenzimática, para uso como antígenos para o diagnóstico imunológico, para modelos de infecção experimental e para identificação molecular e estudos de drogas in vitro (MAIA,C. & CAMPINO, L., 2008). O ELISA consiste na reação de anticorpos presentes nos soros com antígenos solúveis e purificados de Leishmania obtidos a partir de cultura in vitro. Esse antígeno é adsorvido em microplacas e os soros diluídos (controle do teste e das amostras) são adicionados posteriormente. Quando os anticorpos específicos estiverem presentes no soro eles vão se fixar aos antígenos. A visualização da reação ocorre quando adicionada uma antiimunoglobulina de cão marcada com a enzima peroxidase, que se ligará aos anticorpos específicos caso estejam presentes, gerando um produto colorido que poderá ser medido por espectrofotometria (MS, 2003). O ELISA tem como vantagem o escaneamento de um grande número de amostras em um curto período de tempo, utilizando-se uma grande variedade de antígenos, tais como o citoplasma total, antígenos purificados, peptídeos sintéticos e proteínas recombinantes (MAIA,C. & CAMPINO, L., 2008). O teste é sensível, permite a detecção de baixos títulos de anticorpos, mas é pouco preciso na detecção de casos subclínicos ou assintomáticos. (GONTIJO, C. & MELO, M., 2004). Mettler et al., (2005) observaram uma alta sensibilidade quando se aplicou o ELISA em cães assintomáticos (94,1-100%) e sintomáticos (100%), utilizando-se promastigotas solúveis ou antígenos de amastigotas. A RIFI é realizada por antígenos fixados em uma lâmina, onde se aplica primeiro um anticorpo específico não fluorescente. E por último coloca-se um anticorpo fluorescente com especificidade marcada contra determinantes antigênicos do primeiro anticorpo utilizado para

37 37 reagir com o antígeno. Esta técnica apresenta como vantagem a possibilidade de se ter uma fluorescência mais evidente, pelo fato do anticorpo fluorescente se ligar apenas aos anticorpos primários. Outra vantagem é que por esta técnica pode-se trabalhar com vários anticorpos primários específicos para diferentes tipos de antígenos e pode-se identificar qual a classe que o anticorpo pertence (MARTINS, 2008). Maia et al. (2007) encontraram para a RIFI valores de sensibilidade e especificidade de 85,5% e 94,7%, respectivamente, em cães assintomáticos e sintomáticos de uma área endêmica. A sorologia (RIFI e ELISA) baseia-se na detecção de anticorpos anti-leishmania, não avaliando a carga parasitária, mas a resposta imunológica do animal contra o agente. Podem, portanto, acontecer resultados falso-negativos e falso-positivos. Além de serem técnicas laboriosas, também podem ocorrer reações cruzadas com outros tripanosomatídeos. A melhor forma de aumentar a sensibilidade e a especificidade do diagnóstico é a realização combinada de dois testes, ELISA e RIFI, em vez de realizar apenas RIFI, teste considerado o padrãoouro pelo Ministério da Saúde (MS, 2006). Os testes sorológicos não possibilitam a diferenciação entre doença ativa e um contato prévio o com o agente ou ainda não discrimina a doença clínica de infecção sub-clínica, fato este importante quando se trata de cães vacinados. (GONTIJO, C. & MELO, M., 2004). Os testes sorológicos podem ser ineficientes para diagnóstico no período de tempo entre infecção e soroconversão (MANNA et al., 2004). O uso de antígenos brutos, amastigotas ou promastigotas inteiras, ou extratos solúveis das mesmas limita sua especificidade. A clonagem de genes que codificam para proteínas antigênicas da Leishmania é importante para o desenvolvimento de novos alvos para se desenvolver métodos de sorodiagnóstico mais específicos, como por exemplo, o antígeno recombinante rk39, o único atualmente comercializado (MAIA, C. & CAMPINO, L., 2008). A leishmaniose é uma doença fatal para o ser humano, daí a necessidade de seu diagnóstico precoce tanto em humanos quanto de seu principal reservatório urbano (o cão doméstico), e da adoção de medidas de controle para a mesma (MS, 2003).

38 38 Devido às elevadas sensiblidade e especificidade da PCR, ela tem se mostrado uma ferramenta de diagnóstico superior aos métodos convencionais (ASHFORD et al., 1995; SANCHEZ et al., 2001), permitindo a detecção do parasita da Leishmania sp. em diversos tipos de amostras biológicas e também em animais nos quais ainda não ocorreu a soroconversão e cães assintomáticos (SINGH et al., 1999; LACHAUD et al., 2000; XIAO-SU et al., 2000; FERREIRA et al., 2008; QUEIROZ, 2008; PILATTI et al, 2009; LEITE et al., 2010). O diagnóstico por PCR é baseado na amplificação in vitro de seqüências de nucleotídeos específicos apresentadas pelo parasito, utilizando-se uma enzima termoestável, a Taq DNA polimerase, isolada da bactéria termofílica Thermus aquaticus (SINGH, 1997). As células da Leishmania spp. possuem uma rede complexa de moléculas de DNA circular intrincadas (denominadas DNA do cinetoplasto ou kdna) dentro de uma única mitocôndria. O DNA mitocondrial desse parasita representa cerca de 20% do DNA celular total e é organizado em uma rede em forma de disco, onde milhares de pequenos minicírculos interligados constituem 95% dessa estrutura. Cada minicírculo da Leishmania spp. contém uma região conservada de pares de base (pb) e uma região variável presente em cada molécula (DEGRAVE et al., 1994). A região conservada contém três blocos altamente conservados e algumas regiões menos conservadas, que podem ser utilizadas como alvos para PCR para a discriminação dos grupos da Leishmania spp. Além disso, outros alvos podem ser usados para a PCR, tais como o gene do DNA ribossomal e seus espaçadores (NASEREDDIN et al., 2006). Um único resultado negativo de PCR em um cão com suspeita clínica não é suficiente para se descartar a infecção. Alguns estudos que avaliaram diferentes tecidos de cães infectados utilizando a PCR mostraram resultados variáveis e conflitantes, pois em parte, o vasto alcance da sensibilidade observada entre os diferentes estudos pode ser explicado pela distribuição heterogênea dos parasitos em cada tecido ou pela carga parasitária do órgão associada com o trofismo das espécies de Leishmania e resposta imune local (BANETH, G. & AROCH, I., 2008).

39 39 A eficácia da PCR depende de diferentes fatores tais como os iniciadores, o número de cópias do alvo, o método de extração de DNA, o material biológico e o protocolo de PCR (CORTES et al., 2004). A seguir são descritos os métodos de PCR utilizados neste estudo kdna PCR Hibridização O método se baseia na amplificação da região conservada dos minicírculos do kdna, seguida pela hibridização dos produtos de PCR com sondas de minicírculos clonados de L. chagasi, marcados com 32 P (DEGRAVE et al., 1994). Os minicírculos do kdna medem 1kb e estão presentes em a cópias por célula. A região conservada amplificada neste protocolo apresenta 120 pb (ROGERS, W. & WIRTH, D., 1987). Para a hibridização, inicialmente a material amplificado é transferido para uma membrana de nylon pela técnica de Dot-Blot. A sonda é marcada com o radioisótopo 32 P pelo método dos iniciadores aleatórios. O 32 P é um emissor de radiação do tipo β, com energia de 1,7 Mev e meia vida de 14,7 dias (TURNER, 1995). Após a hibridização a membrana é submetida autoradiografia. Das vantagens da técnica, enfatiza-se a possibilidade de distinção entre os subgêneros de Leishmania. A hibridização permite um aumento de sensibilidade de detecção da ordem de 10 vezes (DAR, L. & KHAN, B., 2004) kdna semi nested PCR Neste método, utiliza-se como alvo a região variável dos minicírculos do kdna. São utilizadas duas reações do tipo semi nested, sendo que um dos oligonucleotídeos iniciadores da primeira reação é utilizado novamente na segunda reação. Este método é específico para o gênero Leishmania, mas não permite a distinção entre as espécies (MORALES et al., 2002).

40 Leishmania nested PCR (LnPCR) Nesta técnica utilizam-se iniciadores endereçados para a região do gene do RNA da subunidade ribossômica menor (SSU rrna). Consiste de duas reações do tipo nested, onde inciadores diferentes são utilizados nas duas reações. O DNA nuclear contém aproximadamente 160 cópias do gene SSU rrna. A técnica tem como vantagem a alta sensibilidade e especificidade. Apenas a segunda reação é específica para o gênero Leishmania (CRUZ et al., 2002) Internal transcribed spacer 1 nested PCR (ITS1 npcr) O alvo para essa técnica é a região espaçadora interna transcritível 1 (ITS1), que se localiza entre os genes SSU rrna e 5.8S rrna, a qual difere no tamanho e seqüência de nucleotídeos entre as espécies de Leishmania (SCHÖNIAN et al., 2003). Consiste também de duas reações do tipo nested, onde inciadores diferentes são utilizados nas duas reações. Esta técnica permite a identificação das espécies de Leishmania através do RFLP (Restriction Fragment Lenght Polimorphism) do material amplificado.

41 41 3) JUSTIFICATIVA

42 42 No Brasil, a leishmaniose visceral (LV) é considerada um grave problema de saúde pública, devido a sua magnitude, expansão geográfica e controle complexo, caro e laborioso. Tendo em vista que as atuais medidas de controle são limitadas, a Organização Pan Americana de Saúde/Organização Mundial de Saúde (OPAS/OMS), considera a LV como uma doença negligenciada de categoria 3, pois o campo da saúde pública não possui ferramentas efetivas para o controle avançado (SVS, 2009). Nas duas últimas décadas, a LV reapareceu no mundo de forma preocupante. No Brasil, epidemias urbanas foram observadas em várias cidades e a doença tem sido verificada como infecção oportunista em pacientes com AIDS, à semelhança do que se observa no sul da Europa. Além disso, a expansão da epidemia acometendo grupos de indivíduos jovens ou com co-morbidades tem ocasionado número elevado de óbitos. Observa-se que, nos últimos anos, a letalidade da LV vem aumentando gradativamente, passando de 3,6% no ano de 1994 para 6,7% em 2003, o que representa um incremento de 85% (MS, 2006). A leishmaniose visceral canina (LVC) é um exemplo de uma doença na qual a infecção não é similar a doença clínica. Isso faz com que o seu diagnóstico seja um desafio para o veterinário, para o patologista clínico e outros profissionais da área da saúde em países endêmicos, bem como em regiões não endêmicas onde a infecção importada é uma preocupação crescente (BANETH, G. & AROCH, I., 2008). Como o cão é o principal reservatório doméstico da L. chagasi, o diagnóstico preciso da LVC, além de contribuir para controle da transmissão doença, também é importante para evitar o sacrifício desnecessário de animais. Os métodos sorológicos de diagnóstico são vasta e freqüentemente utilizados, mas embora a resposta humoral específica na LVC seja, em geral, muito intensa e com altos níveis de imunoglobulinas expressas, ela subestima a taxa de infecção por Leishmania nos cães de áreas endêmicas (ALVAR et al., 2004).

43 43 A presença de anticorpos anti-leishmania por si só não é um sinal conclusivo da doença. Os níveis de subclasses de IgG específicas anti-leishmania têm sido utilizadas como marcadores da susceptibilidade e conseqüentemente do estado clínico da doença (CARDOSO et al., 2007). Níveis elevados de IgE somente ocorrem quando o animal desenvolve a patologia, o qual poderá ser um possível indicador da doença ativa, sendo que REIS et al. (2006) encontraram uma forte correlação entre IgE e a sintomatologia. Diversos fatores podem contribuir para a inconsistência nos resultados encontrados durante a realização dos testes sorológicos, como o uso de diferentes antígenos e a variedade de procedimentos e a seleção de diversos valores de corte para diluição (MAIA, C. & CAMPINO, L., 2008). A variação de espécies de Leishmania utilizadas como antígenos pode influenciar significantemente o resultado do diagnóstico da LVC (BALEEIRO et al., 2006). Altos níveis de sensibilidade e especificidade são necessários para se evitar resultados falsos negativos os quais subestimam a infecção, bem como falsos positivos os quais podem levar à eutanásia desnecessária de cães não infectados (FERREIRA et al., 2007). O uso da PCR pode melhorar a detecção da LVC. Infelizmente a maioria dos ensaios de PCR aplicados para a detecção da Leishmania está longe de serem padronizados, pois os diferentes laboratórios utilizam métodos de PCR baseados em diferentes iniciadores e em diferentes tipos de amostras (LACHAUD et al, 2002). A biologia molecular como ferramenta diagnóstica é mais rápida, sensível e específica, capaz de identificar o gênero ou por vezes as espécies de Leishmania. Um dos maiores obstáculos para a implementação desta técnica é a falta de padronização. Desde 1989 mais de 400 publicações foram realizadas sobre o diagnóstico da Leishmaniose por PCR, utilizando-se diferentes genes alvos, protocolos e amostras. No entanto pouquíssimos

44 44 trabalhos foram realizados até o momento com objetivo de comparar a eficiência das diversas técnicas de PCR disponíveis (PILATTI et al, 2009; BENSOUSSAN et al., 2006; LACHAUD et al., 2002; MEREDITH et al., 1993; RAMIREZ et al., 2000; REITHINGER et al., 2000; WEIGLE et al., 1991). De grande importância destaca-se a escolha do teste diagnóstico adotado e da amostra clínica escolhida. Uma técnica padrão deve apresentar altas sensibilidade e especificidade, ser reprodutível, fácil de ser realizada e adaptável para o uso laboratorial sem a necessidade de equipamentos sofisticados, e deve detectar todos os cães infectados por Leishmania na fase inicial da doença e utilizando-se preferencialmente de procedimentos não invasivos para a coleta das amostras (MAIA, C. & CAMPINO, L., 2008). O uso de amostras de swab conjuntival tem se mostrado útil no diagnóstico da LVC por PCR, por se tratar de um tipo de amostra não invasiva e, portanto de melhor aceitação para os proprietários de animais devido ao menor sofrimento do animal (STRAUSS-AYALI et al., 2004; FERREIRA et al., 2008; PILATTI et al., 2009; LEITE et al., 2010). Este trabalho objetiva comparar diferentes metodologias de PCR em amostras clínicas de sangue periférico, biópsias de pele, medula óssea e swab conjuntival. Todos os métodos de PCR utilizados neste trabalho apresentam duas etapas: amplificação seguida de hibridização ou de uma nova amplificação (nested ou semi nested). Dois dos métodos (kdna PCR- Hibridização e kdna snpcr) utilizam iniciadores endereçados aos minicírculos do cinetoplasto (kdna) e os outros dois métodos apresentam como alvo a região codificante (LnPCR) e intergênica não codificante (ITS1 npcr) dos genes do RNA ribossômico (rrna).

45 4) OBJETIVOS

46 46 4.1) Objetivo Geral Comparar métodos de PCR para o diagnóstico de leishmaniose visceral canina (LCV) em diferentes amostras clínicas de cães assintomáticos. 4.2) Objetivos específicos Comparar a sensibilidade dos métodos kdna PCR-hibridização, kdna snpcr, LnPCR e ITS-1 npcr em amostras clínicas de sangue periférico, medula óssea, swab conjuntival e biópsia de pele de cães infectados assintomáticos; Identificar para cada amostra clínica os métodos mais sensíveis; Identificar as amostras que permitem a melhor positividade considerando-se o desempenho global de todos os métodos; Identificar os métodos de maior sensibilidade considerando-se a positividade total das amostras; Indicar com base nos resultados obtidos os métodos mais indicados e as amostras clínicas mais adequadas para o diagnóstico da LVC por PCR.

47 5) MATERIAIS E MÉTODOS

48 48 Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CETEA) da Universidade Federal de Minas Gerais (n de protocolo 183/2008). 5.1 Animais Foram utilizados 30 cães assintomáticos, todos soropositivos para as reações de ELISA e RIFI. Os animais também foram positivos no diagnóstico parasitológico. Seis animais saudáveis, soronegativos, provenientes de áreas não endêmicas foram utilizados como controles negativos. Os cães foram cedidos pelo Centro de Controle de Zoonoses (CCZ) de Belo Horizonte, Minas Gerais, oriundos dos levantamentos rotineiros locais. 5.2 Coleta de amostras Foram coletadas células exfoliativas da conjuntiva inferior de ambas as oculares dos animais pelo método do swab conjuntival utilizando-se o procedimento descrito por Ferreira et al., (2008). Depois de realizado o esfregaço, as extremidades dos swabs foram cortadas e acondicionadas em tubos eppendorf estéreis de 1,5 ml, sendo esses armazenados a - 20 C até o uso. As amostras de sangue periférico foram coletadas de cada animal em tubos de 5 ml contendo EDTA, mantidas no gelo e processadas o mais imediato possível. As amostras de medula foram coletadas em seringas descartáveis através de punção esternal, obtendo-se um volume aproximado de 2 ml em cada coleta, mantidas em gelo e processadas o mais rápido possível. As amostras de pele foram coletadas através de biópsias da região auricular utilizando-se punchs de 0,6 cm de diâmetro, armazenadas em tubos do tipo eppendorf, mantidas em gelo e processadas o mais rápido possível. 5.3 Extração de DNA A extração do DNA do swab conjuntival foi realizada pelo método do fenolclorofórmio, baseada no método de Strauss-Ayali et al. (2004) e modificada de acordo com Ferreira et al. (2008). Foi adicionada às extremidades removidas dos swabs uma mistura de

49 µl de proteinase K (250 µg/ml) e Triton X-100 (1%) em tampão de lise (50 mm Tris, 50 mm NaCl e 10 mm EDTA [ph 8,0]), sendo incubado a 56 C por 2 h. A solução foi eluída do material e a remoção dos contaminantes foi realizada mediante três lavagens com 500 µl de fenol e clorofórmio - álcool isoamílico (24:1) em tubos Phase Lock Gel Heavy. Na primeira lavagem foram utilizados 75% de fenol, na segunda 50% e na última 100% de clorofórmio álcool isoamílico. Após cada lavagem, as soluções foram centrifugadas a g por 5 min. Em seguida, 50 µl de acetato de sódio 3M foram adicionados em cada amostra. O DNA foi precipitado usando-se um volume de isopropanol e, logo em seguida, foi lavado com 250 µl de etanol 75%. Após centrifugação o material foi resuspendido em 30 µl de TE (10 mm Tris e 1mM EDTA [ph 8,0]). O DNA extraído das conjuntivas direita e esquerda foi misturado constituindo uma única amostra que foi armazenada a -20 C até ser usada. A purificação do DNA das amostras de medula óssea foi feita utilizando-se o illustra TM blood genomicprep Mini Spin Kit (GE Healthcare, Buckinghamshire UK) como descrito a seguir. Foi utilizado um volume de 200 a 300 µl de medula óssea, no qual foram adicionados 20 µl de proteinase K (na concentração de 20 mg.ml -1 ) e 400 µl do tampão de lise tipo 10. Posteriormente os tubos eppendorf foram vortexados por 15 seg. Essa mistura foi incubada a temperatura ambiente por 10 min e misturada intermitentemente utilizando o vórtex para auxiliar a lise. O lisado foi aplicado em colunas, fornecidos pelo kit, e centrifugados a g por 1 min. A solução do tubo coletor foi descartada e novas colunas e tubos coletores foram utilizados. Logo após foram adicionado 500 µl do tampão de lise tipo 10 e novamente centrifugado a g por 1 min e descartada a solução do tubo coletor. Foram adicionados 500 µl de tampão de lise tipo 6 e centrifugado a g por 3 min, descartando-se o tubo coletor. Novas colunas foram transferidas para novos tubos eppendorf, sendo adicionados 100 µl do tampão de eluição tipo 5, pré-aquecido a 70ºC, no centro da coluna. A coluna foi incubada a temperatura ambiente por 1 min e centrifugada a g por 1 min. O DNA purificado foi armazenado a -20ºC. O DNA do sangue periférico foi purificado utilizando-se o kit illustra TM blood genomicprep Mini Spin Kit (GE Healthcare, Buckinghamshire UK). A 1 ml de sangue total foram adicionados 3 volumes da solução RBC em novos tubos de 5,0 ml e incubados por 5 min a temperatura ambiente. A solução foi centrifugada a 500 g por 2 min para baixar as células brancas. O sobrenadante foi descartado e ao restante foram adicionados de 100 a 150

50 50 µl de PBS para alcançar um volume de aproximadamente de 200 µl de suspensão. A mistura foi suspendida utilizando vórtex e transferida para tubos eppendorf, sendo adicionado logo após 20 µl de proteinase K (na concentração de 20 mg.ml -1 ). Após foi adicionado 400 µl de tampão de lise tipo 10, misturando bem utilizando vórtex por 15 seg. A mistura foi incubada em temperatura ambiente por 10 min. O lisado foi aplicado em novas colunas e novos tubos coletores e centrifugado a g por 1 min. A solução dos tubos coletores foi descartada e as colunas encaixadas em novos tubos coletores. Foram adicionados 500 µl do tampão de lise tipo 10, centrifugado a g por 1 min e descartada a solução do tubo coletor. Foram adicionados 500 µl do tampão de lise tipo 6, centrifugado a g por 3 min e descartado o tubo coletor. As colunas então foram transferidas para novos tubos do tipo eppendorf, foram adicionados 200 µl do tampão de eluição tipo 5 pré-aquecido a 70ºC no centro da coluna e incubados em temperatura ambiente por 1 min. Logo após os tubos foram centrifugados a g por 1 min e o DNA purificado foi armazenado a -20ºC. O DNA das biópsias de pele foi extraído utilizando-se o Wizard SV Genomic DNA purification Systems (Promega, Madison USA). O material foi cortado em duas partes iguais e colocado em tubo eppendorf de 1,5 ml. A essas amostras foram adicionados 275 µl da solução de digestão (200 µl de solução de lise nuclear, 50 µl de EDTA 0,5 M em ph 8.0, 20 µl de proteinase K na concentração de 20 mg.ml -1, 5 µl de RNase A, contendo um volume total de 275 µl) em cada amostra. A mistura foi incubada por 16 a 18 h a 55ºC. Logo após foram adicionados 250 µl de tampão de lise fornecido a cada amostra e misturado utilizando o vórtex. As misturas foram transferidas a novos tubos coletores com suas respectivas colunas, e centrifugados a g por 3 min. O líquido foi descartado do tubo coletor e foram adicionados 650 µl da solução de lavagem a cada coluna que foi centrifugada a g por 3 min. O líquido do tubo coletor foi descartado e esse procedimento, a partir da adição da solução de lavagem, foi repetido totalizando 4 lavagens das colunas. Após a última lavagem o tubo coletor foi esvaziado, a coluna encaixada novamente e o tubo foi centrifugado a g por 2 min para a secagem da matriz ligada à coluna. As colunas foram removidas e encaixadas em novos tubos eppendorf, sendo adicionados 250 µl de dd H 2 O, sendo essa mistura incubada por 2 min a temperatura ambiente e centrifugada por 1 min a g. O líquido de eluição não foi descartado e foram adicionados mais 250 µl de dd H 2 O às colunas e incubado a temperatura ambiente por 2 min. As colunas foram centrifugadas a g por

51 51 1 min, não descartando o líquido da eluição. As colunas então foram removidas e descartadas e os tubos eppendorf com a solução eluída armazenados a -20ºC. 5.4 Métodos de PCR Em todos os métodos de PCR descritos a seguir foram utilizados como controle positivo 1,0 µl de DNA genômico nas concentrações de 1,0 ηg/µl. A seguinte cepa foi utilizada como controle: L. (L.) chagasi MHOM/BR/1973/BH46. Para todos os métodos foi utilizado o volume de amostra de 1,0 µl. Nos controles negativos o DNA foi substituído por água destilada estéril. As etapas de preparação de reagentes, extração de DNA e reação de PCR foram realizadas em laboratórios diferentes para evitar a contaminação por amplicons. Todos os iniciadores utilizados foram obtidos da Invitrogen Brasil LTDA kdna PCR Hibridização PCR Este método de PCR apresenta como alvo para amplificação a região conservada dos minicírculos do DNA do cinetoplasto de Leishmania (kdna) (DEGRAVE et al., 1994). A reação de PCR foi realizada com os seguintes componentes: 1,0 µl da solução de cada amostra de DNA, 2,5 µl de desoxinucleotídeos trifosfato (dntps datp, dctp, dgtp, e dttp) a 10 mm, 0,2 nmol de cada oligonucleotídeo iniciador [5 (G/C)(G/C)(C/G)CC(A/C)CTAT(A/T)TTACACAACCCC-3 e 5 GGGGAGGGGCGTTCTGCGAA-3 ], 2,5 unidades da enzima Taq DNA Polimerase (Ludwig Biotec), 2,5 µl da solução tampão 10X (Tris-HCl 50 mm [ph 8,3], KCl 50 mm), 2,0 mm de MgCl 2 e um volume complementar de água deionizada autoclavada para completar o volume final de 25 µl. As amostras foram amplificadas em um termociclador (PT-100 BIO RAD) utilizando as seguintes condições de amplificação: desnaturação inicial a 95 C por 15 min, seguida por 30 ciclos de amplificação de 30 s a 94 C, 30 s a 50 C e 30 s a

52 52 72 C, e uma etapa de extensão final a 72 C por 10 min. Depois deste passo o sistema permaneceu a 4 C. Após a amplificação, 15 µl dos produtos de PCR das amostras foram misturados a 3,0 µl de tampão de amostra (Tris 10 mm, EDTA 10 mm, azul de bromofenol 0,005% m/v e glicerol 10% v/v) e submetidos à eletroforese em gel de agarose a 2%, corado com brometo de etídio. Foi utilizado como marcador de peso molecular fragmentos múltiplos de 100 pb. A corrida foi realizada em tampão TBE 1X, sendo aplicada uma diferença de potencial de 110 V. Para visualizar o resultado o gel foi exposto à luz ultravioleta em um transluminador. A seqüência alvo amplificada apresenta 120 pares de base (pb) Dot Blot e Hibridização Os outros 10 µl restantes dos produtos de PCR foram utilizados para hibridização. Estes foram aquecidos a 100 C por 5 min e resfriados em gelo. Após resfriamento foram acrescentados 11 µl de solução desnaturante (NaOH 0,4 M, EDTA 25 mm [ph 8,0]). Em seguida, as amostras foram transferidas, sob vácuo, para membrana de nylon utilizando-se o sistema Bio Dot (Hybri-dot manifold-brl ). A estas amostras foram adicionados mais 100 µl da solução desnaturante e novamente submetidas ao vácuo. A membrana foi retirada do aparelho e lavada com uma solução de SSC 2X (NaCl 0,3 M, citrato de sódio 0,3 mm). Após a lavagem foi deixada para secar sobre papel filtro a temperatura ambiente. Para fixar o DNA à membrana esta foi submetida à luz ultravioleta no aparelho Stratalinker aplicando uma energia de 0,12 J por centímetro quadrado. As condições de hibridização foram previamente descritas por Andrade et al. (2001). Minicírculos clonados de L. (L.) chagasi foram utilizados como sondas. Estes foram marcados com 32 P [α]dctp utilizando-se o método dos iniciadores aleatórios (Invitrogen ). A membrana de nylon, contendo as amostras, foi pré-incubada a 58 C por 30 min em solução 0,5% de leite desnatado, 1% de sulfato dodecil de sódio (SDS) e SSC 2X. A solução foi trocada utilizando-se um volume suficiente para cobrir a membrana. As sondas marcadas foram adicionadas após terem sido desnaturadas a 100 C por 3 min. As membranas foram incubadas por 14 horas a 58 C, com agitação, e depois lavadas em solução SSC 0,5 X, SDS a

53 53 0,5% a 65 C por 30 min. Após lavagem a membrana foi deixada para secar a temperatura ambiente. Ao final, foi exposta ao cassete BAS 2325 (Fujifilm ) por 2 h. A imagem foi obtida através do analisador de imagem Bio-Imaging Analyzer (Fujifilm ) kdna semi nested PCR (kdna snpcr) Este método foi conduzido de acordo com Morales et al. (2002), sendo realizadas duas reações de amplificação, tendo como alvo de amplificação a região variável dos minicírculos do DNA do cinetoplasto de Leishmania (kdna). Por ser uma reação semi nested um dos oligonucleotídeos iniciadores é utilizado nas duas amplificações. A primeira etapa da reação de PCR foi realizada com 1,0 µl de solução de amostra de DNA, 5,0 µl de solução tampão 10X (Tris-HCl 50 mm [ph 8,3], KCl 50 mm), 2,0 mm de MgCl 2, 1,0 µl de dntps a 10 mm, 1,4 unidades da enzima Taq DNA Polimerase, 15 pmol de solução de trabalho de cada oligonucleotídeo iniciador [5 CGA TTT TTG AAC GGG ATT TCT GCA C 3 e 5 CTC CGG GGC GGG AAA CTG G 3 ] e um volume complementar de água deionizada autoclavada totalizando um volume final de 50 µl. Para a segunda reação de PCR 25 µl do produto de amplificação da primeira reação foram diluídos em 1 ml de água destilada e estéril, sendo que 10 µl desta diluição foram utilizados como amostra de DNA. Foram adicionados à amostra de DNA, 2,5 µl de solução tampão 10X, 2,0 mm de MgCl 2, 0,5 µl de dntps a 10 mm, 0,7 unidades da enzima Taq DNA Polimerase, 15 pmol de solução de trabalho de cada oligonucleotídeo iniciador [5 CGA TTT TTG AAC GGG ATT TCT GCA C 3 e 5 GGG GTT GGT GTA AAA TAG GGC CGG 3 ] e um volume complementar de água deionizada autoclavada totalizando um volume final de 25 µl. Nas duas etapas descritas acima as amostras foram amplificadas nas seguintes condições: desnaturação inicial a 94 C por 5 min, 30 ciclos de amplificação de 30 s a 94 C, 30 s a 67 C e 30 s a 72 C e a extensão final a 72 C por 5 min. Depois disso o sistema

54 54 permaneceu a 4 C. O termociclador (PT-100 BIO RAD) foi programado para delinear todas essas etapas nas temperaturas e tempos determinados. A visualização dos produtos de amplificação de cada etapa foi realizada da mesma forma descrita para o método kdna PCR-Hibridização utilizando-se um volume de 20 µl dos produtos de amplificação de PCR e 5 µl da solução de tampão de amostra (Tris 10 mm, EDTA 10 mm, azul de bromofenol 0,005% m/v e glicerol 10% v/v). reação. A seqüência alvo deve apresentar 800 pb na primeira reação e 780 pb na segunda Leishmania nested PCR (LnPCR) Este método consiste em duas etapas, sendo realizadas duas amplificações (nested), tendo como alvo de amplificação a região variável do gene codificante do RNA da subunidade ribossômica menor (SSU rrna) (CRUZ et al., 2002). A primeira etapa a reação de PCR foi realizada com 1,0 µl de solução amostra de DNA, 5,0 µl de solução tampão 10X (Tris-HCl 50 mm [ph 8,3], KCl 50 mm), 2,0 mm de MgCl 2, 1,0 µl de dntps a 10 mm, 1,4 unidades da enzima Taq DNA Polimerase, 15 pmol de solução de trabalho de cada oligonucleotídeo iniciador [5 GGT TCC TTT CCT GAT TTA CG 3 e 5 GGC CGG TAA AGG CCG AAT AG 3 ] e um volume complementar de água deionizada autoclavada totalizando um volume final de 50 µl. A amplificação ocorreu nas seguintes condições: desnaturação inicial a 94 C por 5 min, 30 ciclos de amplificação de 30 s a 94 C, 30 s a 60 C e 30s a 72 C e a extensão final a 72 C por 5 min. Depois disso o sistema permaneceu a 4 C. O termociclador (PT-100 BIO RAD) foi programado para delinear todas essas etapas nas temperaturas e tempos determinados. Para a segunda reação de PCR 25 µl do produto de amplificação da primeira reação foram diluídos em 1 ml de água destilada e estéril, sendo que 10 µl desta diluição foram

55 55 utilizados como amostra de DNA. Foram adicionados à amostra de DNA, 2,5 µl de solução tampão 10X, 2,0 mm de MgCl 2,, 0,5 µl de dntps a 10 mm, 0,7 unidades da enzima Taq DNA Polimerase, 15 pmol de solução de trabalho de cada oligonucleotídeo iniciador [5 TCC CAT CGC AAC CTC GGT T 3 e 5 AAA GCG GGC GCG GTG CTG 3 ] e um volume complementar de água deionizada autoclavada totalizando um volume final de 25 µl. Nesta etapa da amplificação foram utilizadas as seguintes condições: desnaturação inicial a 94 C por 5 min, 30 ciclos de amplificação de 30 s a 94 C, 30 s a 65 C e 30s a 72 C e a extensão final a 72 C por 5 min. A visualização dos produtos de amplificação de cada etapa foi realizada da mesma forma descrita para o método kdna PCR Hibridização, utilizando-se um volume de 20 µl dos produtos de amplificação de PCR e 5 µl da solução de tampão de amostra (Tris 10 mm, EDTA 10 mm, azul de bromofenol 0,005% m/v e glicerol 10% v/v). 353pb. A seqüência alvo da primeira reação deve apresentar 603 pb e a da segunda reação Internal Transcribed Spacer 1 nested PCR (ITS1 npcr) Neste método o alvo ITS 1, da região dos genes dos RNA ribossômicos, passa por duas amplificações. O método foi adaptado de SCHÖNIAN et al. (2003). Na primeira amplificação 1,0 µl de solução de amostra de DNA foi misturado a 5,0 µl de solução tampão 10X (Tris-HCl 50 mm [ph 8,3], KCl 50 mm), 2,0 mm de MgCl 2, 1,0 µl de dntps a 10 mm, 1,4 unidades da enzima Taq DNA Polimerase, 15 pmol de cada oligonucleotídeo iniciador [5 CTG GAT CAT TTT CCG ATG 3 e 5 TGA TAC CAC TTA TCG CAC TT 3 ] e um volume complementar de água deionizada autoclavada totalizando um volume final de 50 µl. Uma alíquota de 25 µl dos produtos de PCR da primeira amplificação foi diluída em 1 ml de água destilada e estéril, sendo utilizados 10 µl dessa diluição para amostra de DNA na segunda amplificação. Os demais constituintes da reação são: 2,5 µl de solução tampão

56 56 10X, 2,0 mm de MgCl 2, 0,5 µl de dntps a 10 mm, 0,7 unidades da enzima Taq DNA Polimerase, 15 pmol de cada oligonucleotídeo iniciador [5 CAT TTT CCG ATG ATT ACA CC 3 e 5 CGT TCT TCA ACG AAA TAG G 3 ] e um volume complementar de água deionizada autoclavada totalizando um volume final de 25 µl. Nas duas etapas descritas acima as amostras foram amplificadas em um termociclador (PT-100 BIO RAD) utilizando as seguintes condições de amplificação: desnaturação inicial a 94 C por 5 min, seguida por 30 ciclos de amplificação de 30 s a 94 C, 30 s a 53 C e 30 s a 72 C, e uma etapa de extensão final a 72 C por 5 min. A visualização dos produtos de amplificação de cada etapa foi realizada da mesma forma descrita para o método kdna PCR - Hibridização, mas utilizando um volume de 20 µl dos produtos de amplificação de PCR e 5 µl da solução de tampão de amostra (Tris 10 mm, EDTA 10 mm, azul de bromofenol 0,005% m/v e glicerol 10% v/v). O produto de PCR para a primeira reação deve apresentar de 300 a 350 pb, já o da segunda reação de 280 a 330 pb. 5.5 Análise estatística Para a análise estatística o Qui-quadrado de Pearson foi utilizado na avaliação da positividade dos cães, com nível de significância de 5%. O teste foi aplicado separadamente para cada método de PCR avaliado, onde as amostras clínicas de DNA foram confrontadas duas a duas. Depois os métodos de PCR foram confrontados dois a dois e esse procedimento também foi adotado quando as amostras foram comparadas entre si separadamente para uma nova análise. Assim foi verificado se houve diferença entre os métodos de PCR e entre as amostras clínicas avaliadas. Trinta por cento das amostras clínicas foram repetidas para se confirmar a confiabilidade dos resultados obtidos.

57 6) RESULTADOS

58 58 No presente trabalho cada método de PCR foi avaliado em amostras clínicas de sangue periférico, biópsias de pele, medula óssea e swab conjuntival de cães assintomáticos. Em todas as reações de PCR os controles negativos não apresentaram nenhuma amplificação e os controles positivos apresentaram a banda esperada, demonstrando não ter havido nenhum tipo de contaminação ou inibição durante a realização dos experimentos. 6.1 Avaliação da sensibilidade do método kdna PCR - hibridização utilizando-se o DNA de amostras clínicas O método kdna PCR - hibridização foi positivo para 5/30 (17 %) amostras de sangue periférico (FIG. 1), 17/30 (57 %) de pele (FIG. 2), 19/30 (63,3 %) de medula óssea (FIG. 3) e 21/30 (70 %) de swab conjuntival (FIG. 4). Os resultados descritos acima estão consolidados no gráfico da FIG. 5 que apresenta os resultados da etapa de hibridização para todas as amostras. Não houve diferença estatística entre as positividades das amostras de pele, medula e swab conjuntival. Porém todas as anteriores apresentaram positividades significativamente superiores às amostras de sangue, com valores de p< 0,001. Os animais não infectados do grupo controle foram negativos para todas as amostras testadas.

59 59 Figura 1: Autorradiograma dos resultados obtidos pelo método kdna PCR-hibridização para as amostras de sangue periférico. Os produtos de PCR foram hibridizados com sondas de minicírculos clonados de kdna de L.(L.) chagasi marcadas com 32 P. CN: controle negativo sem DNA. CP: controle positivo para L. (L.) chagasi (MHOM/BR/1973/BH46). 1-30: amostras de cães. Figura 2: Autorradiograma dos resultados obtidos pelo método kdna PCR-hibridização para as amostras de pele. Os produtos de PCR foram hibridizados com sondas de minicírculos clonados de kdna de L.(L.) chagasi marcadas com 32 P. CN: controle negativo sem DNA. CP: controle positivo para L. (L.) chagasi (MHOM/BR/1973/BH46). 1-30: amostras de cães.

60 60 Figura 3: Autorradiograma dos resultados obtidos pelo método kdna PCR-hibridização para as amostras de medula óssea. Os produtos de PCR foram hibridizados com sondas de minicírculos clonados de kdna de L.(L.) chagasi marcadas com 32 P. CN: controle negativo sem DNA. CP: controle positivo para L. (L.) chagasi (MHOM/BR/1973/BH46). 1-30: amostras de cães. Figura 4: Autorradiograma dos resultados obtidos pelo método kdna PCR-hibridização para as amostras de swab conjuntival. Os produtos de PCR foram hibridizados com sondas de minicírculos clonados de kdna de L.(L.) chagasi marcadas com 32P. CN: controle negativo sem DNA. CP: controle positivo para L. (L.) chagasi (MHOM/BR/1973/BH46). 1-30: amostras de cães.

61 61 Figura 5: Porcentagem de cães positivos obtidos pelo método kdna PCR-hibridização para as amostras de sangue periférico, pele, medula óssea e swab conjuntival. 6.2 Avaliação da sensibilidade do método kdna snpcr utilizando-se o DNA de amostras clínicas O método kdna snpcr foi capaz de identificar 7/30 (23,3%) amostras positivas de sangue periférico (FIG. 6), 17/30 (57%) de pele (FIG. 7), 12/30 (40%) de medula óssea (FIG. 8) e 24/30 (77%) de swab conjuntival (FIG. 9). Quando se comparou as amostras de sangue periférico e medula óssea, e pele e medula óssea não foi observada diferença estatística entre as positividades. Foram observadas diferenças significativas entre as amostras de sangue periférico e pele (p< 0,01), sangue periférico e swab conjuntival (p< 0,001), pele e swab conjuntival (p< 0,001) e medula e swab conjuntival (p< 0,001). Os animais não infectados do grupo controle foram negativos para todas as amostras testadas. Os resultados descritos acima estão consolidados no gráfico da FIG. 10, o qual mostra a porcentagem de cães positivos da segunda amplificação referente ao método analisado.

62 62 Figura 6: Gel de agarose dos produtos da 2ª reação de PCR obtidos pelo método kdna snpcr referente às amostras de sangue periférico. P: padrão de peso molecular 100pb. CN: controle negativo sem DNA para a 1ª reação. CN2: controle negativo sem DNA para a 1ª reação. CP: controle positivo para L. (L.) chagasi (MHOM/BR/1973/BH46). 1-30: amostras de cães.

63 63 Figura 7: Gel de agarose dos produtos da 2ª reação de PCR obtidos pelo método kdna snpcr referente às amostras de pele. P: padrão de peso molecular 100pb. CN: controle negativo sem DNA para a 1ª reação. CN2: controle negativo sem DNA para a 1ª reação. CP: controle positivo para L. (L.) chagasi (MHOM/BR/1973/BH46). 1-30: amostras de cães.

64 64 Figura 8: Gel de agarose dos produtos da 2ª reação de PCR obtidos pelo método kdna snpcr referente às amostras de medula óssea. P: padrão de peso molecular 100pb. CN: controle negativo sem DNA para a 1ª reação. CN2: controle negativo sem DNA para a 1ª reação. CP: controle positivo para L. (L.) chagasi (MHOM/BR/1973/BH46). 1-30: amostras de cães.

65 65 Figura 9: Gel de agarose dos produtos da 2ª reação de PCR obtidos pelo método kdna snpcr referente às amostras de swab conjuntival. P: padrão de peso molecular 100pb. CN: controle negativo sem DNA para a 1ª reação. CN2: controle negativo sem DNA para a 1ª reação. CP: controle positivo para L. (L.) chagasi (MHOM/BR/1973/BH46). 1-30: amostras de cães.

66 66 Figura 10: Porcentagem de cães positivos obtidos pelo método kdna snpcr para as amostras de sangue periférico, pele, medula óssea e swab conjuntival. 6.3 Avaliação da sensibilidade do método LnPCR utilizando-se o DNA de amostras clínicas O método LnPCR conseguiu detectar 9/30 (30%) amostras positivas de sangue periférico (FIG. 11), 15/30 (50%) de pele (FIG. 12), 13/30 (43,3%) de medula óssea (FIG. 13) e 19/30 (63,3%) de swab conjuntival (FIG. 14). Houve diferença estatística entre as positividades do swab conjuntival em relação às amostras de medula e sangue (p< 0,01). Porém não ocorreu esta diferença entre as amostras de swab conjuntival e pele. As amostras de pele apresentaram também positividade significativamente superior as de sangue (p< 0,01). Não houve diferença significativa entre as positividades obtidas com amostras de sangue e medula. Os animais do grupo controle não positivaram em nenhuma das amostras testadas. Os resultados descritos acima estão consolidados no gráfico da FIG. 15, o qual mostra a porcentagem de cães positivos da segunda amplificação referente ao método LnPCR.

67 67 Figura 11: Gel de agarose dos produtos da 2ª reação de PCR obtidos pelo método LnPCR referente às amostras de sangue periférico. P: padrão de peso molecular 100pb. CN: controle negativo sem DNA para a 1ª reação. CN2: controle negativo sem DNA para a 1ª reação. CP: controle positivo para L. (L.) chagasi (MHOM/BR/1973/BH46). 1-30: amostras de cães.

68 68 Figura 12: Gel de agarose dos produtos da 2ª reação de PCR obtidos pelo método LnPCR referente às amostras de pele. P: padrão de peso molecular 100pb. CN: controle negativo sem DNA para a 1ª reação. CN2: controle negativo sem DNA para a 1ª reação. CP: controle positivo para L. (L.) chagasi (MHOM/BR/1973/BH46). 1-30: amostras de cães.

69 69 Figura 13: Gel de agarose dos produtos da 2ª reação de PCR obtidos pelo método LnPCR referente às amostras de medula óssea. P: padrão de peso molecular 100pb. CN: controle negativo sem DNA para a 1ª reação. CN2: controle negativo sem DNA para a 1ª reação. CP: controle positivo para L. (L.) chagasi (MHOM/BR/1973/BH46). 1-30: amostras de cães.

70 70 Figura 14: Gel de agarose dos produtos da 2ª reação de PCR obtidos pelo método LnPCR referente às amostras de swab conjuntival. P: padrão de peso molecular 100pb. CN: controle negativo sem DNA para a 1ª reação. CN2: controle negativo sem DNA para a 1ª reação. CP: controle positivo para L. (L.) chagasi (MHOM/BR/1973/BH46). 1-30: amostras de cães.

71 71 Figura 15: Porcentagem de cães positivos obtidos pelo método LnPCR para as amostras de sangue periférico, pele, medula óssea e swab conjuntival. 6.4 Avaliação da sensibilidade do método ITS1 npcr utilizando-se o DNA de amostras clínicas De acordo com as análises pelo método ITS1 npcr foram encontradas 19/30 (63,3%) amostras positivas para as amostras clínicas de sangue periférico (FIG. 16), 19/30 (63,3%) amostras positivas para as amostras de pele (FIG. 17), 29/30 (97%) para as amostras de medula óssea (FIG. 18) e 29/30 (97%) para as amostras de swab conjuntival (FIG. 19). A positividade das amostras de sangue periférico e pele, bem como de medula óssea e swab conjuntival foram idênticas. A positividade das amostras de medula óssea e swab conjuntival foram significativamente superiores as obtidas com as amostras de sangue periférico e pele (p< 0,001). Os animais do grupo controle não positivaram em nenhuma das amostras testadas. Os resultados descritos acima estão consolidados no gráfico da FIG. 20, o qual mostra a porcentagem de cães positivos na segunda amplificação referente ao método ITS1 npcr.

72 72 Figura 16: Gel de agarose dos produtos da 2ª reação de PCR obtidos pelo método ITS1 npcr referente às amostras de sangue periférico. P: padrão de peso molecular 100pb. CN: controle negativo sem DNA para a 1ª reação. CN2: controle negativo sem DNA para a 1ª reação. CP: controle positivo para L. (L.) chagasi (MHOM/BR/1973/BH46). 1-30: amostras de cães.

73 73 Figura 17: Gel de agarose dos produtos da 2ª reação de PCR obtidos pelo método ITS1 npcr referente às amostras de pele. P: padrão de peso molecular 100pb. CN: controle negativo sem DNA para a 1ª reação. CN2: controle negativo sem DNA para a 1ª reação. CP: controle positivo para L. (L.) chagasi (MHOM/BR/1973/BH46). 1-30: amostras de cães.

74 74 Figura 18: Gel de agarose dos produtos da 2ª reação de PCR obtidos pelo método ITS1 npcr referente às amostras de medula óssea. P: padrão de peso molecular 100pb. CN: controle negativo sem DNA para a 1ª reação. CN2: controle negativo sem DNA para a 1ª reação. CP: controle positivo para L. (L.) chagasi (MHOM/BR/1973/BH46). 1-30: amostras de cães.

75 75 Figura 19: Gel de agarose dos produtos da 2ª reação de PCR obtidos pelo método ITS1 npcr referente às amostras de swab conjuntival. P: padrão de peso molecular 100pb. CN: controle negativo sem DNA para a 1ª reação. CN2: controle negativo sem DNA para a 1ª reação. CP: controle positivo para L. (L.) chagasi (MHOM/BR/1973/BH46). 1-30: amostras de cães.

76 76 Figura 20: Porcentagem de cães positivos obtidos pelo método ITS1 npcr para as amostras de sangue periférico, pele, medula óssea e swab conjuntival. 6.5 Comparação da sensibilidade dos métodos de PCR por amostra clínica Para as amostras de sangue o método ITS1 npcr apresentou a melhor positividade (63,3%) sendo estatisticamente superior a positividade dos demais métodos com p< 0,001, exceto quando comparado ao método LnPCR, o qual apresentou um valor de p< 0,01. Não houve diferença significativa entre os métodos kdna PCR-hibridização, kdna snpcr e LnPCR, que apresentaram respectivamente positividades de 16,7%, 23,3% 30,0% (FIG.21). Embora o ITS1 npcr tenha apresentado o melhor resultado para as amostras de pele não foi verificada diferença estatística em relação à positividades dos demais métodos avaliados (FIG.21). O ITS1 npcr se sobressaiu também para as amostras de medula apresentando a maior positividade (97%), estatisticamente superior aos demais métodos (p< 0,001). O kdna PCRhibridização, com positividade de 63,3%, apresentou o segundo melhor resultado, superior

77 aos obtidos pelo LnPCR (43,3%) e pelo kdna snpcr (40%). Entre estes dois últimos métodos não houve diferença estatística (FIG.21). 77 Com relação às amostras de swab conjuntival novamente o método ITS1 npcr apresentou a melhor positividade (97%), superior estatisticamente a positividade dos demais métodos, com os respectivos valores de p para ITS 1 npcr e LnPCR (p< 0,001), ITS 1 npcr e kdna PCR-hibridização (p< 0,01), e ITS 1 npcr e kdna snpcr (p< 0,05). Não foi verificada diferença significativa entre os métodos kdna snpcr, kdna PCR-hibridização e LnPCR com positividades de 77%, 70% e 63,3% respectivamente (FIG.21). Figura 21: Comparação da positividade dos quatro métodos de PCR estudados para as amostras de sangue periférico, pele, medula óssea e swab conjuntival.

78 78 Os resultados obtidos para as amostras de sangue, para cada método e por animal foram apresentados na tabela 4. Um total de 21 cães foram positivos, considerando como positivo o animal que tenha positivado em pelo menos uma das técnicas. Os resultados para as amostras de pele foram mostrados na tabela 5 e também 21 cães foram positivos. Para as amostras de medula foram obtidos 29 cães positivos (TAB. 6) e para o swab conjuntival todos os 30 cães foram positivos (TAB. 7), segundo este critério.

79 79 Tabela 4: Resultado das amostras clínicas de sangue periférico analisadas pelos quatro métodos de PCR avaliados. MÉTODO Total de cães positivos kdna PCR Hibridização kdna snpcr LnPCR ITS1 npcr : amostras de cães, + : Resultado Positivo, - : Resultado Negativo. Número de cães com resultado positivo em pelo menos uma das técnicas: 21.

80 80 Tabela 5: Resultado das amostras de biópsias de pele analisadas pelos quatro métodos de PCR avaliados. MÉTODO Total de cães positivos kdna PCR Hibridização kdna snpcr LnPCR ITS1 npcr : amostras de cães, + : Resultado Positivo, - : Resultado Negativo. Número de cães com resultado positivo em pelo menos uma das técnicas: 21.

81 81 Tabela 6: Resultado das amostras de medula óssea analisadas pelos quatro métodos de PCR avaliados. MÉTODO Total de cães positivos kdna PCR Hibridização kdna snpcr LnPCR ITS1 npcr : amostras de cães, + : Resultado Positivo, - : Resultado Negativo. Número de cães com resultado positivo em pelo menos uma das técnicas: 29.

82 82 Tabela 7: Resultado das amostras de swab conjuntival analisadas pelos quatro métodos de PCR avaliados. MÉTODO Total de cães positivos kdna Hibridização kdna snpcr LnPCR ITS1 npcr : amostras de cães, + : Resultado Positivo, - : Resultado Negativo. Número de cães com resultado positivo em pelo menos uma das técnicas: 30.

83 Comparação dos métodos de PCR utilizando-se o somatório da positividade de todas as amostras clínicas Quando se analisou os métodos utilizando-se o somatório da positividade obtida de todas as amostras clinicas, o método ITS1 npcr foi o que apresentou o melhor resultado, com 96/120 amostras positivas, seguido pelos métodos kdna PCR-Hibridização, com 62/120 amostras positivas, e o kdna snpcr que obteve 60/120 amostras positivas. O método com o pior desempenho foi o LnPCR apresentando 56/120 amostras positivas (FIG 22). O total de amostras analisado foi de 120, sendo 30 de sangue periférico, 30 de pele, 30 de medula óssea e 30 de swab conjuntival. A positividade do método ITS1 npcr foi significativamente superior (p< 0,001) a dos demais métodos. Já os outros métodos não apresentaram positividade estatisticamente significante entre si. Figura 22: Positividade total dos métodos de PCR.

84 Avaliação da positividade total das diferentes amostras clínicas utilizando-se o somatório das positividades de todos os métodos de PCR As amostras clínicas foram avaliadas separadamente levando-se em consideração o somatório das positividades de todos os métodos de PCR analisados (FIG 23). As amostras clínicas de swab conjuntival foram as que apresentaram a melhor positividade, seguida pelas amostras de medula óssea, biópsias de pele e sangue periférico. Foram obtidos os seguintes resultados para a somatória das positividades: 40/120 para sangue periférico, 68/120 para pele, 73/120 para medula e 93/120 para swab conjuntival. As amostras de swab conjuntival apresentaram positividade estatisticamente superior às demais, com p< 0,001 relação a pele, p< 0,001em relação ao sangue e p< 0,01 em relação a medula óssea. Amostras de pele e medula que não apresentaram diferença de positividade significativa. Estas duas amostras, entretanto, foram estatisticamente superiores as de sangue (p< 0,01). Figura 23: Positividade total das amostras clínicas avaliadas.