A influência do borohidreto de sódio na imobilização do extrato enzimático da tirosinase de Agaricus bisporus

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1 A influência do borohidreto de sódio na imobilização do extrato enzimático da tirosinase de Agaricus bisporus V.P.S dos SANTOS 1, A.G. TORRES 2, K.S. PEREIRA 1 e A.M SALGADO 1 1 Universidade Federal do Rio de Janeiro, Centro de Tecnologia, Escola de Química, Departamento de Engenharia Bioquímica 2 Universidade Federal do Rio de Janeiro, Centro de Tecnologia, Instituto de Química para contato: andrea@eq.ufrj.br RESUMO A tirosinase é uma enzima de grande potencial de aplicação em biotecnologia, principalmente em biocatálise e biossensores. Uma das etapas mais importantes para a utilização da tirosinase consiste na escolha de métodos de imobilização que resultem em imobilizados com alta atividade catalitica e estáveis. O borohidreto de sodio (NaBH4) é um agente redutor empregado para inativar bases de Shiffs e grupos aldeídos remanescentes presentes no suporte após a imobilização. O extrato enzimático da tirosinase de Agaricus biporus foi imobilizado em membrana de nylon 6,6 por ligação covalente-reticulação com gluraldeído. O efeito do NaBH4 foi avaliado utilizando três concentrações (0.25, 0.5 e 1 mg/ml) em ph 8, durante 15 minutos de reação, a 4 C.Todas as concentrações de borohidreto de sódio testadas promoveram a redução da atividade catalítica da tirosinase em mais de 50%, além de não aumentarem a estabilidade operacional. O NaBH 4 não se mostrou um agente redutor apropriado para esse sistema. 1. INTRODUÇÃO A enzima tirosinase vem sendo bastante utilizada em diversos processos biotecnológicos que vão desde a biorremediação até a confecção de biossensores para as áreas ambiental e de alimentos (COSNIER, 2015). Os processos de imobilização tem como objetivo tornar viável, operacional e economicamente, o uso de enzimas, através da possibilidade de reutilização, de melhorias na estabilidade térmica, operacional e de estocagem, ampliação da faixa de ph ideal, dentre outros benefícios. Para isso, contudo, é necessário que o método de imobilização seja adequado assim como algumas opções de tratamento pós-imobilização, o que inclui o uso de agentes redutores de bases de Shiff s (HERMANSON, 2013).

2 O borohidreto de sódio é um dos agentes redutores mais utilizados para a estabilização de sistemas de imobilização, devido a sua abilidade em tornar grupos aldeídos remanescentes em grupos hidroxil inertes e transformar bases de Schiff s fracas em ligações amino secundárias estáveis, no suporte, após a imobilização. Interações indesejáveis entre esses grupos do suporte e a enzima podem causar diminuição da atividade catalítica e estabilidade (MIELENZ; ADNEY; MCMILLAN, 2009). Uma característica intrínseca ao borohidreto de sódio é o efeito deletério ao sítio ativo da enzima, que pode estar diretamente ligado a natureza da proteína, condições da redução (presença ou ausência de agitação, ph, temperatura e concentração do agente redutor) (TWEEL; HARDER; BUITELAAR, 2013). Este trabalho tem como objetivo determinar a influência do borohidreto de sódio na estabilidade operacional da enzima tirosinase imobilizada em membrana de nylon 6,6 por meio de ligação covalente reticulação com glutaraldeído. 2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Obtenção do extrato enzimático O procedimento utilizado para realizar a extração química com acetona seguida de etapas de congelamento/descongelamento, foi adaptado do procedimento de KAMEDA et al (2006). Em um liquidificador industrial com jarra de inox, foram triturados 500 g de corpos de frutificação de Agaricus bisporus com 1 L de solvente gelado. A mistura foi filtrada á vácuo. O resíduo de cogumelo foi congelado por 24 horas. Após descongelamento, o resíduo de cogumelo foi ressuspenso com tampão fosfato de sódio 0.1M ph 6 e congelado por 24 horas. Após descongelamento, o resíduo foi centrifugado a 4000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente. O sobrenadante obtido constitui o extrato enzimático. O precipitado foi ressuspenso com tampão e repetidas as etapas de congelamento, descongelamento e centrifugação. O extrato foi submetido a precipitação sequencial de proteínas com sulfato de amônio (0-20%, 20-40% e 40-60% de saturação) SCOPES, (1994), dialisados por 24 h a 4 C e armazenado congelado em frascos escuros. A acetona foi recuperada por evaporação rotativa para reutilização. 2.2 Imobilização da enzima do extrato enzimático A tirosinase foi imobilizada em membranas de nylon 6,6 via ligação covalente seguida da reticulação com GA (glutaraldeído). Membranas de nylon foram hidrolisadas em solução de HCl 3M por 2 horas a 35 C. Após lavagem tripla com água destilada, as membranas foram ativadas com solução de glutaraldeído 1,5%, durante 2 horas sob agitação, a temperatura de 25 C. Os suportes ativados foram lavados com solução tampão fosfato de sódio 0,1M e postos em contato com 5 ml solução de extrato enzimático (3000 U) durante 15 h a 8 C, sob agitação lenta. Gluraldeído foi adicionado até a concentração de 1,5%, para promover a ligação cruzada enzima-

3 enzima, durante 30 min. As membranas foram lavadas com solução tampão fosfato de sódio para retirar enzimas não imobilizadas. 2.3 Tratamento com borohidreto de sódio O efeito da redução dos imobilizados com borohidreto de sódio, foi avaliado utilizando três concentrações (0.25, 0.5 e 1 mg/ml). Os imobilizados foram imersos em soluções de NaBH 4 ph 8, durante 15 min, sem agitação e sob refrigeração (8 C). Após a redução as membranas foram lavadas com solução tampão fosfato de sódio ph 6 e armazenadas em condição semiumida a 4 C. 2.4 Determinação da atividade da enzima livre e imobilizada e eficiência da imobilização A atividade enzimática da enzima livre foi medida por meio do procedimento adaptado de CAMPOS et al., (1996). 1 ml do extrato enzimático diluído 1:10 foi adicionado a 5,5 ml de tampão fosfato de sódio 0,1 M ph 6 e 1,5 ml de solução de substrato L-tirosina 1.2 mm. Após agitação a mistura foi levada a leitura espectrofotométrica em modo cinético a 280 nm durante 10 minutos. A atividade enzimática expressa em unidades por ml (U/mL) foi calculada a a partir da equação (1). (1) Onde Abs 1 : absorbância inicial, Abs 2 : absorbância final, T 1 : tempo inicial e T 2 : tempo final Para a enzima imobilizada a atividade foi medida fazendo-se a leitura em modo fotométrico, durante 10 minutos com leitura de aliquotas minuto a minuto. A eficiência de imobilização foi determinada através da equação (2). % (2) onde, Us= unidades de atividade enzimática total presente no suporte e U i = unidades de atividade utilizadas na imobilização. 2.5 Estabilidade operacional Para a avaliação da estabilidade operacional, as membramas contendo a tirosinase imobilizada com e sem tratamento com borohidreto de sódio, foram submetidos a 10 ciclos de reação de 10 minutos cada, com substrato L-tirosina, medindo-se a atividade como descrito no ítem 2.4.

4 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Eficiência de imobilização O método de imobilização da tirosinase do extrato de Agaricus bisporus, em membrana de nylon 6,6, nas condições de imobilização testadas, apresentou eficiência de imobilização de aproximandamente 60% da atividade recuperada em relação a carga enzimática disponível empregada na imobilização (3000 U). 3.2 Avaliação da redução com NaBH 4 Os resultados redução em diferentes concentrações de NaBH 4 das membranas com tirosinase imobilizada em comparação com as membranas não reduzidas, em estão apresentados no Gráfico Atividade enzimática U/mL Sem redução 0.25 mg/ml de NabH4 0.5 mg/ml de NaBH4 1 mg/ml de NaBH4 Número de ciclos de reação Gráfico 1 Estabilidade operacional dos imobilizados sem e com redução com NaBH 4, durante 10 ciclos de reação. As membranas não submetidas a redução com NaBH 4, perderam cerca de 59% da atividade inicial ao longo de 10 reutilizações. As membranas tratadas com 0.25 mg/ml de borohidreto de sódio, perderam cerca de 68% da atividade inicial do primeiro ciclo de reação, o que indica menor estabilidade operacional em relação as membranas não reduzidas com borohidreto. Nas membranas tratadas com as concentrações de 0.5 mg/ml houve perda de atividade ao longo de 10 ciclos de operação de cerca de 60%, o que indica menor estabilidade operacional em relação as membranas não reduzidas. Com a concentração de 1 mg/ml a perda da

5 atividade ao longo de 10 bateladas foi 51% sugerindo aumento de estabilidade operacional em relação as membranas não tratadas, mas drástica redução da atividade médida (1759 U/mL membranas não tratadas, 607 U/mL membranas tratadas com 1 mg/ml de borohidreto de sódio). Como é possível observar no Gráfico 1, houve diminuição da atividade enzimática média em todas as concentrações testadas na redução dos imobilizados com borihidreto de sódio, quando comparadas com as membranas sem redução, diretamente proporcional a concentração do NaBH 4, indicando que este pode causar danos aestrutura da enzima tirosinase (clivagem nas pontes de dissulfeto e ligações de peptídeos, por exemplo), ainda que na menor concentração testada. Na literatura estão descritos alguns trabalhos em que o borohidreto de sódio foi utilizado conferindo estabilidade ao imobilizado mas sempre com alguma perda na atividade da enzima, que em geral, varia de acordo com a natureza da mesma e das condições de redução. No trabalho de CHUANG, (2005), a enzima tirosinase comercial, foi imobilizada em esferas de quitosana e tratadas com 25 mg/ml de NaBH 4 em ph 7, sob agitação, durante 1h. A retenção da atividade após a imobilização foi de aproximadamente 12,3% para a imobilização com a redução e de 12,9 % sem redução com NaBH 4. Nesse caso houve baixa perda de atividade e aumento na estabilidade operacional e térmica. No trabalho de MIELENZ, ( 2009), todas as concentrações de NaBH 4, utilizadas para a estabilização da lipase em ph 10, promoveram descrécismo da atividade catalítica além de promover também o decréscimo da estabilidade térmica e não influir na estabilidade de armazenamento e operacional. 4. CONCLUSÕES O borohidreto de sódio não foi considerado um redutor adequado para o sistema de imobilização descrito dentro das condições testadas. Além de causar danos ao sítio ativo da tirosina do extrato de Agaricus bisporus, ocasionando queda drástica na atividade recuperada da enzima imobilizada, não promoveu aumento da estabilidade operacional. 5. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem ao CNPq pelo financiamento deste trabalho e pelas bolsas concedidas. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CAMPOS, C. F. et al. Chemical composition, enzyme activity and effect of enzyme inactivation on flavor quality of green coconut water. Journal of Food Processing and Preservation, v. 20, n. 6, p , dez CHUANG, G. Immobilization of Tyrosinase on Chitosan - An Optimal Approach to Enhance the Productivity of L -DOPA from L -Tyrosine. p , 2005.

6 COSNIER, S. Electrochemical Biosensors. [s.l.] CRC Press, HERMANSON, G. T. Bioconjugate Techniques. [s.l.] Academic Press, KAMEDA, E.; LANGONE, M. A. P.; COELHO, M. A. Z. Tyrosinase extract from Agaricus bisporus mushroom and its in natura tissue for specific phenol removal. Environmental technology, v. 27, n. 11, p , nov MIELENZ, J. R.; ADNEY, W. S.; MCMILLAN, J. D. Biotechnology for Fuels and Chemicals: The Twenty-Eighth Symposium. [s.l.] Springer Science & Business Media, SCOPES, R. K. Protein Purification: Principles and Practice. [s.l.] Springer, TWEEL, W. J. J. VAN DEN; HARDER, A.; BUITELAAR, R. M. Stability and Stabilization of Enzymes: Proceedings of an International Symposium Held in Maastricht, The Netherlands, November [s.l.] Elsevier, 2013.