Avaliação de estrutura genética e de misturas de genomas em plantas daninhas reveladas com o uso de marcadores moleculares

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2 Avaliação de estrutura genética e de misturas de genomas em plantas daninhas reveladas com o uso de marcadores moleculares Dra. Claudete Aparecida Mangolin mangolimca@gmail.com Laboratório de Genética e Biotecnologia Vegetal Departamento de Biotecnologia, Genética e Biologia Celular Universidade Estadual de Maringá

3 Expectativa: Conferindo competência para uma ampla dispersão. Resistência a pressões de seleção, como pela ação de herbicidas aplicados para o seu controle. Formam um grupo de plantas com alta diversidade genética. Plantas Daninhas Pressões de seleção (ação de herbicidas aplicados) para o controle Leva a uma redução da variabilidade genética

4 Qual a importância prática do conhecimento da diversidade genética de populações de daninhas? Premissa: Diversidade genética alta confere competência para ampla dispersão. - Podendo requerer diversidade para o método de controle; presença de diferentes genótipos podem escapar da pressão de seleção.

5 Qual a importância prática de conhecer a forma como as populações de daninhas estão geneticamente estruturadas? Premissa: Populações geneticamente estruturadas refletem grupos geneticamente divergentes 1- Podem requerer formas de controle divergentes. 2- Para populações com divergência genética baixa podem ser aplicadas formas similares de controle.

6 Espécies analisadas: 1- Euphorbia heterophilla ( wild poinsettia = amendoim bravo; leiteiro) 12 populações 1 do Mato Grosso (MT) e 11 do Paraná (PR)

7 Populações de Euphorbia heterophylla coletadas de diferentes plantas em 12 localidades de nove cidades em dois estados do Brasil (Mato Grosso - MT e Paraná - PR)

8 Grupo 1 Grupo 2 Dendrograma e a relação entre as plantas das 12 populações de Euphorbia heterophylla, baseado nas medidas de distância genética e obtido pelo método de UPGMA e análise de agrupamento realizada para o polimorfismo dos alelos dos loci Est-1, Est-3, Est-4, Est-5, Est-6 e Est-7 utilizando do coeficiente de Jaccard.

9 Número de loci polimórficos (N (pl) ), proporção de loci polimórficos (%P), proporção de alelos por locus (A), proporção de alelos para os loci polimórficos Est-1, Est-3, Est-4, Est-5, Est-6, and Est-7 (AP), heterozigosidade média observada (H o ) e esperada (H e ) em plantas de Euphorbia heterophylla descendentes das 12 populações.

10 Coeficientes de fixação F (F (IS), F (IT), F (ST) ; Wright, 1965) e o valor do fluxo gênico (Nm), para plantas descendentes de 12 populações de Euphorbia heterophylla. 1- Diversidade genética alta (He = 0,3887). 2- Divergência genética alta (Fst = 0,1663) formando dois grandes grupos divergentes no dendrograma. 3- Fluxo gênico alto (Nm 1.0) - dispersão de sementes. 4- Déficit de heterozigotos de 12,40% - pressão de seleção.

11 Euphorbia heterophylla com marcadores ISSR (Inter Simple Sequences Repeats 10 populações. Localização dos 10 pontos de coleta de sementes de Euphorbia heterophylla - oito no Estado do Paraná, um no Rio Grande do Sul e um em São Paulo.

12 132

13 9 ISSR Primers para ISSR, sequências de nucleotídeos dos primers, número de segmentos amplificados por primer nas 132 amostras de E. heterophylla com suas respectivas temperaturas de anelamento

14 Número de alelos observados (Na), Número efetivo de alelos (Ne), Índice de Shannon (I), Diversidade genética de Nei (1973) (He), número de locos polimórficos e porcentagem de locos polimórficos para cada amostra de Euphorbia heterophylla estudada. Ht = 0,3611 G st = 0,3607 Nm = 0,8864 (moderada)

15 Análise da estrutura Bayesiana (K = 6; ΔK = 31,7853). Bar Plot das 132 amostras de Euphorbia heterophylla agrupadas em 6 grupos. Grupo1 Grupo2 Grupo3 Grupo4 Grupo5 Grupo6 Mistura de genomas ancestrais Mistura de genomas ancestrais Predomínio de grupos ancestrais para amostras de cada localidade em decorrência de prováveis efeitos fundadores de cada um dos genomas ancestrais.

16 Dendrograma da distância genética entre as amostras de plantas de Euphorbia heterophylla coletadas em 10 localidades construído utilizando o método UPGMA. 4 grupos divergentes, com Pato Branco I e Pato Branco III formando 2 grupos isolados. Esterases e ISSR confirmaram a premissa de diversidade genética alta, divergência genética alta com populações geneticamente estruturadas em E. heterophyla.

17 2- Conyza canadensis x Conyza bonariensis Sementes das duas espécies foram coletadas de várias plantas, em diferentes campos de soja, na área rural de Engenheiro Coelho SP (Brasil). Sementes de cada espécie de Conyza foram casualmente distribuidas para germinação em vasos separados de 500-ml contendo solo estéril. As plantas obtidas foram usadas para os experimentos.

18 - Isoenzimas Esterase (EST; EC _) Isoenzimas Malato desidrogenase (MDH; EC ) Isoenzimas Fosfatase ácida (ACP; EC )

19 Número de alelos (Na) e número efetivo de alelos (Ne) por locos polimórficos, heterozigosidade média observada (Ho) e heterozigosidade esperada (He), em amostras de C. bonariensis e C. canadensis.

20 Evidências: Diversidade genética alta em ambas espécies: Conyza bonariensis He = 0,5461 Conyza canadensis He = 0,5386 Divergência genética baixa (Fst = 0,0199) indicando mistura de amostras, confirmada pelo valor muito alto do fluxo gênico (Nm = 12,32); Nm = Fst = 0.25(1 - Fst)/Fst. Dispersão de sementes na mesma área rural e mistura de plantas das duas espécies nos campos.

21 Marcadores microssatélites - análise de polimorfismo em locos SSR Divergência genética alta entre C. canadensis e C. bonariensis pode ser observada em amostras para as duas espécies coletadas no continente Norte americano Califórnia, onde estas plantas têm morfologias diferentes e bem definidas. C. canadensis - (Dinuba, CA) C. bonariensis - (Parlier, CA)

22 Amostras de Conyza sumatrensis (SF) obtidas de vários locais (Campo Mourão, Floresta, Cascavel, Cafelândia, Peabiru e Toledo) no Estado do Paraná, Brasil e amostras de Conyza canadensis (HW) e Conyza bonariensis (BH) obtidas de Dinuba, Fresno, e Parlier no Vale Central Califórnia, USA.

23 Amostras de Conyza sumatrensis (SF) obtidas de vários locais (Campo Mourão, Floresta, Cascavel, Cafelândia, Peabiru e Toledo) no Estado do Paraná, Brasil e amostras de Conyza canadensis (HW) e Conyza bonariensis (BH) obtidas de Dinuba, Fresno, e Parlier no Vale Central Califórnia, USA.

24 Doze pares de primers de SSR (Simple Sequence Repeat) usados para análises de plantas de Conyza sumatrensis, C. canadensis e C. bonariensis, e o número de alelos para cada loco.

25 C. canadensis x C. bonariensis x C. sumatrensis Número de alelos (Na) e número de alelos efetivos (Ne) por loco SSR polimórfico, heterozigosidade média observada (H o ) e heterozigosidade média esperada (H e ), e a porcentagem de locos polimórficos (%P), nas amostras das três espécies de Conyza (C. canadensis, C. bonariensis e C. sumatrensis).

26 Análise da estrutura Bayesiana Bar plot de amostras de Conyza canadensis (1) obtidas de Fresno (HWS 156) e Dinuba (HWR), C. bonariensis (2) obtidas de Parlier e C. sumatrensis obtidas de Campo Mourão (3), Floresta (4), Cascavel (5), Cafelândia (6), Peabiru (7) e Toledo (8) Cada barra vertical representa uma planta com a proporção de cada um dos genomas ancestrais em seus segmentos coloridos. Cada cor representa um grupo genômico ancestral. Proporção de amostras de Conyza canadensis, C. bonariensis e C. sumatrensis em cada grupo (K = 3) e o número de plantas por amostras.

27 Número de alelos (Na) e número de alelos efetivos (Ne) por loco SSR polimórfico, heterozigosidade média observada (H o ) e heterozigosidade média esperada (H e ), porcentagem de locos polimórficos (%P) nas amostras de Conyza sumatrensis de seis diferentes locais do Paraná, sul do Brasil.

28 Aliada com a diversidade de morfologias e diversidade molecular - suspeita de ocorrência de mais de uma espécie e de mistura de genomas. a) Conyza spp em área urbana Zona 07 Maringá-PR. b) Infestação em área de Citrus Município de Castelo Branco-PR. c) Conyza spp em plantação de soja. Município de Floresta-PR. d) e e) Conyza spp no campus da Universidades Estadual de Maringá. f) Área rural no município de Mandaguari-PR totalmente infestada por buva. Proposta de ampliar as investigações e analisar exemplares de buva agora denominados Conyza spp. de diferentes origens, e de estados diferentes.

29 50 localidades - Dos estados de Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná, São Paulo e Mato Grosso do Sul - Total de 500 plantas

30 1 - São José do Ouro (RS) 2 - Saldanha Marinho (RS) 3 - Lagoa Vermelha (RS) 4 - Santo Ângelo (RS) 5 - Campos Novos 1 (SC) 6 - Campos Novos 2 (SC) 7 - Abelardo Luz (SC) 8 - Curitibanos 1 (SC) 9 - Curitibanos 2 (SC) 10 - Quilombo (SC) 11 - Luiziana (PR) 12 - Janiópolis (PR) 13 Goioerê (PR) 14 Mariluz (PR) 15 Rancho Alegre D Oeste (PR) 16 - São João do Ivaí (PR) 17 - Quinta do Sol (PR) 18 - Alto Piquiri (PR) 19 - Toledo (PR) 20 - Marechal Cândido Rondon (PR) 21 - Guaíra 1 (PR) 22 - Guaíra 2 (PR) 23 - Palotina 1 (PR) 24 - Palotina 2 (PR) 25 - Brasilândia do Sul (PR) 26 - Francisco Alves (PR) 27 - Maringá (PR) 28 - Céu Azul (PR) 29 - Ouro Verde do Oeste 1 (PR) 30 - Ouro Verde do Oeste 2 (PR) 31 - Lindoeste (PR) 32 - Londrina 1 (PR) 33 - Londrina 2 (PR) 34 - Sertanópolis (PR) 35 - Bela Vista do Paraiso (PR) 36 - Cambé (PR) 37 - Mamborê 1 (PR) 38 - Mamborê 2 (PR) 39 - Pato Branco (PR) 40 - Cambira (PR) 41 - Francisco Beltrão (PR) 42 - Santa Helena (PR) 43 - Tamboara (PR) 44 - Assaí (PR) 45 - Rolandia (PR) 46 - Palmital (SP) 47 - Campos Novos Paulistas (SP) 48 - Caarapó (MS) 49 Itaporã (MS) 50 Itaquiraí (MS)

31 Dez pares de primers de Microssatélites usados para a análise de plantas de Conyza spp. Repetições amplificadas para cada microssatélite e o número de alelos por locos

32 He = Ho = Déficit de heterozigotos [evidência da pressão de seleção] Hom obs = Análise da variância molecular (AMOVA), valores de grau de liberdade (GL), soma dos quadrados (SQ), variância e porcentagem de variância molecular dentro e entre as amostras de Conyza spp. Valores muito próximos de variância dentro e entre as amostras

33 Parâmetros médios de coeficiente de endogamia (Fis), proporção de diversidade gênica entre as amostras (Fst), fluxo gênico entre as amostras (Nm) avaliados para os dos dez locos SSRs Diversidade genética alta = Divergência genética muito alta = 0,4208; Fluxo gênico baixo = [Nm < 0.5] Excesso de homozigotos = 0,3899 Resultado de pressão de seleção diferencial; # Seleção divergente contribuindo para gerar diversidade genética alta

34 - Seleção diferencial que levou a formação de 11 grupos de genomas ancestrais. - Populações com predomínio de um dos grupos de genomas. - Populações com mistura de grupos de genomas. Evidentes principalmente no PR com número maior de populações analisadas

35 A pressão selecionou 7 grupos de genomas diferentes, 6 deles Resistentes ao Glyphosate, mostrando que a resistência pode surgir entre grupos de genomas ancestrais diferentes Resistente Pouco Suscetível Medianamente Suscetível A seleção para Resistência não parece estar associada com um genótipo específico Suscetível

36 Esta Tabela mostra que a R também está presente em plantas apresentando mistura de genomas ancestrais; isto confirma que a R não está associada com grupos de genomas ancestrais predominantes. Resistente Pouco Suscetível Medianamente Suscetível Suscetível População de Ouro Verde do Oeste 1 -PR - Evidência de população com polimorfismo alto, heterozigosidade observada alta, plantas Resistentes com apenas 1.25% de controle ao glyphosate.

37 Confere competência para ampla dispersão de diferentes genótipos com genes para Resistência Polimorfismo alto Heterozigosidade esperada alta Para Conyza spp. Resistência: -Presente em populações com diversidade genética baixa e - Presente em populações com diversidade genética alta

38 3- Digitaria insularis - Capim amargoso Outra evidência de seleção de plantas Resistentes independente do seu genótipo foi observada no capim amargoso 20 primers para ISSR ISSR primers, sequences of nucleotides of the ISSR primers, and number of segments amplified per primer in the individuals of the five populations of Digitaria insularis

39 Geographical representation of the collection locations for the five populations of Digitaria insularis. PY-R: Paraguay resistant; PR-R: Paraná resistant; PR-S: Paraná susceptible; SP-S: São Paulo susceptible; and SP-R: São Paulo resistant. Origin and geographical coordinates of the five populations of Digitaria insularis

40 Primeiro caso de resistencia ao glyphosate in D. insularis em 2005 na cidade de Caaguazú, provincia de Alto Paraná province, Paraguai (Heap, 2016). Em 2007 No município de Guaíra - Paraná, aproximadamente 350 km do primeiro foco de resistência ao glifosato no Brasil (Heap, 2016). No início de 2009, populações de D. insularis resistentes ao glyphosate foram identificadas em pomares de citrus no Estado de São Paulo (Carvalho et al., 2011). Bar plot das cinco populações de Digitaria insularis. PY-R: Paraguai resistente; PR-R: Paraná resistente; PR-S: Paraná suscetível; SP-S: São Paulo suscetível; e SP-R: São Paulo resistente.

41 Proporção de plantas de Digitaria insularis em cada grupo (K = 4), e o número de plantas analisadas de cada população (PY-R: Paraguay resistente; PR-R: Paraná resistente; PR-S: Paraná suscetível; SP-R: São Paulo resistente; e SP-S: São Paulo suscetível). Indicação de que a seleção para a Resistência não está associada com um Genótipo específico

42 Representa um grupo de plantas com alta diversidade genética. Conferindo competência para uma ampla dispersão. Plantas Daninhas Observamos que pressões de seleção (ação de herbicidas aplicados) para o controle. Levando a uma redução da variabilidade genética (Ho) Seleção para Resistência a herbicidas não parece estar associada com o genótipo

43 Obrigada