Universidade Estadual de Londrina

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1 Universidade Estadual de Londrina CENTRO DE EDUCAÇÃO FÍSICA E ESPORTE CURSO DE BACHARELADO EM EDUCAÇÃO FÍSICA TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO EFEITO DO EXERCÍCIO FÍSICO DE INTENSIDADE MODERADA SOBRE LESÕES PROVOCADAS POR ESTRESSE OXIDATIVO INDUZIDO POR CICLOFOSFAMIDA EM RATOS WISTAR Karla Fabiana Goessler LONDRINA PARANÁ 2009

2 KARLA FABIANA GOESSLER EFEITO DO EXERCÍCIO FÍSICO DE INTENSIDADE MODERADA SOBRE LESÕES PROVOCADAS POR ESTRESSE OXIDATIVO INDUZIDO POR CICLOFOSFAMIDA EM RATOS WISTAR Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Bacharelado em Educação Física do Centro de Educação Física e Esporte da Universidade Estadual de Londrina, como requisito para sua conclusão. COMISSÃO EXAMINADORA Prof. Dra. Solange de Paula Ramos Universidade Estadual de Londrina Prof. Dr. Marcos Doederlein Polito Universidade Estadual de Londrina Prof. Dra. Andréa Name Colado Simão Universidade Estadual de Londrina Londrina, 17 de Dezembro de 2009

3 Dedico este trabalho a Deus, que nunca permitiu que eu desistisse de lutar pelos meus sonhos, aos meus pais Carlos e Cecilia, minha avó Tereza e a minha irmã Priscila, a quem eu devo todas as minhas conquistas, e a minha orientadora e acima de tudo amiga, Solange, por sempre acreditar e confiar no meu trabalho.

4 AGRADECIMENTOS Acima de tudo, agradeço a Deus por permitir que mais essa etapa da minha vida seja concluída e por me dar forças para não desistir diante de todas as dificuldades encontradas nesses anos. A minha mãe Cecília, meu pai Carlos, minha irmã Priscila e minha avó Tereza, pela compreensão, paciência e apoio durante esses anos, por entenderem a minha ausência e por sonharem junto comigo. Sem vocês, essa etapa não teria se concretizado. A minha madrinha Cidinha, por ser a minha maior intercessora diante de Deus. A minha orientadora Solange, a quem eu devo grande parte do conhecimento que adquiri nesses quatro anos, por me acompanhar durante esse tempo de graduação, e por todas as oportunidades a mim oferecidas e confiadas. Por toda dedicação, paciência, apoio, por estar ao meu lado nos momentos mais difíceis, me proporcionando tranqüilidade e confiança, e acima de tudo pela amizade que construímos nesse tempo. A você, devo muito mais do que um simples obrigada. Aos membros da banca, pelo auxilio, dedicação e contribuição para a realização e qualidade do trabalho. Ao meu grande amigo Hugo, por estar sempre ao meu lado e me acolher nos momentos em que mais precisei, compartilhando e vivendo comigo sempre as minhas alegrias e tristezas e por me ensinar a confiar em Deus sempre e acima de tudo e jamais desistir. A Aline, por toda a disposição em me auxiliar nas horas de dúvidas, pelo apoio e demonstração concreta de amizade em todos os momentos, pelas orações, compreensão, tranqüilidade, e por me levar para mais perto de Deus. A Hiviny, por ter demonstrado ser mais do que uma simples amiga da graduação, por acompanhar, viver, sonhar, se alegrar e sofrer todos os momentos ao meu lado. A Maria e ao Luis, que mesmo distantes, fizeram-se presentes em todo momento. Obrigada, por acreditarem em mim e por estarem sempre ao meu lado. Aos amigos, Guto, Ju e Estela que sempre estiveram presentes nos momentos importantes da minha vida. Aos amigos Cléo e Paulinha, que apesar do pouco tempo de amizade, demonstraram apoio e incentivo, nesse momento importante da minha vida. A Maíra e a Larissa, por estarem presentes mesmo de muito longe, por toda

5 demonstração de amizade, que foi fortalecida com a distância. A Queli, Andréa e a Fer, por serem meu apoio durante esses anos de convivência. A todos os amigos do Dom Bosco Jr., pelas orações e compreensão da minha ausência durante esse ano. Em especial, ao meu ministério da Ação Social, que compreenderam todas as minhas faltas e sempre me apoiaram em todas as decisões. Ao Fábio, pela disposição em ajudar no trabalho, pela amizade, pelas conversas e por me incentivar quando foi necessário. A Mari e a Tassi, por sempre estarem dispostas a me ouvir quando mais precisei, pela compreensão, amizade e confiança que construímos nesse tempo. A Stephanie, Mayara, Fernandinho, Luis, Thâmara, Paulo e a Lu Rocha, por sempre me apoiarem mesmo de longe. Ao Rodrigo, Tati e Ju, que me suportaram durante esses anos e me escutaram diariamente no caminho à UEL, sempre quando precisei. Aos amigos de laboratório, que contribuíram para que esse trabalho pudesse ser concretizado. Aos amigos de turma, por todos esses anos de convivência. As técnicas do laboratório, Renata e a Andréia que sempre estiveram à disposição de ajudar quando fosse possível. Ao laboratório de Imunologia Clínica do Hospital Universitário UEL e ao Hospital Veterinário, por colaborar nas análises. Ao laboratório LAPA, em especial, ao João, por disponibilizar o espaço para a realização da microtomia, sempre em que foi preciso. Enfim, agradeço a todos, que de alguma forma colaboraram para a realização e o sucesso desse trabalho.

6 GOESSLER, Karla Fabiana. Efeito do exercício físico de intensidade moderada sobre lesões provocadas por estresse oxidativo induzido por ciclofosfamida em ratos Wistar. Trabalho de Conclusão de Curso. Curso de Bacharelado em Educação Física. Centro de Educação Física e Esporte. Universidade Estadual de Londrina, RESUMO O estresse oxidativo é caracterizado pelo desequilíbrio entre os sistemas pró e antioxidantes. A metabolização de alguns fármacos quimioterápicos, como a ciclofosfamida pode induzir o aumento do estresse oxidativo. Existem evidências na literatura de que o exercício físico crônico de intensidade moderada pode melhorar a atividade do sistema antioxidante, por meio de adaptações do sistema enzimático, atuando contra a produção excessiva dos radicais livres. O objetivo do estudo foi verificar os possíveis efeitos protetores do exercício físico crônico e moderado sobre lesões no tecido muscular cardíaco, tecido muscular esquelético e fígado, provocadas pelo estresse oxidativo induzido pela ciclofosfamida em ratos Wistar. Foram utilizados 24 ratos machos, divididos em 4 grupos de 6 animais: controle sedentário (SCo), controle treinado (TCo), sedentário e tratado com ciclofosfamida (SCF) e treinados e tratado com ciclofosfamida (TCF). As adaptações ao estresse oxidativo foram analisadas por meio da avaliação da Capacidade Antioxidante Total Plasmática (TRAP), da Quimiluminescência Induzida por t-butil Hidroperóxidos (QL), pela Determinação das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e através da dosagem de Óxido Nítrico (NO) em amostras de sangue. As lesões teciduais foram avaliadas por meio de microscopia óptica. A hipótese do estudo é que o exercício crônico de intensidade moderada pode diminuir as lesões cardíacas, musculares e hepáticas aumentando os mecanismos de defesa antioxidantes. Os animais treinados apresentaram menor massa corporal quando comparados aos sedentários. Os animais TCF não apresentaram diferenças significativas de massa corporal em relação ao TCo, após a administração da ciclofosfamida. Entretanto, os animais SCF apresentaram redução significativa do peso, quando comparado ao SCo. Houve aumento significativo da vascularização do miocárdio para os animais TCo, em relação aos sedentários e TCF. Além disso, houve redução da percentagem de áreas e severidade de lesões teciduais em

7 coração, músculo nos animais TCF comparados ao SCF, demonstrando a eficiência do exercício em atenuar as lesões provocadas pelo tratamento com a CF. No fígado, foi observado presença de hepatócitos em regeneração nos grupos SCF e TCF, enquanto os grupos SCo e TCo apresentaram aspecto de normalidade. Não houve diferença significativa nos níveis plasmáticos de oxidação protéica, oxidação lipídica, capacidade antioxidante total e óxido nítrico entre os grupos. Animais do SCF apresentaram níveis menores de hidroperóxidos, em relação aos demais grupos. Concluímos que o exercício físico moderado pode atenuar os danos provocados pelo tratamento com a ciclofosfamida. Os resultados sugerem que o exercício na intensidade utilizada pode prevenir as lesões teciduais induzidas pela drogas por mecanismos que não dependem exclusivamente da regulação do sistema oxidante celular. Palavras-chave: Estresse Oxidativo, Exercício Físico Moderado, Sistemas Antioxidantes, Ciclofosfamida.

8 ABSTRACT Oxidative stress is characterized by an imbalance between the pro and antioxidants systems. The metabolism of some chemotherapeutic agents such as cyclophosphamide may lead to increased oxidative stress. There is evidence in the literature that chronic exercise at moderate intensity can improve the activity of the antioxidant system, through adjustments in the enzymatic system, counteracting the excessive production of free radicals. The aim of this study was to investigate the possible protective effects of chronic exercise at moderate intensity on cardiac, skeletal muscle and liver injuries, caused by oxidative stress induced by cyclophosphamide in rats. We used 24 male rats divided into 4 groups of 6 animals: sedentary control (Sco), trained control (TCO), sedentary and treated with cyclophosphamide (SCF) and trained and treated with cyclophosphamide (TCF). Adaptations to oxidative stress were analyzed by means of the total plasma antioxidant capacity (TRAP), chemiluminescence induced by t-butyl hydroperoxide (QL), the determination of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and by the dosage of nitric oxide (NO) in blood samples. The tissue lesions were evaluated by means of light microscopy. The study hypothesis is that chronic exercise at moderate intensity can reduce heart, muscle and liver damages by increasing the antioxidant defense mechanisms. The trained animals had lower body mass compared to sedentary. TCF animals showed no significant differences in body mass in relation to the TCO group, after administration of cyclophosphamide. However, SCF animals showed a significant reduction in weight compared to SCO group. It was observed a significant increase in myocardium vascularization in TCo animals compared to sedentary and TCF ones. In addition, a reduction in the percentage of areas and severity of tissue damage in heart muscle in TCF animals compared to SCF ones, demonstrating the effectiveness of exercise in ameliorate the damage caused by treatment with CF. In the liver, was observed hepatocyte regeneration areas in SCF and TCF groups, while the SCO and TCo groups presented normal morphology. There was no significant difference in plasma levels of protein oxidation, lipid oxidation, total antioxidant capacity and nitric oxide between the groups. Animals of the SCF group showed lower levels of hydroperoxides than other groups. We conclude that moderate exercise can reduce the damage caused by treatment with

9 cyclophosphamide. The results suggest that exercise intensity used can prevent tissue damage induced by drugs by mechanisms that do not depend exclusively on the regulation of cellular oxidant system. Key Words: Oxidative stress, moderate exercise, antioxidant systems, cyclophosphamide.

10 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Protocolo de treinamento Tabela 2 Critérios para avaliação morfológica do fígado Tabela 3 Critérios da graduação da avaliação morfológica do fígado Tabela 4 Critérios para avaliação patológica do músculo estriado esquelético e cardíaco Tabela 5 Valores do peso absoluto e relativo do coração, músculo e fígado... 25

11 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Análise do da variação na massa corporal intra-grupos Figura 2 Análise da variação na massa corporal inter-grupos Figura 3 Capilares sanguíneos do miocárdio - HE Figura 4 Áreas de edema, neutrófilos e necrose no tecido muscular cardíaco - HE Figura 5 Avaliação das áreas de edema, infiltrado inflamatório e necrose, no músculo estriado cardíaco Figura 6 Grau de áreas de edema no tecido muscular cardíaco Figura 7 Grau de áreas de infiltrado inflamatório no tecido muscular cardíaco Figura 8 Grau de áreas de necrose no tecido muscular cardíaco Figura 9 Avaliação das áreas de edema, infiltrado inflamatório e necrose no músculo estriado esquelético Figura 10 Grau das áreas de edema no tecido muscular esquelético Figura 11 Grau das áreas de infiltrado inflamatório no tecido muscular esquelético Figura 12 Grau das áreas de necrose no tecido muscular esquelético Figura 13 Hepatócitos em regeneração e hepatócitos íntegros - HE Figura 14 Análise dos marcadores de estresse oxidativo: FOX, NO e TRAP Figura 15 Análise dos marcadores de estresse oxidativo: AOPP e HIDROP... 38

12 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO JUSTIFICATIVA OBJETIVOS Objetivos Específicos REVISÃO DA LITERATURA Sistema Oxidativo Mecanismos de Defesa Antioxidante Exercício Físico e Espécies Reativas de Oxigênio Ciclofosfamida MÉTODOS Caracterização da Amostra Grupos Experimentais Protocolo de Treinamento Administração da Ciclofosfamida Obtenção do Soro Procedimentos Histológicos Coloração de Hematoxilina e Eosina Análise Histológica Fígado Músculo Estriado Esquelético Músculo Estriado Cardíaco Avaliação do Estresse Oxidativo Capacidade Antioxidante Total Plasmática Quimiluminescência Induzida por t-butil Hidroperóxidos Determinação de TBARS... 22

13 5.8.4 Dosagem de Óxido Nítrico Análise Estatística RESULTADOS Massa Corporal Peso Absoluto e Relativo do Coração, Músculo e Fígado Análise Histológica do Tecido Muscular Estriado Cardíaco Capilares Sanguíneos no Miocárdio Edema, Infiltrado Inflamatório e Necrose Análise Histológica do Tecido Muscular Estriado Esquelético Edema, Infiltrado Inflamatório e Necrose Análise Histológica do Fígado Avaliação do Estresse Oxidativo DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS... 45

14 6 1 INTRODUÇÃO O estresse oxidativo (EO) é caracterizado por um desequilíbrio entre a produção de espécies reativas de oxigênio (EROS) e os mecanismos de defesa antioxidantes, e pode ser provocado por diversos fatores, sendo eles ambientais, como a poluição, através do estilo de vida, como o sedentarismo ou através do tratamento com fármacos quimioterápicos, como a ciclofosfamida (CF) (SCHNEIDER et al. 2004; CHICCO et al., 2006). Em situações de EO, há a liberação de compostos tóxicos, com características de EROS, que provocam danos ao DNA, lipídeos e proteínas, e consequentemente desencadeia alterações na função celular e tecidual. Por outro lado, existem evidências na literatura que demonstram que o exercício físico de intensidade moderada, pode promover adaptações aos sistemas antioxidantes, através da estimulação do EO de baixa intensidade, e assim, proteger os tecidos contra os danos provocados por EROS (EBBELING et al., 1989; FINKEL et al., 2000; SCHNEIDER et al., 2004; CHICCO et al., 2006). De acordo com essas evidências, o estudo se propõe a verificar o efeito do exercício físico de intensidade moderada, sobre lesões provocadas por EO através do tratamento com CF, tendo como hipótese que o exercício físico de intensidade moderada, pode proteger os tecidos contra os danos provocados por CF, reduzindo o número e a severidade das lesões.

15 7 2 JUSTIFICATIVA Existem evidências na literatura de que as adaptações teciduais e fisiológicas induzidas pelo exercício físico moderado e crônico (EFMC) podem minimizar as lesões provocadas por EO nas células. Um estudo realizado por Chicco et al., (2006), demonstrou que o exercício moderado protege os tecidos contra o EO induzido pela doxorrubinicina, em animais. Parte dos efeitos protetores pode ser atribuídos ao aumento da expressão de sistemas antioxidantes celulares, sendo essa uma adaptação das células ao EO de baixa intensidade, que é produzido pelo EFMC. Considerando que o EO pode ser provocado por drogas como a CF, o presente estudo se propõe a verificar quais os efeitos do EFMC neste modelo de lesão celular.

16 8 3 OBJETIVOS Avaliar os benefícios do exercício físico de intensidade moderada, sobre as lesões provocadas por EO induzido por CF em ratos Wistar. 3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Avaliação das alterações de massa corporal e massa relativa do coração, músculo estriado esquelético e fígado provocados pelo exercício e pela CF. Avaliação das alterações histológicas no tecido muscular estriado cardíaco, tecido muscular estriado esquelético e fígado, provocadas pelo exercício e pela CF; Análise da capacidade antioxidante e grau de EO no plasma.

17 9 4 REVISÃO DA LITERATURA 4.1 Sistema Oxidativo As EROS são moléculas que possuem número ímpar de elétrons em sua última camada eletrônica, o que provoca alta reatividade e as torna muito reativas à qualquer outro tipo de molécula, incluindo lipídeos, proteínas e ácidos nucléicos (FERREIRA, et al. 1997). As EROS podem desencadear reações em cadeia que levam a formação de novos radicais, amplificando a sua capacidade de produzir lesões e são produzidas naturalmente no organismo, por meio de processos metabólicos oxidativos. A maioria das EROS produzidas são inativadas por agentes antioxidantes da própria célula e algumas etapas da produção são úteis ao organismo, como por exemplo, na ativação do sistema imunológico, onde os macrófagos utilizam o peróxido de hidrogênio para destruir as bactérias e outros elementos estranhos. (BRASILEIRO FILHO, 2006; SCHNEIDER et al. 2004). O óxido nítrico (NO) também é um radical livre, sendo considerado um dos mais importantes mediadores de processos intra e extracelulares. É sintetizado a partir da L-arginina, que é covertida em L-citrulina através da enzima NO-sintase (NOS), podendo apresentar efeitos benéficos ou destrutivos ao organismo, tendo como metabólitos o nitrito e o nitrato. Dentre seus efeitos protetores o NO está envolvido no relaxamento vascular e tem um papel de grande importância na proteção do vaso sanguíneo, modulação das reações inflamatórias ou antinflamatórias. Porém, o NO pode apresentar características citotóxicas, principalmente em situações de EO, onde há deficiência dos sistemas antioxidantes. Nessas situações, o aumento do EO provoca a elevação da enzima NO sintase induzível (inos), o que aumenta a produção de NO, que pode reagir com as EROS e formar o peroxinitrito, uma potente EROS. O inos não é expresso em situações normais, sendo induzido por citocinas e/ou endotoxinas em várias células, entre elas, macrófagos, linfócitos T, células endoteliais, miócitos, hepatócitos, condrócitos, neutrófilos e plaquetas (DUSSE et al., 2003; CERQUEIRA et al., 2002).

18 10 Situações de EO também podem ocorrer durante a metabolização de drogas, principalmente por ação do sistema enzimático citocromo P450, na mitocôndria. Durante estes processos podem ser produzidos metabólicos com atividade de radicais livres e espécies reativas de oxigênio (BRASILEIRO FILHO, 2006). Entre as drogas que podem provocar dano por estresse oxidativo estão os quimioterápios anti-neoplásicos (ciclofosfamida, isofasfamida, doxorrubinicina), antinflamatórios (Acetaminofen) e corticosteróides (ciclosporina) (YÜCI et al., 2008; CHICCO et al., 2006; BRASILEIRO FILHO, 2006). 4.2 Mecanismos de Defesa Antioxidante Com o objetivo de defender o organismo contra as lesões provocadas pelas EROS, existem os sistemas antioxidantes, que são divididos em sistema não enzimático e sistema enzimático. Pertencem ao sistema não enzimático os compostos sintetizados pelo organismo, como a bilirrubina, ceruloplasmina, hormônios sexuais, coenzima Q, ácido úrico e melatonina, além de outros elementos que são ingeridos através da dieta regular ou da suplementação, como o β-caroteno (pró-vitamina A), ácido ascórbico (vitamina C), alfa tocoferol (vitamina E) e flavonóides. O sistema enzimático é composto pela catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPX), glutationa redutase (GR) e superóxido desmutase (SOD), sendo essas as principais enzimas (NETO et al., 2008; SCHNEIDER et al.; 2004; JI, 1999; BRASILEIRO FILHO, 2006). Os antioxidantes atuam em diferentes níveis no organismo, impedindo a formação das EROS. A inibição da reação em cadeia do ferro e cobre é capaz de impedir os danos provocados pelas EROS aos lipídeos, proteínas e DNA, sendo um mecanismo de defesa atribuído principalmente aos antioxidantes obtidos na dieta, como vitaminas C, E e A, flavonóides e pró-vitamina A. Além dessas funções, os antioxidantes podem reparar as lesões provocadas pelas EROS, removendo os danos no DNA e reconstituindo as membranas celulares danificadas. Os antioxidantes enzimáticos, CAT e GPX atuam impedindo o acúmulo de radical superóxido e de peróxido de hidrogênio, inibindo a produção do radical hidroxil. Em algumas situações, pode ocorrer o aumento da síntese dos sistemas enzimáticos

19 11 antioxidantes, como resposta adaptativa do organismo as situações de EO (BIANCHI et al., 1999; SCHNEIDER et al.; 2004). As EROS reagem facilmente com outras moléculas, apresentando, portanto uma vida média curta, o que dificulta sua mensuração. Por isso, a maior parte dos estudos que tem como objetivo avaliar as lesões oxidativas utilizam os produtos das reações dessas moléculas com componentes celulares, como os lipídios, proteínas e ácidos nucléicos, como biomarcadores de EO (SOUZA et al.; 2006). A membrana celular é o componente mais suscetível à ação das EROS, devido a grande disposição dos ácidos graxos poliinsaturados das membranas à peroxidação lipídica, que pode desencadear reações em cadeia. O produto final da lipoperoxidação são os hidroperóxidos lipídicos, que podem se decompor em aldeídos, principalmente em malondialdeído (MDA) e em hidrocarbonetos voláteis, como o etano e pentano. O teste de determinação das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) é frequentemente utilizado na literatura, sendo baseado na reação do ácido tiobarbitúrico com os produtos da decomposição dos hidroperóxidos, que tem como um dos principais produtos o MDA (SOUZA et al., 2006; FERREIRA et al.; 1997; SILVA et al.; 1999). De acordo com a literatura, é importante avaliar também a capacidade antioxidante total plasmática (TRAP), por ser um método que leva em consideração a integração entre todos os componentes do sistema e sua complexidade. É possível determinar o tempo do consumo de todos os antioxidantes da amostra, por meio da exposição a radicais produzidos a uma velocidade conhecida. Sendo assim, a capacidade antioxidante, é representada através da concentração de radicais degradados, que reflete indiretamente a quantidade de antioxidantes presentes na amostra. Normalmente utiliza-se como referência o TROLOX (2-carboxi-2,5,7,8- tetrametil-6-cromanol), que é um análogo hidrossolúvel da vitamina E, sendo os resultados expressos em capacidade antioxidante equivalente ao TROLOX (GANDRA et al., 2004).

20 Exercício Físico Moderado e Crônico (EFMC) e EROS A prática regular de atividade física em geral, está associada a uma melhor qualidade de vida, por ser um importante fator na promoção da saúde. O EFMC é indicado como coadjuvante no controle e tratamento de várias doenças, além de ser fator de prevenção para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares, diabetes, doenças metabólicas e autoimunes. Uma das possíveis ações benéficas do EFMC é o aumento das defesas antioxidantes em diversos tecidos, protegendo o organismo contra a ação deletéria das EROS (GOMEZ-CABRERA et al., 2008; LUMINI et al., 2008; RADAK et al., 2008; CRUZAT et al. 2007). Estudos recentes em humanos e animais mostram que o EFMC apresenta papel protetor contra lesões provocadas por EO (RADAK et al., 2008; BOVERIS et al., 2008). Quando o EFMC é praticado, a quantidade de EROS produzidas em resposta ao esforço físico apresenta efeito benéfico sobre os tecidos, pois provocam adaptações nos mecanismos antioxidantes celulares. Para proteger os tecidos contra os danos provocados pelas EROS produzidas durante o EFMC, o sistema antioxidante responde de maneira adaptativa, elevando sua atividade em animais e em indivíduos treinados (SACHDEV et al., 2008; ARAÚJO et al., 2006; GOMEZ- CABRERA et al., 2008). O exercício físico moderado, com etapas de adaptação, aumenta a expressão da enzima Superóxido Dismutade Manganês (MnSOD) no coração de ratos e protege os animais contra os danos provocados pelo EO em lesões de isquemia e reperfusão. Além disso, foi observado o aumento da expressão de Superóxido Dismutase (SOD) mitocondrial e citoplasmática e catalase no músculo estriado esquelético de camundongos (FRENCH et al., 2008; BOVERIS et al., 2008). Em ratos com dieta deficiente em vitaminas antioxidantes, o protocolo de natação, diminui a lipoperoxidação de membranas (efeito das EROS) no músculo estriado esquelético das patas traseiras (TEIXEIRA et al., 2009).

21 Ciclofosfamida (CF) A CF é uma droga utilizada na quimioterapia anti-neoplásica e no tratamento de doenças autoimunes. Sua metabolização ocorre a nível mitocondrial, através das enzimas oxidases, sendo a ativação inicial da droga realizada através das enzimas hepáticas P450, que libera dois metabólitos citotóxicos, a orceína e a mostarda fosforamina. Esses metabólitos liberados induzem a lipoperoxidação das membranas mitocondriais e a liberação do citocromo C, que inibe a síntese de DNA e provoca apoptose induzida por EO. O principal mecanismo de apoptose induzido pela CF está relacionado à produção de radicais livres e ativação do gene p53, observada principalmente no tecido muscular cardíaco (PEKAR et al., 2007; MIRKES et al., 1998; HOSAKO et al., 2007; BRASILEIRO FILHO, 2006; CAMARGO et al., 2006). A CF e outros agentes que induzem EO provocam lesão cardíaca por vários mecanismos. A cardiotoxicidade pode ser gerada por apoptose e necrose das células musculares cardíacas. O tratamento com a droga, induz cardiomiopatia, miocardite, depressão do miocárdio, arritmia maligna e falência cardíaca congestiva (SHANHOLTZ et al., 2001). Nas células do miocárdio, a ciclofosfamida inibe o sistema de enzimas lisossomais e ATPases, altera o metabolismo do colesterol, provoca degeneração das membranas mitocondriais e desorganização dos miofilamentos contráteis (SUDHARSAN et al., 2006; MYTHILLI et al., 2006a; MYTHILLI et al., 2006b). O fígado sofre ação dos produtos tóxicos e radicais livres liberados pelo metabolismo da CF e o principal achado histopatológico é a necrose centrolobular, além disso, provoca lipoperoxidação das membranas dos hepatócitos e diminui a concentração de enzimas antioxidantes (SELVAKUMAR et al., 2004; BRASILEIRO FILHO, 2006). Os efeitos da administração da droga no músculo esquelético são induzidos pela redução da síntese protéica e produção de proteínas anormais (TILIGINAC et al., 2002) além da depleção dos sistemas antioxidantes (FRIEDMAN et al., 1990). (BARKER et al., 2007; TILIGINAC et al., 2002).

22 14 5 MÉTODOS 5.1 Animais Foram utilizados 24 ratos machos, Wistar, com aproximadamente 100 gramas, obtidos do Biotério do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Londrina CCB/UEL. Os procedimentos experimentais foram realizados no laboratório do departamento de Histologia, onde os animais foram mantidos em gaiolas coletivas, em temperatura de 22 C a 24 C e ciclo de claro/escuro de 12 horas. Foi fornecida ração normocalórica NUVILAB e água potável à vontade. 5.2 Grupos Experimentais Os animais foram divididos em 4 grupos de 6 animais, sendo eles: sedentários e sem CF (SCo), sedentário e tratado com CF (SCF), treinados sem CF (TCo), treinados e tratados com CF (TCF). Os animais dos grupos TCo e TCF foram submetidos ao treinamento físico, enquanto os animais SCo e SCF foram mantidos em sedentarismo. Um dia após o término do período de treinamento, os animais dos grupos SCF e TCF, receberam uma única dose de CF e foram sacrificados após 7 dias. Os grupos dos animais TCo e SCo receberam uma única dose de PBS estéril. O peso dos animais foi avaliado antes do período de treinamento ou sedentarismo, e semanalmente até o dia do sacrifício. 5.3 Protocolo de Treinamento Os animais dos grupos TCo e TCF foram submetidos a 21 dias de treinamento de natação, cinco vezes por semana, em tanques individuais (37 X 30cm, com 31cm de água), com temperatura da água em aproximadamente 32 C, conforme protocolo da tabela 1.

23 15 Tabela 1. Protocolo de treinamento. 1 ao 2 = 5 min 3 ao 5 = 10 min 6º ao 8 = 15 min Carga 5% 13 ao 16 = 25 min 17 ao 20 = 30 min 21 = 40 min Carga 5% Carga 5% Carga 5% 9 ao 12 = 20 min Carga 5% Ciclofosfamida PBS A partir do sexto dia de treinamento, foi acrescentada uma carga correspondente a aproximadamente 4-5% do peso corporal do animal, para adequar a intensidade do treinamento. De acordo com estudo realizado por Gobatto et al. (2001), a máxima fase estável de lactato, que representa a intensidade máxima de exercício onde a capacidade de remoção do lactato sanguíneo permite compensar a sua produção, foi observada em cargas de até 5% do peso corporal do animal. Portanto, para ratos sedentários, cargas inferiores a 6% do peso corporal podem ser consideradas como aeróbias. Protocolo modificado de acordo com o proposto por Stoppa, et al. (2002). 5.4 Administração da Ciclofosfamida Os animais dos grupos tratados com CF receberam dose única da droga (200 mg/kg de peso corporal), um dia após o término do treinamento, dissolvida em solução salina via intraperitoneal. (SUDHARSAN et al. 2006). Os animais foram sacrificados após 7 dias da aplicação, por inalação de éter dietílico. 5.5 Obtenção de Soro Foram obtidas amostras de no mínimo 5mL de sangue total, sem anticoagulante, coletados por punção cardíaca. O soro foi separado por centrifugação a 1200 rpm (4200g) por 5 minutos e aliquotados e congelados à - 70 C até a realização dos testes.

24 Procedimentos Histológicos O músculo tríceps sural da pata direita, o coração e o fígado, foram removidos, lavados em solução salina e imediatamente pesados. O material foi fixado em solução de Bouin aquosa, durante 24 horas, desidratado em solução de álcool etílico a 70%, 90% e álcool absoluto. A seguir o material foi diafanizado em xilol, e incluído em parafina histológica. Foram realizados cortes de 7 µm em micrótomo (Leica ) e fixados em lâminas de vidro, para coloração por soluções de hematoxilina/eosina Coloração de Hematoxilina e Eosina Os cortes de todos os órgãos analisados foram desparafinizados em banhos de xilol e álcool-xilol (v/v) e reidratados em solução de álcool etílico absoluto, 90%, 70% e água. À seguir, foram corados em hematoxilina (durante 45 segundos) e lavados em água corrente durante 5 minutos, corados em eosina (1 minuto), lavados rapidamente em água e álcool 70% e desidratas em soluções de álcool 90%, 100% e xilol. Em seguida, cobertos com lamínulas fixadas com Bálsamo do Canadá e analisadas em microscópio óptico. 5.7 Análise Histológica A avaliação histológica dos cortes corados em HE foi realizada através da descrição qualitativa do parecer de três avaliadores calibrados. Foram selecionadas uma lâmina para cada animal, de todos os grupos, e realizada a média dos escores dos avaliadores. Para cada tecido, foram adotados diferentes critérios de avaliação:

25 Fígado Foram escolhidos vinte campos aleatórios por lâmina, sendo observados oito itens para verificar a integridade dos hepatócitos e identificar sinais de lesão tecidual e celular, de acordo com critérios estabelecidos por Chaves (2006): 1. Preservação dos lóbulos hepáticos (ordenação e integridade dos cordões celulares em relação à veia centro lobular). 2. Avaliação da integridade da veia centrolobular. 3. Avaliação da integridade do espaço porta. 4. Avaliação da congestão ou dilatação dos capilares sinusóides hepáticos. 5. Sinais de extravasamento de hemácias nos sinusóides hepáticos. 6.Integridade dos núcleos dos hepatócitos: (tamanho, coloração e fragmentação). 7. Estrutura dos hepatócitos. 8. Avaliação da infiltração gordurosa no citoplasma das células. Com o objetivo de quantificar o grau das possíveis áreas lesão, foram adotadas pontuações conforme a tabela 2. A somatória dos sinais indicativos de lesão, (ausente, leve, moderado e acentuado), poderia atingir o valor mínimo de zero, se não fosse encontrado nenhum indicativo de lesão em todos os oito parâmetros analisados, e o valor máximo de 18 pontos, se os indicativos de lesão fossem máximos em todos os oito parâmetros observados. Tabela 2. Critérios para avaliação morfológica do fígado. Escore Lesão Critérios de lesão 0 Ausente Sinal indicativo de lesão presente em nenhum a dois dos vinte campos observados 1 Leve Sinal indicativo de lesão presente em três a oito dos vinte campos observados 2 Moderada Sinal indicativo de lesão presente em nova a quatorze dos vinte campos observados 3 Acentuada Sinal indicativo de lesão presente em mais de quinze dos vinte campos observados

26 18 Para comparação entre os grupos foram realizadas a somatória de pontos para cada parâmetro de cada animal, sendo que o valor mínimo atingido poderia ser zero e o valor máximo cento e quarenta e quatro, para cada grupo, conforme mostrado na tabela 3. Tabela 3. Critérios da graduação histológica para a comparação entre os grupos, considerando os oito parâmetros avaliados, conforme a somatória do número de pontos da graduação numérica e a porcentagem dos pontos para lesão ausente, leve, moderada, acentuada e grave. Graduação qualitativa Escore (%) Critérios da graduação Ausente 0-14 pontos 0-10% Somatória de sinais indicativos de lesão presente entre zero e quatorze do total de cento e quarenta e quatro pontos Leve pontos 11-25% Somatória de sinais indicativos de lesão presente entre quinze e trinta e seis do total de cento e quarenta e quatro pontos Moderada pontos 26-50% Somatória de sinais indicativos de lesão presente entre trinta e sete e setenta e dois do total de cento e quarenta e quatro pontos Acentuada pontos 51-75% Somatória de sinais indicativos de lesão presente entre setenta e três e cento e oito do total de cento e quarenta e quatro pontos Grave pontos % Somatória de sinais indicativos de lesão presente entre cento e nove e o total de cento e quarenta e quatro pontos

27 Músculo Estriado Esquelético Foi solicitado a três observadores calibrados que observassem as seguintes alterações em toda a extensão da lâmina, para seleção dos campos de análise: - Áreas de necrose/fibrose; - Necrose de fibras: perda de estriações transversais, núcleos picnóticos, edema e floculação de citoplasma. - Presença de infiltrado inflamatório (morfometria). Para a avaliação de possíveis lesões no músculo esquelético foram utilizados os critérios descritos na tabela 4, de acordo com Brasileiro et al., Tabela 4: Critérios para avaliação patológica do músculo estriado esquelético e cardíaco. Escores Grau 0 Ausente Grau 1 Leve Grau 2 Moderado Grau 3 Acentuado Dissociação de fibras musculares (edema) Ausente 1 espaço claro por campo 100x 2-4 espaços claros por campo 100x >5 espaços claros por campo 100x Infiltrado Neutrofílico Ausente 1-10 neutrófilos por campo 400x neutrófilos por campo 400x >20 neutrófilos por campo 400x Necrose de fibras musculares Ausente 1 fibra por campo (100x) 2-3 fibras por campo (100x) >4 fibras por campo (100x)

28 Coração Para a análise do grau de lesão observada no tecido muscular cardíaco, serão considerados os mesmos critérios utilizados para o músculo estriado esquelético (tabela 4), porém, foram realizadas também a quantificação de capilares por área (400X). 5.8 Avaliação do Estresse Oxidativo (EO) Capacidade Antioxidante Total Plasmática (TRAP) A capacidade antioxidante total plasmática (TRAP) foi avaliada por quimiluminescência (QL) em uma adaptação do método da técnica descrita por Repetto et al. (1996). Esta metodologia detecta antioxidantes hidro e lipossolúveis presentes no plasma. Ao meio de reação (1,8 ml de tampão glicina 0,1 M, ph 8,6) serão acrescido 100 μl de luminol em solução aquosa 200 μm, 5 μl de soro diluído 50% em tampão glicina e 100 μl de solução aquosa de 2,2 azo-bis (2- amidinopropano) 200 mm. Sabe-se que o 2,2 azo-bis gera radicais peroxil rapidamente, via interação com radicais centrados em carbono e oxigênio molecular, causando a oxidação de lipídeos e proteínas em biomoléculas (Yokozawa, 2000). Estes radicais livres reagem com o luminol (que atua como um amplificador de sinal), produzindo Quimiluminescência (QL). Esta reação é inibida pela superóxido dismutase (SOD), catalase e análogos da vitamina E. A adição de plasma também diminui a QL em níveis basais por um período (tempo de indução t i ) proporcional à concentração plasmática de antioxidantes (TRAP) até que os radicais do luminol sejam regenerados, restituindo-se os níveis iniciais de QL. O sistema será calibrado com análogo de vitamina E (Trolox), 100 μl na concentração de 20 μm em tampão glicina ph 8,6. Uma comparação do tempo de indução depois da adição de concentrações conhecidas de Trolox e plasma, permitirão obter valores de TRAP em equivalentes de Trolox segundo a equação:

29 21 t amostra TRAP (μm Trolox) = D x t Trolox D é um fator de diluição da amostra no meio de reação, t amostra é o tempo de indução promovido pela adição da amostra de plasma, t Trolox é o tempo de indução promovido por 1 μm de Trolox. Os resultados serão expressos em μm de Trolox. Este experimento será conduzido em um contador β marca Beckman (EUA) modelo LS 6000, utilizando-se um modo de contagem não coincidente por 30 minutos, com uma faixa de resposta entre 300 a 620 nm Quimiluminescência Induzida por t-butil Hidroperóxidos (QL) A avaliação da formação de lipoperóxidos por QL foi efetuada em uma adaptação da técnica descrita por Gonzalez et al. (1991). A QM estimulada por t- butil hidroperóxido foi empregada para analisar a integridade dos mecanismos de defesa antioxidante não-enzimáticos e os níveis de lipoperóxidos. Este teste baseiase na premissa de que um aumento de QM está relacionado com um estresse oxidativo prévio sofrido pelo tecido, levando ao consumo das defesas antioxidantes de baixo peso molecular, tais como vitamina E e formação de lipoperóxidos, resultando em aumento da emissão de fótons. As análises foram realizadas em frascos plásticos para cintilação com capacidade para 20 ml e protegidos da luz. O meio de reação consistiu de 1750 μl de tampão fosfato 30 mm ph 7,4 e KCl 20 mm (v/v) acrescidos de 250 μl de soro e mais 20 μl de terc-butil (t-buooh) com concentração final de 3 mm em 2,0 ml de meio de reação. A QL foi medida em um contador β marca Beckman (EUA) modelo LS 6000, em um modo de contagem não coincidente, com uma faixa de resposta entre 300 a 620 nm. Este experimento foi conduzido a uma temperatura de 30 C. Os resultados foram expressos em contagem por minuto (c.p.m.).

30 Determinação das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) O TBARS foi determinado pelo método descrito por Jentzsch et al. (1996), utilizando uma concentração elevada de butil hidroxytolueno antes do aquecimento e das leituras do diferencial em 535 e 572 nm, que melhora substancialmente sua especificidade Dosagem de Óxido Nítrico (NO) Os níveis de NO no soro foram avaliados através das concentrações de nitrito (NO - 2 ) e nitrato (NO - 3 ) de acordo com a reação de Griess acrescentando a redução de nitrato ao nitrito com cádmio (GUEVARA et al., 1998; GONZÁLVEZ et al., 1998). 5.9 Análise Estatística Os dados foram analisados por métodos descritivos, expressos em média e desvio padrão. Para a comparação das médias do peso absoluto e relativo dos órgãos, quantidade de capilares no miocárdio e as variáveis de EO, foi utilizado o teste de Levene para verificar a homogeneidade da amostra, sendo os dados homogêneos, foi utilizado o teste ANOVA One-Way, quando os dados não foram homogêneos foi utilizado o teste Kruskal-Wallis, e quando fosse indicado diferença, o teste Man-Withney. Para a comparação da massa corporal dos animais no inicio do experimento (M1), após 21 dias de treinamento (M2) e após uma semana da aplicação de CF (M3), foi utilizado o teste ANOVA Two-Way. O teste post-hoc LSD foi utilizado para identificar as diferenças especificas, adotando o nível de significância de p<0,05. Para análise do grau de lesão dos órgãos, foi utilizado o teste Qui-quadrado. As informações foram processadas no programa estatístico SPSS 17.0.

31 23 6 Resultados 6.1 Massa Corporal A figura 1 apresenta as diferenças intra-grupos, no início do experimento (M1), 21 dias após o treinamento ou sedentarismo (M2) e sacrifício após 7 dias de aplicação da CF (M3). Nos grupos SCo e TCo, houve ganho de massa corporal durante os três períodos experimentais, entretanto, os grupos SCF e TCF, não apresentaram ganho de massa corporal de M2 para M3, indicando que a CF impediu o ganho de massa corporal esperado para esses animais. 350 * M1 M2 M * * * * * * * 200 Peso (g) SCO SCF TCo TCF Figura 1. Análise da variação na massa corporal intra-grupos, nos três momentos: M1 (inicial), M2 (término do treinamento e aplicação da droga) e M3 (sacrifício). *p<0,05 vs. M1 e p<0,05 vs. M2. Anova Two-Way, post-hoc LSD.

32 24 Na figura 2, observamos que no início do experimento, os animais apresentavam massa corporal semelhante. Após o término do treinamento, os grupos treinados, apresentaram menor massa corporal, quando comparado aos sedentários. Sete dias após a aplicação da droga, os animais do grupo SCo continuaram ganhando massa corporal, entretanto, os animais SCF não tiveram esse comportamento, indicando que a droga provocou alterações que impediram o desenvolvimento normal desses animais. Os animais TCo e TCF continuaram com menor massa corporal em relação aos sedentários. SCo SCF TCo TCF 350 p< * * 200 Peso (g) Início Término Treinamento Sacrifício Figura 2. Análise da variação na massa corporal inter-grupos. *p<0,05 vs. SCo e p<0,05 vs. SCF. Anova Two-Way post-hoc LSD.

33 Peso Absoluto e Relativo do Coração, Músculo e Fígado. A tabela 5 demonstra os resultados dos valores do peso absoluto e relativo, dos órgãos, respectivamente. Não foram observadas diferenças nos valores do peso absoluto do músculo entre os grupos. Os pesos absolutos do coração e do fígado foram significativamente menores nos animais dos grupos SCF, TCo e TCF em relação ao grupo SCo. Não foram encontradas diferenças no peso relativo dos órgãos. Tabela 5. Valores do peso absoluto e relativo do coração, músculo e fígado (média ± desvio padrão). Grupos (n=6) Coração Músculo Fígado Absoluto SCo 1,14 ± 0,11 0,69 ± 0,13 13,55 ± 2,08 SCF 0,99 ± 0,08* 0,72 ± 0,17 10,93 ± 0,83* TCo 0,98 ± 0,11* 0,79 ± 0,08 10,56 ± 0,70* TCF 1,01 ± 0,06* 0,74 ± 0,19 10,04 ± 1,84* Relativo SCo 0,40 ± 0,04 0,25 ± 0,07 4,5 ± 0,19 SCF 0,38 ± 0,03 0,28 ± 0,08 4,2 ± 0,34 TCo 0,39 ± 0,03 0,32 ± 0,04 4,2 ± 0,27 TCF 0,43 ± 0,02 0,31 ± 0,07 4,2 ± 0,48 Anova One-Way- LSD *p< 0,05 vs. SCo. 6.3 Análise Histológica do Tecido Muscular Estriado Cardíaco Capilares Sanguíneos no Miocárdio A quantidade de capilares sanguíneos (400x), foi significativamente maior para os animais do grupo TCo (11± 3), quando comparado aos animais dos grupos SCo (6±3), SCF (5±1) e TCF (7±3), como demonstrado na figura 3.

34 26 A B Figura 3. Capilares sanguíneos do miocárdio. (A) Sedentários x (B) Treinados (400x HE) Edema, Infiltrado Inflamatório e Necrose Na figura 4, apresentamos as áreas de edema, neutrófilos e necrose, coradas em HE, sendo essas áreas representadas quantitativamente, na figura 5. Os animais do grupo SCF apresentaram maior número de áreas de infiltrado inflamatório quando comparados aos grupos demais grupos. O exercício físico reduziu significativamente o infiltrado de neutrófilos nos animais submetidos ao tratamento com CF. O grupo SCF apresentou maior percentagem de áreas de necrose quando comparado aos demais grupos, embora o treinamento físico também tenha aumentado a percentagem de áreas de necrose. O grupo TCF apresentou redução significativa de áreas de necrose quando comparado ao grupo SCF. A ciclofosfamida (SCF) e o exercício (TCo) provocaram aumento do número de áreas de edema. No entanto, houve uma diminuição significativa nas áreas de edema dos animais do grupo TCF, em relação ao SCF.

35 27 As figuras 6, 7 e 8, apresentam a freqüência do grau de infiltrado inflamatório, necrose, e edema para cada grupo. Observamos que o tratamento com a ciclofosfamida provoca aumento da gravidade dos parâmetros estudados, no entanto o treinamento físico provocou lesões leves e moderadas. No entanto, o treinamento físico diminuiu a gravidade das lesões nos animais TCF. a b Figura 4. Avaliação das áreas de edema, infiltrado inflamatório e necrose no tecido muscular cardíaco de ratos Wistar submetidos ao tratamento com CF e/ou exercício físico. (a) Área de edema (SCF); (b) neutrófilos ( ) e áreas de necrose, com desorganização das fibras musculares (SCF) (400x HE).

36 a b c * SCO SCF TCO TCF 70 * Edema (%) * Netrófilos (%) * Necrose (%) * * * Figura 5. Avaliação das áreas de edema (a), infiltrado inflamatório (b) e necrose (c) no músculo estriado cardíaco, de ratos Wistar submetidos ao tratamento com CF e/ou exercício físico. *p<0,05 vs. SCo, p<0,05 vs. SCF, p<0,05 vs. TCo, p<0,05 vs. TCF. Qui quadrado com correção de Yates.

37 29 100% Acentuado Moderado Leve Ausente 80% 60% 40% 20% 0% SCo SCF TCo TCF Figura 6. Grau de áreas de edema no tecido muscular cardíaco, de ratos Wistar submetidos ao tratamento com CF e/ou exercício físico.

38 30 100% Acentuado Moderado Leve Ausente 80% 60% 40% 20% 0% SCo SCF TCo TCF Figura 7. Grau de áreas infiltrado inflamatório no tecido muscular cardíaco de ratos Wistar submetidos ao tratamento com CF e/ou exercício físico..

39 31 100% Acentuado Moderado Leve Ausente 80% 60% 40% 20% 0% SCo SCF TCo TCF Figura 8. Grau de áreas de necrose no tecido muscular cardíaco de ratos Wistar submetidos ao tratamento com CF e/ou exercício físico. 6.4 Análise Histológica do Tecido Muscular Estriado Esquelético Edema, Infiltrado Inflamatório e Necrose A figura 9 representa as áreas de edema (a), infiltrado inflamatório (b) e necrose (c) encontrada para cada grupo. Observamos que houve uma diminuição significativa nas áreas de edema para os animais do grupo TCF, quando comparados aos animais SCF. As áreas de edema encontradas nos animais TCo, foram menores quando comparadas ao grupo SCo. A porcentagem de infiltrado inflamatório foi significativamente maior nos grupos SCF, TCo e TCF em relação ao grupo controle. A percentagem de áreas de necrose foram significativamente maiores nos grupos SCF e TCo, no entanto, o grupo TCF não apresentou diferença significativa em relação ao grupo controle.

40 32 Quanto a gravidade das lesões, os animais SCF apresentaram maior percentagem de áreas com edema e necrose consideradas moderados e severos, em relação aos grupos TCo e TCF a b c *, SCO SCF TCO TCF Edema (%) * Neutrófilos (%) Necrose (%) * * * * * * Figura 9. Avaliação das áreas de edema, infiltrado inflamatório e necrose no músculo estriado esquelético de ratos Wistar submetidos ao tratamento com CF e/ou exercício físico. *p<0,05 vs. SCo, p<0,05 vs. SCF. Qui-Quadrado com correção de Yates.

41 33 100% Acentuado Moderado Leve Ausente 80% 60% 40% 20% 0% SCo SCF TCo TCF Figura 10. Grau das áreas de edema no tecido muscular esquelético de ratos Wistar submetidos ao tratamento com CF e/ou exercício físico..

42 34 100% Acentuado Moderado Leve Ausente 80% 60% 40% 20% 0% SCo SCF TCo TCF Figura 11. Grau das áreas de infiltrado inflamatório no tecido muscular esquelético de ratos Wistar submetidos ao tratamento com CF e/ou exercício físico..

43 35 100% Acentuado Moderado Leve Ausente 80% 60% 40% 20% 0% SCo SCF TCo TCF Figura 12. Grau das áreas de necrose no tecido muscular esquelético de ratos Wistar submetidos ao tratamento com CF e/ou exercício físico. 6.4 Análise Histológica do Fígado De acordo com os critérios de avaliação pré estabelecidos, todos os grupos apresentaram indicativos de lesão leve, sendo que a somatória dos pontos de acordo com a porcentagem foi de 22% para o grupo SCF, 20% para o SCo, 19% para o TCo e 16% para o TCF. No entanto, observamos que os hepatócitos dos animais dos grupos SCF, se apresentavam em processo de regeneração (citoplasma espandido e floculado), em relação aos demais grupos, sugerindo que a metabolização da CF tenha provocado maior dano neste tecido (figura 13).

44 36 a b Figura 13. (a) Hepatócitos em processo de regeneração, grupo SCF; (b) hepatócitos com aspecto de integridade, grupo TCF (400x HE). 6.6 Avaliação do Estresse Oxidativo A figura 14 e 15 apresenta os valores referentes aos marcadores de estresse oxidativo. Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos, para a oxidação lipídica (14a), óxido nítrico (14b) e capacidade antioxidante total do plasma (14c) e oxidação proteíca (15a). Animais do grupo SCF apresentaram redução significativa da concentração plasmática de hidroperóxidos lipídicos (15b). Uma possível explicação para esses resultados, pode ser baseada na hipótese de que o pico do metabolismo da droga, e níveis mais altos de produtos do estresse oxidativo, tenha acontecido entre o 2º e 3º dia após a aplicação da droga, sendo assim, no 7º dia, esses valores já estariam voltando aos níveis normais. Entretanto, foram observadas reduções significativas nos níveis de HIDROP nos grupos SCF e TCo, quando comparados ao SCo, além disso, o grupo SCF apresentou ainda, menores índices de HIDROP quando comparado aos grupos TCo e TCF, sendo que os índices do grupo TCF foi maior quando comparado ao TCo.

45 37 a b c FOX (c.p.m) NO (µmol/l) TRAP (µmtrolox) SCO SCF TCo TCF 0 SCO SCF TCo TCF 0 SCO SCF TCo TCF Figura 14. Análise dos marcadores de estresse oxidativo de ratos Wistar submetidos ao tratamento com CF e/ou exercício físico. (a) FOX = oxidação lipídica, (b) NO = Óxido Nítrico e (c) TRAP = capacidade antioxidante total do plasma. Anova One-Way-LSD, p<0,05.