UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

Transcrição

1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS CLÁUDIO AFONSO PINHO LOPES UTILIZAÇÃO DA BIOTÉCNICA DE MANIPULAÇÃO DE OÓCITOS INCLUSOS EM FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS PARA A AVALIAÇÃO IN VITRO DO POTENCIAL DE ANTICORPOS ANTI-ZONA PELÚCIDA PARA A IMUNOESTERILIZAÇÃO DE CADELAS FORTALEZA-CE 2008

2 CLÁUDIO AFONSO PINHO LOPES UTILIZAÇÃO DA BIOTÉCNICA DE MANIPULAÇÃO DE OÓCITOS INCLUSOS EM FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS PARA A AVALIAÇÃO IN VITRO DO POTENCIAL DE ANTICORPOS ANTI-ZONA PELÚCIDA PARA A IMUNOESTERILIZAÇÃO DE CADELAS Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de carnívoros, onívoros, herbívoros e aves. Orientador: Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo FORTALEZA-CE 2008

3 CLÁUDIO AFONSO PINHO LOPES UTILIZAÇÃO DA BIOTÉCNICA DE MANIPULAÇÃO DE OÓCITOS INCLUSOS EM FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS PARA A AVALIAÇÃO IN VITRO DO POTENCIAL DE ANTICORPOS ANTI-ZONA PELÚCIDA PARA A IMUNOESTERILIZAÇÃO DE CADELAS Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Ciências Veterinárias. Aprovada em: _22_/_12_/_2008_ Conceito: Satisfatório Com Louvor Nota: 10 (Dez) Banca Examinadora Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo Orientador UECE Profa. Dra. Maria Denise Lopes Examinadora-UNESP Profa. Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva Examinadora-UECE Prof. Dr. Claudio Cabral Campello Examinador-UECE Prof. Dr. José Roberto Viana Silva Examinador-UFC

4 Aos animais DEDICO

5 AGRADECIMENTOS Agradeço à Universidade Estadual do Ceará (UECE) por toda a formação profissional de qualidade proporcionada nos últimos doze anos, que culmina neste momento com a conclusão do curso de doutorado em Ciências Veterinárias. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela bolsa de estudos para a realização do curso de doutorado, que foi muito importante para o êxito deste trabalho. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa para a realização de treinamento e estudos no exterior, que possibilitaram um importante aprimoramento desta tese, além do incremento de minha qualificação e experiência profissionais. À Universidade de Brasília (UnB, Instituto de Biologia, Laboratório de Microscopia Eletrônica) e ao Leibniz Institute for Zoo and Wildlife Research (IZW, Berlim, Alemanha), pela oportunidade de treinamento e de realização de estudos. Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV) pelos ensinamentos e apoio prestados. Aos funcionários do PPGCV, e, em especial, às secretárias Adriana Albuquerque e Cristina Sabóia do Nascimento, por toda assistência sempre provida com atenção e cordialidade. Agradeço a Deus pelo amor, força e orientação para prosseguir durante esta jornada que se encerra e naquelas que estão por vir. Aos meus amados pais Francisco Heine Maia Lopes e Suely Pinho Lopes por todo o amor e dedicação sempre fundamentais. À minha amada irmã Cláudia Valéria Pinho Lopes pelo amor, amizade, orientação e alegria. Ao meu querido orientador e amigo Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo por todos os ensinamentos, pela confiança, pela atenção, pela compreensão, pelo apoio incondicional, pela amizade, pelo exemplo de pesquisador competente e pessoa íntegra. Aos Professores Dra. Sônia Nair Báo, Dra. Katarina Jewgenow e Dr. Claudio Cabral Campello, pelos valiosos ensinamentos, pela confiança, pelo apoio e pela amizade. Aos Professores Dra. Maria Denise Lopes, Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva e Dr. José Roberto Viana Silva, por terem gentilmente aceito o convite para aprimorar com sua competência este trabalho.

6 Aos companheiros do Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Préantrais (LAMOFOPA) da UECE pela colaboração e pela amizade, e, em especial, a Juliana Jalles de Holanda Celestino, Dra. Maria Helena Tavares de Matos, Márcia Viviane Alves Saraiva, Ana Kelen Felipe Lima, Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues, Anelise Maria Costa Vasconcelos Alves, Mônica Aline Parente Melo, Fabrício de Sousa Martins, Guilherme Ferreira de Sousa Meneses, Karla Daniely dos Santos Bastos, José Erisvaldo Maia Júnior, Isabel Bezerra Lima-Verde, Dra. Liliam Mara Trevisan Tavares e Jamily Bezerra Bruno. Aos companheiros do Laboratório de Microscopia Eletrônica da UnB, Victor Hugo da Silva Tibúrcio, Bruno Fiorillo, Bruno Arrivabene Cordeiro, Shélida Braz Vasconcelos, Carolina Aquino Luque, Leonora Tavares Bastos, João Victor, Larissa Cunha, Suzi, Elaine Porfírio, Débora, Khesller Name e Wellington. Aos companheiros do IZW, Romy Waurich, Maxi Pöschmann, Birgit Bieber, Karin Müller, Christiane Franz, Sigrid Holz, Jennifer Ringleb, Mirja Faβbender, Ulrike Jakop, Sebastian Waldau, Antje Frank, Katrin Paschmionka, Marlies Rohleder, Beate Braun, Yuyu Niu, Yvonne Meyer-Lucht, Aines Castro-Prieto, Rafael Prieto, Fabiano Fernandes, Francisca Robles, Jan Axtner, Nina Schwensow, Jennifer Schön, Alexandra Weyrich, Roland Frey, Simone Sommer, Joseph Saragusty, Heribert Hofer, Silke Ehle, Beate Peters-Mergner, Wolfgang Richter, Steven Seet, Arne Ludwig, Wolfgang Tauche e Steffen Berthold. A todos que não foram aqui mencionados, mas que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho.

7 RESUMO O objetivo deste estudo foi avaliar o potencial de anticorpos anti-zona pelúcida para a imunoesterilização de cães, através da análise da capacidade de antisoro produzido por imunização de coelhos com zona pelúcida porcina (pzp) de promover a atresia de folículos pré-antrais (FOPA). Para este propósito, utilizou-se a biotécnica de manipulação de oócitos inclusos em folículos pré-antrais para se estabelecer um modelo experimental in vitro, compreendendo métodos de preservação e cultivo in vitro de FOPA caninos. Na Fase I, avaliaram-se os efeitos da temperatura (4, 20 ou 38 C), meio (salina fisiológica ou Meio Essencial Mínimo MEM) e tempo (2, 6, 12 ou 24 h) de armazenamento sobre a morfologia e viabilidade folicular. As técnicas de histologia clássica e microscopia eletrônica de transmissão, e a análise de viabilidade utilizando-se Azul de Tripan e marcadores fluorescentes (calceína-am e etídio homodímero-1) foram utilizadas para essa finalidade. O uso de MEM a 4ºC apresentou-se como o método mais eficiente, possibilitando a preservação de percentuais de folículos viáveis com ultraestrutura íntegra similares ao controle fresco por até 12 h. Na Fase II, avaliou-se a eficiência dos crioprotetores dimetil sulfóxido, etileno glicol, glicerol e 1,3-propanodiol para a criopreservação de FOPA caninos através de congelação lenta. Observou-se que o dimetil sulfóxido (DMSO) na concentração de 1,5 M possibilitou a preservação dos maiores percentuais de FOPA viáveis e com ultra-estrutura intacta após a descongelação. Na fase III, avaliou-se o efeito de soro anti-pzp sobre a viabilidade de FOPA caninos cultivados in vitro durante 24 h, e também sobre a ligação de espermatozóides caninos a óocitos homólogos. Utilizaram-se FOPA frescos ou criopreservados com 1,5 M DMSO, que apresentaram resultados similares. Observou-se que a adição de 10% de soro anti-pzp ao meio de cultivo não teve efeito sobre folículos com diâmetro inferior a 100 µm em relação aos controles (ausência de soro ou adição de 10% de soro pré-imune). Entretanto, o soro anti-pzp causou a atresia de FOPA com diâmetros superiores a 100 µm, conforme avaliado com calceína-am e etídio homodímero-1. Este soro a 10% mostrou-se capaz também de inibir a ligação de espermatozóides à zona pelúcida canina. Desta forma, demonstrou-se in vitro o potencial do soro anti-pzp para a imunoesterilização (através da eliminação de FOPA) e para a imunocontracepção (através do bloqueio da ligação de espermatozóides aos oócitos) de cães. Palavras-chave: Imunocontracepção. Zona pelúcida. Folículos pré-antrais. Cães.

8 ABSTRACT The aim of this study was do evaluate the potential of anti-zona pellucida antibodies for immunosterilization in dogs, through analyzing the capability of anti-porcine zona pellucida (pzp) antibodies to cause atresia of preantral follicles (PF). For this purpose, the biotechnique of manipulation of oocytes enclosed in preantral follicles was employed to establish an in vitro experimental model, comprising preservation and in vitro culture methods for canine PF. In Phase I, the effects of storage temperature (4, 20 ou 38 C), medium (saline solution or Minimum Essential Medium MEM) and time (2, 6, 12 ou 24 h) on follicular morphology and viability were evaluated. Classical Histology and transmission electron microscopy, and viability analysis using Trypan Blue and fluorescent labels (calcein-am and ethidium homodimer-1) were used. Storage in MEM at 4ºC was the most efficient method, which enabled preservation of the percentages of viable follicles with intact ultrastructure similar to the fresh control for up to 12 h. In Phase II, the efficiency of the cryoprotectants dimethyl sulfoxide, ethylene glycol, glycerol and 1,2-propanediol for the cryopreservation of canine PF through slow freezing was assessed. It was observed that dimethyl sulfoxide (DMSO) at 1.5 M provided the preservation of the highest percentages of viable PF with intact ultrastructure after thawing. In phase III, the effects of anti-pzp serum on viability of canine PF cultured in vitro for 24 h, and also on canine sperm binding to homologous oocytes was evaluated. Fresh PF as well as PF cryopreserved in 1.5 M DMSO were used and results between then were similar. Supplementation of culture medium with 10% anti-pzp serum had no effect on follicles smaller than 100 µm as compared to controls (absence of serum or supplementation with pre-immune serum). However, antipzp serum led PF with diameter larger than 100 µm to degenerate, as detected using calcein-am and ethidium homodimer-1. Anti-pZP serum also blocked sperm binding to canine ZP. In conclusion, it was demonstrated in vitro the potential of anti-pzp serum for immunosterilization (through induction of atresia to PF) and for immunocontraception (through sperm binding blocking) in dogs. Keywords: Immunocontraception. Zona pellucida. Preantral follicles. Dogs.

9 LISTA DE FIGURAS Capítulo I Figura 1. Esquema representativo do processo reprodutivo. 43 Capítulo II Figura 1. Design of experiment I. 63 Figura 2. Histological features of stored canine ovarian fragments. 67 Figura 3. Effects of medium, temperature and time of storage on the percentages of morphologically normal canine preantral follicles. 68 Figura 4. Electron micrographs of normal follicles from control group and stored in MEM at 4 C for 12 h. 70 Figura 5. Ultrastructure of follicles stored in MEM at 4 C for 24 h. 71 Figura 6. Electron micrographs of follicles stored in saline solution at 4 C for 24 h. 72 Figura 7. Viability assessment of canine preantral follicles using trypan blue dye exclusion test. 73 Figura 8. Viability assessment of canine preantral follicles using fluorescent probes. 76 Figura 9. Percentages of viable canine preantral follicles in fresh ovaries and after storage in MEM at 4ºC for 12 h or 24 h as assessed by trypan blue dye exclusion test and labeling with calcein-am and ethidium homodimer. 77 Capítulo III Figura 1. Figura 2. Percentages of morphologically normal preantral follicles in ovarian tissue before (control) and after exposure and freezingthawing tests in medium containing 1.5 M EG or GLY. 90 Electron micrographs of canine preantral follicles from control and frozen-thawed using 1.5 M EG or GLY. 93

10 Capítulo IV Figura 1. Figura 2. Figura 3. Figura 4. Figura 5. Histological features of canine ovarian fragments before and after freezing-thawing with 1.5 M DMSO or PROH. 108 Percentages of morphologically normal preantral follicles in ovarian tissue before (fresh control) and after exposure and freezing-thawing tests in medium containing 1.5 M DMSO or PROH or without cryoprotectants (exposure and freezing controls). 109 Electron micrographs of canine preantral follicles from control and frozen-thawed using 1.5 M DMSO or PROH. 111 Viability assessment of canine preantral follicles using fluorescent probes. 113 Percentages of viable canine preantral follicles in fresh ovaries and after exposure and freezing-thawing using 1.5 M DMSO as assessed by trypan blue dye exclusion test and labeling with calcein-am and ethidium homodimer. 114 Capítulo V Figura 1. Figura 2. Figura 3. Figura 4. Percentages of viable canine preantral follicles before (fresh control time 0 h) and after in vitro culture for 24 h with in medium containing no serum or 10% pre-immune serum (control) or anti-pzp. 128 Viability evaluation of canine preantral follicles using fluorescent probes. 129 Assessment of anti-pzp antibodies ability to inhibit canine oocyte-sperm interaction. 130 Assessment of the contraceptive efficiency of anti-porcine zona pellucida (pzp) antibodies in dogs using an in vitro test for canine sperm binding to homologous ZP. 131

11 LISTA DE TABELAS Capítulo II Tabela 1. Percentages (viable/total) of viable canine preantral follicles in control and after storage. 74 Capítulo III Tabela 1. Degenerated preantral follicles (%) in control and after exposure and freezing-thawing tests. 91 Capítulo IV Tabela 1. Percentages of viable follicles in the fresh control and after exposure to cryoprotectants and slow freezing-thawing as assessed using trypan blue. 112

12 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS A Antro ANOVA Analysis of variance (Análise de variância) ATP Adenosina trifosfato bm basement membrane (membrana basal) BrdU Bromo-deoxiuridina BSA Bovine serum albumin (Albumina sérica bovina) CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CCZ Centro de Controle de Zoonoses CG Células da granulosa CGP Células germinativas primordiais CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CT Células da teca DMSO Dimetilsulfóxido DNA Deoxyribonucleic acid (Ácido desoxirribonucléico) EG Etilenoglicol er endoplasmic reticulum (retículo endoplasmático) FOPA Folículo ovariano pré-antral FSH Follicle stimulating hormone (Hormônio folículo estimulante) GC Granulosa cells (Células da granulosa) GLY Glycerol (glicerol) GnRH Gonadotrophin releasing hormone (Hormônio liberador de gonadotrofinas) h Horas HC Histologia clássica HE Hematoxilina-eosina ICC Instituto Central de Ciências IVM in vitro maturation (maturação in vitro) IZW Institut for Zoo and Wildlife Reseach l Lipid droplet (gota lipídica) L Litro LAMOFOPA Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Ovarianos Pré- Antrais

13 LFCR Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução M Molar MEM Meio essencial mínimo ml Mililitro mm Milimolar MNPF Morphologically normal preantral follicles (Folículos pré-antrais morfologicamente normais) MOIFOPA Manipulação de oócitos inclusos em folículos pré-antrais mrna Ácido ribonucléico mensageiro n número de amostras NUBIS Núcleo de Biotecnologia de Sobral PAS Periodic Acid Schiff (Ácido periódico de Schiff) PBS Phosphate-buffered saline (Salina tamponada com fosfato) PROH 1,2-Propanediol (1,2-Propanodiol) pzp Zona pelúcida porcina OMS Organização Mundial da Saúde RT Room temperature (temperatura ambiente) sc stromal cells (células do estroma) SEM Standard error of the mean (Erro padrão da média) SNK Student-Newman-Keuls TB Trypan Blue (Azul de Tripan) TEM Transmission Electron Microscopy (Microscopia Eletrônica de Transmissão) UECE Universidade Estadual do Ceará UFC Universidade Federal do Ceará UnB Universidade de Brasília v Vesicles (vesículas) ZP Zona pellucida (Zona pelúcida) μg Micrograma μl Microlitro μm Micrômetro μm Micromolar ºC Graus Celsius

14 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA 2.1 A superpopulação de cães Contracepção para cadelas Imunocontracepção Ovário mamífero Oogênese e foliculogênese População folicular ovariana A biotécnica de MOIFOPA Preservação de FOPA durante o transporte de ovários Criopreservação Cultivo in vitro de folículos ovarianos JUSTIFICATIVA HIPÓTESES CIENTÍFICAS OBJETIVOS CAPÍTULO I 39 Imunocontracepção em mamíferos com ênfase no controle populacional de cães 7. CAPÍTULO II 58 Preservação de folículos pré-antrais caninos por períodos curtos: efeitos da temperatura, meio e tempo 8. CAPÍTULO III 83 Criopreservação de folículos pré-antrais caninos utilizando-se etilenoglicol e glicerol 9. CAPÍTULO IV 99 Criopreservação bem-sucedida de folículos pré-antrais caninos utilizando-se dimetil sulfóxido e 1,3-propanodiol

15 10. CAPÍTULO V 121 Potencial de anticorpos anti-zona pelúcida para a imunoesterilização de cães: efeitos sobre folículos pré-antrais in vitro 11. CONCLUSÕES PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 140

16 16 1 INTRODUÇÃO A superpopulação de cães constitui um grave problema em diversas cidades do mundo, caracterizado pela existência de grandes conjuntos de animais sem responsáveis, que podem compor um importante reservatório de zoonoses. Neste contexto, as autoridades sanitárias realizam a eliminação sistemática destes animais como estratégia de controle populacional. Todos os anos, esta situação resulta na eutanásia de milhões de animais sadios, além do dispêndio de um elevado volume de recursos econômicos estimados na ordem de bilhões de dólares (Frank e Carlisle-Frank, 2007). Esta abordagem, no entanto, é estritamente paliativa, por não atuar sobre a origem do problema, que consiste em elevadas taxas de natalidade dos cães. Além disso, a eliminação dos animais sem responsáveis, associada à sua má qualidade de vida, faz emergirem questões éticas de bem-estar animal, que definem a necessidade de novas estratégias de ação. Assim, um sistema de controle populacional para cães, para ser efetivo, racional e humanitário, deve basear-se no controle de natalidade. Apesar dos esforços despendidos nos últimos anos para o desenvolvimento de métodos farmacológicos e químicos para a esterilização cães, as técnicas cirúrgicas têm se mantido como os principais procedimentos para este propósito (Howe, 2006). Entretanto, estes métodos demandam muito tempo e possuem alto custo financeiro para aplicação em escala populacional (Kutzler e Wood, 2006), sendo assim logística e economicamente inviáveis para uso em populações caninas numerosas, como no caso das metrópoles. Uma nova abordagem para o desenvolvimento de métodos contraceptivos, denominada imunocontracepção, surge como uma importante perspectiva para o controle reprodutivo canino em larga escala. Esta modalidade contraceptiva tem como princípio induzir o sistema imunológico à síntese de anticorpos específicos para moléculas bioativas do aparelho reprodutor que, uma vez revestidas por tais anticorpos, têm sua função cessada, interrompendo-se assim o processo reprodutivo. Em determinadas situações, pode ocorrer a eliminação da população de células germinativas e conseqüente esterilidade, denominando-se este processo imunoesterilização. Estudos têm demonstrado que a vacinação com proteínas da zona pelúcida (ZP), estrutura que circunda os óocitos, resulta em infertilidade prolongada em diversas espécies de mamíferos. Sugere-se que este efeito decorre do bloqueio da ZP à ligação de

17 17 espermatozóides pelos anticorpos produzidos. A resposta imunológica aos antígenos da ZP pode ainda causar a eliminação dos oócitos (Ringleb et al., 2004). Nesta tese, foi avaliado o potencial de anticorpos anti-zp para a imunoesterilização de cadelas, através da análise da capacidade de um antisoro produzido por imunização de coelhos com ZP porcina (pzp) para promover a atresia de folículos pré-antrais caninos. Para este propósito, a biotécnica de manipulação de oócitos inclusos em folículos pré-antrais (MOIFOPA) foi utilizada para se estabelecer um modelo experimental in vitro. Uma vez que os trabalhos relacionados ao uso desta técnica em cães são bastante escassos e limitados à avaliação de métodos de maturação, avaliaram-se neste estudo protocolos de preservação de folículos pré-antrais caninos durante o período compreendido entre a coleta dos ovários e o uso no laboratório, além da criopreservação utilizando-se diferentes crioprotetores para o armazenamento de folículos a longo prazo. Por último, os folículos preservados pelos métodos estabelecidos neste trabalho foram cultivados in vitro para a avaliação dos efeitos dos anticorpos anti-zp. Para uma melhor compreensão dos estudos realizados nesta tese, segue-se uma revisão de literatura abordando diversos temas relacionados à superpopulação de cães, à imunocontracepção e à biotécnica de MOIFOPA.

18 18 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 A superpopulação de cães A domesticação do cão ocorreu, segundo estudos arqueológicos, na Eurásia, há cerca de anos. Canídeos selvagens passaram a adentrar a área dos acampamentos humanos, para se alimentarem com sobras de comida, o que fez com que estabelecessem, paulatinamente, um convívio harmonioso com o homem. Em contrapartida, esses animais passaram a auxiliar na defesa dessas comunidades e na caça. Este vínculo de lealdade fora rompido unilateralmente pelo homem quando, tendo adotado o padrão urbano de assentamento, passou a permitir a reprodução deliberada de seus cães, não assumindo a responsabilidade pela vida dos animais das numerosas ninhadas, que são abandonados nas ruas (World Society for the Protection of the Animals, 1999) Dinâmica da população de cães O conjunto de cães sem responsáveis que vivem nos espaços públicos constitui um importante reservatório de zoonoses, o que leva as autoridades de saúde a realizarem a eliminação sistemática destes animais. Entretanto, de acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), não existe nenhuma prova de que a eliminação de cães possa gerar um impacto significativo sobre as densidades populacionais desses animais (World Health Organization, 1992). Assim, os sistemas de controle populacional de cães baseados em apreensão sistemática e eutanásia em grande escala têm sido adotados em várias partes do mundo erroneamente, em função do desconhecimento sobre a composição e a dinâmica da população canina (World Health Organization, 1990). Qualquer redução no tamanho da população canina, resultante do aumento da taxa de mortalidade, é rapidamente compensada pelo aumento da taxa de sobrevivência das frações remanescentes, que terão melhor acesso aos recursos ambientais disponíveis (Wandeler et al., 1988). Além disso, a taxa de reposição de animais sobrepõe facilmente a taxa de eliminação, sendo que, em relação a esta, a mais elevada registrada até hoje é de aproximadamente 15% da população canina (World Health Organization, 1992). As populações de cães errantes são mantidas a partir dos filhotes em excesso dos animais domiciliados (que possuem elevadas taxas de sobrevivência, por receberem abrigo e alimento antes de serem abandonados às ruas), e não pelas proles dos próprios

19 19 animais errantes, que apresentam taxas de sobrevivência muito reduzidas (Wandeler et al., 1988). Desta forma, um sistema de controle populacional de cães, para ser efetivo, deve basear-se na contenção da natalidade, através de programas de controle reprodutivo. Modelos matemáticos de dinâmica populacional demonstram que, para espécies que se reproduzem através de sistemas poligâmicos de acasalamento, como a canina e a felina, o controle da reprodução de 65% das fêmeas pode permitir a estabilização de uma determinada população. Por outro lado, a contracepção direcionada aos machos deve abranger mais de 95% desses animais para que se obtenha o mesmo efeito, o que é inviável em termos práticos (Jewgenow et al., 2006). Neste contexto, sistemas de manejo demográfico para cães devem ter como foco o controle reprodutivo das fêmeas. 2.2 Contracepção para cadelas Os métodos contraceptivos atualmente disponíveis para o controle reprodutivo canino não são adequados para utilização em escala populacional por razões econômicas, operacionais, culturais e/ou de segurança. O confinamento de cadelas durante o estro é considerado um método bastante satisfatório, por sua simplicidade e por não envolver custo algum. Contudo, em várias localidades, sua aplicação é dificultada por questões culturais, não se podendo contar com a cooperação efetiva das comunidades, sobretudo as de baixa renda (World Health Organization, 1992). Durante a execução de um programa de controle populacional de cães e gatos realizado em vilas rurais do noroeste do Estado do Paraná, observou-se a existência de um contigente substancial de pessoas que demonstraram pouca preocupação com o controle reprodutivo de seus animais. Cerca de um terço dos proprietários de animais de companhia dessas localidades não aderiu ao projeto, o que sugere que a consciência acerca da importância da posse responsável depende do nível educacional da comunidade (Molento et al., 2005). O controle reprodutivo de cadelas pode ser realizado também através de métodos farmacológicos. O uso de progestágenos, dentre os quais se destacam o megestrol, a medroxiprogesterona e a proligestona, é o recurso mais utilizado. Estes compostos consistem em esteróides sintéticos, que atuam através de retroalimentação negativa sobre a secreção do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) e controle da liberação das gonadotrofinas pela hipófise, com supressão da esteroidogênese e da

20 20 gametogênese (Rodrigues e Rodrigues, 2005). Diversos efeitos adversos têm sido associados à utilização prolongada de progestágenos. A ocorrência de neoplasias mamárias, alterações clínico-patológicas características de diabetes mellitus e letargia foi reportada em cadelas após o uso de megestrol. Por sua vez, uma elevada incidência de hiperplasia endometrial cística e supressão adrenocortical têm sido relatada em conseqüência do tratamento com medroxiprogesterona (Kutzler e Wood, 2006). Selman et al. (1995) descreveram alterações histopatológicas em diversos órgãos de cadelas tratadas com proligestona, sendo notáveis a atrofia do córtex da glândula adrenal, tumores mamários e vacuolização das células das ilhotas de Langerhans. Além disso, Selman et al. (1996) demonstraram a afinidade da proligestona com receptores de glicocorticóides, o que pode resultar em supressão do eixo hipotalâmico-hiposifárioadrenocortical e resistência à insulina. A esterilização cirúrgica de cadelas, comumente realizada através de ovariohisterectomia, possui um custo financeiro elevado e demanda muito tempo, sendo assim inadequada em termos operacionais para a aplicação em populações caninas muito numerosas (Kutzler e Wood, 2006). Ademais, complicações pós-operatórias como hemorragia, piometra e/ou granuloma do coto, fistulações, adesões peritoniais e incontinência urinária têm sido relatadas, embora sejam facilmente prevenidas por uma técnica cirúrgica realizada com rigor (Howe, 2006). Apesar de seu limitado potencial para a redução das taxas de natalidade caninas, este método ainda se constitui na melhor alternativa para o controle da reprodução de cães. Neste contexto, faz-se urgente o desenvolvimento de agentes esterilizantes inócuos injetáveis, para que seja possível o controle reprodutivo de cães de modo efetivo (World Health Organization, 1992). 2.3 Imunocontracepção A imunocontracepção consiste em induzir o sistema imunológico a neutralizar elementos de importância estrutural e funcional envolvidos na reprodução. Antígenos presentes na superfície dos espermatozóides, as proteínas da ZP, as gonadotrofinas (FSH e LH), seus receptores específicos e seu hormônio liberador (GnRH) têm sido utilizados como alvos para a elaboração de vacinas contraceptivas para carnívoros. Atualmente, os melhores resultados têm sido obtidos através de imunização com ZP,

21 21 que tem se mostrado capaz de promover contracepção por longos períodos em diversas espécies (Jewgenow et al., 2006). A ZP consiste em uma matriz glicoprotéica extracelular que circunda os oócitos de mamíferos e desempenha funções fundamentais no processo de fecundação através da regulação da ligação de espermatozóides, indução da reação acrossômica e do bloqueio à polispermia (Wassarman, 2008). Ao microscópio eletrônico, a ZP é vista como uma rede entrelaçada com fenestrações, apresentando uma camada interna compacta com pequenos poros, e uma camada externa frouxamente arranjada com grandes poros (Greve e Wassarman, 1989). A vacinação ativa com proteínas da ZP suprime a fertilidade em diversas espécies por interferência na interação oócito-espermatozóides durante a fecundação, além de afetar a população de folículos ovarianos em crescimento (Ringleb et al., 2004). Diversos estudos têm demonstrado a ocorrência de alterações patológicas em folículos após a vacinação com antígenos da ZP, sendo encontradas evidências que indicam o envolvimento da resposta imunológica celular nesses processos (Millar et al., 1989; Rhim et al.,1992; Lou and Tung, 1993; Jackson et al., 1998; Lou et al. 2000). Millar et al. (1989), utilizando um anticorpo monoclonal para a ZP3 murina (mzp3) com reconhecida capacidade de bloquear a fecundação, identificou uma seqüência de sete aminoácidos na referida proteína, que consistiria de um epítopo para linfócitos B, e o testou como antígeno imunocontraceptivo. Um peptídeo de 16 aminoácidos incorporando a referida seqüência foi sintetizado e utilizado para imunizar ativamente fêmeas de camundongo. Os anticorpos produzidos determinaram contracepção duradoura na ausência de histopatologia do ovário e citotoxicidade celular. Estes autores sugeriram que tais resultados deviam-se à ausência de epítopos para linfócitos T na referida seqüência. A redução do número de folículos primordiais após imunização ativa contra uma das glicoproteínas zonárias (ZP3) é uma consequência comum (Aitken, 2002). Apesar dos diversos indícios de mecanismos imunológicos celulares para a patogênese das alterações de folículos ovarianos, em nenhum dos estudos em que foi verificada depleção de folículos primordiais, observou-se a infiltração de linfócitos T (Kerr et al., 1998). Uma explicação para esse fenômeno consiste no recrutamento acelerado de tais folículos para compor a população de folículos em crescimento que é eliminada devido à ação de anticorpos anti-zp (Skinner et al., 1984). Alternativamente, sugere-se que uma proporção significativa de folículos primordiais expressa a proteína ZP3, sendo

22 22 destruídos por anticorpos anti-zp por fixação de complemento (Grootenhuis et al., 1996). Gwatkin et al. (1977) localizaram anticorpos e complemento na ZP de oócitos de camundongo inférteis imunizados com ZP de hamster. Outro possível mecanismo pode consistir da interrupção da comunicação entre oócitos e células da granulosa via junções do tipo gap obstruídas por grandes quantidades de anticorpos anti-zp aderidos ( Mahi- Brown et al., 1988). Barber et al. (2001) demonstraram através de imunohistoquímica ultra-estrutural que anticorpos anti-zp são capazes de se ligar a proteínas zonárias presentes no aparelho de golgi de oócitos caninos em folículos pré-antrais. Além disso, a expressão da proteína codificada pelo gene ZPA foi detectada no citoplasma de oócitos caninos inclusos em folículos primordiais, enquanto em folículos primários e secundários foi observada a transcrição de mrna a partir dos genes ZPA, ZPB e ZPC (Blackmore et al., 2004). Um padrão semelhante de expressão de proteínas da ZP foi descrito por Jewgenow e Fickel (1999) em felinos. Assim, nestas duas espécies de carnívoros, os mecanismos descritos acima para eliminação de folículos primordiais podem se processar, estabelecendo-se assim o potencial de anticorpos anti-zp para a imunoesterilização desses animais. Na maioria dos estudos sobre imunocontracepção baseada na ZP, as glicoproteínas da pzp têm sido utilizadas devido à sua alta disponibilidade em matadouros e ao elevado grau de homologia com as proteínas da ZP de diversas espécies mamíferas, o que garante a reatividade cruzada dos anticorpos produzidas com a ZP nativa (Niu et al., 2006). Até o presente, o estudo da ação de anticorpos anti-zp sobre oócitos tem sido realizado utilizando-se apenas modelos experimentais in vivo. Entretanto, o uso de um sistema de cultivo in vitro de folículos ovarianos pode proporcionar uma análise mais precisa do processo de eliminação dos referidos gametas. Neste contexto, a biotécnica MOIFOPA pode prover os métodos necessários ao desenvolvimento de um modelo experimental in vitro para este propósito. No capítulo I, constituído por um artigo de revisão de literatura sobre métodos imunocontraceptivos, mais informações detalhadas acerca desta estratégia de contracepção podem ser obtidas.

23 Ovário mamífero O ovário mamífero é composto por muitos tipos de células diferenciadas, que trabalham em conjunto promovendo um ambiente ideal para o desempenho de suas funções endócrinas e gametogênica (Bristol-Gould e Woodruff, 2006). O ovário é constituído por duas regiões: cortical e medular. O córtex ovariano, localizado na parte mais externa, é circundado pelo epitélio germinal e corresponde à região funcional do órgão, sendo formado por tecido conectivo (fibroblastos, colágeno e fibras reticulares), folículos ovarianos e corpos lúteos em vários estádios de desenvolvimento ou em regressão (Liu et al., 2006). A região medular, localizada mais internamente, é constituída por tecido conjuntivo, células musculares lisas, nervos, vasos sanguíneos e linfáticos responsáveis pela nutrição e estruturação do ovário (Hafez, 1996). 2.5 Oogênese e foliculogênese A oogênese consiste na formação e diferenciação do gameta feminino que se desenvolve em várias fases e tem início na vida fetal com as células germinativas primordiais (CGP) e culmina com a formação do oócito haplóide fecundado (Bristol- Gould e Woodruff, 2006). Em mamíferos, nos estádios iniciais do desenvolvimento ovariano, ocorre a migração das células germinativas primordiais (CGP) do saco vitelínico para a gônada primitiva com sua posterior colonização (Eppig et al., 2004). Imediatamente após a diferenciação das gônadas, ocorre a transformação das CGP em oogônias mitoticamente ativas e, então, em oócitos primários (Suh et al., 2002). Em seguida, uma camada de células somáticas planas conhecidas como células da prégranulosa, originárias do epitélio celômico, circundam os oócitos primários formando os folículos primordiais (Magoffin, 2005), iniciando assim a foliculogênese. Após a formação dos folículos primordiais, as células da pré-granulosa param de se multiplicar e entram num período de quiescência. Os oócitos primários inclusos nesses folículos encontram-se na fase de prófase I da meiose. A progressão da divisão meiótica ocorre somente na puberdade, com a liberação do pico pré-ovulatório de FSH e LH, formação dos oócitos secundários e outra parada da meiose na fase de metáfase II (Gordon, 1994). A meiose será retomada novamente somente após a fecundação do oócito pelo espermatozóide, originando o oócito haplóide fecundado e marcando o fim da oogênese (Figueiredo et al., 2008).

24 24 Desta forma, aos processos de formação, crescimento e maturação folicular dáse o nome de foliculogênese, que é iniciado com a formação do folículo primordial culminando com o estádio de folículo pré-ovulatório (van den Hurk e Zhao, 2005). O folículo ovariano é considerado a unidade funcional do ovário mamífero, cuja principal função é proporcionar um ambiente ideal para o crescimento e maturação do oócito (Cortvrindt e Smitz, 2001). Durante a foliculogênese, a morfologia folicular é alterada, uma vez que o oócito cresce e as células circundantes se diferenciam (Bristol-Gould e Woodruff, 2006). De acordo com o grau de evolução, os folículos podem ser classificados em folículos pré-antrais (primordiais, em transição, primários e secundários) e antrais (terciários e pré-ovulatórios) (Silva et al., 2004). Vale ressaltar que os folículos pré-antrais (FOPA) representam 90% da população folicular e são responsáveis pela renovação contínua de folículos antrais no ovário (Katska- Ksiazkiewicz, 2006). 2.6 População folicular ovariana Em muitos mamíferos, a população folicular ovariana é estabelecida ainda na vida intra-uterina (primatas e ruminantes Knight e Glister, 2006) ou em um curto período de tempo após o nascimento (roedores Ojeda et al., 2000). Por outro lado, recentes trabalhos têm demonstrado mecanismos envolvidos na formação de novas células germinativas e folículos em mulheres (Bukovsky et al., 2004) e camundongas adultas (Johnson et al., 2004). Esses autores demonstraram indícios da continuidade da oogênese e foliculogênese no período pós-natal, pela atuação de células-tronco. Para Bukovsky et al. (2004), a renovação folicular pós-natal ocorre regularmente em mulheres, mas a origem das células-tronco para tal não seria a medula óssea, e sim células germinativas presentes na superfície do epitélio ovariano. No entanto, devido aos resultados controversos até o momento, mais trabalhos sobre esse assunto são necessários para esclarecer esse fenômeno. A população folicular difere entre as espécies, além de ser observada uma grande variação individual (Katska-Ksiazkiewicz, 2006), sendo de aproximadamente na camundonga (Shaw et al., 2000); na cabra (Lucci et al., 1999); na gata (Lima, 2006); na ovelha (Amorim et al., 2000); na vaca (Betteridge et al., 1989) e aproximadamente na mulher (Erickson, 1986). Ao longo da vida do animal, ocorre uma redução ordenada do número de FOPA (Shaw et

25 25 al., 2000). Essa redução deve-se a dois fenômenos que ocorrem naturalmente no ovário, a ovulação e a atresia ou morte folicular. Somente uma pequena parte (0,1%) dos folículos primordiais chega à ovulação (Nuttinck et al., 1993), enquanto os demais tornam-se atrésicos durante as fases de crescimento e maturação oocitária (Otala et al., 2002). 2.7 A biotécnica de MOIFOPA A disponibilidade de oócitos é um fator limitante no desenvolvimento de novas técnicas reprodutivas (Smitz e Cortvrindt, 2002). Os métodos atuais para a produção in vitro de embriões dependem de uma oferta escassa de oócitos competentes de grandes folículos antrais ou pré-ovulatórios, que estão presentes no ovário em número relativamente reduzido (Telfer, 1998). Sabe-se que os FOPA representam cerca de 90% de toda a população folicular, armazenando assim a grande maioria dos oócitos presentes em ovários mamíferos (Silva et al., 2003). Dessa forma, a possibilidade de desenvolver sistemas in vitro que explorem o grande número de oócitos provenientes de folículos imaturos de ovários mamíferos deve ser considerada, destacando-se portanto a biotécnica de MOIFOPA. A MOIFOPA é uma biotécnica da reprodução que vem sendo aprimorada nos últimos tempos e consiste em uma das principais ferramentas utilizadas atualmente para a elucidação da foliculogênese inicial. Tal biotécnica consiste no isolamento, conservação (resfriamento e criopreservação) e/ou cultivo in vitro de FOPA, visando a estocagem, ativação, crescimento e maturação in vitro do folículo primordial até o estádio pré-ovulatório (Figueiredo et al., 2008), prevenindo-se, assim, a ocorrência da atresia. Assim, no futuro, será possível obter, de um único ovário, milhares de FOPA que, cultivados e submetidos a outras biotécnicas da reprodução como a fecundação in vitro e a clonagem, viabilizarão a produção in vitro de um grande número de embriões. Destes, um número de crias saudáveis significativamente maior do que aquele obtido através da reprodução natural também poderá ser alcançado. Na medicina veterinária, o principal objetivo é aumentar a produtividade de animais de alto valor genético, ou mesmo a preservação de espécies ameaçadas de extinção. A biotécnica de MOIFOPA também representa uma excelente alternativa para incrementar e auxiliar no desenvolvimento de pesquisas relacionadas à indústria

26 26 farmacêutica (Figueiredo et al., 2008) e à imunoesterilização utilizando-se anticorpos anti-zp. 2.8 Preservação de FOPA durante o transporte de ovários A preservação da viabilidade e da capacidade de desenvolvimento dos FOPA durante o período compreendido entre a coleta dos ovários e seu uso no laboratório é um fator crítico em decorrência da condição de isquemia. Para que isto seja possível, mesmo após longos períodos de transporte, como ocorre nos casos em que os animais doadores se encontram em regiões bastante afastadas dos laboratórios de manipulação, alguns fatores essenciais para a sobrevivência das células devem ser levados em consideração, tais como o meio, a temperatura e o tempo de preservação (Santos et al., 2004). Diferentes meios têm sido utilizados para a preservação de FOPA, podendo ser citados: TCM 199 (Costa et al., 2005), solução salina 0,9% (Matos et al., 2004; Celestino et al., 2008), solução salina tamponada com fosfato (PBS) - (Santos et al., 2002), solução Braun-Collins (Carvalho et al., 2001), solução à base de água de coco (Lucci et al., 2004a) e Meio Essencial Mínimo (MEM) (Chaves et al., 2008). Métodos para armazenamento de ovários por curtos períodos já foram desenvolvidos para caprinos (Silva et al., 2000), ovinos (Andrade et al., 2002a,b; Matos et al., 2004) e bovinos (Lucci et al., 2004a; Celestino et al., 2007). Nesses estudos, as temperaturas de 4, 20 e 39 C foram testadas para a preservação de FOPA. Em geral, a temperatura mais eficiente é a de 4 C, permitindo a preservação da morfologia e capacidade de FOPA suínos de crescer in vitro após períodos de armazenamento de até 18 h, enquanto a 20 C, isto foi possível por apenas 6 h (Lucci et al., 2007). Em caprinos, apenas temperatura de 4ºC permitiu preservar, após 4 h de armazenamento, a qualidade de FOPA inclusos em fragmentos de córtex ovariano, que, após cultivo in vitro por sete dias, apresentaram percentuais de folículos morfologicamente normais similares ao controle fresco (Chaves et al., 2008). Durante o transporte dos ovários para o laboratório, a privação de oxigênio do tecido resulta em uma mudança do metabolismo aeróbico para anaeróbico, sendo o produto principal, o ácido láctico, acumulado dentro da célula causando redução do ph (Wongsrikeao et al., 2005). Com a intenção de se minimizarem os efeitos deletérios da isquemia, o estabelecimento de hipotermia provoca uma redução do metabolismo

27 27 celular e, assim, dos requerimentos de energia e nutrientes, aumentando a resistência de folículos durante a preservação in vitro (Silva et al., 2003). A preservação de FOPA por períodos indeterminados pode ser obtida, por sua vez, através da utilização de técnicas eficientes de criopreservação (Santos, 2005). 2.9 Criopreservação Princípios básicos A criopreservação consiste em um método de preservação de material biológico a baixas temperaturas, geralmente em nitrogênio líquido a 196 C, ou em sua fase de vapor a -150 C. Os únicos estados físicos existentes abaixo de aproximadamente -130 C são o cristalino e o vítreo e, em ambos, a viscosidade é muito elevada, a difusão é considerada insignificante (dependendo do tempo de armazenamento), a energia cinética molecular é muito baixa e reações metabólicas impulsionadas por energia térmica ocorrem muito lentamente ou são paralisadas completamente (Kartha, 1985). Portanto, à temperatura do nitrogênio líquido, a viabilidade durante o armazenamento pode ser estendida por longos períodos de tempo, com manutenção da estabilidade do material genético (Stushnoff e Seufferheld, 1995). Para a criopreservação, faz-se necessária a utilização de um ou mais componentes que confiram proteção às células durante a congelação, conhecidos como agentes crioprotetores (Mullen, 2007). A capacidade do material biológico de sobreviver ao processo de criopreservação depende de sua tolerância aos agentes crioprotetores, à desidratação, ao resfriamento e ao reaquecimento Agentes crioprotetores Os agentes crioprotetores são componentes utilizados durante a congelação para proteger as células contra os efeitos deletérios da desidratação, resfriamento e da redução extrema de temperatura. O modo de ação dos agentes crioprotetores na célula não é plenamente conhecido e isso se dá provavelmente devido aos inúmeros efeitos deles na célula. Em geral, esses agentes podem agir (i) penetrando nas células (crioprotetores intracelulares) e substituindo as moléculas de água, (ii) reduzindo o ponto de congelação, (iii) protegendo membranas celulares por meio da sua ligação às

28 28 cabeças dos grupos fosfolipídicos, (iv) aumentando a viscosidade do meio, e/ou (v) diminuindo a concentração de eletrólitos durante a criopreservação, e, assim, o risco de danos osmóticos. Contudo, agentes crioprotetores podem ser tóxicos, bem como podem facilitar a entrada de agentes tóxicos nas células (Mullen, 2007; Santos, 2007c). Os agentes crioprotetores podem ser alcoóis, açúcares, amidas e grandes polímeros, que atuam por diferentes mecanismos (Fuller, 2004; Acker, 2007), sendo classificados como intra ou extracelulares. Crioprotetores intracelulares ou penetrantes possuem baixo peso molecular e a capacidade de substituir a água intracelular. Como exemplos, podem ser citados o glicerol (GLI), etilenoglicol (EG), dimetilsulfóxido (DMSO) e propanodiol (PROH). Quando os crioprotetores são adicionados, a água intracelular (solvente) deixa a célula e os crioprotetores penetrantes (soluto) a penetram, interagindo com a membrana celular, estabilizando as proteínas intracelulares e reduzindo o ponto de congelação. Estudos recentes demonstraram que o GLI, DMSO, PROH e EG nas concentrações de 1,5 e 3,0 M foram utilizados com sucesso para a criopreservação de tecido ovariano de caprinos (Rodrigues et al., 2004a,b) e ovinos (Santos et al., 2006) previamente exposto a esses compostos a uma temperatura de 20 C por um período de 20 minutos (período de equilíbrio). O GLI tem sido usado largamente para a congelação de embriões bovinos devido à sua baixa citotoxicidade. Entretanto, o GLI induz a severos danos no citoplasma devido à baixa permeabilidade da membrana plasmática a esta substância (Széll et al., 1986). Oócitos de camundongos isolados são menos permeáveis ao glicerol que ao DMSO, PROH e EG (Paynter et al., 1997). A baixa permeabilidade das células ao GLI aumenta o risco do estresse osmótico durante a descongelação e diluição, pois a entrada de água na célula ocorre mais rapidamente do que a saída do GLI. Isso explica as baixas taxas de sobrevivência e de maturação de oócitos criopreservados em GLI (Wani et al., 2004). Crioprotetores extracelulares ou não-penetrantes, entre eles os açúcares como a sacarose e a trealose, e polissacarídeos como o ficol, agem otimizando o efeito dos crioprotetores penetrantes. Utilizada com freqüência, a sacarose age como um tampão osmótico contra o estresse causado durante a remoção dos crioprotetores intracelulares (Mandelbaum et al., 1988). A sacarose pode ser utilizada com sucesso como crioprotetor extracelular para folículos pré-antrais murinos, especialmente quando combinada com EG (Salehnia et al., 2002). Ainda, a sacarose (0,1 M) associada ao DMSO ou PROH mostrou-se eficiente para criopreservar o tecido ovariano bovino, fato

29 29 demonstrado pela integridade ultra-estrutural dos folículos pré-antrais criopreservados (Lucci et al., 2004b). Crioprotetores extracelulares, também conhecidos como agentes de alto peso molecular, aumentam a viscosidade da solução (por exemplo, o polivinil álcool) ou se ligam às cabeças dos grupos fosfolipídicos (açúcares, tais como sacarose e trealose), protegendo as membranas celulares contra as injúrias do frio. Outra substância comumente adicionada para melhorar a eficiência do meio de criopreservação consiste no soro fetal bovino. Contudo, a importância do soro na criopreservação não é cientificamente comprovada, além do risco de conter agentes infecciosos que não são destruídos durante os procedimentos de criopreservação (Santos, 2007c) Criopreservação: métodos e danos O processo de criopreservação envolve basicamente as seguintes etapas: (1) adição de agente crioprotetor (período de equilíbrio); (2) resfriamento e indução da formação de gelo, seguidos por congelação ou vitrificação; (3) estocagem em nitrogênio líquido; (4) descongelação ou aquecimento e (5) remoção ou diluição do agente crioprotetor. A criopreservação pode ser realizada por dois métodos básicos: congelação convencional (lenta) e vitrificação. A congelação lenta é caracterizada pela exposição das células ou tecidos a baixas concentrações de agente crioprotetor ( 1,5 M) - (Paynter et al., 2000), por um período que pode variar de 20 (Rodrigues et al., 2004a,b) a 60 minutos (Candy et al., 1997). Nesse método, é utilizado um freezer programável, em que o material é resfriado lentamente a uma velocidade de 2ºC/min até 4 a 9ºC, mantendo-se esta temperatura por um curto período (10 a 15 min) para a estabilização térmica e indução da cristalização da solução crioprotetora (seeding) através do contato de um elemento metálico pré-resfriado em nitrogênio líquido com a parede do recipiente que contém o as amostras. Este procedimento visa prevenir a ocorrência da cristalização do meio em temperaturas inferiores ao seu ponto de solidificação, que resulta na liberação de energia sob forma de calor e elevação da temperatura da solução, seguida de redução brusca durante o equilíbrio térmico com o freezer (Reichenbach et al., 2008). Em seguida, o sistema continua sendo resfriado lentamente a uma velocidade de 0,3ºC/min. Uma vez que a desidratação celular é suficientemente atingida (entre 30 a 140ºC), o material é estocado em nitrogênio líquido (-196 C). Este é o método mais utilizado para

30 30 a criopreservação de tecido ovariano (Cox et al., 1996; Candy et al., 1997; Newton et al., 1998; Liu et al., 2008; Qi et al., 2008; Tsuribe et al., 2008). Utilizando este método, já foi possível a restauração da fertilidade após transplante em ovinos (Salle et al., 1999; Almodim et al., 2004) e murinos (Liu et al., 2008), bem como já foram obtidos nascimentos a partir de tecido ovariano criopreservado de murino (Guenasena et al., 1997), ovino (Gosden et al., 1994; Salle et al., 2003) e humano (Oktay, 2001; Donnez et al., 2004; Meirow et al., 2005). O método de vitrificação consiste em utilizar uma taxa de congelação extremamente rápida, que leva à formação de um estado vítreo do material criopreservado, protegendo-se as células da formação de cristais de gelo (Huang et al., 2008). A vitrificação foi idealizada por Luyet em 1937, e, depois de quase 50 anos, Rall e Fahy descreveram este método como uma alternativa ao processo de congelação lenta (Rall e Fahy, 1985). Ao contrário da congelação lenta, a vitrificação envolve a exposição do material biológico a altas concentrações de agente crioprotetor (geralmente entre 4 e 6 M) por um curto período de tempo (25 segundos a 5 minutos), geralmente à temperatura ambiente, seguido de um resfriamento ultra-rápido em nitrogênio líquido, não sendo necessária a utilização de equipamentos sofisticados e de alto custo. De acordo com Stachecki e Cohen (2004), a vitrificação possui dois aspectos básicos a serem levados em consideração. O primeiro consiste no fato de que as altas concentrações de agentes crioprotetores utilizadas na exposição aumentam os efeitos tóxicos e, em segundo lugar, apesar desse efeito durante o período de equilíbrio, a vitrificação, por ser uma congelação altamente rápida, aumenta as taxas de sobrevivência. Este método de congelação já foi reportado para oócitos maturos (Chian et al., 2004), embriões (Isachenko et al., 2005) e tecido ovariano de diferentes espécies como camundongas (Kagabu e Umezu, 2000), ratas (Sugimoto et al., 2000) e ovelhas (Al-aghbari e Menino, 2002). Assim como na congelação lenta, resultados satisfatórios com nascimentos foram obtidos após vitrificação de ovários inteiros ou FOPA de camundongas (Liu et al., 2001; de la Peña et al., 2002; Migishima et al., 2003), entretanto os resultados, principalmente em outras espécies, ainda são controversos. Existem dois fatores que podem levar à morte celular durante o processo de congelação/descongelação: a formação de gelo intracelular e o choque osmótico. Esses efeitos negativos podem ser reduzidos ou evitados com a utilização de agentes crioprotetores (de la Vega e Wilde, 1991), bem como modificando-se o processo de criopreservação. De acordo com Stachecki e Cohen (2004), os efeitos do gelo

31 31 intracelular e do choque osmótico são fatores letais se as células não são tratadas apropriadamente. A prevenção da formação de gelo intracelular é considerada um dos fatores mais importantes quando se deseja realizar um eficiente protocolo de criopreservação. Na congelação clássica (lenta), essa formação pode ser evitada com um resfriamento celular lento, permitindo a progressiva desidratação celular (Mazur et al., 2005). Existem duas hipóteses para a formação de gelo intracelular. A primeira, postulada por Muldrey e McGann (1990), sugere que o gelo intracelular seja formado como conseqüência de danos ou defeitos na membrana plasmática, que permitiriam a passagem do gelo extracelular através da membrana (teoria do fluxo osmótico). Com o super-resfriamento celular durante a congelação, a força de efluxo da água para o meio extracelular atingiria um valor crítico e, consequentemente, causaria danos à membrana, permitindo a entrada do gelo extracelular para o meio intracelular. Uma outra hipótese é a de que o gelo extracelular em contato (direto ou indireto) com a membrana plasmática, causaria a formação de gelo intracelular, levando injúria ao conteúdo celular. Há duas versões para essa segunda hipótese. Na primeira, Toner et al. (1990) sugerem que o gelo extracelular provocaria uma mudança conformacional na membrana, que se transformaria em um nucleador heterogêneo dos conteúdos celulares (contato indireto). Na segunda, postulada por Mazur (2004), o gelo extracelular cresceria através de poros preexistentes na membrana, onde tal contato direto levaria à formação de gelo intracelular. Outra causa de morte celular consiste no efeito solução, que envolve alterações citoplasmáticas como resultado da desidratação, aumento da concentração e precipitação de solutos e alterações de ph (Mazur et al., 1984). Por muito tempo, acreditou-se que a morte celular poderia ser causada pelo aumento da concentração de soluto fora da célula devido ao resfriamento e a congelação da água extracelular (Lovelock, 1953). Contudo, estudos mais recentes têm reportado uma alta tolerância celular ao estresse osmótico. Agca et al. (2000) expuseram oócitos bovinos a crescentes concentrações de cloreto de sódio para elevar a osmolaridade a concentrações supravitais (até 4800 mosm) e observaram que até 2400 mosm, posteriormente os oócitos foram capazes de ser fecundados e foram obtidos blastocistos. Outros pesquisadores expuseram oócitos humanos e murinos a concentrações variáveis de agente crioprotetor ou açúcares sem resfriamento e observaram considerável tolerância celular às condições osmóticas impostas (Oda et al., 1992; Hotamisligil et al., 1996). Os danos supracitados não são observados exclusivamente durante o

32 32 resfriamento, mas também durante o processo de descongelação/re-aquecimento, uma vez que as células recuperam seu metabolismo na presença de substâncias tóxicas como os agentes crioprotetores. Assim, El-Naggar et al. (2006) sugerem que as células ou tecidos criopreservados devem ser descongelados em uma velocidade alta. Agentes crioprotetores podem ser removidos em uma (Leibo, 1984), três (Rodrigues et al., 2004a,b) ou mesmo em seis lavagens (Shelton, 1992). Apesar de uma lavagem ser suficiente para embriões descongelados, folículos isolados e tecido ovariano devem ser lavados em três passos para retirada de resquícios de agentes crioprotetores (Lima et al., 2006; Sadeu et al., 2006; Santos et al., 2006) Métodos de análise de FOPA criopreservados Para a aplicação de um protocolo de criopreservação, é necessário determinar o(s) agente(s) crioprotetore(s) mais indicado(s), sua concentração, tempo de exposição e método de remoção. Um método prático para se verificar a qualidade folicular após a congelação/descongelação é a histologia clássica. Contudo, esta análise morfológica não é suficiente para se avaliar o processo de criopreservação (Schotanus et al., 1997; van den Hurk et al., 1998; Martinez-Madrid et al., 2004), por permitir apenas a identificação dos sinais primários da atresia (picnose nuclear, danos citoplasmáticos, desconexão entre as células da granulosa e o oócito, bem como irregularidades na membrana basal) - (Jorio et al., 1991; Hulshof et al., 1995; Demirci et al., 2002). A morfologia celular observada por histologia não está sempre correlacionada com a integridade ultraestrutural, que requer o uso da microscopia eletrônica de transmissão para sua análise (Santos et al., 2006). Além das organelas celulares, a verificação da integridade da membrana plasmática também é fundamental para a avaliação da viabilidade celular, e tem sido realizada utilizando-se o corante vital azul de trypan (Santos et al., 2007a,b) ou o marcador fluorescente etídio homodímero (Schotanus et al., 1997; van den Hurk et al., 1998). Outro parâmetro utilizado para a análise da viabilidade consiste na atividade enzimática no citoplasma, detectável nas células foliculares através do composto calceína-am (Schotanus et al., 1997; van den Hurk et al., 1998), que é clivado por enzimas esterase em células vivas, resultando em um produto fluorescente (De Clerck et al., 1994).

33 Cultivo in vitro de folículos ovarianos O objetivo principal do cultivo in vitro de FOPA é permitir o desenvolvimento folicular assegurando o crescimento e a maturação oocitária, bem como a multiplicação e posterior diferenciação das células da granulosa inclusas nesses folículos (Figueiredo et al., 2008). O cultivo de ovários tem sido utilizado com diferentes propósitos como avaliar a importância da vascularização, apoptose, fatores de crescimento e hormônios para o desenvolvimento de FOPA dentre outros (Fortune et al., 2000; Erickson, 2001; Flaws et al., 2001; O`Brien et al., 2003; Matos et al., 2007). Dentre os hormônios testados e já comumente adicionados ao meio de base para o cultivo de folículos ovarianos, destaca-se o FSH, sendo demonstrada sua importância para a manutenção da viabilidade e proliferação das células da granulosa de FOPA (Matos et al., 2007; Choi et al., 2008) Em roedores, a pequena dimensão dos ovários possibilita o cultivo do órgão inteiro, o que tem sido bastante útil para o estudo da foliculogênese inicial em pequenos mamíferos (Fortune, 2003). Em animais domésticos de médio e grande porte, devido às grandes dimensões dos ovários, não é possível utilizar este modelo. Para estes animais, o cultivo de pequenos fragmentos de córtex ovariano, rico em folículos primordiais, tem sido realizado para o estudo da ativação e crescimento de folículos primordiais caprinos (Silva et al., 2004), bovinos (Braw-Tal e Yossefi, 1997) e humanos (Scott et al., 2004). Esse tipo de cultivo in vitro tem a vantagem de manter a integridade estrutural folicular e as interações entre as células foliculares e células do estroma, facilitando a perfusão do meio para o tecido ovariano (Telfer, 1996). Já o segundo sistema de cultivo folicular envolve o isolamento, mecânico ou enzimático, dos FOPA (Abir et al., 2001b), permitindo o monitoramento diário do crescimento folicular, bem como o efeito in vitro de hormônios e fatores de crescimento sobre cada classe folicular (Abir et al., 2001a). Apesar dos métodos enzimáticos de isolamento serem mais práticos, os mecânicos têm sido mais comumente adotados para o isolamento de FOPA de ovários bovinos (Itoh et al., 2002), caprinos (Arunakumari et al., 2007), ovinos (Amorim et al., 2000), ratas (Zhao et al., 2000) e camundongas (Lenie et al., 2004). Tais métodos têm proporcionado a recuperação de um grande número de FOPA, sendo mais utilizados a microdissecção para folículos com diâmetro igual ou superior a 150 μm (Lee et al., 2007) e o isolamento pelo tissue chopper para folículos menores (Martinez-Madrid et al., 2004) ou ainda a associação de ambos os métodos (Gupta et al., 2008). Além disso,

34 34 o isolamento mecânico mantém a integridade da estrutura folicular, a membrana basal permanece intacta após o procedimento e as interações oócito-células da granulosa-teca são mantidas (Demeestere et al., 2002). Em relação aos avanços obtidos através da MOIFOPA, em gatas (Jewgenow e Stolte, 1996), gambás (Butcher e Ullman, 1996) e macacas (Fortune et al., 1998) foi observado o crescimento de FOPA após cultivo in vitro, porém sem a formação de antro. Nas espécies bovina (Itoh et al., 2002), caprina (Huanmin e Yong, 2000) e humana (Roy e Treacy, 1993), os FOPA isolados foram cultivados in vitro e desenvolveram-se até o estádio antral. Em ovinos, folículos secundários isolados e cultivados por 6 dias atingiram a maturação nuclear (Tamilmani et al., 2005). Em suínos e bubalinos, folículos secundários crescidos in vitro chegaram até a ovulação, tiveram seus oócitos fecundados in vitro, com desenvolvimento até estádio de blastocisto (Wu e Tian, 2007; Gupta et al., 2008). No entanto, os maiores avanços do cultivo folicular foram alcançados em camundongos, com o nascimento de crias viáveis a partir da maturação de oócitos provenientes de FOPA cultivados in situ e isolados, em que o oócito adquiriu competência meiótica para ser fecundado e completar o desenvolvimento embrionário (O Brien et al., 2003). Provavelmente, essa estratégia de associar o cultivo de folículos in situ e isolados seja necessária para promover o crescimento de folículos primordiais de espécies domésticas e primatas (Silva et al., 2006). Para a espécie canina, poucos estudos com FOPA têm sido realizados, restringindo-se todos à avaliação de sistemas de maturação (Bolamba et al., 1998, 2002, 2006). Nenhum trabalho foi realizado com o objetivo de estabelecer métodos de preservação ou de cultivo in vitro.

35 35 3 JUSTIFICATIVA A superpopulação de cães nas cidades resulta na eutanásia de milhões de animais sadios, além do dispêndio de um elevado volume de recursos econômicos estimados na ordem de bilhões de dólares anualmente (Frank e Carlisle-Frank, 2007). Nos países em desenvolvimento, estes recursos são utilizados, principalmente, para a execução de programas de controle da raiva urbana, que se baseiam na eliminação de cães errantes, na vacinação da população animal e no tratamento de pessoas potencialmente expostas ao vírus rábico (Wandeler et al., 1988). O tratamento profilático pós-exposição para pessoas agredidas por cães de rua, instituído obrigatoriamente nestes casos por não ser possível a observação do animal agressor, onera bastante os cofres públicos. Isto porque o custo médio de um esquema completo de soro-vacinação pode exceder a quantia de U$ 4.000, quando se utilizam vacinas produzidas em cultivo celular e imunoglobulinas anti-rábicas homólogas (Dhankhar et al., 2008), e a freqüência desses eventos de agressão em cidades de países em desenvolvimento, a exemplo do município de Fortaleza (Ceará, Brasil), é bastante elevada (Lopes et al., 2001). Outra consideração importante acerca desses tratamentos é o risco de reações adversas severas quando se utilizam vacinas produzidas por cultivo em tecido nervoso de animais, que constituem o único tipo disponível em alguns países (Rupprecht et al., 2002). Por exemplo, reações de desmielinização central e/ou periférica, algumas das quais fatais, têm sido associadas ao uso da vacina Fuenzalida & Palácios, obtida a partir de cultivo em cérebros de camundongos lactentes, sendo reportadas incidências de até um caso para cada tratamentos (Meltzer e Rupprecht, 1998). O Estado do Ceará possui uma das maiores incidências de raiva canina e raiva humana transmitida por cães no Brasil. No período de 2002 a 2005, confirmaram-se em laboratório 175 casos de raiva canina, o que indica uma elevada circulação da doença em cães (Secretaria de Saúde do Estado do Ceará, 2006). Devido ao fato de que o número de casos de raiva animal e humana tende a ser maior em áreas com elevada densidade de cães errantes, onde os contatos entre homens e animais são mais freqüentes (Haddad et al., 1988; Osman e Haddad, 1988), as autoridades sanitárias do referido, bem como de outros estados da federação, têm realizado a apreensão sistemática e eutanásia de cães de rua. Contudo, estudos realizados em diversos países demonstram que a a eliminação de cães errantes é ineficaz e apresenta maior custo que

36 36 o investimento no controle da reprodução animal e em programas educativos para a população (World Health Organization, 1990). Mais que um dilema de ordem econômica e sanitária, a superpopulação canina e a forma como é controlada compõem um complexo dilema ético. A qualidade de vida de cães abandonados é extremamente baixa, sendo marcantes a fome, doenças, desconforto por condições climáticas adversas, atropelamentos, crueldades, enfim, uma situação multifatorial de sofrimento intenso. Neste contexto, faz-se fundamental e urgente a realização de programas de controle da reprodução de cães, bem como o desenvolvimento de métodos contraceptivos eficientes, seguros e de custo suficientemente baixo para permitir sua utilização em massa. Assim, será possível intervir de maneira racional, efetiva e humanitária sobre o problema da superpopulação de cães, obtendo-se, conseqüentemente, uma economia expressiva de recursos públicos, além de promoção da saúde pública e do bem-estar animal. O potencial da técnica de imunoesterilização por anticorpos anti-zp de reunir todas as características supracitadas representa uma importante perspectiva para a solução desta questão. Considerando-se a importância da realização de estudos in vitro preliminares aos testes in vivo, com o intuito de se estabelecer uma base sólida e precisa de conhecimentos, minimizando-se a experimentação com animais, utilizou-se no presente trabalho a biotécnica de MOIFOPA como modelo experimental. Entretanto, uma vez que ainda não há informações relativas à aplicação desta tecnologia para cães, estudos foram conduzidos para a definição de métodos de preservação e cultivo in vitro de folículos pré-antrais caninos. Neste contexto, realizou-se a avaliação de protocolos de resfriamento e criopreservação utilizados para outras espécies, sendo ainda empregado um sistema de cultivo em desenvolvimento para possibilitar a análise dos efeitos de anticorpos anti-zp sobre os referidos folículos.

37 37 4 HIPÓTESES CIENTÍFICAS Folículos ovarianos pré-antrais caninos podem ser preservados por meio de armazenamento hipotérmico durante o período de isquemia compreendido entre a coleta dos ovários e seu uso no laboratório. Folículos pré-antrais caninos podem ainda ser criopreservados através de congelação lenta utilizando-se agentes crioprotetores, mantendo-se a viabilidade e a integridade ultra-estrutural. Folículos pré-antrais caninos frescos ou criopreservados podem ser cultivados in vitro mantendo sua viabilidade. Esta técnica pode ser utilizada como modelo experimental para o teste de agentes esterilizantes. Anticorpos anti-zp são capazes de se ligar especificamente à ZP de oócitos de caninos, causando bloqueio da ligação de espermatozóides ou atresia de folículos préantrais.

38 38 5 OBJETIVOS 5.1 Objetivo Geral Avaliar o potencial de anticorpos anti-zp para a imunoesterilização de cadelas. 5.2 Objetivos Específicos - Definir um método de preservação de FOPA caninos por períodos curtos, avaliando-se os parâmetros meio (solução de NaCl a 0,9% - salina fisiológica ou Meio Essencial Mínimo MEM), temperatura (4, 20 ou 38 C) e tempo de conservação (2,6,12 ou 24 h); - estabelecer um método de criopreservação de FOPA caninos, avaliando-se a eficiência dos agentes crioprotetores dimetilsulfóxido, etilenoglicol, glicerol e 1,3- propanodiol durante a execução da técnica de congelação lenta; - cultivar in vitro FOPA caninos frescos ou criopreservados de modo a manterse sua viabilidade; - analisar o efeito de anticorpos policlonais anti-pzp sobre FOPA caninos cultivados in vitro.

39 39 6 CAPÍTULO I Imunocontracepção em mamíferos com ênfase no controle populacional de cães Immunocontraception in mammals emphasizing dog population control Revista Brasileira de Reprodução Animal (Publicado, v.29, n.3/4, p , 2005)

40 40 Imunocontracepção em mamíferos com ênfase no controle populacional de cães (Immunocontraception in mammals emphasizing dog population control) Cláudio Afonso Pinho Lopes*, Diana Célia Sousa Nunes-Pinheiro, José Ricardo de Figueiredo Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará, CEP , Fortaleza, CE, Brasil. * Autor para correspondência: claudioapl@gmail.com Resumo A superpopulação de cães constitui um sério problema em diversas cidades do mundo, sendo necessário o desenvolvimento de sistemas de contenção de natalidade baseados no controle da reprodução. Os métodos contraceptivos atualmente disponíveis são inadequados para uso em escala populacional. Neste contexto, a imunocontracepção surge como uma importante perspectiva para a solução desta questão. No presente trabalho, são abordados diferentes métodos de imunocontracepção em mamíferos, baseados no uso de hormônios reprodutivos, antígenos do embrião, da zona pelúcida e do espermatozóide, apresentando seus princípios e os avanços obtidos em seu desenvolvimento. Palavras-chave: imunocontracepção, imunoesterilização, mamíferos, cães. Abstract Dog overpopulation is a serious problem in many cities throughout the world, which requires the development of birth control systems based upon reproduction blocking. Contraception methods available nowadays are not suitable for use in a population scale. In this context, immunocontraception is an important perspective for filling this gap. In this article, immunocontraceptive methods for mammals based on use of reproductive hormones and antigens from embryo, zona pellucida and spermatozoon are reviewed, focusing on their principles and development advances. Keywords: Immunocontraception, immunosterilization, mammals, dogs.

41 41 Introdução A superpopulação de cães constitui um sério problema em diversas cidades do mundo, caracterizado pela existência de uma grande quantidade de animais sem responsáveis que vivem nos espaços públicos. Esses animais compõem um reservatório de zoonoses, e, assim, um risco de agravo à saúde pública, o que implica o dispêndio expressivo de recursos. Neste contexto, as autoridades sanitárias realizam a eliminação sistemática desses animais como estratégia de controle populacional. Esta abordagem, no entanto, é estritamente paliativa, por não atuar sobre a origem do problema, que consiste das elevadas taxas de natalidade de cães. Além disso, a eliminação dos animais sem responsáveis faz emergirem questões éticas que definem a necessidade de novas estratégias de ação. Assim, um sistema de controle populacional para cães, para ser efetivo, racional e humanitário, deve basear-se no controle de natalidade. As técnicas contraceptivas atualmente disponíveis para cães não são adequadas para uso em escala populacional. Os métodos cirúrgicos, além do custo elevado e dos riscos inerentes a qualquer procedimento cirúrgico, são logisticamente inviáveis para populações grandes. Os métodos farmacológicos, baseados no uso de hormônios, têm apresentado efeitos adversos. Um novo conceito em métodos contraceptivos, a imunocontracepção, surge como uma importante perspectiva para o desenvolvimento de métodos aplicáveis ao controle da reprodução de cães em larga escala. Além de cães, outras espécies de mamíferos também encontram-se em superpopulação, como os felinos domésticos em diversas regiões do mundo (Slater, 2001) e, em particular, na Austrália (Bradley et al., 1999), o elefante em alguns países do sul da África (Stout e Colenbrander, 2004) e o cervo de cauda branca (Rutberg et al., 2004) na América do Norte. Problemas de animais em excesso também ocorrem em parques zoológicos, em virtude da reprodução dos animais cativos (Kirkpatrick e Rutberg, 2001). Assim, o uso da imunocontracepção pode ser útil também no controle das populações dessas espécies. Neste contexto, no presente trabalho, serão abordados diferentes métodos de imunocontracepção em mamíferos, baseados no uso de hormônios reprodutivos e de antígenos do embrião, da zona pelúcida e do espermatozóide, apresentando-se seus princípios e os avanços obtidos em seu desenvolvimento.

42 42 A imunocontracepção A imunocontracepção consiste da ligação de anticorpos a moléculas bioativas do sistema reprodutor responsáveis por interações fundamentais ao processo reprodutivo, que, desta forma, é interrompido. Por exemplo, a ligação de anticorpos à superfície da zona pelúcida (ZP) de oócitos torna estes inacessíveis a espermatozóides, impedindo, assim, as interações moleculares necessárias ao processo de fertilização. O efeito contraceptivo é reversível, mantendo-se até que as concentrações (títulos) dos anticorpos específicos, que gradativamente vão decaindo a níveis abaixo de um limiar contraceptivo, ou seja, tornem-se insuficientes para o bloqueio da reprodução. A duração deste efeito varia em função do título inicial de anticorpos contraceptivos, sendo observados períodos de até cinco anos de infertilidade (Brown et al., 1997). A imunocontracepção tende a ser destituída de efeitos colaterais adversos, uma vez que as moléculas a serem bloqueadas devem desempenhar funções limitadas ao processo reprodutivo. Além disso, a verificação criteriosa do potencial de reatividade cruzada de anticorpos contraceptivos com outros elementos do organismo, em decorrência de algum grau de homologia, deve sempre ser procedida. Em alguns casos, os anticorpos produzidos e/ou células citotóxicas do sistema imunológico ativadas nas vacinações causam a destruição de elementos nãoregeneráveis do sistema reprodutivo, caracterizando-se, assim, um processo de esterilização imunológica, também denominado imunoesterilização. Diversos antígenos do sistema reprodutor são passíveis de ligação por anticorpos, sendo, portanto, moléculas-alvo em potencial para o desenvolvimento de métodos de imunocontracepção ou imunoesterilização (Fig. 1). O hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH), secretado pelo hipotálamo, controla a liberação dos hormônios folículo estimulante (FSH) e luteinizante (LH), que, por sua vez, controlam a gametogênese em machos e fêmeas. Assim, a ligação de anticorpos às moléculas desses hormônios ou aos seus receptores resulta na interrupção da ovulação ou da produção de espermatozóides. As glicoproteínas da ZP e determinados antígenos da superfície do espermatozóide, responsáveis pela cascata de reações que constituem o processo de fertilização, também são passíveis de bloqueio por anticorpos. As gonadotrofinas coriônicas (GC), responsáveis pela manutenção da gestação até o desenvolvimento completo da placenta, podem também constituir moléculas-alvo para a

43 43 imunocontracepção. O bloqueio por anticorpos de proteínas bioativas do embrião pode também ser utilizado como método para interrupção da gestação em seu início. Imunização ativa Os anticorpos contraceptivos podem ser produzidos por meio de imunização ativa (vacinação), utilizando-se como imunógeno a molécula-alvo a ser bloqueada. Entretanto, em populações com grande diversidade genética, uma parcela significativa dos indivíduos pode não ter capacidade de resposta imunológica a determinados antígenos, o que resulta na redução da eficácia do método.

44 44 Imunização passiva Uma técnica alternativa à vacinação contraceptiva, com potencial de reunir maiores eficácia, segurança e praticidade, consiste da administração de anticorpos contraceptivos pré-formados em outros animais, ou seja, a imunização passiva (soroterapia). A maior eficácia decorre do fato de este método não depender da capacidade de cada indivíduo de responder imunologicamente ao elemento-alvo a ser neutralizado. Esta técnica é ainda mais segura que a vacinação, pois é possível analisar a especificidade dos anticorpos produzidos antes de serem administrados (Talwar, 1999). Outra vantagem deste método é sua praticidade, uma vez que uma única aplicação de anticorpos pode resultar em títulos adequados, enquanto os procedimentos de vacinação, geralmente, requerem diversas aplicações de imunógeno. Os anticorpos de interesse podem ser produzidos pela hiperimunização de plantéis de animais selecionados para a produção de soro, do qual se procede a purificação e a concentração das imunoglobulinas específicas para o antígeno a ser neutralizado, a exemplo dos soros anti-ofídicos produzidos em eqüinos. Imunocontracepção baseada em hormônios reprodutivos GnRH A molécula de GnRH consiste de um decapeptídeo incapaz de desencadear uma resposta imunológica quando utilizado como vacina. Elementos com estruturas pequenas não são capazes de estimular as células do sistema imunológico, ou seja, não são imunogênicos, sendo denominados haptenos (Janeway et al., 2001). Para que uma resposta imunológica seja estabelecida para haptenos, é necessário que estes sejam ligados a proteínas de grandes dimensões, denominadas proteínas carreadoras. Assim, o GnRH tem sido quimicamente conjugado a diversas proteínas, como os toxóides tetânico (TT) e diftérico (TD), para seu uso como agente imunocontraceptivo. Ladd et al. (1994) vacinaram cães com GnRH conjugado ao toxóide tetânico, obtendo uma redução dos níveis séricos de testosterona a limiares observados em animais castrados, o que resultou em azoospermia. Miller et al. (2000) analisaram a eficácia de uma vacina constituída por GnRH para o controle reprodutivo de um grupo de cervos machos e fêmeas de cauda branca. Após um esquema de vacinação composto

45 45 por duas aplicações apenas de imunógeno, observou-se uma redução de 88% da fertilidade das fêmeas, além da interrupção da produção de testosterona pelos machos, com conseqüente perda da libido. Estes efeitos mantiveram-se por até dois anos, sem a necessidade de vacinações de reforço. Robbins et al. (2004) vacinaram felinos domésticos machos e fêmeas com GnRH conjugado à leucotoxina A e observaram a produção de anticorpos em títulos imunoneutralizantes que se mantiveram por mais de 20 meses. Neste período, os machos apresentaram supressão da produção de testosterona e da espermatogênese, verificando-se atrofia das células de Sertoli e ausência de espermátides. As fêmeas mantiveram-se em anestro durante o mesmo período, não sendo observada a ocorrência de folículos terciários ao exame histológico dos ovários. Uma única injeção de anticorpos monoclonais anti-gnrh ao início do proestro suprimiu a ovulação subseqüente em fêmeas de rato. Quando administrados a cadelas, estes anticorpos também interromperam o estro, conforme verificado pela avaliação do comportamento, citologia vaginal e perfis de hormônios sexuais (Talwar et al., 1985). FSH Nos machos, a ausência de estimulação por FSH afeta significativamente a proliferação de espermatogônias e, assim, a produção quantitativa de espermatócitos primários (Suresh et al., 1995). Além disso, evidências sugerem que a privação de FSH também afeta o processo de espermiogênese, levando à produção de espermatozóides de baixa qualidade ou imaturos, resultando em infertilidade. Dessa forma, a neutralização do FSH por anticorpos pode ser utilizada como técnica imunocontraceptiva (Moudgal et al., 1997a). Macacos vacinados com FSH ovino (ofsh) apresentaram oligozoospermia e infertilidade (Srivastav e Das, 1992). A administração a macacos, de anticorpos para o FSH ou para o receptor deste hormônio (FSH-R), causou uma inibição da transformação de espermatogônias em espermatócitos primários, bem como do processo de espermiogênese (Aravindan et al., 1993; Suresh et al., 1995). Não houve alteração da produção de testosterona, observando-se apenas oligozoospermia, mas a qualidade dos espermatozóides foi afetada de forma suficiente ao estabelecimento de infertilidade. Aravindan et al. (1993) observaram que os títulos de anticorpos anti-fsh em animais vacinados com o FSH ovino não duram mais de dias, pois estes são

46 46 rapidamente usados para a bioneutralização do FSH, produzido de forma contínua pela hipófise. Assim, uma alternativa de técnica imunocontraceptiva para se afetar a espermatogênese consiste do uso de anticorpos para o receptor de FSH. Macacos vacinados com um fragmento recombinante do receptor do FSH apresentaram títulos efetivos de anticorpos para o antígeno utilizado, que se mantiveram por mais de 300 dias após apenas duas a três injeções do imunógeno. Estes anticorpos ligaram-se efetivamente a moléculas do receptor do FSH nos testículos, impedindo a ligação do FSH, o que resultou em inibição da transformação de espermatogônias em espermatócitos primários. Os animais vacinados, ao serem submetidos ao teste de cópula, apresentaram-se inférteis. Não houve qualquer alteração nas concentrações séricas de testosterona (Moudgal et al., 1997b). LH A eficácia de vacinas baseadas em LH ovino (olh) para a interrupção da função testicular foi avaliada em coelhos (Jeyakumar e Moudgal, 1996) e macacos (Suresh et al., 1995). Os anticorpos produzidos foram capazes de se ligar ao LH, resultando em uma redução intensa (~90%) das concentrações séricas de testosterona. A quantificação da população de células germinais por citometria de fluxo mostrou que, semanas após a vacinação, a população de espermátides foi reduzida em mais de 90%, e a de espermatócitos primários em mais de 50%. Os autores sugeriram que a azoospermia resultante decorreu da interrupção da meiose, que é controlada pela testosterona testicular. Remy et al. (1996) observaram que a vacinação de ratos machos com receptor de LH (LH-R) suprimiu a fertilidade de forma proporcional aos títulos de anticorpos produzidos contra os receptores de LH. Coelhas vacinadas com receptores de LH bovino produziram anticorpos para este receptor e apresentaram falha de ovulação após cópula, inseminação artificial ou injeção de gonadotrofina coriônica (Singh et al., 1995). Essas coelhas mantiveram-se inférteis por 10 meses após a vacinação, mesmo após repetidas cópulas. Entretanto, a ovulação foi reestabelecida com o declínio dos anticorpos. De modo semelhante, babuínos e macacos rhesus vacinados com receptores de LH tornaram-se inférteis, mas, com o declínio dos anticorpos, retornaram à fertilidade normal (Shukla et al., 1991; Pal et al., 1992).

47 47 Cadelas vacinadas com receptores de LH bovino apresentaram redução dos níveis de progesterona, sugerindo-se falha de ovulação e de função do corpo lúteo e não manifestaram sinais de estro. Com o declínio dos anticorpos anti-receptores de LH cerca de 500 dias após a vacinação, os perfis hormonais, a citologia vaginal e os sinais de estro retomaram o padrão normal. Assim, comprovou-se que a vacinação de cadelas com receptores de LH leva a um estado reversível de infertilidade (Saxena et al., 2002). Imunocontracepção baseada em proteínas embrionárias Outra modalidade de técnica imunocontraceptiva consiste da ligação de anticorpos a moléculas bioativas do embrião, como a proteína transportadora de riboflavina (RCP). A proteína transportadora de riboflavina é o principal mediador do suprimento de vitamina do embrião em desenvolvimento. A vacinação de fêmeas de primatas com a proteína transportadora de riboflavina de galinha resultou na produção de anticorpos que interromperam a gestação, provavelmente durante o estágio periimplantação do embrião no útero (Adiga et al., 1997). A demonstração por imunohistoquímica da presença da proteína transportadora de riboflavina em oócitos ovulados e embriões em clivagem de fêmeas de rato sugere que estes podem constituir um alvo para a citotoxicidade mediada por anticorpos e processos degenerativos. Imunocontracepção baseada na Zona Pelúcida A zona pelúcida é uma estrutura extracelular que circunda e protege oócitos e, subseqüentemente, o embrião (Wolgemuth et al., 1984). A zona pelúcida é composta por três glicoproteínas denominadas ZP1, ZP2 e ZP3. As duas últimas se unem para formar filamentos, que são interligados por ZP1 (Greve e Wassarman, 1985). A zona pelúcida desempenha funções fundamentais no processo de fertilização, que é iniciado pela ligação dos espermatozóides à sua superfície (Gupta et al., 1997). Evidências sugerem que, em camundongos, hamsters e no homem, a ZP3 constitui o receptor primário ao qual se ligam os espermatozóides (Moller et al., 1990; Van-Duin et al., 1994). Em suínos, sugere-se que a ZP3 e a ZP1 associadas participem do processo de ligação dos espermatozóides (Yurewicz e Sacco, 1996). A ligação da ZP3 ao receptor cognato do espermatozóide induz uma cascata de transdução de sinal que determina a reação acrossômica (Gupta et al., 1997). A reação

48 48 acrossômica resulta na liberação de enzimas proteolíticas necessárias para que os espermatozóides penetrem na estrutura da zona pelúcida e na remodelação da superfície dessas células para manutenção da adesão à zona pelúcida e para a fusão com a membrana do oócito (Yanagimachi, 1994). Após a reação acrossômica, a ZP2 passa a desempenhar a função de receptor (secundário) para os espermatozóides, mantendo-os aderidos ao oócito (Gupta et al., 1997). A ZP2 também desempenha uma função importante no mecanismo de bloqueio à polispermia. Após a fusão de um espermatozóide ao oócito, ocorre a clivagem da ZP2 (Moller e Wassarman, 1989). Os fragmentos resultantes permanecem nãocovalentemente ligados à zona pelúcida, tornando essa zona resistente à proteólise e, portanto, prevenindo a penetração espermática. Assim, devido às funções fundamentais das glicoproteínas da zona pelúcida no processo de fertilização, estas tornam-se moléculas-alvo em potencial para a constituição de técnicas imunocontraceptivas. A viabilidade do uso de glicoproteínas da zona pelúcida para a imunocontracepção foi demonstrada pela primeira vez pela vacinação de fêmeas de camundongo com zona pelúcida de hamster, que resultou na produção de anticorpos capazes de se ligar à zona pelúcida endógena, induzindo infertilidade (Gwatkin et al., 1977). Antisoro de hamsters imunizados com ZPA humana recombinante foi administrado a fêmeas de hamster, observando-se uma redução significativa da fecundidade (Koyama e Hasegawa, 2004). Anticorpos produzidos contra um peptídeo sintético correspondente a um segmento da zona pelúcida felina (fzp) foram capazes de bloquear a ligação de espermatozóides a oócitos de gata e a fertilização in vitro (Ringleb et al., 2004). Estudos iniciais de caracterização imunológica revelaram que os anticorpos produzidos para as glicoproteínas da zona pelúcida de uma espécie são capazes de se ligar às glicoproteínas de várias outras espécies (Sacco et al., 1981). Esta reatividade imunológica cruzada deve-se a graus variáveis de homologia das seqüências protéicas, o que estabelece a possibilidade de vacinação heteróloga. Devido à grande disponibilidade de ovários suínos em abatedouros, as preparações de zona pelúcida suína (pzp) tornaram-se os antígenos de escolha (Gupta et al., 2004). A vacinação com pzp mostrou-se efetiva para o controle populacional de cavalos selvagens (Kirkpatrick et al., 1990), várias espécies de animais cativos em zoológicos (Kirkpatrick et al., 1996), cervos de cauda branca (Rutberg et al., 2004) e elefantes-africanos (Fayrer- Hosken et al., 1999).

49 49 A vacinação de coelhas com pzp resultou em infertilidade (Wood et al., 1981). O monitoramento subseqüente dos animais imunizados mostrou que o efeito foi irreversível. A histologia dos ovários destes animais revelou uma destruição de oócitos em todos os folículos em crescimento e uma depleção severa da população de folículos quiescentes (Skinner et al., 1984). A vacinação de primatas não-humanos com pzp também resultou em infertilidade irreversível associada a alterações de folículos ovarianos (Gulyas et al., 1983). Estes e outros estudos, empregando modelos animais diferentes, demonstraram que a vacinação com pzp resulta em infertilidade mais provavelmente por distrofia do ovário que por um bloqueio da fertilização (Gupta et al., 2004). Diversos estudos têm acumulado evidências que indicaram o envolvimento da resposta imunológica celular na histopatologia dos ovários após a vacinação com antígenos da zona pelúcida (Naz et al., 1995). Rhim et al. (1992) demonstraram ser possível transferir a ooforite de fêmeas de camundongo vacinadas com peptídeos que continham segmentos da mzp3, para animais normais, através da transferência de linfócitos T CD4+, sem a detecção de anticorpos anti-mzp3 nos receptores. Gu et al. (2004), ao infectarem coelhas com um vírus myxoma recombinante que expressa a ZP2 de coelho (MV-ZPB), observaram a produção de anticorpos específicos para esta proteína, que se ligaram à zona pelúcida nativa. Houve uma redução significativa das quantidades de folículos ovarianos terciários e pré-ovulatórios das fêmeas infectadas, sendo observada a infiltração de linfócitos T nos ovários de alguns animais. Apesar dos diversos indícios de mecanismos imunológicos celulares para a patogênese da redução de folículos ovarianos, em nenhum dos estudos em que foi verificada depleção de folículos primordiais após vacinação com zona pelúcida, observou-se a infiltração de linfócitos T (Aitken, 2002). De fato, não se conhece uma associação entre a ooforite observada após a vacinação com zona pelúcida e a depleção de folículos primordiais (Kerr et al., 1998). Uma explicação alternativa para a patologia do ovário após a vacinação com zona pelúcida é que a perda de folículos primordiais reflete seu recrutamento acelerado para compor a população de folículos em crescimento que é eliminada devido à ação de anticorpos anti-zona pelúcida (Aitken, 2002). Outra possibilidade é que uma proporção significativa de folículos primordiais expressem níveis baixos de ZP3, sendo destruídos por anticorpos antizona pelúcida por fixação de complemento (Grootenhuis et al., 1996). Em coelhos, foi demonstrado que a resposta imunológica humoral (de

50 50 anticorpos) pode causar perdas foliculares, provavelmente por meio da ligação de anticorpos aos oócitos, que bloqueia a comunicação entre estas células e as da granulosa (Skinner et al., 1984). Em cadelas, o potencial do uso de técnicas imunocontraceptivas que têm as glicoproteínas da zona pelúcida como moléculas-alvo tem sido avaliado visando ao controle populacional de cães nas cidades. Mahi e Yanagimachi (1979) demonstraram que anticorpos produzidos contra extratos de ovários de cadela são capazes de inibir a fertilização de oócitos caninos in vitro. Em outro estudo, cadelas vacinadas com zona pelúcida de suínos produziram altos títulos de anticorpos capazes de se ligar cruzadamente à zona pelúcida canina (dzp) e apresentaram-se inférteis após acasalamento (Mahi-Brown et al., 1982). A vacinação de cadelas com ZP3 canina recombinante conjugada ao toxóide diftérico também resultou em infertilidade (Srivastava et al., 2002). A análise histológica dos ovários dos animais imunizados revelou um aumento da taxa de atresia folicular, não sendo observada infiltração por linfócitos. Nosso grupo está avaliando o potencial da imunização passiva com anticorpos antizona pelúcida canina para a imunoesterilização de cadelas. Imunocontracepção baseada em antígenos espermáticos Outra estratégia para o desenvolvimento de técnicas imunocontraceptivas que bloqueiam a fertilização consiste da utilização de anticorpos capazes de se ligar às moléculas bioativas da superfície do espermatozóide responsáveis pelas interações que constituem este processo. Alternativamente, estes anticorpos, se presentes no muco cervical, podem causar a aglutinação dos espermatozóides, impedindo-os de acessar o trato reprodutivo superior feminino (Delves et al., 2002). Casos de ocorrência natural de anticorpos aglutinadores de espermatozóides em mulheres de casais inférteis indicam que estas estratégias podem ser efetivas (Van Voorhis e Stovall, 1997) e seguras, pois não se observam quaisquer outros efeitos, além da infertilidade, devido à presença destes anticorpos (Aitken, 2002). Potencialmente, estas técnicas podem ser aplicadas a machos, mas o número de espermatozóides a serem neutralizados (~ ) torna isso um desafio maior que fazê-lo sobre um número limitado (dezenas a centenas) destas células no trato reprodutivo superior feminino (Delves et al., 2002). A vacinação de cangurus machos com espermatozóides homólogos resultou em produção de anticorpos capazes de penetrar o trato reprodutivo e de se ligar ao

51 51 acrossoma e à peça intermediária dos espermatozóides, resultando em redução das taxas de fertilização (Asquith et al., 2006). Dentre os antígenos espermáticos com potencial para servir como moléculasalvo em técnicas imunocontraceptivas, destacam-se as enzimas hialuronidase (PH-20), lactato desidrogenase C4 (LDH-C4) e o antígeno associado ao espermatozóide-9 (SPAG9). A PH-20 está presente na superfície externa da membrana plasmática que reveste o acrossoma, possibilitando ao espermatozóide penetrar a massa de células do cumulus rica em ácido hialurônico (Sabeur et al., 1997). Homólogos desta molécula têm sido encontrados em uma ampla variedade de espécies e sua eficácia contraceptiva como imunógeno tem sido demonstrada em porcos-da-índia machos. A LDH-C4 é uma enzima específica do espermatozóide de várias espécies (Goldberg, 1986). A vacinação de fêmeas de babuíno com a LDH-C4 resultou em uma redução do índice de fertilidade de 77% (controle) para 29% (Goldberg e Herr, 1999). O SPAG9 é uma molécula presente no acrossoma em espermatozóides humanos e de outras espécies de primatas, que parece participar da adesão destas células a oócitos. Anticorpos produzidos contra SPAG9 recombinante humano (rhspag9) mostraram-se capazes de bloquear in vitro a ligação entre espermatozóides e oócitos humanos (Jagadish et al., 2005). Conclusão A viabilidade do desenvolvimento de técnicas imunocontraceptivas eficazes, demonstrada pelos estudos compilados neste trabalho, constitui uma importante perspectiva para a solução do problema de superpopulação de cães. O controle da reprodução de fêmeas é preferível ao de machos, uma vez que, em programas de contenção de natalidade, poucos indivíduos machos não-controlados são capazes de manter os índices de fertilidade de uma população conforme já foi verificado em alguns casos. Neste contexto, para cadelas, destacam-se as técnicas imunocontraceptivas baseadas no GnRH, receptor de LH, proteína transportadora de riboflavina, zona pelúcida e antígenos espermáticos. Dentre estas, o uso da zona pelúcida para a imunoesterilização através da eliminação dos folículos primordiais é uma técnica bastante promissora.

52 52 Referências Adiga PR, Subramanian S, Rao J, Kumar M. Prospects of riboflavin carrier protein (RCP) as an antifertility vaccine in male and female mammals. Hum Reprod Update, v.3, p , Aitken RJ. Immunocontraceptive vaccines for human use. J Reprod Immunol, v.57, p , Aravindan GR, Gopalakrishnan K, Ravindranath N, Moudgal NR. Effect of altering endogenous gonadotropin concentrations on the kinetics of testicular germ cells turn over in the bonnet monkey (Macaca radiata). J Endocrinol, v.137, p , Asquith KL, Kitchener AL, Kay DJ. Immunisation of the male tammar wallaby (Macropus eugenii) with spermatozoa elicits epididymal antigen-specific antibody secretion and compromised fertilisation rate. J Reprod Immunol, v.69, p , Bradley MP, Eade J, Penhale J, Bird P. Vaccines for fertility regulation of wild and domestic species. J Biotechnol, v.73, p , Brown RG, Bowen WD, Eddington JD, Kimmins WC, Mezei M, Patersons JL, Pohajdak B. Evidence for a long-lasting single administration contraceptive vaccine in grey seals. J Reprod Immunol, v.35, p.43-51, Delves PJ, Lund T, Roitt IM. Antifertility vaccines. Trends Immunol, v.23, p , Fayrer-Hosken RA, Bertschinger HJ, Kirkpatrick JR, Grobler D, Lamberski N, Honneyman G, Ulrich T. Contraceptive potential of the porcine zona pellucida vaccine in the African elephant (Loxodonta africana). Theriogenology, v.52, p , Goldberg E. Sperm specific lactate dehydrogenase and development of a contraceptive vaccine. In: Clark DA, Croy BA (Ed.). Reproductive immunology. New York: Elsevier, p Goldberg E, Herr JC. LDH-C4 as a contraceptive vaccine. In: Gupta SK (Ed.). Reproductive immunology. New Delhi: Narosa, p Greve JM, Wassarman PM. Mouse egg extracellular coat is a matrix of interconnected filaments possessing a structural repeat. J Mol Biol, v.181, p , 1985.

53 53 Grootenhuis AJ, Philipsen HL, de Breet-Grijsbach JT, van Duin M. Immunocytochemical localization of ZP3 in primordial follicles of rabbit, marmoset, rhesus monkey and human ovaries using antibodies against human ZP3. J Reprod Fertil Suppl, n.50, p.43-54, Gu W, Holland M, Janssens P, Seamark R, Kerr P. Immune response in rabbit ovaries following infection of a recombinant myxoma virus expressing rabbit zona pellucida protein B. Virology, v.318, p , Gulyas BJ, Yuan LC, Gwatkin RB, Schmell ED. Response of monkeys to porcine zona pellucida as detected by a solid-phase radioimmunoassay. J Med Primatol, v.12, p , Gupta SK, Jethanandani P, Afzalpurkar A, Kaul R, Santhanam R. Prospects of zona pellucida glycoproteins as immunogens for contraceptive vaccine. Hum Reprod Update, v. 3, p , Gupta SK, Srivastava N, Choudhury S, Rath A, Sivapurapu N, Gahlay GK, Batra D. Update on zona pellucida glycoproteins based contraceptive vaccine. J Reprod Immunol, v.62, p.79 89, Gwatkin RB, Williams DT, Carlo DJ. Immunization of mice with heat solubilized hamster zonae: production of anti-zona antibody and inhibition of fertility. Fertil Steril, v.28, p , Janeway CA, Travers P, Walport M, Shlomchick M. Immunobiology. New York: Garland, p Jagadish N, Rana R, Mishra D, Garg M, Chaurasiya D, Hasegawa A, Koyama K, Suri A. Immunogenicity and contraceptive potential of recombinant human sperm associated antigen (SPAG9). J Reprod Immunol, v.67, p.69-76, Jeyakumar M, Moudgal NR. Immunization of male rabbits with sheep luteal receptor to lutenizing hormone results in production of antibodies exhibiting hormone agonistic and antagonistic activities. J Endocrinol, v.150, p , Kerr LE, Paterson M, Aitken RJ. Molecular basis of sperm-egg interaction and the prospects for immunocontraception. J Reprod Immunol, v.40, p , Koyama K, Hasegawa A. Effects of passive immunization with zona antigens on ovulation, fertilization and implantation. Am J Reprod Immunol, v.52, p.s19, Kirkpatrick JF, Rutberg AT. Fertility Control in Animals. In: Salem DJ, Rowan AN (Ed.). The state of the animals, Washington: HSUS Press, p

54 54 Kirkpatrick JF, Shideler SE, Turner Jr. JW. Remotely-delivered immunocontraception in feral horses. Wildl Soc Bull, v.18, p , Kirkpatrick JF, Turner Jr. JW, Liu IK, Fayrer-Hosken R. Applications of pig zona pellucida immunocontraception to wildlife fertility control. J Reprod Fertil Suppl, v.50, p , Ladd A, Tsong Y, Walfield A, Thau R. Development of an antifertility vaccine for pets based on active immunization against luteinizing hormone-releasing hormone. Biol Reprod, v.51, p , Miller LA, Johns BE, Killian GJ. Immunocontraception of white-tailed deer with GnRH vaccine. American J Reprod Immunol, v.44, p , Mahi-Brown CA, Huang TT Jr, Yanagimachi R. Infertility in bitches induced by active immunization with porcine zonae pellucidae. J Exp Zool, v.222, p.89-95, Mahi CA, Yanagimachi R. Prevention of in vitro fertilization of canine oocytes by anti-ovary antisera: a potential approach to fertility control in the bitch. J Exp Zool. v.210, p , Moller CC, Bleil JD, Kinloch RA, Wassarman PM. Structural and functional relationships between mouse and hamster zona pellucida glycoproteins. Dev Biol, v.137, p , Moller CC, Wassarman PM. Characterization of a proteinase that cleaves zona pellucida glycoprotein ZP2 following activation of mouse eggs. Dev Biol, v.132, p , Moudgal NR, Jeyakumar M, Krishnamurthy HN, Sridhar S, Krishnamurthy H, Martin F. Development of male contraceptive vaccine a perspective. Hum Reprod Update, v.3, p , 1997a. Moudgal NR, Sairam MR, Krishnamurthy HN, Sridhar S, Krishnamurthy H, Khan H. Immunization of male bonnet monkeys (M. radiata) with a recombinant FSH receptor preparation affects testicular function and fertility. Endocrinology, v.138, p , 1997b. Naz RK, Sacco A, Singh O, Pal R, Talwar GP. Development of contraceptive vaccines for humans using antigens derived from gametes (spermatozoa and zona pellucida) and hormones (human chorionic gonadotrophin): current status. Hum Reprod Update, v.1, p.1-18, 1995.

55 55 Pal R, Singh O, Talwar G, Singh M, Saxena, BB. Active immunization of baboons (Papio anubis) with the bovine LH receptor. J Reprod Immunol, v.21, p , Remy JJ, Couture L, Rabenosa H, Haertle T, Salesse R. Immunization against exon 1 decapeptides from the lutropin/choriogonadotropin receptor or the follitropin receptor as potential male contraceptive. J Reprod Immunol, v.32, p.37-54, Rhim SH, Millar SE, Robey F, Luo AM, Lou YH, Yule T, Allen P, Dean J, Tung KS. Autoimmune disease of the ovary induced by a ZP3 peptide from the mouse zona pellucida. J Clin Invest, v.89, p.28-35, Ringleb J, Rohleder M, Jewgenow K. Impact of feline zona pellucida glycoprotein B- derived synthetic peptides on in vitro fertilization of cat oocytes. Reproduction, v.127, p , Robbins SC, Jelinski MD, Stotish RL. Assessment of the immunological and biological efficacy of two different doses of a recombinant GnRH vaccine in domestic male and female cats (Felis catus). J Reprod Immunol, v.64, p , Rutberg AT, Naugle RE, Thiele LA, Liu IKM. Effects of immunocontraception on a suburban population of white-tailed deer Odocoileus virginianus. Biol Conserv, v.116, p , Sabeur K, Cherr GN, Yudin AI, Primakoff P, Li MW, Overstreet JW. The PH-20 protein in human spermatozoa. J Androl, v.18, p , Sacco AG, Yurewicz EC, Subramanian MG, DeMayo FJ. Zona pellucida composition: species cross reactivity and contraceptive potential of the antiserum to a purified pig zona antigen (PPZA). Biol Reprod, v.25, p , Saxena BB, Clavio A, Singh M, Rathnam P, Bukharovich Y, Reimers Jr T, Saxena A, Perkins S. Modulation of ovarian function in female dogs immunized with bovine luteinizing hormone receptor. Reprod Domest Anim, v.37, p.9-17, Shukla K, Chowdury SR, Malaviya B, Rathnam P, Saxena BB. Active immunization of rhesus monkey (Macaca mulatta) against LH-receptor. Adv Contracept Deliv Syst, v.7, p , Singh J, O Neill C, Handelsman DJ. Induction of spermatogenesis by androgens in gonadotropin deficient (hpg) mice. Endocrinology, v.136, p , Skinner SM, Mills T, Kirchik HJ, Dunbar BS. Immunization with zona pellucida proteins results in abnormal ovarian follicular differentiation and inhibition of gonadotropin-induced steroid secretion. Endocrinology, v.115, p , 1984.

56 56 Slater MR. The role of veterinary epidemiology in the study of free-roaming dogs and cats. Prev Vet Med, v.48, p , Srivastava N, Santhanam R, Sheela P, Mukund S, Thakral SS, Malik BS, Gupta SK. Evaluation of the immunocontraceptive potential of Escherichia coli-expressed recombinant dog ZP2 and ZP3 in a homologous animal model. Reproduction, v.123, p , Srivatsav A, Das RP. Sperm production and fertility of bonnet monkeys (Macaca radiata) following immunization with ovine follicle stimulating hormone. Indian J Exp Biol, v.30, p , Stout TAE, Colenbrander B. Contraception as a tool for limiting elephant population growth; the possible pitfalls of various approaches. In: Symposium on Tropical Animal Health and Production, 15, 2004, Utrecht. Proceedings Utrecht: Utrecht University Press, p Suresh R, Medhamurthy R, Moudgal NR. Comparative studies on the effects of specific immunoneutralization of endogenous FSH or LH on testicular germ cell transformations in the adult bonnet monkey (Macaca radiata). Am J Reprod Immunol, v.34, p.35-43, Talwar GP. Vaccines and passive immunological approaches for the control of fertility and hormone-dependent cancers. Immunol Rev, v.171, p , Talwar GP, Gupta SK, Singh V, Sahal D, Iyer KSN, Singh O. Bioeffective monoclonal antibody against the decapeptide gonadotropin releasing hormone: reacting determinant and action on ovulation and estrus suppression. Proc Natl Acad Sci USA, v.82, p , Van Duin M, Polman JE, De Breet IT, van Ginneken K, Bunschoten H, Grootenhuis A, Brindle J, Aitken RJ. Recombinant human zona pellucida protein ZP3 produced by Chinese hamster ovary cells induces the human sperm acrosome reaction and promotes sperm egg fusion. Biol Reprod, v.51, p , Van Voorhis BJ, Stovall DW. Autoantibodies and infertility: a review of the literature. J Reprod Immunol, v.33, p , Wolgemuth DJ, Celenza J, Bundman DS, Dunbar BS. Formation of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development. Dev Biol, v.106, p.1-14, Wood DM, Liu C, Dunbar BS. Effect of alloimmunization and heteroimmunization with zonae pellucidae on fertility in rabbits. Biol Reprod, v.25, p , 1981.

57 57 Yanagimachi R. Mammalian fertilization. In: Knobil E, Neill JD (Ed.). The physiology of reproduction. New York: Raven Press, p.189. Yurewicz EC, Sacco AG. Porcine zona pellucida glycoproteins: binding of ZPB ZPC heterocomplexes in boar sperm vesicles. Biol Reprod, v.54, p.71, 1996.

58 58 7 CAPÍTULO II Preservação de folículos pré-antrais caninos por períodos curtos: efeitos da temperatura, meio e tempo Short-term preservation of canine preantral follicles: effects of temperature, medium and time Animal Reproduction Science (Aceito para publicação, 2008)

59 59 Short-term preservation of canine preantral follicles: effects of temperature, medium and time Cláudio Afonso Pinho Lopes a,b,*, Regiane Rodrigues dos Santos c, Juliana Jales de Hollanda Celestino a, Mônica Aline Parente Melo a, Roberta Nogueira Chaves a, Claudio Cabral Campello a, José Roberto Viana Silva d, Sônia Nair Báo e, Katarina Jewgenow b, José Ricardo de Figueiredo a. a. Faculty of Veterinary, PPGCV, LAMOFOPA, State University of Ceará, Fortaleza, Brazil. Postal address: Av. Paranjana 1700, Campus do Itaperi, CEP , Fortaleza, CE, Brazil. b. Institute for Zoo and Wildlife Research, Berlin, Germany. Postal address: Postfach , D-10252, Berlin, Germany. c. Department of Farm Animal Health, Utrecht University, The Netherlands. Postal address: Yalelaan 7, 3584 CL Utrecht, Netherlands. d. Biotechnology Nucleus of Sobral (NUBIS), Federal University of Ceará, Sobral, Brazil. Postal address: Rua Gerardo Rangel s/n, Campus do Derby, CEP , Sobral, CE, Brazil. e. Laboratory of Electron Microscopy, Institute of Biology, University of Brasília, Brazil. Postal address: Universidade de Brasília, Campus Universitário Darcy Ribeiro (Asa Norte), Instituto Central de Ciências (ICC Sul), CEP 70910, Brasília, DF, Brazil. * Corresponding author. Tel.: Fax address: lopes@izw-berlin.de (C.A.P. Lopes). Correspondence address: Institut für Zoo- und Wildtierforschung (IZW). Postfach , D-10252, Berlin, Germany. Resumo O uso da vasta população de folículos pré-antrais é uma alternativa promissora para a obtenção de elevados números de oócitos fertilizáveis para a biotecnologia reprodutiva. Esta questão é particularmente importante para canídeos, uma vez que a taxas atuais de successo das técnicas in vitro que utilizam oócitos são muito limitadas, e muitas espécies desta família encontram-se ameaçadas pela extinção. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da temperatura, meio e tempo sobre a morfologia e viabilidade de folículos pré-antrais caninos durante a preservação por curtos períodos. Ovários caninos foram divididos em fragmentos, que foram incubados em solução de NaCl a 0,9% ou em Meio Essencial Mínimo (MEM) a 4, 20 ou 38 C por 2, 6, 12 or 24 h. Os folículos pré-antrais inclusos nos fragmentos foram então analisados por

60 60 histologia, microscopia eletrônica de transmissão e teste de viabilidade utilizando-se Azul de Tripan, calceína-am e etídio homodímero-1. As percentagens de folículos morfologicamente normais e viáveis foram mantidas similares ao controle (tempo 0 h) após a incubação em salina a 4ºC ou 20ºC por até 6 h, e a 38 C por 2 h. Utilizando-se MEM, tal preservação foi possível por 12 h a 4 C ou 20ºC, e por 6h a 38ºC. Estes resultados indicam que a preservação de folículos pré-antrais caninos é realizada com maior eficiência através do armazenamento hipotérmico (4 ou 20 C) em MEM, que possibilita a manutenção da morfologia e viabilidade por até 12 h. Palavras-Chave: Preservação; Hipotermia; Morfologia; Viabilidade; Folículos pré-antrais; Canino. Abstract The use of the large pool of preantral follicles is a promising alternative to provide high numbers of fertilizable oocytes to reproductive biotechnology. This issue is particularly important to canids, since current rates of success of in vitro techniques using oocytes are very limited, and many species within this family are threatened by extinction. The aim of this study was to evaluate effects of temperature, medium and time on morphology and viability of canine preantral follicles during short-term preservation. Canine ovaries were cut into fragments which were incubated in 0.9% NaCl solution or in Minimum Essential Medium (MEM) at 4, 20 or 38 C for 2, 6, 12 or 24 h. Afterwards, preantral follicles were analyzed by histology, transmission electron microscopy and viability testing using trypan blue, calcein-am and ethidium homodimer-1. Percentages of morphological normal and viable follicles were maintained similar to control (time 0 h) after incubation in 0.9% NaCl at 4ºC or 20ºC for up to 6 h and at 38 C for 2 h. Using MEM, such preservation was possible for 12 h at 4 C or 20ºC, and for 6h at 38ºC. These results indicate that preservation of canine preantral follicles might be better accomplished through hypothermic (4 or 20 C) storage in MEM, which ensures maintenance of morphology and viability for up to 12 h. Keywords: Preservation; Hypothermia; Morphology; Viability; Preantral follicle; Canine.

61 61 1. Introduction Reproductive biotechnology has a great potential to contribute for the conservation of endangered wildlife species. However, a limiting factor for the development and efficiency of reproductive techniques is the lack of abundant numbers of fertilizable oocytes. This problem could be addressed by using the large source of oocytes enclosed in preantral follicles (Telfer, 2001), which exist in ovaries in numbers of thousands to millions depending on the species. In vitro culture systems capable to promote growth and maturation of these follicles have been developed for several species, and birth of healthy offspring after embryo transfer of in vitro fertilized oocytes derived from primordial follicles has, so far, been achieved in mice (Eppig and Schroeder, 1989). Due to the fact that time from ovary collection to the outset of in vitro culture can be very long, especially when the donor animal is far from the reproductive laboratory, as is the case with free-ranging individuals in the wild, preservation of viability is a critical issue since cells are under ischemia. In this context, studies have assessed short-term preservation of preantral follicles combining different temperatures and media in several species such as caprine (Silva et al. 2000, 2001; Carvalho et al. 2001; Ferreira et al. 2001), ovine (Andrade et al. 2001, 2002a,b; Matos et al. 2004), bovine (Lucci et al. 2004) and swine (Lucci et al. 2007). Conversely, to our knowledge, there is not to date a study on short term preservation of canine preantral follicles. Few works have addressed the storage of canine ovaries, but only effects on in vitro maturation (IVM) of oocytes from antral follicles have been evaluated and findings are controversial. Taş et al. (2006) demonstrated that bitch oocytes maintained at 4 C in physiologic saline had higher maturation rates than those kept at C. In contrast, Lee et al. (2006) observed that viability of canine antral oocytes after in vitro maturation was significantly decreased when ovaries were stored at 4 C in relation to 38 C. Thus, methods for preservation of canine oocytes are still to be established, and more studies are needed to gather consistent data. Once established, in vitro embryo production in dogs based upon the vast pool of preantral follicles could be adapted to endangered wild canids, which would contribute enormously to the multiplication of individuals of such species. Nine canid species are under risk of extinction, which has already occurred to the Falklands Wolf, Dusicyon australis (IUCN, 2007). In this context, the aim of this study was to assess the preservation of canine preantral follicles maintained in physiologic saline solution or in Minimum Essential Medium (MEM) at different temperatures and times of storage. To this end, evaluation

62 62 of morphology through histological and ultrastructural analyses, as well as viability assays based on trypan blue dye exclusion and the fluorescent probes calcein-am and ethidium homodimer were performed. 2. Materials and methods 2.1. Source and preparation of canine ovaries Pairs of ovaries (n=15) were aseptically collected during ovariectomy of healthy mixed-breed bitches (Canis familiaris) whose reproductive history and age were unknown, but it was estimated that most were months old and believed nulliparous. After removal from the bursa ovarica, ovaries were rinsed once with 70% ethanol for 10 seconds, twice in sterile phosphate-buffered saline (PBS) and eventual corpora lutea were excised using a scalpel Experimental design Experiment I: morphological evaluation of stored canine preantral follicles Immediately after collection and preparation, pairs of ovaries (n=5) were divided each into 25 fragments, from which one was randomly selected as control (time 0 h) and fixed for histology and ultrastructural analysis. The remaining fragments were placed into 15 ml tubes (Corning Glass Works, Corning, NY, USA) containing 2 ml of sterile saline solution (0.9% NaCl solution, osmolarity 300 mosmol/l, ph 7.2) or HEPES-buffered Minimum Essential Medium (MEM, osmolarity 280 mosmol/l, ph7.2; Sigma, St. Louis, MO, USA) at 4, 20 or 38ºC and stored for 2, 6, 12, or 24 h, and subsequently fixed for morphological analysis as the non-stored control sample (Figure 1). Thermoflasks filled with water were used for maintaining temperatures, which were monitored throughout the experiment. Each treatment was repeated five times.

63 63 Figure 1. Design of experiment I: pairs of canine ovaries were divided into 25 fragments, being one selected as non-stored control (time 0 h), whilst the others were incubated in saline solution or in Minimum Essential Medium (MEM) at 4, 20 or 38ºC for 2, 6, 12, or 24 h. Afterwards, fragments were submitted to morphological analysis Experiment II: assessment of viability of stored canine preantral follicles In this study, effects of storage on canine preantral follicles were further analyzed through assessment of viability. Five pairs of canine ovaries were cut each into 25 fragments, and one was randomly selected and immediately submitted to follicle isolation followed by trypan blue dye exclusion test as described later. The other fragments were maintained in saline solution or in MEM at 4, 20 or 38 C for 2, 6, 12 or 24 h, and afterwards evaluated similarly as for the control. Based on results of experiment I and trypan blue test, a second viability trial was performed. Pairs of ovaries (n=5) were cut into three portions, from which one was immediately processed for follicle isolation and testing using trypan blue as well as calcein-am and ethidium homodimer, which was employed to provide an additional and more precise method of viability assessment. The remaining fractions were stored in MEM at 4 C for 12 and 24 h, and afterwards analyzed similarly as for the control.

64 Histological analysis In order to assess the morphology of canine preantral follicles submitted to the different treatments, fragments of ovarian tissue were fixed in Carnoy for 12 h, dehydrated in a graded series of ethanol, clarified with xylene, embedded in paraffin wax and serially sectioned at 7 µm. Every fifth section was mounted on glass slides, stained with periodic acid Schiff (PAS)-hematoxylin and evaluated by light microscopy at a 400x magnification (Zeiss, Germany). Preantral follicles were defined as an oocyte surrounded either by one layer of flattened or cuboidal granulosa cells, or several layers of cuboidal granulosa cells with no antrum. Follicular morphology was evaluated based on the integrity of the oocyte, granulosa cells and basement membrane. Preantral follicles were classified and counted as (i) morphologically normal, when containing an oocyte with regular shape and uniform cytoplasm, and organized layers of granulosa cells, or (ii) degenerated, when the oocyte exhibited pycnotic nucleus and/or ooplasma shrinkage, and occasionally granulosa cells layers became disorganized, detached from the basement membrane and/or included enlarged cells. To avoid evaluating and counting a follicle more than once, preantral follicles were analyzed only in the sections where oocyte nucleus was observed Ultrastructure analysis In order to better examine follicular morphology, transmission electron microscopy (TEM) was performed to analyze ultrastructure of preantral follicles from the control, as well as from treatments that did not differ statistically from control in histology. A portion with a maximum dimension of 1 mm 3 was cut from each fragment of ovarian tissue and fixed in Karnovsky solution (2% paraformaldeyde and 2% glutaraldeyde in 0.1 M sodium cacodylate buffer ph 7.2) for 3 h at room temperature (RT, approximately 25 C). After three washes in sodium cacodylate buffer, specimens were post-fixed in 1% osmium tetroxide, 0.8% potassium ferricyanide and 5 mm calcium chloride in 0.1 M sodium cacodylate buffer for 1 h at RT. The samples were then dehydrated through a gradient of acetone solutions and thereafter embedded in Spurr s epoxy resin. Afterwards, semi-thin sections (3 µm) were cut, stained with toluidine blue and analyzed by light microscopy at a 400x magnification. Ultra-thin sections (60 70 nm) were obtained from preantral follicles classified as morphologically normal in semi-thin sections, according to the criteria adopted in histology. Subsequently, ultra-thin sections were contrasted with uranyl acetate and lead citrate,

65 65 and examined under a Jeol 1011 (Jeol, Tokyo) transmission electron microscope operating at 80 kv Assessment of preantral follicles viability Canine preantral follicles were isolated from control and stored ovarian fragments using the mechanical method described by Figueiredo et al. (1993). Briefly, using a tissue chopper (The Mickle Laboratory Engineering Co., Gomshal, Surrey, UK) adjusted to a sectioning interval of 87.5 µm, samples were cut into small pieces, which were placed in MEM and suspended 40 times using a large Pasteur pipette (diameter of about 1600 µm) and subsequently 40 times with a smaller Pasteur pipette (diameter of approximately 600 µm) to dissociate preantral follicles from stroma. The obtained material was passed through 500- and 100-μm nylon mesh filters, resulting in a suspension containing preantral follicles smaller than 100 μm in diameter. This procedure was carried out within 10 min at RT. Thereafter, viability of preantral follicles was assessed through trypan blue dye exclusion test (Jewgenow et al., 1998). Briefly, 10 μl of 0.4% trypan blue (Sigma, Deisenhofen, Germany) were added to 90 μl of the suspension of isolated preantral follicles, which were examined using an inverted microscope after incubation for 5 min at RT. Follicles were classified as viable if the oocyte and <10% granulosa cells remained unstained, or as non-viable if uptake of the dye by the oocyte and/or 10% granulosa cells occurred. Preantral follicles were also analyzed using a two-color fluorescence cell viability assay based on the simultaneous determination of live and dead cells by calcein-am and ethidium homodimer-1, respectively. Whilst the first probe detected intracellular esterase activity of viable cells, the later labeled nucleic acids of non-viable cells with plasma membrane disruption. Since it is difficult to distinguish the outline of live cells labeled with calcein-am within follicle structure, determination of the percentage of viable granulosa cells was achieved through using Hoechst to detect all nuclei, enabling counting of the total number of cells. The test was performed by adding 4 μm calcein-am, 2 μm ethidium homodimer-1 (Molecular Probes, Invitrogen, Karlsruhe, Germany) and 10 μm Hoechst (Sigma, Deisenhofen, Germany) to the suspension of isolated follicles, followed by incubation at 37 C for 10 min. After being labeled, follicles were washed three times by centrifugation at 100xg for 5 min and resuspension in MEM, mounted on a glass microscope slide in 5 μl antifading medium (DABCO, Sigma, Deisenhofen, Germany) to prevent photobleaching, and finally examined using an a DMLB fluorescence microscope

66 66 (Leica, Germany). The emitted fluorescent signals of Hoechst, calcein-am, and ethidium homodimer were collected at 350, 488, and 568 nm, respectively. Oocytes and granulosa cells were considered live if the cytoplasm was stained positively with calcein-am (green) and chromatin was not labelled with ethidium homodimer (red). Preantral follicles were classified as viable when the oocyte and <10 % of granulosa cells were live, and as non-viable, when the oocyte and/or 10 % granulosa cells were dead Statistical analysis All experiments were replicated five times. Analysis of variance (ANOVA) of the data was performed using the GLM procedure of the software SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) with a factorial design (medium, temperature and time of storage). Differences of percentages of morphologically normal preantral follicles (MNPF) and viable follicles between control and treatments (combinations of medium, temperature and time of storage) were determined by Duncan s multiple range test. Differences were considered statistically significant when P < Results 3.1. Experiment 1: Morphological evaluation of stored canine preantral follicles Histological analysis A total of 4,045 preantral follicles were examined in histology, with a range of 146 to 179 in each treatment. Proportions of preantral follicles at each developmental stage were similar among fragments obtained from a pair of ovaries and thus follicular diameters were homogenous between treatments. Most of the studied follicles were at the primordial or resting stage and had a diameter of µm. Primary or activated follicles (30-40 µm) and secondary follicles (40-100) were also analyzed in lower numbers equally found in all experimental groups. MNPF in control as well as after storage exhibited a spherical or elliptical oocyte with a large central or eccentric nucleus and uniform cytoplasm. Granulosa cells without pycnotic nuclei were wellorganized in layers surrounding the oocyte and a distinguishable intact basement membrane could be observed (Fig. 2A-C). Degenerated follicles showed a retraced oocyte with or without a pycnotic nucleus, and occasionally a strongly eosinophilic cytoplasm (Fig. 2D). Layers of granulosa cells remained unaltered or became

67 67 disorganized into a low density mass of cells which were many times swollen and/or detached from basement membrane. Occurrence of pycnotic bodies in granulosa cells or rupture of the basement membrane were not observed. Fig. 2. Histological features of stored canine ovarian fragments. Morphologically normal primordial (A) and primary (B) follicles comprised an oocyte (o) displaying a large nucleus (nu) and homogenous cytoplasm surrounded by one layer of flattened or cuboidal granulosa cells (gc) respectively, whilst in secondary follicles two or more layers were present without antrum (C). Degenerated preantral follicles often displayed oocyte retraction (D, arrow) and disorganization of granulosa cell layers. The arrowhead indicates an intact basement membrane. Scale bars represent 6 µm (A) and 10 µm (B,C and D). PAS-hematoxilin.

68 68 The effects of medium, temperature and time of storage on the percentages of MNPF are shown in Fig. 3. Maintenance in saline solution at 4 C for up to 24 h, at 20 C for up to 12 h or at 38 C for 6 h kept proportions of MNPF similar (P > 0.05) to control values (time zero). A decrease (P < 0.01) of the percentages of MNPF in relation to the control was observed after holding in saline solution at 20 C for 24 h and at 38 C for 12 and 24 h. With respect to MEM, similar results were obtained, with exception of the maintenance of follicles at 20 C for 24 h and at 38 C for 12 h, for which percentages of MNPF were also similar (P > 0.05) to control values. Fig. 3. Effects of medium, temperature and time of storage on the percentages of morphologically normal canine preantral follicles. (*) Differs significantly from the control (P < 0.05); (a, b, c) different letters for the same medium and time of incubation denotes significant differences between temperatures (P < 0.05); (A, B, C) different letters for a given combination of medium and temperature indicates significant differences among times of incubation (P < 0,05); (X,Y) different letters represent significant differences between media for fixed time and temperature of incubation. The effect of storage time on the percentages of MNPF at each temperature and for each solution was analyzed. At 4 C, percentages of MNPF were not affected by the incubation time, for both solutions. Similar results were obtained after preservation in MEM at 20 C. Otherwise, when ovarian fragments were kept at 20 C in saline solution, there was a decrease (P < 0.01) in the percentages of MNPF after 24 h compared to 2, 6 or 12 h. A reduction (P < 0.05) in the proportions of MNPF occurred

69 69 at 38 C with the increase of incubation time to 12 h in saline solution and to 24 h in MEM. Regarding the effect of temperature on percentages of MNPF for a defined period of storage, a decrease (P < 0.05) in percentages of MNPF was observed when ovarian fragments were maintained in MEM for 24 h at 38ºC in comparison to 4ºC. The comparison between saline solution and MEM at a same temperature and storage period showed that at 38 C after 12 h, percentages of MNPF were higher when ovarian fragments were maintained in MEM Ultrastructure analysis Transmission electron microscopy of stored preantral follicles was performed for assessment of ultrastructure in comparison to normal follicles from the control group. At least five follicles per group were analyzed. Normal follicles contained an oocyte displaying a very homogenous cytoplasm plenty of round shaped mitochondria with continuous membranes, few peripheral cristae and electron-dense granules. Some elongated forms with parallel cristae could also be seen. Small Golgi apparatus cisternae were rarely observed. Smooth and rough endoplasmic reticulum were present, either as isolated aggregations or as complex associations with mitochondria. The nuclei of oocytes were large and usually round, well delimited by the nuclear envelope, the chromatin was uncondensed and a nucleolus could often be identified. Granulosa cells were small and presented a high nucleus-to-cytoplasm ratio. Their irregularly shaped nuclei contained loose chromatin in the inner part and small peripheral aggregates of condensed chromatin. The cytoplasm exhibited a great number of mitochondria and well-developed smooth and rough endoplasmic reticulum. The cellular membranes of oocyte and surrounding granulosa cells were closely justaposed, and sometimes few short microvilli could be observed. A distinct continuous basement membrane surrounded follicles and was tightly attached to ovarian stroma (Fig. 4).

70 70 Fig. 4. Electron micrographs of normal follicles from control group (A) and stored in MEM at 4 C for 12 h (B). O, oocyte; GC, granulosa cells; ne, nuclear envelope; m, mitochondria; ser, smooth endoplasmic reticulum; bm, basement membrane; sc, stromal cells. (A, 5000x, scale bar=5 µm; B, 10000x, scale bar = 2 µm). The ultrastructural pattern described above was observed in normal follicles from control as well as after storage in MEM at 4 C or 20 C for up to 12 h and at 38 C for up to 6 h; in saline solution at 4 C or 20 C for up to 6 h. When ovarian fragments were incubated at 4 C in MEM or in saline solution for 24 h and 12 h respectively, and at 38ºC in saline solution for 2 h, discreet changes in ultrastructure suggesting onset of degeneration could be observed in follicles evaluated as morphological normal in semithin sections by light microscopy. Some mitochondria both in the oocyte and in granulosa cells were very enlarged, displayed fewer cristae and lower electron density of the matrix, which may indicate swelling (fig. 5).

71 71 Fig. 5. Ultrastructure of follicles stored in MEM at 4 C for 24 h. Mitochondria displaying substantial enlargement, loss of peripheral cristae and an electron-lucent matrix (arrows) were observed both in oocytes (A) and granulosa cells (B). O, oocyte; GC, granulosa cells; nu, nucleolus; m, mitochondria; bm, basement membrane. (A, 6000x, scale bar=5 µm; B, 10000x, scale bar = 2 µm). More severe alterations of ultrastructure were noticed after storage in saline solution at 4ºC for 24 h, at 20ºC for 12 h and at 38ºC for 6 h; in MEM at 20ºC for 24 h and at 38ºC for 12 h. Follicles contained high numbers of vacuoles spread throughout the cytoplasm of all cells, which often fused creating large vacated areas. Furthermore, signs of proliferation of the endoplasmic reticulum and damage to mitochondrial membranes and cristae were observed. Granulosa cells had a swollen aspect and presented a very low density of organelles. Some of these cells completely disappeared, resulting in a empty space. In oocytes, swelling of the nuclear cisterna and disruption of the nuclear envelope were observed along some segments of the nuclear outline (fig. 6). In some follicles kept in MEM at 20ºC for 24 h, the cytoplasm of oocyte and granulosa cells seemed to be clotted, possibly due to nuclear content leak.

72 72 Fig. 6. Electron micrographs of follicles stored in saline solution at 4 C for 24 h. A primordial follicle containing several vacuoles spread throughout the ooplasma as indicated by arrows (A, 5000x, scale bar=5 µm); the insert is displayed at a higher magnification (B, 12000x, scale bar=2 µm), note the occurrence of nuclear cisterna swelling (arrowhead). Another primordial follicle exhibiting widespread vacuolization and a granulosa cell with a very large vacated area indicated by an asterisk (C, 8000x, scale bar=2 µm); a higher magnification of the same follicle (D, 15000x, scale bar=2 µm), observe the discontinuity of the nuclear envelope (thick arrow). O, oocyte; GC, granulosa cells; nu, nucleolus; ne, nuclear envelope; m, mitochondria; bm, basement membrane.

73 Experiment II: assessment of viability of stored canine preantral follicles Preantral follicles were mechanically isolated from control and stored canine ovarian fragments and viability was assessed by trypan blue dye exclusion test (fig. 7). A total of 6,037 follicles were examined, with a range of 171 to 281 in each treatment. Fig. 7. Viability assessment of canine preantral follicles using trypan blue (TB) dye exclusion test. Isolated preantral follicles were incubated with 0.04% TB for five minutes and then classified as viable if the oocyte and <10% granulosa cells remained unstained (A), or as non-viable if oocyte and/or 10% granulosa cells were stained (B). Scale bars represent 10 µm. The effects of medium, temperature and time of storage on the percentages of viable preantral follicles are shown in Table 1. Maintenance in saline solution at 4 C or 20ºC for up to 6 h kept proportions of viable follicles similar (P > 0.05) to control values (time zero). A decrease (P < 0.01) of the percentages of viable follicles in relation to the control was observed after holding in saline solution at 4ºC or 20 C for 12 and 24 h, and at 38 C after all incubation times. With respect to MEM, storage of follicles at 4ºC or 20ºC for up to 12 h, and at 38 C for up to 6 h preserved viable follicles, whose percentages were similar (P > 0.05) to control values.

74 74 Table 1. Percentages (viable/total) of viable canine preantral follicles in control and after storage. Medium Temperature ( C) Time (h) Control 67 (186/279) Saline 4º 55% aba (151/276) 52% aba (132/255) 41% *aba (107/259) 37% *aba (87/234) 20º 54% aba (123/229) 52% abab (145/281) 39% *abb (97/246) 20% *bc (35/171) 38º 43% *ba (96/222) 43% *ba (115/265) 30% *bb (69/231) 23% *bb (45/195) MEM 4º 67% aa (172/258) 61% aa (159/259) 64% ca (176/275) 48% *ab (96/200) 20º 65% aa (171/264) 58% abab (160/277) 60% cab (162/272) 32% *abb (59/185) 38º 62% aa (138/222) 58% abab (148/255) 47% *ab (111/238) 22% *bc (42/189) (*) Differs significantly from control (P < 0.05); (a, b, c) different letters denotes significant difference between values within a column (P < 0.05); (A, B, C) different letters indicates significant difference between values of a row (P < 0,05). The effect of storage time on the percentages of viable follicles at each temperature and for each solution was analyzed. At 4 C, percentages of viable follicles in saline solution were not affected by the incubation time, but a significant reduction (P < 0.05) was observed in MEM from 12 to 24 h of holding. When ovarian fragments were kept at 20 C in saline solution, there was a decrease (P < 0.01) of the percentages of viable follicles after 12 h, and a further reduction from 12 h to 24 h; in MEM, this reduction was observed after 24 h only. A decrease (P < 0.05) in the proportions of viable follicles occurred with the increase of incubation time to 12 h in both solutions at 38 C. An additional decrease (P < 0.01) was observed in MEM at 38 C from 12 to 24 h.

75 75 Regarding the effect of temperature on percentages of viable follicles for a defined period of storage, a reduction (P < 0.05) in the viability of follicles was observed when ovarian fragments were maintained in MEM at 38 C for 12 h compared to 4ºC and 20ºC, and for 24 h, in relation to 4ºC only. The comparison between saline solution and MEM at a same temperature and incubation period showed that after storage at 38ºC for 2 h, and at all temperatures for 12 h, percentages of viable follicles were higher when ovarian fragments were maintained in MEM. Based on the results of morphological evaluation (experiment I) and viability assessment with trypan blue, which evidenced that storage in MEM at 4ºC is able to maintain viability of canine preantral follicles for the longer time (12 h) and to preserve ultrastructure more efficiently, as verified after 24 h of incubation, a second viability trial using this protocol was performed with five replicates. In addition to trypan blue testing, a fluorescence cell viability assay based on labeling of live and dead cells by calcein- AM and ethidium homodimer-1, respectively, was employed. Hoechst was integrated to the test to allow counting of total cell number for calculation of the percentage of viable granulosa cells within each follicle (fig. 8).

76 76 Fig. 8. Viability assessment of canine preantral follicles using fluorescent probes. (A) An isolated preantral follicle classified as viable (B) since cells were labeled by calcein- AM (green fluorescence). (D) A secondary follicle considered non-viable (E) as cells were marked with ethidium homodimer-1 (red fluorescence). (C, F) The same follicles in A and D respectively, stained with Hoechst 33342, which was also used in the assay to allow counting of the total number of cells for calculation of the percentage of dead cells. Scale bars represent 20 µm. After storing ovarian fragments in MEM at 4ºC for 12 h, percentages of viable follicles remained unaltered in comparison to control, as assessed by both trypan blue and calcein-am/ethidium homodimer assays, whose values did not differ from each other (P < 0.01). However, a significant decrease (P < 0.05) in percentages of viable follicles was observed with the increase of incubation to 24 h according to the two viability tests, which once more retrieved similar results (fig.9).

77 77 Fig. 9. Percentages of viable canine preantral follicles in fresh ovaries and after storage in MEM at 4ºC for 12 h or 24 h as assessed by trypan blue dye exclusion test and labeling with calcein-am and ethidium homodimer. (*) Differs significantly from control (P < 0.05); (a, b) different letters for values of viability assays within the same time of incubation denotes significant differences (P < 0.05); (A, B) different letters for results of a same test indicates significant differences between times of incubation (P < 0,05). 4. Discussion The present study evaluated for the first time the short term preservation of canine preantral follicles, which can be successfully accomplished using either 0.9% NaCl solution or MEM, but efficiency of each medium depends on temperature and time of holding. Percentages of MNPF remained unaltered, as observed by histological analysis, after incubation at 4ºC in both media for up to 24 h, and at 20ºC in saline solution and MEM for up to 12 h and 24 h respectively. Conversely, holding at physiologic temperature (38ºC) maintained percentages of MNPF for only 6 h in saline solution and 12 h in MEM. Therefore, hypothermia during storage of canine ovaries provides more efficient preservation of morphology of preantral follicles. This may be explained by a reduction of metabolism, followed by a decrease in requirements of oxygen and nutrients as well as metabolites production, which is critically important since cells are under ischemia. Indeed, hypothermia has proven to be an exceptional means of protection of any organ, with metabolic rate falling exponentially by about

78 78 50% per 6 C drop in organ temperature (Kirklin & Barrat-Boyes, 1993). Our results are in accordance with other works, which reported that maintenance at 4ºC and 20ºC preserves morphology of bovine (Lucci et al., 2004), caprine (Carvalho et al., 2001; Ferreira et al., 2001; Silva et al., 2000, 2001) and ovine (Andrade et al., 2001; Matos et al., 2004) preantral follicles for longer times than at physiological temperature. In addition, Wood et al. (1997) showed that maintenance in saline at 4ºC inhibited degeneration of cat follicles for 48 h after excision. Transmission electron microscopy revealed that, after storage in saline solution at 4ºC and 20ºC for 12 h, at 38 C for 2 h, in MEM at 4ºC and 20ºC for 24 h and at 38ºC for 12 h, preantral follicles considered morphologically normal in histology had alterations in ultrastructure indicative of degeneration. Therefore, electron microscopy proved to be a valuable tool to detect early morphological modifications due to atresia, which can be observed only at the ultrastructural level before becoming pronounced more grossly to be identified through light microscopy. Ultrastructure of ovine (Matos et al., 2004) and caprine (Silva et al., 2000) preantral follicles could be preserved for up to 24 h at 4ºC. The shorter periods of preservation of ultrastructure observed in the present study may be due to a higher sensibility of canine preantral follicles to ischemia and/or to cold storage in relation to follicles of small ruminants. Follicles in ovarian fragments maintained at 4ºC in MEM and saline solution for 24 h and 12 h respectively, and at 38ºC in saline solution for 2 h displayed the least degree of damaging, containing some enlarged mitochondria with reduced cristae and electron-lucent matrix. Silva et al. (2001) observed that damage to mitochondria is one of the first signs of degeneration in goat preantral follicles during storage in vitro. Ischemia impairs cellular energetic metabolism which decreases the activity of the Na+/K+-ATPase pump with a gain in sodium (Bonz et al., 1998). During mild ischemia, mitochondrial matrix swells moderately due to uptake of sodium (Garlid, 1996). Incubation in MEM at 20ºC for 24 h and at 38ºC for 12 h, and in saline solution at 4ºC for 24 h and at 20ºC for 12 h led to more severe changes characterized mainly by high numbers of vacuoles spread throughout the cytoplasm of both oocyte and granulosa cells. Silva et al. (2001) demonstrated that structural changes due to degeneration progress with the increase of preservation temperature and incubation time. Atresia in vivo is also characterized by cytoplasmic vacuoles in oocytes (van den Hurk et al., 1998) and granulosa cells (Hay et al., 1976), which may be originated from endoplasmic reticulum swelling. On other hand, these vacuoles may be derived from altered mitochondria, as observed in cryopreserved bovine oocytes by Fuku et al. (1995).

79 79 Notwithstanding previous studies on preservation of preantral follicles provided important knowledge on this issue, approaches were limited to analysis of morphology, which is not always correlated with the viability of follicles (Santos et al., 2007). Therefore, in the present work, viability assessment using the trypan blue dye exclusion test was employed. It was observed that storage in MEM at 4ºC and 20ºC maintained percentages of viable preantral follicles for up to 12 h, whilst at 38ºC such preservation was possible for up to 6 h. In saline, percentages of viable follicles were kept at 4ºC and 20ºC for up to 6 h, and at 38ºC, a significant decrease of viability was observed after only 2 h of incubation. Percentages of viable follicles were much lower than those of morphologically normal follicles in every treatment. This proves that a more precise determination of the proportions of follicles with adequate quality for subsequent applications such as in vitro culture may rely on viability assessment. We further analyzed viability of canine preantral follicles stored in MEM at 4ºC, the protocol which maintained proportions of viable follicles for the longer time (12 h) while preserving ultrastructure more efficiently after 24 h, using a more accurate method based on fluorescent probes. For this purpose, labeling of non-viable cells with disruption of plasma membrane was performed again by using ethidium homodimer-1, which enabled a better individualized visualization of dead cells through fluorescent staining of nuclei. Concomitantly, identification of viable cells was performed through detection of esterase activity with calcein-am. Hoechst was used to mark all nuclei in each follicle for total cell number counting and calculation of percentages of live cells. Results of this assay were similar to values observed with trypan blue testing, which thus proved to be a reliable, practical and quick method for viability assessment of preantral follicles. Accordingly, Poeschmann et al. (2008) observed a significant correlation between both methods while analyzing viability of feline preantral follicles. In this study, MEM was more efficient than saline solution to preserve viability of follicles after 12 h of incubation at any tested temperature. In addition, at 38ºC, MEM was able to maintain viability similar to control for 6 h, whilst, in saline solution, percentages of viable follicles were decreased after only 2 h of incubation. Furthermore, after 24 h at 4ºC, ultrastructure of follicles was altered to a lesser extent in ovarian fragments maintained in MEM. Therefore, composition of medium is critical for short-term storage of canine preantral follicles. We infer that endogenous nutrient resources in these follicles are very limited, thus it is necessary to provide supplementary nutritional compounds in preservation solutions. Although hypothermia may have reduced metabolic rates, these were possibly high enough to have depleted own energetic sources of follicles kept in saline at 4ºC and 20ºC after 6 h, leading to

80 80 degeneration, whereas MEM, which comprises sugars, aminoacids, vitamins and inorganic salts, supported survival for up to 12 h. In conclusion, preservation of canine preantral follicles during storage is achieved more efficiently through hypothermia in a nutritive medium. Maintenance of viability and ultrastructural integrity can be accomplished at 4 C and 20ºC in saline solution for 6 h or in MEM for 12 h, being the later solution also adequate at 38ºC for 6 h. We suggest the use of MEM at 4ºC for up to 12 h in order to provide optimal preservation of quality of canine preantral follicles for subsequent applications such as in vitro culture. Acknowledgements During the period of this work, Claudio A. P. Lopes received financial support from the National Council for Scientific and Technological Development (CNPq; doctoral scholarship) and the Coordination for Improvement of Graduate Personnel (CAPES; fellowship for studies abroad, PDEE, grant 5212/06-5), both institutions of the Brazilian Government. José Ricardo de Figueiredo was also recipient of a grant from CNPq. We would like to express our appreciation to the Center for Zoonosis Control (CCZ) of Fortaleza Municipality (Brazil) and to the veterinary clinics of the animal shelter Tierheim-Berlin and Tierklinik-Biesdorf (Germany), which gently provided the dog ovaries. We also thank Dr. Vicente J. F. Freitas (LFCR, UECE) for logistical support. References Andrade, E.R., Rodrigues, A.P.R., Amorim, C.A., Carvalho, F.C.A., Dode, M.A.N., Figueiredo, J.R., Short term maintenance of sheep preantral follicles in situ in 0.9% saline and Braun Collins solution. Small Rumin. Res. 41, Andrade, E.R., Amorim, C.A., Matos, M.H.T., Rodrigues, A.P.R., Silva, J.R.V., Dode, M.A.N., Figueiredo, J.R., 2002a. Evaluation of saline and coconut water solutions in the preservation of sheep preantral follicles in situ. Small Rumin. Res. 43, Andrade, E.R., Amorim, C.A., Costa, S.H.F., Ferreira, M.A.L., Rodrigues, A.P.R., Dode, M.A.N., Figueiredo, J.R., 2002b. Preliminary study of short-term preservation of ovine ovarian tissue containing preantral follicles in saline solution or TCM 199. Vet. Rec. 151,

81 81 Bonz, A., Siegmund, B., Ladilov, Y., Vahl, C.F., Piper, H.M., Metabolic recovery of isolated adult rat cardiomyocytes after energy depletion: existence of an ATP threshold? J. Mol. Cell. Cardiol. 30, Carvalho, F.C.A., Lucci, C.M., Silva, J.R.V., Andrade, E.R., Báo, S.N., Figueiredo, J.R., Effect of Braun Collins and saline solutions at different temperatures and incubation times on the quality of goat preantral follicles preserved in situ. Anim. Reprod. Sci. 66, Eppig, J.J., Schroeder, A.C., Capacity of mouse oocytes from preantral follicles to undergo embryogenesis and development to live young after growth, maturation, and fertilization in vitro. Biol. Reprod. 41, Ferreira, M.A.L., Brasil, A.F., Silva, J.R.V., Andrade, E.R., Rodrigues, A.P.R., Figueiredo, J.R., Effects of storage time and temperature on atresia of goat ovarian preantral follicles held in M199 with or without indole-3-acetic acid supplementation. Theriogenology 55, Figueiredo, J.R., Hulshof, S.C.J., Van den Hurk, R., Ectors, F.J., Fontes, R.S., Nusgens, B., Bevers, M.M., Beckers, J.F., Development of a combined new mechanical and enzymatic method for the isolation of intact preantral follicles from fetal, calf and adult bovine ovaries. Theriogenology 40, Fuku, E., Xia, L., Downey, B.R., Ultrastructural changes in bovine oocytes cryopreserved by vitrification. Cryobiology 32, Garlid, K.D., Cation transport in mitochondria the potassium cycle. Biochim. Biophys. Acta 1275, Hay, M.F., Cran, D.G., Moor, R.M., Structural changes occurring during atresia in sheep ovarian follicles. Cell Tissue Res. 169, IUCN IUCN Red List of Threatened Species. < Downloaded on 17 April Jewgenow, K., Penfold, K.L., Meyer, H.H.D., Wildt D.E., Viability of small preantral ovarian follicles from domestic cats after cryoprotectant exposure and cryopreservation. J. Reprod. Fertil. 112, Kirklin, J.W., Barratt-Boyes, B.G., Cardiac Surgery, Second Edition. Churchill- Livingstone, New York, USA., pp. 91. Lee, H.S., Yin, X.J., Kong, I.K., Sensitivity of canine oocytes to low temperature. Theriogenology 66, Lucci, C.M., Kacinskis, M.A., Rumpf, R., Báo, S.N., Effects of lowered temperatures and media on short-term preservation of zebu (Bos indicus) preantral ovarian follicles. Theriogenology 61,

82 82 Lucci, C.M., Schreier, L.L., Machado, G.M., Amorim, C.A., Báo, S.N., Dobrinsky, J.R., Effects of Storing Pig Ovaries at 4 or 20C for Different Periods of Time on the Morphology and Viability of Pre-Antral Follicles. Reprod. Domest. Anim. 42, Matos, M.H.T., Andrade, E.R., Lucci, C.M., Báo, S.N., Silva, J.R.V., Santos, R.R., Ferreira, M.A.L., Costa, S.H.F., Celestino, J.J.d.H., Figueiredo, J.R., Morphological and ultrastructural analysis of sheep primordial follicles preserved in 0.9% saline solution and TCM 199. Theriogenology 62, Poeschmann, M., Fassbender, M., Lopes, C., Dorresteijn, A., Jewgenow, K., Viability assessment of primordial follicles of domestic cats to develop cryopreservation protocols for ovarian tissue, 41st Annual Conference of Physiology and Pathology of Reproduction and 33rd Mutual Conference on Veterinary and Human Reproductive Medicine. Reprod. Domest. Anim. 43 (Suppl. 1), 25. Santos, R.R., Tharasanit, T., van Haeften, T., Figueiredo, J.R., Silva, J.R.V., van den Hurk, R., Vitrification of goat preantral follicles enclosed in ovarian tissue by using conventional and solid-surface vitrification methods. Cell Tissue Res. 327, Silva, J.R.V., Lucci, C.M., Carvalho, F.C.A., Báo, S.N., Costa, S.H.F., Santos, R.R., Figueiredo, J.R., Effect of coconut water and Braun Collins solutions at different temperatures and incubation times on the morphology of goat preantral follicles preserved in vitro. Theriogenology 54, Silva, J.R.V., Báo, S.N., Lucci, C.M., Carvalho, F.C.A., Andrade, E.R., Ferreira, M.A.L., Figueiredo, J.R., Morphological and ultrastructural changes occuring during degeneration of goat preantral follicles preserved in vitro. Anim. Reprod. Sci. 66, Taş, M., Evecen, M., Özdaş, Ö.B., Cirit, Ü, Demir, K., Birler, S., Pabuccuğlu, S., Effect of transport and storage temperature of ovaries on in vitro maturation of bitch oocytes. Anim. Reprod. Sci. 96, Telfer, E.E., In vitro development of pig preantral follicles. Reprod. Suppl. 58, van den Hurk, R., Spek, E.R., Hage, W.J., Fair, T., Ralph, J.H., Schotanus, K., Ultrastructure and viability of isolated bovine preantral follicles. Hum. Reprod. Update 4, Wood, T.C., Montali, R.J., Wildt, D.E., Follicle-oocyte atresia and temporal taphonomy in cold-stored domestic cat ovaries. Mol. Reprod. Dev. 46,

83 83 8 CAPÍTULO III Criopreservação de folículos pré-antrais caninos utilizando-se etilenoglicol e glicerol Cryopreservation of canine preantral follicles using ethylene glycol and glycerol Brazilian Journal of Veterinary Research (Submetido, 2008)

84 84 Cryopreservation of canine preantral follicles using ethylene glycol and glycerol C.A.P. Lopes 1,3, M.C.A. Luque 2, S. B. Vasconcelos 2, G.M. Silva 1, S.N. Báo 2, J.R. Figueiredo 1 1 LAMOFOPA, PPGCV, Faculty of Veterinary, State University of Ceará, Brazil. 2 Laboratory of Electron Microscopy, Institute of Biology, University of Brasília, Brazil. 3 Corresponding author. claudioapl@gmail.com Resumo O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos da congelação lentadescongelação rápida sobre a morfologia de folículos pré-antrais caninos utilizando-se glicerol e etilenoglicol. Fragmentos de tecido ovariano canino foram equilibrados por 20 min a 20ºC em Meio Essencial Mínimo contendo um dos crioprotetores mencionados à concentração de 1,5 M, sendo então congelados, estocados em nitrogênio líquido (-196ºC) por uma semana e descongelados. A morfologia dos folículos foi analisada através de histologia e microscopia eletrônica de transmissão. As percentagens de folículos pré-antrais morfologicamente normais (FPMN) foram significativamente reduzidas após a exposição ao glicerol em relação ao controle, o que não foi observado com o etilenoglicol. Após a congelação/descongelação, as percentagens de FPMN apresentaram-se significativamente inferiores em comparação ao controle utilizando-se ambos crioprotetores, que não diferiram estatisticamente entre si. Entretanto, a microscopia eletrônica de transmissão revelou que apenas os folículos congelados com etilenoglicol possuíam ultra-estrutura normal. Como conclusão, este estudo demonstrou que a morfologia de folículos pré-antrais caninos pode ser preservada através de congelação lenta seguida de descongelação rápida utilizando-se etilenoglicol a 1,5 M. Abstract The aim of the present study was to evaluate the effects of slow freezing-rapid thawing using glycerol and ethylene glycol on morphology of canine preantral follicles. Slices of canine ovarian tissue were equilibrated for 20 min at 20ºC in minimum essential medium containing either cryoprotectants at 1.5 M, and then frozen, stored in liquid nitrogen (-196ºC) for a week and thawed. Morphology of follicles was analyzed through histology and transmission electron microscopy. The results showed that the percentages of morphologically normal preantral follicles (MNPF) were significantly

85 85 reduced after exposure to glycerol, but not to ethylene glycol in comparison to the control. After freezing/thawing, the percentages of MNPF were significantly decreased as compared to the control using either cryoprotectants, which were statistically similar in relation to each other. However, transmission electron microscopy revealed that only follicles frozen with ethylene glycol had normal ultrastructure. In conclusion, this study demonstrated that morphology of canine preantral follicles can be successfully preserved through slow freezing-rapid thawing using 1.5 M ethylene glycol. Keywords: cryopreservation, slow freezing, preantral follicles, canine. Introduction Cryopreservation of gametes is potentially an important tool for the conservation of endangered species and biodiversity maintenance. Significant advances in this field has been obtained through genome resource banking which has been allowed by the relative success achieved with semen cryopreservation, in which widely implemented protocols are used. Conversely, almost all mammalian species oocytes studied have proven very difficult to successfully cryopreserve (Woods et al., 2004). The process of cryopreservation can cause degeneration of oocytes, disassembly of cell microtubules resulting in the disruption of the spindle apparatus followed by aneuploidy, and zona pellucida (ZP) hardening which thus may impair the subsequent fertilization process. These effects can be a direct consequence of intracellular ice-crystal formation, rapid or massive osmotic and temperature change and the relative toxicity of cryoprotectant under certain conditions (Ko et al., 2008). In order to overcome these problems, the cryopreservation of preantral ovarian follicles emerges as a promising alternative for female gamete cryobanking. Immature oocytes in preantral follicles still have not metaphase spindle fibers and lack a ZP and cortical granules. Moreover, such oocytes are far smaller and less differentiated than Metaphase II oocytes. All these characteristics are potentially beneficial for freeze preservation (Oktay et al., 1998). Together with these qualitative advantages, this strategy for female gamete banking can also potentially provide a much higher quantity of fertilizable oocytes, because thousands of these follicles can be obtained from an ovary (Rutherford & Gosden, 1999). Cryopreservation of isolated primordial follicles through slow freezing was successfully achieved in the mouse (Carroll and Gosden, 1993). Follicles were transplanted to sterilized hosts which could afterwards produce normal offspring after mating. Live young were also obtained after in vitro culture, maturation and fertilization

86 86 of mouse oocytes within frozen-thawed secondary follicles (Smitz and Cortvrindt, 1998). More recently, live births after orthotopic autotransplantation of cryopreserved ovarian tissue were described in a woman (Donnez et al., 2004), as well as in ewes (Bordes et al., 2005). Although cryopreservation of preantral follicles from carnivores would be specially important since many wild species of these are currently threatened by extinction, few studies have been published on this topic. Jewgenow et al. (1998) demonstrated that small preantral follicles isolated from cat ovaries survive cryopreservation, remaining structurally intact and physiologically active after thawing. In another work, Bosch et al. (2004) reported the survival of cat ovarian tissue subjected to slow freezing-thawing and transplantation to an immunocompromised host, which was followed by development of follicles from early up to the antral stage. With respect to canids, to our knowledge, only one attempt to cryopreserve preantral follicles is reported. Ishijima et al. (2006) vitrified canine ovarian cortex and xenotransplanted to immunodeficient mice. Although antral follicle formation did not occur, grafted tissue was morphological normal and proliferating cell nuclear antigen immunoreactivity was detected in primary follicles. Nonetheless, detailed morphological and quantitative analyses on cryopreservation of canine preantral follicles are still to be performed, and knowledge gathered in this species could be applied to endangered canids. The aim of this study was to evaluate the cryopreservation of canine preantral follicles through slow freezing of ovarian tissue using 1.5 M glycerol (GLY) or ethylene glycol (EG). For this purpose, morphology of follicles after exposure to the cryoprotectants and freezing-thawing was analyzed through histology and transmission electron microscopy (TEM). Materials and Methods Collection and preservation of canine ovaries Ovarian pairs (n=5) were aseptically collected at local veterinary clinics during ovariohysterectomy of healthy mixed-breed bitches (Canis lupus familiaris), whose reproductive history and age were unknown, but it was estimated that they were months old. After removal from the bursa ovarica and excision of eventual corpora lutea using a scalpel, ovaries were placed into 50 ml tubes (Corning Glass Works, Corning, NY, USA) containing 15 ml of HEPES-buffered Minimum Essential Medium (H-MEM, osmolarity 280 mosmol/l, ph7.2; Sigma, St. Louis, MO, USA). Then,

87 87 transportation to the laboratory was carried out at 4 C within one hour in thermoflasks filled with water. All procedures were performed aseptically. Exposure test At the laboratory, five fragments of cortex (approximately 3 x 3 x 1 mm) were cut from each pair of ovaries, and one of these pieces was randomly selected as control and fixed for histology and ultrastructural analysis. The remaining samples were placed into cryovials containing 1.8 ml of freezing medium which consisted of Minimum Essential Medium (MEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1.5 M GLY or EG, prepared immediately prior to use under sterile conditions. After incubation at 20ºC for 20 min (equilibration period), half of the fragments was subjected to cryoprotectant removal according to the method described by Candy et al. (1997). Briefly, three washes of 5 min each in MEM with 10% FBS were performed at room temperature (RT, approximately 25 C). Samples were subsequently fixed for histology and TEM in order to evaluate effects of exposure to cryoprotectants on preantral follicles. Freezing-thawing The cryovials with the remaining fragments were transferred to a biological programmable freezer (Freeze Control, CryoLogic Pty Ltd.,Waverley, Australia) pre-set at 20 C. The following program was used to freeze the tissue samples: cooling from 20 to -7 C at a rate of 2 C/min; holding at -7 C for 15 min (after 5 min, ice crystal formation - seeding - was induced manually by touching the vials with a forceps prechilled in liquid nitrogen); temperature was then lowered 0.3 C/min to -30 C, and further reduced by 0.15 C/min to -33 C; finally, the vials were plunged into liquid nitrogen (-196 C) and stored for 7 days. Thereafter, ovarian tissue pieces were thawed through rapid warming by exposing the cryovials to air at RT for 1 min, followed by immersion in a water bath at 38ºC for 3 min. Cryoprotectant removal was carried as describe for the exposure test, and pieces of ovarian cortex were fixed for histological and ultrastructural analyses. This experiment was repeated five times. Histological analysis In order to assess the morphology of canine preantral follicles submitted to the different treatments, fragments of ovarian tissue were fixed in Carnoy for 12 h,

88 88 dehydrated in a graded series of ethanol, clarified with xylene, embedded in paraffin wax and serially sectioned at 7 μm. Every fifth section was mounted on glass slides, stained with periodic acid Schiff (PAS)-hematoxylin and evaluated by light microscopy at a 400x magnification (Zeiss, Germany). Preantral follicles were defined as an oocyte surrounded either by one layer of flattened or cuboidal granulosa cells, or several layers of cuboidal granulosa cells with no antrum. Follicular morphology was evaluated based on the integrity of the oocyte, granulosa cells and basement membrane. Preantral follicles were classified and counted as (i) morphologically normal, when containing an oocyte with regular shape and uniform cytoplasm, and organized layers of granulosa cells; (ii) degenerated grade 1, when the oocyte exhibited pycnotic nucleus and/or ooplasma shrinkage; (iii) degenerated grade 2, when in addition to oocyte damage, granulosa cells layers became disorganized, detached from the basement membrane and/or included enlarged cells. To avoid evaluating and counting a follicle more than once, preantral follicles were analyzed only in the sections where oocyte nucleus was observed. All the slides were coded to prevent observer bias. Ultrastructural analysis In order to better examine follicular morphology, TEM was performed to analyze ultrastructure of preantral follicles from the control as well as from treatments that did not differ statistically from control in histology. A portion with a maximum dimension of 1 mm 3 was cut from each fragment of ovarian tissue and fixed in modified Karnovsky solution (2% paraformaldeyde and 2% glutaraldeyde in 0.1 M sodium cacodylate buffer ph 7.2) for 3 h at room temperature (RT, approximately 25 C). After three washes in sodium cacodylate buffer, specimens were post-fixed in 1% osmium tetroxide, 0.8% potassium ferricyanide and 5 mm calcium chloride in 0.1 M sodium cacodylate buffer for 1 h at RT. The samples were then dehydrated through a gradient of acetone solutions and thereafter embedded in Spurr s epoxy resin. Afterwards, semi-thin sections (3 μm) were cut, stained with toluidine blue and analyzed by light microscopy at a 400x magnification. Ultra-thin sections (60 70 nm) were obtained from preantral follicles classified as morphologically normal in semi-thin sections, according to the criteria adopted in histology. Subsequently, ultra-thin sections were contrasted with uranyl acetate and lead citrate, and examined under a Jeol 1011 (Jeol, Tokyo) transmission electron microscope operating at 80 kv.

89 89 Statistical analysis All experiments were replicated five times. Analysis of variance (ANOVA) of the data was performed using the GLM procedure of the software SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Differences of percentages of morphologically normal preantral follicles (MNPF) and degenerated follicles between control and treatments were determined by t-test. Differences were considered statistically significant when P < Results Histological analysis of ovarian fragments before and after exposure to cryoprotectants and freezing-thawing Thirty preantral follicles were examined per treatment in each replicate through histology, resulting in a total of 750 analyzed follicles. MNPF in control as well as after exposure to cryoprotectants and freezing-thawing exhibited a spherical or elliptical oocyte with a large central or eccentric nucleus and uniform cytoplasm. Granulosa cells without pycnotic nuclei were well-organized in layers surrounding the oocyte and a distinguishable intact basement membrane could be observed. Degenerated grade 1 follicles showed a retraced oocyte with or without a pycnotic nucleus, and occasionally a strongly eosinophilic cytoplasm, whilst layers of granulosa cells remained unaltered. In degenerated grade 2 follicles, along with the described oocyte alterations, granulosa cells layers became disorganized into a low density mass of cells which were many times swollen and/or detached from basement membrane. Occurrence of pycnotic bodies in granulosa cells or rupture of the basement membrane was not observed. The percentages of MNPF observed in the control and after the exposure and freezing-thawing tests are shown in figure 1. Immersion of ovarian fragments into the solution containing 1.5 M EG had no effect on the percentages of normal follicles as compared with the control (P>0.05). Conversely, exposure to 1.5 M GLY reduced significantly (P <0.05) the percentages of MNPF in comparison to the control and to immersion in 1.5 M EG. After freezing-thawing, the percentages of normal follicles were significantly decreased as compared to the control (P <0.05) using either cryoprotectant, which were statistically similar in relation to each other (P >0.05). For both cryoprotectants, it was observed that post-thawing percentages of MNPF were

90 90 significantly reduced in relation to the values obtained after the exposure test (P <0.05). Fig. 1. Percentages of morphologically normal preantral follicles in ovarian tissue before (control) and after exposure and freezing-thawing tests in medium containing 1.5 M EG or GLY. (*) Differs significantly from the control (P <0.05); (a, b) different letters for the same test (exposure or freezing-thawing) denote significant differences between media (P <0.05); (A, B) different letters for a given cryoprotectant indicates significant differences among exposure and post-thawing values (P <0.05). Regarding to the distribution of follicular degeneration among the different experimental groups, table 2 shows the percentages of grade 1 and grade 2 degenerated preantral follicles in ovarian fragments from the control, exposure and freezing-thawing tests. A significant (P <0.05) predominance of degenerated grade 1 follicles over those of grade 2 was observed in all treatments. In the exposure test, percentages of degenerated grade 1 follicles increased significantly as compared to the control (P <0.05) when GLY was used, but remained unchanged in the presence of EG (P >0.05). Percentages of degenerated grade 2 were similar to control using either GLY or EG (P >0.05).

91 91 Table 2. Degenerated preantral follicles (%) in control and after exposure and freezingthawing tests. Exposure test Freezing-thawing Control GLY EG GLY EG Grade 1 35* aad 16 bad 40* aad 47* abd 13 d Grade 2 6 aae 5 aae 17* abe 12* abe 4 e *P < 0:05, significantly differs from control. Different superscripts (a, b) differ significantly between cryoprotectants at a same test. Different superscripts (A, B) differ significantly between exposure test and cryopreservation. Different superscripts (d, e) differ significantly between Grades 1 and 2 of degeneration. After freezing-thawing, significantly (P <0.05) higher values of degenerated grade 1 and 2 follicles in comparison to the control were observed with both cryoprotectants, which were similar to each other (P >0.05). Percentages of degenerated grade 1 follicles were significantly higher after cryopreservation as compared to the exposure test when EG was used (P <0.05), but not with GLY (P >0.05). Regarding percentages of degenerated grade 2 follicles, a significant (P <0.05) rise was observed after freezing-thawing relative to exposure to either cryoprotectants. Ultrastructural analysis TEM of frozen-thawed preantral follicles was performed in order to assess the ultrastructure of follicles classified as normal at the histological level. At least five follicles per group were analyzed. Normal follicles contained an oocyte displaying a very homogenous cytoplasm plenty of round shaped mitochondria with continuous membranes, few peripheral cristae and electron-dense granules. Some elongated forms with parallel cristae could also be seen. Small Golgi apparatus cisternae were rarely observed. Smooth and rough endoplasmic reticulum were present, either as isolated aggregations or as complex associations with mitochondria. The nuclei of oocytes were large and usually round, well delimited by the nuclear envelope. The chromatin was uncondensed and a nucleolus could often be identified. A few vacuoles were also observed. Granulosa cells were small and presented a high nucleus-tocytoplasm ratio. Their irregularly shaped nuclei contained loose chromatin in the inner part and small peripheral aggregates of condensed chromatin. The cytoplasm exhibited

92 92 a great number of mitochondria and well-developed smooth and rough endoplasmic reticulum. The cellular membranes of oocyte and surrounding granulosa cells were closely juxtaposed, and sometimes few short microvilli could be observed. A distinct continuous basement membrane surrounded follicles and was tightly attached to ovarian stroma (Fig. 2A-C). The ultrastructural pattern described above was observed in normal follicles from control and freezing-thawing with EG. When GLY was used for freezing, despite some follicles displayed normal morphology, changes could be detected in follicles evaluated as normal in semi-thin sections by light microscopy. The ooplasm presented a reduced electron density and lower numbers of organelles, heterogeneously distributed in small clusters. Some large vacuoles could also be seen. In granulosa cells, loss of cytoplasm content was noticed, leading to the existence of very large empty spaces in some cases (Fig. 2D). Discussion The present study evaluated for the first time the cryopreservation of canine preantral follicles through slow freezing, employing GLY and EG as cryoprotectants. It was demonstrated that ultrastructural integrity of such follicles can be successfully maintained with the use of 1.5 M EG. Exposure of canine ovarian tissue to 1.5 M GLY at 20ºC during 20 minutes resulted in a significant reduction of MNPF percentages. An osmotic stress due to the presence of cryoprotectants in the freezing medium is one of the primary theories of injury during cryopreservation, whilst the inherent toxicity of these compounds is also an important consideration (Mullen et al., 2008). GLY induces severe osmotic damage to the cytoplasm due to its low membrane permeability (Szell et al., 1986). In accordance to our results, it has been demonstrated that exposure of ovarian tissue to 1.5 GLY results in a substantial reduction of the percentage of normal follicles (caprine: Rodrigues et al., 2004; ovine: Santos et al., 2006). Therefore, we suggest that the current method for exposure to GLY is inadequate and some protocol adjustments such as gradual addition/removal and use of an osmotic buffer like sucrose (Adams et al., 2003) should be done to minimize osmotic damage.

93 93 Fig. 2. Electron micrographs of canine preantral follicles from control (a) and frozenthawed using 1.5 M EG (b, c) or GLY (d). In Fig. 2a (2,500x, scale bar= 10 µm) and Fig. 2b (3,000x, scale bar= 10 µm), normal follicles containing an oocyte with homogenous cytoplasm and a large nucleus well delimited by the nuclear envelope are displayed. A nucleolus could often be identified (nu). In Fig. 2c (8,000x, scale bar= 2 µm), the same follicle shown in Fig. 2b is displayed at a higher magnification. Note the great number of intact mitochondria (m) and smooth endoplasmic reticulum (ser) in the cytoplasm of the oocyte and surrounding granulosa cells cryopreserved with EG. In Fig. 2d (10,000x, scale bar= 2 µm), observe the reduced electron density of the ooplasm, the lower numbers of organelles and a large empty space (asterisk) after freezing-thawing with GLY. O, oocyte; GC, granulosa cells; l, lipid droplet. On other hand, 1.5 M EG, which has a molecular weight of compared with for GLY (Massip, 2001), did not exert any effect on preantral follicles after

94 94 exposure of ovarian tissue under the same conditions of GLY addition. Amorim et al. (2003) exposed isolated ovine primordial follicles to EG at different concentrations and observed that viability was maintained in concentrations up to 2 M. Sommerfeld and Niemann (1999) showed that bovine embryos are able to survive exposure to concentrations of 3.6 M EG without appreciable loss of developmental capacity. Conversely, Lucci et al. (2004) observed that exposure of zebu bovine ovarian tissue to 1.5 M EG resulted in a high decrease of MNPF, which was greater than that observed after exposure to GLY under the same conditions. This discrepancy of EG cytotoxicity might reflect a higher sensitivity of bovine preantral follicles to chemical effects caused by this cryoprotectant compared to canine follicles. This is in accordance with the fact that cells from different species can respond very differently to a cryoprotectant (Schellander et al., 1994; Cocero et al., 1996). After freezing and thawing, the percentages of MNPF were significantly reduced from values observed after exposure to both cryoprotectants, which showed similar preservation efficiency. Therefore, the freezing and/or thawing processes resulted in damage to follicles, probably due to intracellular ice formation (IIF). We hypothesize that the concentration of cryoprotectants used (1.5 M) was not enough to protect cells against crioinjury. Permeating cryoprotectants such as GLY and EG are small molecules that permeate the membranes of cells, form hydrogen bonds with water molecules and prevent ice crystallization. At high enough concentrations, they inhibit the formation of the characteristic ice crystal and lead to the development of a solid, glasslike, so-called vitrified state in which water is solidified, but not expanded (Jain and Paulson, 2006). Rodrigues et al. (2004) demonstrated that a rise in concentration of EG from 1.5 to 3.0 M was able to significantly increase percentages of normal preantral follicles during cryopreservation of caprine ovarian tissue. In the present study, since follicles proved to not be affected by exposure to EG at 1.5 M, we suggest that concentration of this cryoprotectant may be increased up to a threshold on which cytotoxic and/or osmotic effects are still inexistent and protection against cryoinjuries is maximum. Regarding to freezing with GLY, we also have to consider that the protocol of cryoprotectant addition might have not been adequate for complete permeation of cells, which resulted in intracellular concentrations not reaching sufficient levels for cryoprotection. Candy et al. (1997) showed that the survival rate of mice primordial follicles after freezing increased in function of exposure time to GLY, which suggests that the extent of follicular survival is at least in part determined by the final tissue concentration achieved. In all treatments, percentages of grade 1 degenerated follicles were higher than that for grade 2 degenerated follicles, which characterizes that oocytes are more

95 95 susceptible than granulosa cells to degeneration in vivo and after exposure to cryoprotectants and freezing-thawing. The increase of grade 1 degenerated follicles after freezing and thawing observed in this work was also found in studies with nonhuman primate (Candy et al., 1995), human (Hovatta et al., 1996), bovine (Lucci et al., 2004), caprine (Rodrigues et al., 2004a,b) and ovine (Santos et al., 2006) ovarian tissue. We supposed that oocytes are less resistant to exposure to cryoprotectants and cryopreservation than granulosa cells because of its lower surface area-to-volume ratio, which reduces permeability to both water and ACPs (Wood et al., 2004). TEM performed on frozen-thawed follicles classified as normal in histology revealed that only those frozen with EG had preserved ultrastructure, whilst follicles frozen with GLY showed severe ultrastructural damages. Therefore, TEM proved to be an essential tool to detect damage due to the freezing-thawing process which can be observed only at the ultrastructural level but not through light microscopy. The most severe damage observed was made up of large empty spaces not surrounded by membranes. This feature suggests the occurence of crystallization, and was also observed in glycerol-frozen ovine embryos (Cocero et al., 2002). Once established, knowledge on cryopreservation of canine preantral follicles could be applied to endangered canids in order to lengthen the genetic lifespan of each rare female. To this end, development of in vitro culture systems capable to promote growth and maturation of this vast pool of oocytes has to be accomplished. However, at present, such systems still do not lead to normal full follicle development in nonrodent species, for which oocyte growth is a long-term, coordinated and complex process, and the time required to reach the mature stage is thought to be up to several months. Currently, xenotransplantation into immunodeficient recipients seems to be one the most promising ways for obtaining oocytes from ovaries for further exploration of assisted reproduction techniques (Jewgenow and Paris, 2006). Fassbender et al. (2007) demonstrated the survival of cat ovarian cortex tissue transplanted under the kidney capsule of athymic nude rats. Follicular development was monitored through high-resolution ultrasonography, and cumulus oocytes complexes could be collected and in vitro matured. In conclusion, preservation of morphology of canine preantral follicles can be accomplished through slow freezing and rapid thawing using 1.5 M EG. Nevertheless, further studies are necessary to evaluate developmental capacity of such follicles, which demands the establishment of in vitro culture systems or use of transplantation approaches.

96 96 Acknowledgements CAP Lopes and JR Figueiredo are recipients of grants from CNPq (Brazil). We would like to express our appreciation to the Center for Zoonosis Control (CCZ) of Fortaleza Municipality (Brazil), which gently provided the canine ovaries. References Adams SL, Kleinhans FW, Mladenov PV, Hessian PA Membrane permeability characteristics and osmotic tolerance limits of sea urchin (Evechinus chloroticus) eggs. Cryobiology 47:1 13. Amorim CA, Rondina D, Rodrigues APR, Costa SHF, Figueiredo JR, Gonçalves PBD, Giorgetti A Isolated ovine primordial follicles cryopreserved in different ethylene glycol concentrations. Theriogenology 60, Bordes A, Lornage J, Demirci B, Franck M, Courbiere B, Guerin J F, Salle B Normal gestations and live births after orthotopic autograft of vitrifiedwarmed hemi-ovaries into ewes. Hum. Reprod. 20, Bosch P, Hernandez-Fonseca HJ, Miller DM, Wininger JD, Massey JB, Lamb SV, Brackett BG Development of antral follicles in cryopreserved cat ovarian tissue transplanted to immunodeficient mice. Theriogenology 61, Candy CJ, Wood MJ, Whittingham DG Follicular development in cryopreserved marmoset ovarian tissue after transplantation. Hum Reprod 9: Candy CJ, Wood MJ, Whittinghan DG Effect of cryoprotectants on the survival of follicles in frozen mouse ovaries. J. Reprod. Fertil. 110, Carroll J, Gosden RG Transplantation of frozen-thawed mouse primordial follicles. Hum. Reprod. 8, Cocero MJ, Lopez-Sebastian A, Barragan ML, Picazo RA Differences on post-thawing survival between ovine morula and blastocysts cryopreserved with ethylene glycol and glycerol. Cryobiology 33: Cocero MJ, de la Espina SMD, Aguilar B Ultrastructural Characteristics of Fresh and Frozen-Thawed Ovine Embryos Using Two Cryoprotectants. Biol. Reprod. 66, Donnez J, Dolmans M, Demylle D, Jadoul P, Pirard C, Squifflet, J, Martinez- Madrid, B, Van Langendonckt A Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. Lancet 364,

97 97 Fassbender M, Hildebrandt TB, Paris MC, Colenbrander B, Jewgenow K High-resolution ultrasonography of xenografted domestic cat ovarian cortex. J. Reprod. Dev. 53, Hovatta O, Silye R, Krausz T, Abir R, Margara R, Trew G, Lass A, Winston RM Cryopreservation of human ovarian tissue using dimethylsulphoxide and propanediol sucrose as cryoprotectant. Hum Reprod 11: Ishijima T, Kobayashi Y, Lee DS, Ueta YY, Matsui M, Lee JY, Suwa Y, Miyahara K, Suzuki H Cryopreservation of canine ovaries by vitrification. J. Reprod. Dev. 52, Jain,JK, Paulson RJ Oocyte cryopreservation. Fertil. Steril. 86, Jewgenow K, Penfold LM, Meyer HH, Wildt DE Viability of small preantral ovarian follicles from domestic cats after cryoprotectant exposure and cryopreservation. J. Reprod. Fertil. 112, Jewgenow K, Paris MCJ Preservation of female germ cells from ovaries of cat species. Theriogenology 66, Ko CS, Ding DC, Chu TW, Chu YN, Chen IC, Chen WH, Wu GJ Changes to the meiotic spindle and zona pellucida of mature mouse oocytes following different cryopreservation methods. Animal Reproduction Science 105 (2008) Lucci CM, Kacinskis MA, Lopes LHR, Rumpf R, Báo SN Effect of different cryoprotectants on the structural preservation of follicles in frozen zebu bovine (Bos indicus) ovarian tissue. Theriogenology 61, Massip A. Cryopreservation of embryos of farm animals. Reprod Domest Anim 2001;36: Mullen SF, Li M, Li Y, Chen Z, Critser JK Human oocyte vitrification: the permeability of metaphase II oocytes to water and ethylene glycol and the appliance toward vitrification. Fertil. Steril. 89, Oktay K, Newton H, Ausbard Y, Salha O, Gosden RG Cryopreservation of immature human oocytes and ovarian tissue: an emerging technology? Fertil Steril 1998;354:1 7. Rodrigues APR, Amorim CA, Costa SHF, Matos, MHT, Santos RR, Lucci CM, Báo SN, Figueiredo JR. 2004a. Cryopreservation of caprine ovarian tissue using glycerol and ethylene glycol. Theriogenology 61, Rodrigues APR, Amorim CA, Costa SHF, Matos MHT, Santos RR, Lucci CM, Báo SN, Ohashi OM, Figueiredo JR. 2004b. Cryopreservation of caprine ovarian tissue using dimethylsulphoxide and propanediol. Anim. Reprod. Sci. 84,

98 98 Rutherford AJ, Gosden RG Ovarian tissue cryopreservation: a practical option? Acta Paediatr Suppl 1999;433:13 8. Santos RR, Rodrigues APR, Costa SHF, Silva JRV, Matos MHT, Lucci CM, Báo SN, Van den Hurk R, Figueiredo JR Histological and ultrastructural analysis of cryopreserved sheep preantral follicles. Anim. Reprod. Sci. 91, Schellander K, Peli J, Schmoll F, Brem G Effects of different cryprotetants and carbohydrates on freezing of matured and unmatured bovine oocytes. Theriogenology;42: Smitz, J., Cortvrindt, R Follicle culture after ovarian cryostorage. Maturitas 30, Sommerfeld V, Niemann H Cryopreservation of bovine in vitro produced embryos using ethylene glycol in controlled freezing or vitrification. Cryobiology 38, Szell A, Shelton JN Role of equilibration before rapid freezing of mouse embryos. J. Reprod. Fertil. 78, Woods EJ, Benson JD, Agca Y, Critser JK Fundamental cryobiology of reproductive cells and tissues. Cryobiology 48:

99 99 9 CAPÍTULO IV Criopreservação bem-sucedida de folículos pré-antrais caninos utilizando-se dimetilsulfóxido e 1,3-propanodiol Successful cryopreservation of canine preantral follicles using dimethyl sulfoxide and 1,3-propanediol Reproduction, Fertility and Development (Submetido, 2008)

100 100 Successful cryopreservation of canine preantral follicles using dimethyl sulfoxide and 1,3-propanediol C. A. P. Lopes A,B,E, A. K. F. Lima A, R. R. Santos C, M. H. T. Matos A, A. P. R. Rodrigues A, S. N. Báo D, K. Jewgenow B, J. R. Figueiredo A A LAMOFOPA, PPGCV, Faculty of Veterinary, State University of Ceará, Brazil. B Leibniz-Institute for Zoo and Wildlife Research Berlin, Germany. C Department of Equine Sciences, Pharmaceuticals, Pharmacology and Toxicology Division, Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht University, The Netherlands. D Laboratory of Electron Microscopy, Institute of Biology, University of Brasília, Brazil. E Corresponding author. lopes@izw-berlin.de Resumo A criopreservação de folículos pré-antrais é uma abordagem potencialmente importante para a conservação de espécies ameaçadas pela extinção, uma vez que técnicas têm sido desenvolvidas para a obtenção de oócitos fertilizáveis a partir desta vasta fonte de gametas. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da congelação lenta-descongelação rápida utilizando-se dimetilsulfóxido (DMSO) ou 1,3-propanodiol (PROH) sobre a morfologia e viabilidade de folículos pré-antrais caninos. Fragmentos de tecido ovariano canino foram equilibrados por 20 min a 20ºC em Meio Essencial Mínimo contendo um dos crioprotetores mencionados à concentração de 1,5 M, sendo então congelados e descongelados. A morfologia dos folículos foi analisada através de histologia e microscopia eletrônica de transmissão (MET), e a viabilidade avaliada utilizando-se Azul de Tripan e marcadores fluorescentes. Os resultados demonstraram que a exposição de tecido ovariano canino a ambos crioprotetores não apresentou efeito sobre a morfologia e viabilidade foliculares. Após a congelação e descongelação, os folículos mantiveram-se histologicamente normais, mas a MET revelou danos à ultra-estrutura dos folículos congelados em PROH. A viabilidade foi significativamente reduzida com ambos crioprotetores. Entretanto, altos percentuais de folículos viáveis (65%) foram matidos com DMSO. Como conclusão, este estudo demonstrou que a criopreservação de folículos pré-antrais caninos viáveis com ultraestrutura intacta pode ser realizada com sucesso através de congelação lenta e descongelação rápida utilizando-se DMSO a 1,5 M.

101 101 Palavras-chave: criopreservação, folículos pré-antrais, canino, congelação lenta, dimetilsulfóxido, propanodiol. Abstract Cryopreservation of preantral follicles is potentially an important approach for the conservation of endangered species in such way that techniques have been developed in order to retrieve fertilizable oocytes from this large pool of gametes. The aim of this study was to evaluate the effects of slow freezing-rapid thawing using dimethyl sulfoxide (DMSO) or 1,3-propanediol (PROH) on morphology and viability of canine preantral follicles. Slices of canine ovarian tissue were equilibrated for 20 min at 20ºC in minimum essential medium (MEM) containing either cryoprotectants at 1.5 M, and then frozen-thawed. Morphology of follicles was analyzed through histology and transmission electron microscopy (TEM), and viability assessed using trypan blue and fluorescent probes. The results showed that exposure of canine ovarian tissue to both cryoprotectants had no effect on follicular morphology and viability. After freezingthawing, follicles remained histologically normal, but TEM revealed damage to the ultrastructure of those frozen in PROH. Viability was significantly reduced when either compound was used. However, high percentages of viable follicles (65%) were maintained with DMSO. In conclusion, this study demonstrated that cryopreservation of viable canine preantral follicles with intact ultrastructure can be successfully accomplished through slow freezing and rapid thawing using 1.5 M DMSO. Additional keywords: cryopreservation, preantral follicles, canine, slow freezing, dimethyl sulfoxide, propanediol. Introduction Along with the global warming, extinction of species is an increasing major concern worldwide, since biodiversity is a central component of Earth s life supporting systems (Khuroo et al., 2007), and the removal of single species can affect the functioning of global ecosystems (Myers et al., 2000). In this context, in addition to the crucial protection of habitats, reproductive biotechnology has a great potential to contribute for the conservation of endangered wild animal species. Nevertheless, a limiting factor for the development of reproductive techniques, and also for their efficiency, is the lack of abundant numbers of fertilizable oocytes.

102 102 This problem could be addressed by using the large source of oocytes enclosed in preantral follicles (Telfer, 2001), which exist in ovaries in number of thousands to millions depending on the species. This category comprises around 90 to 95% of entire follicular population, storing a vast majority of the oocytes in mammalian ovaries (Figueiredo et al., 2006). In vitro culture systems capable to promote growth and maturation of preantral follicles have been developed for several species. Currently, birth of healthy offspring after embryo transfer of in vitro fertilized oocytes derived from primordial follicles has been accomplished only in mice (Eppig and Schroeder, 1989). The oocyte growth period in this species is about 3 weeks, whereas, in non-rodents, the time required to reach the mature stage is thought to be up to several months (Jewgenow and Paris, 2006). Therefore, the creation of such systems is a challenging task still at an early stage of development, and long-term preservation of preantral follicles until the establishment of routine culture is an important issue. It could permit to lengthen the genetic lifespan of each rare female of an endangered species after death through the storage of its large pool of gametes. Cryopreservation of isolated primordial follicles through slow freezing was successfully achieved in the mouse (Carroll and Gosden, 1993). Follicles were transplanted to sterilized hosts which could afterwards produce normal offspring after mating. Live young were also obtained after in vitro culture, maturation and fertilization of mouse oocytes within frozen-thawed secondary follicles (Smitz and Cortvrindt, 1998). More recently, live births after orthotopic autotransplantation of cryopreserved ovarian tissue were described in a woman (Donnez et al., 2004), as well as in ewes (Bordes et al., 2005). Although cryopreservation of preantral follicles from carnivores would be specially important since many wild species of these are currently threatened by extinction, few studies have been published on this topic. Jewgenow et al. (1998) demonstrated that small preantral follicles isolated from cat ovaries survive cryopreservation, remaining structurally intact and physiologically active after thawing. In addition, Bosch et al. (2004) reported the survival of cat ovarian tissue subjected to slow freezing-thawing and transplantation to an immunocompromised host, which was followed by development of follicles from early up to the antral stage. With respect to canids, to our knowledge, only one attempt to cryopreserve preantral follicles was reported. Ishijima et al. (2006) vitrified canine ovarian cortex and xenotransplanted to immunodeficient mice. Although antral follicle formation did not occur, grafted tissue was morphological normal and proliferating cell nuclear antigen immunoreactivity was detected in primary follicles. Nonetheless, detailed morphological and quantitative

103 103 analyses on cryopreservation of canine preantral follicles are still to be performed, and knowledge gathered in this species could be applied to endangered canids. The aim of this study was to evaluate the cryopreservation of canine preantral follicles through slow freezing of ovarian tissue using 1.5 M dimethyl sulfoxide (DMSO) or 1.5 M 1,3-propanediol (PROH). For this purpose, morphology of follicles after exposure to the cryoprotectants and freezing-thawing was analyzed through histology and transmission electron microscopy (TEM), and viability was assessed through the trypan blue dye exclusion test as well as using the fluorescent probes calcein-am and ethidium homodimer. Materials and methods Collection and preservation of canine ovaries Ovarian pairs were collected during ovariectomy of healthy months old bitches (Canis lupus familiaris) at local veterinary clinics. After removal from the bursa ovarica and excision of eventual corpora lutea using a scalpel, ovaries were placed into 50 ml tubes (Corning Glass Works, Corning, NY, USA) containing 15 ml of HEPESbuffered Minimum Essential Medium (H-MEM, osmolarity 280 mosmol/l, ph7.2; Sigma, St. Louis, MO, USA). Then, transportation to the laboratory was carried out at 4 C within one hour in thermoflasks filled with water. All procedures were performed aseptically. Experiment 1: Morphological evaluation of follicles after exposure to cryoprotectants and freezing-thawing At the laboratory, seven fragments of cortex (approximately 3 x 3 x 1 mm) were cut from each pair of ovaries (n=5), and one of these pieces was randomly selected as fresh control and fixed for histology and ultrastructural analysis. The remaining samples were placed into cryovials containing 1.8 ml of freezing medium which consisted of Minimum Essential Medium (MEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1.5 M DMSO or 1.5 M PROH or without cryoprotectant (freezing control), prepared immediately prior to use under sterile conditions. After incubation at 20ºC for 20 min (equilibration period), half of the fragments was subjected to cryoprotectant removal according to the method described by Candy et al. (1997). Briefly, three washes of 5 min each in MEM with 10% FBS were performed at room temperature (RT,

104 104 approximately 25 C). Samples were subsequently fixed for histology and TEM in order to evaluate effects of exposure to cryoprotectants on preantral follicles. The cryovials with the remaining fragments were transferred to a biological programmable freezer (Freeze Control, CryoLogic Pty Ltd.,Waverley, Australia) pre-set at 20 C. The following program was used to freeze the tissue samples: cooling from 20 to -7 C at a rate of 2 C/min; holding at -7 C for 15 min (after 5 min, ice crystal formation - seeding - was induced manually by touching the vials with a forceps prechilled in liquid nitrogen); temperature was then lowered 0.3 C/min to -30 C, and further reduced by 0.15 C/min to -33 C; finally, the vials were plunged into liquid nitrogen (-196 C) and stored for 7 days. Thereafter, ovarian tissue pieces were thawed through rapid warming by exposing the cryovials to air at RT for 1 min, followed by immersion in a water bath at 38ºC for 3 min. Cryoprotectant removal was carried out as describe for the exposure test, and pieces of ovarian cortex were fixed for histological and ultrastructural analyses. This experiment was repeated five times. Experiment II: Viability assessment of follicles exposed to cryoprotectants and frozenthawed A second study using a similar experimental protocol as described above in the morphological investigation was performed with the objective of analyzing effects of exposure to cryoprotectants and freezing-thawing on viability of preantral follicles. Five ovaries were used, and fragments from the fresh control and testing groups undergone follicle isolation followed by trypan blue dye exclusion test as described later. Based on the results of this assay and experiment I, viability of follicles cryopreserved with the substance which provided the best outcome was further analyzed using a more accurate method of assessment based on fluorescent probes. Additional pairs of ovaries (n=5) were cut into fragments, from which one was immediately processed for follicle isolation and analyzed using trypan blue as well as calcein-am and ethidium homodimer. Remaining fractions were subjected to exposure to the selected cryoprotectant, frozen-thawed and analyzed after each procedure similarly as for the control. All samples were evaluated in duplicate. Histological analysis In order to assess the morphology of canine preantral follicles submitted to the different treatments, fragments of ovarian tissue were fixed in Carnoy for 12 h, dehydrated in a graded series of ethanol, clarified with xylene, embedded in paraffin

105 105 wax and serially sectioned at 7 μm. Every fifth section was mounted on glass slides, stained with periodic acid Schiff (PAS)-hematoxylin and evaluated by light microscopy at a 400x magnification (Zeiss, Germany). Preantral follicles were defined as an oocyte surrounded either by one layer of flattened or cuboidal granulosa cells, or several layers of cuboidal granulosa cells with no antrum. Follicular morphology was evaluated based on the integrity of the oocyte, granulosa cells and basement membrane. Preantral follicles were classified and counted as (i) morphologically normal, when containing an oocyte with regular shape and uniform cytoplasm, and organized layers of granulosa cells, or (ii) degenerated, when the oocyte exhibited pycnotic nucleus and/or ooplasma shrinkage, and occasionally granulosa cells layers became disorganized, detached from the basement membrane and/or included enlarged cells. To avoid evaluating and counting a follicle more than once, preantral follicles were analyzed only in the sections where oocyte nucleus was observed. Ultrastructural analysis In order to better examine follicular morphology, TEM was performed to analyze ultrastructure of preantral follicles from the control as well as from treatments that did not differ statistically from control in histology. A portion with a maximum dimension of 1 mm 3 was cut from each fragment of ovarian tissue and fixed in modified Karnovsky solution (2% paraformaldeyde and 2% glutaraldeyde in 0.1 M sodium cacodylate buffer ph 7.2) for 3 h at room temperature (RT, approximately 25 C). After three washes in sodium cacodylate buffer, specimens were post-fixed in 1% osmium tetroxide, 0.8% potassium ferricyanide and 5 mm calcium chloride in 0.1 M sodium cacodylate buffer for 1 h at RT. The samples were then dehydrated through a gradient of acetone solutions and thereafter embedded in Spurr s epoxy resin. Afterwards, semi-thin sections (3 μm) were cut, stained with toluidine blue and analyzed by light microscopy at a 400x magnification. Ultra-thin sections (60 70 nm) were obtained from preantral follicles classified as morphologically normal in semi-thin sections, according to the criteria adopted in histology. Subsequently, ultra-thin sections were contrasted with uranyl acetate and lead citrate, and examined under a Jeol 1011 (Jeol, Tokyo) transmission electron microscope operating at 80 kv. Assessment of preantral follicles viability Canine preantral follicles were isolated from ovarian fragments using the mechanical method described by Figueiredo et al. (1993). Briefly, using a tissue

106 106 chopper (The Mickle Laboratory Engineering Co., Gomshal, Surrey, UK) adjusted to a sectioning interval of 87.5 μm, samples were cut into small pieces, which were placed in MEM and suspended 40 times using a large Pasteur pipette (diameter of about 1600 μm) and subsequently 40 times with a smaller Pasteur pipette (diameter of approximately 600 μm) to dissociate preantral follicles from stroma. The obtained material was passed through 500- and 100-μm nylon mesh filters, resulting in a suspension containing preantral follicles smaller than 100 μm in diameter. This procedure was carried out within 10 min at RT. Thereafter, viability of preantral follicles was assessed through trypan blue dye exclusion test (Jewgenow et al., 1998). Briefly, 10 μl of 0.4% trypan blue (Sigma, Deisenhofen, Germany) were added to 90 μl of the suspension of isolated preantral follicles, which were examined using an inverted microscope after incubation for 5 min at RT. Follicles were classified as viable if the oocyte and <10% granulosa cells remained unstained, or as non-viable if uptake of the dye by the oocyte and/or 10% granulosa cells occurred. Preantral follicles were also analyzed using a two-color fluorescence cell viability assay based on the simultaneous determination of live and dead cells by calcein-am and ethidium homodimer-1, respectively. Whilst the first probe detected intracellular esterase activity of viable cells, the later labeled nucleic acids of non-viable cells with plasma membrane disruption. The test was performed by adding 4 μm calcein-am and 2 μm ethidium homodimer-1 (Molecular Probes, Invitrogen, Karlsruhe, Germany) to the suspension of isolated follicles, followed by incubation at 37 C for 10 min. After being labeled, follicles were washed three times in MEM and mounted on a glass microscope slide in 5 μl antifading medium (DABCO, Sigma, Deisenhofen, Germany) to prevent photobleaching, and finally examined using an a DMLB fluorescence microscope (Leica, Germany). The emitted fluorescent signals of calcein- AM and ethidium homodimer were collected at 488 and 568 nm respectively. Oocytes and granulosa cells were considered live if the cytoplasm was stained positively with calcein-am (green) and chromatin was not labelled with ethidium homodimer (red). Statistical analysis All experiments were replicated five times. Kolmogorov-Smirnov and Bartlett s tests were applied to verify normal distribution of data and homogeneity of variances respectively. Afterwards, analysis of variance (ANOVA) was performed using the GLM procedure of the software SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Differences of percentages of morphologically normal preantral follicles (MNPF) and viable follicles

107 107 between control and treatments were determined by Dunnett s test. Student Newman Keuls (SNK) test was used to compare results among testing groups. Data were expressed as means ± standard error of means (SEM). Differences were considered statistically significant when P <0.05. Results Experiment 1: Morphological evaluation of follicles after exposure to cryoprotectants and freezing-thawing A total of 1079 preantral follicles were examined in histology, with a range of 145 to 171 in each treatment. Morphologically normal preantral follicles (MNPF) in control as well as after exposure to cryoprotectants and freezing-thawing exhibited a spherical or elliptical oocyte with a large central or eccentric nucleus and uniform cytoplasm. Granulosa cells without pycnotic nuclei were well-organized in layers surrounding the oocyte and a distinguishable intact basement membrane could be observed (Fig. 1a-c). Degenerated follicles showed a retraced oocyte with or without a pycnotic nucleus, and occasionally a strongly eosinophilic cytoplasm (Fig. 1d). Layers of granulosa cells remained unaltered or became disorganized into a low density mass of cells which were many times swollen and/or detached from basement membrane. Occurrence of pycnotic bodies in granulosa cells or rupture of the basement membrane was not observed. The percentages of MNPF observed in the control and after the exposure and freezing-thawing tests are shown in figure 2. Immersion of ovarian fragments into the cryopreservation medium, which contained either DMSO or PROH at 1.5 M had no effect on the percentages of normal follicles as compared with the fresh control (P>0.05). Similarly, freezing-thawing with either cryoprotectant maintained the percentages of MNPF (P >0.05). Nevertheless, the absence of cryoprotectants in the freezing medium (freezing control) led to a severe decrease of the percentages of normal follicles (22%) as compared with the fresh control (90%) and freezing with DMSO (84%) or PROH (80%) (P <0.05). For both cryoprotectants, it was observed that percentages of MNPF after freezing-thawing were similar to the values obtained after the exposure test (P <0.05).

108 108 Fig. 1. Histological features of canine ovarian fragments before (a) and after freezingthawing with 1.5 M DMSO (b) or PROH (c, d). Morphologically normal preantral follicles comprised an oocyte displaying a large nucleus (nu) and homogenous cytoplasm surrounded by one or more layers of flattened or cuboidal granulosa cells (gc) and without antrum (a, b and c). Degenerated preantral follicles often displayed oocyte retraction (d, arrow) and disorganization of granulosa cell layers. Scale bars represent 10 µm (a, b and c) or 20 µm (d). PAS-hematoxilin.

109 109 Fig. 2. Percentages of morphologically normal preantral follicles in ovarian tissue before (fresh control) and after exposure and freezing-thawing tests in medium containing 1.5 M DMSO or PROH or without cryoprotectants (exposure and freezing controls). (*) Differs significantly from the control (P <0.05); (a, b) different letters for the same test denote significant differences between media (P <0.05); (A, B) different letters for a given medium indicates significant differences among exposure and postthawing values (P <0.05). Ultrastructural analysis TEM of frozen-thawed preantral follicles was performed in order to assess the ultrastructure of follicles classified as normal at the histological level. At least five follicles per group were analyzed. Normal follicles contained an oocyte displaying a very homogenous cytoplasm plenty of round shaped mitochondria with continuous membranes, few peripheral cristae and electron-dense granules. Some elongated forms with parallel cristae could also be seen. Small Golgi apparatus cisternae were rarely observed. Smooth and rough endoplasmic reticulum were present, either as isolated aggregations or as complex associations with mitochondria. The nuclei of oocytes were large and usually round, well delimited by the nuclear envelope. The chromatin was uncondensed and a nucleolus could often be identified. A few vacuoles were also observed. Granulosa cells were small and presented a high nucleus-tocytoplasm ratio. Their irregularly shaped nuclei contained loose chromatin in the inner part and small peripheral aggregates of condensed chromatin. The cytoplasm exhibited a great number of mitochondria and well-developed smooth and rough endoplasmic

110 110 reticulum. The cellular membranes of oocyte and surrounding granulosa cells were closely juxtaposed, and sometimes few short microvilli could be observed. A distinct continuous basement membrane surrounded follicles and was tightly attached to ovarian stroma (Fig. 3a-c). The ultrastructural pattern described above was observed in normal follicles from control, after exposure to either cryoprotectants and freezing-thawing with DMSO. When PROH was used for freezing, despite some follicles displayed normal morphology, changes could be detected in follicles evaluated as normal in semi-thin sections by light microscopy. The ooplasm presented a reduced electron density and lower numbers of organelles, heterogeneously distributed in small clusters. Some large vacuoles could also be seen. In granulosa cells, loss of cytoplasm content was noticed, leading to the existence of very large empty spaces in some cases (Fig 3c). Experiment II: Viability assessment of follicles exposed to cryoprotectants and frozenthawed Preantral follicles from ovarian fragments of the control and testing groups were mechanically isolated and viability was assessed by trypan blue dye exclusion test. A total of 1,289 follicles were examined, with a range of 152 to 200 in each treatment. The percentages of viable follicles observed in each treatment are presented in table 1.

111 111 Fig. 3. Electron micrographs of canine preantral follicles from control (a) and frozenthawed using 1.5 M DMSO (b, d) or PROH (c). In Fig. 3a (2500x, scale bar= 10 µm) and 3b (6000x, scale bar= 5 µm), normal follicles containing an oocyte with homogenous cytoplasm and a large nucleus well delimited by the nuclear envelope are displayed. A nucleolus could often be identified (nu), as well as a continuous basement membrane (bm). In Fig. 3c (2500x, scale bar= 10 µm), observe the large vacuoles (arrowheads) and a large empty space (asterisk) after freezing-thawing with PROH. In Fig. 3d (6000x, scale bar= 5 µm), note the great number of intact mitochondria (m) and smooth endoplasmic reticulum (ser) in the cytoplasm of an oocyte and surrounding granulosa cells cryopreserved using DMSO. O, oocyte; GC, granulosa cells; v, vacuole.

112 112 Table 1. Percentages of viable follicles in the fresh control and after exposure to cryoprotectants and slow freezing-thawing as assessed using trypan blue. Treatments Exposure Freezing-thawing Fresh control 77.68±2.89 No cryoprotectant 75.82±2.62aA 5.94±2.82*cB 1.5 M PROH 73.24±3.35aA 48.74±4.55*bB 1.5 M DMSO 73.76±2.63aA 65.68±1.66*aB (*) Differs significantly from control (P <0.05); (a, b, c) different letters denotes significant difference between values within a column (P <0.05); (A, B) different letters indicate significant difference between values of a row (P <0,05). Immersion of ovarian fragments into 1.5 M DMSO or 1.5 M PROH had no effect on the percentages of viable follicles as compared with the fresh and test control (medium without cryoprotectant) (P >0.05). Nevertheless, freezing in either 1.5 M DMSO or 1.5 M PROH and rapid thawing resulted in a significant reduction of the percentages of viable follicles in relation to the fresh control (P <0.05), which were higher on the use of DMSO than when PROH was employed (P <0.05). The absence of cryoprotectants in the freezing medium (cryopreservation control) led to a severe and significant decrease of the percentages of viable follicles in comparison with the fresh control and with freezing with DMSO or PROH. For both cryoprotectants, it was observed that percentages of viable follicles after freezing-thawing were significantly decreased as compared with the values obtained after the exposure test. Based on the results of morphological evaluation (experiment I) and viability assessment with trypan blue, which evidenced that freezing-thawing using 1.5 M DMSO provides preservation of ultrastructure and higher percentages of viable follicles than PROH, a second viability trial using the former cryoprotectant was performed. In addition to trypan blue testing, a fluorescence cell viability assay based on labelling of live and dead cells by calcein-am and ethidium homodimer-1, respectively, was employed (Fig. 4).

113 113 Fig. 4. Viability assessment of canine preantral follicles using fluorescent probes. (a) An isolated preantral follicle classified as viable after slow freezing- rapid thawing with 1.5M DMSO, since cells were labeled by calcein-am (b) (green fluorescence). (c) Another follicle from the same treatment considered non-viable as cells were marked with ethidium homodimer-1 (d) (red fluorescence). Scale bars represent 10 µm. Percentages of viable follicles remained unaltered after exposure of ovarian cortex fragments to 1.5 M DMSO in comparison to the control (P >0.05) as assessed by trypan blue and calcein-am/ethidium homodimer assays, whose values did not differ from each other (P >0.05). However, a significant reduction in the percentages of viable follicles relative to the fresh control and exposed fragments was observed after freezing-thawing according to the two viability tests, which once more retrieved similar results (Fig.5).

114 114 Fig. 5. Percentages of viable canine preantral follicles in fresh ovaries and after exposure and freezing-thawing using 1.5 M DMSO as assessed by trypan blue dye exclusion test and labeling with calcein-am and ethidium homodimer. (*) Differs significantly from control (P <0.05); (a, b) different letters within the same test (exposure or freezing-thawing) denote significant differences between values of the viability assays (P <0.05); (A, B) different letters for a same viability assay indicates significant differences between tests (P <0.05). Discussion The present study evaluated for the first time the cryopreservation of canine preantral follicles through slow freezing, employing DMSO and PROH as cryoprotectants. It was demonstrated that viability and ultrastructural integrity of such follicles can be successfully maintained with the use of 1.5 M DMSO. Exposure of ovarian fragments to either DMSO or PROH at 1.5 M did not cause reduction of the percentages of MNPF follicles as evaluated in histology, and ultrastructural analysis through TEM confirmed the integrity of such follicles. Accordingly, Lucci et al. (2004) also observed no effect of such cryoprotectants at the same concentrations on bovine preantral follicles. On other hand, caprine (Rodrigues et al., 2004) and ovine (Santos et al., 2006) ovarian tissue exposed to 1.5 M DMSO or PROH at similar conditions (temperature and time) showed a significant reduction of the percentage of normal preantral follicles. Indeed, an osmotic stress due to the presence of cryoprotectants in the freezing medium is one of the primary theories of

115 115 injury during cryopreservation, whilst the inherent toxicity of these compounds is also an important consideration (Mullen et al., 2008). We hypothesize that these differences reflect a species-specific resistance of preantral follicles enclosed in ovarian cortex to exposure to DMSO and PROH at 1.5 M. After freezing and thawing with either cryoprotectants, percentages of MNPF also remained unchanged as evaluated by histology. However, TEM revealed alterations in the ultrastructure of follicles frozen with PROH which were previously evaluated as normal in histology. Therefore, TEM proved to be an essential tool to detect damage due to the freezing-thawing process which can be observed only at the ultrastructural level but not through light microscopy. The most severe damage observed was made up of large empty spaces not surrounded by membranes. This feature suggests the occurence of crystallization, and was also observed in glycerolfrozen ovine embryos (Cocero et al., 2002). This relative inefficiency of PROH to protect canine preantral follicles during freezing-thawing may be due to the fact that its ability to prevent ice-crystal formation is limited at 1.5 M (Jain and Paulson, 2006). Similarly, integrity of caprine (Rodrigues et al., 2004) and bovine (Lucci et al., 2004) preantral follicles cryopreserved in 1.5 M DMSO was confirmed, whilst similar modifications were found in follicles frozen-thawed with 1.5 M PROH. Notwithstanding previous studies on cryopreservation of preantral follicles provided important knowledge on this issue, most approaches were limited to analysis of morphology, which is not always correlated with the viability of follicles (Santos et al., 2007). Therefore, in the present work, we further analyzed the quality of follicles through assessment of viability using the trypan blue dye exclusion test. After exposure to either DMSO or PROH at 1.5 M, percentages of viable follicles remained similar to those of the controls. Accordingly, Jewgenow et al. (1998) demonstrated that adding these cryoprotectants at the same concentrations to isolated feline small preantral follicles did not result in decrease of viability after in vitro culture in comparison to the control. Amorim et al. (2004) observed that only exposure to DMSO or PROH at concentrations higher than 2 M and 1.5 M respectively reduced the numbers of viable preantral follicles isolated from ovine ovaries. Thus, our results show that addition of DMSO or PROH at up to 1.5 M to canine ovarian tissue affects neither the integrity nor the viability of preantral follicles as a consequence of osmotic and toxic effects of the freezing solution. When post-thaw viability of follicles was examined, a significant decrease was found with the use of both cryoprotectants in comparison to the fresh control. However, a high percentage (65%) of viable follicles was maintained through the employment of 1.5 M DMSO, whilst PROH did not show a comparable efficiency for follicular

116 116 preservation, which might be due to the ultrastructural damages detected in the morphological analysis. In accordance, Jewgenow et al. (1998) showed that viability of isolated feline preantral follicles was also reduced after freezing-thawing with either 1.5 M DMSO or PROH. Conversely, Rodrigues et al. (2005) observed that cryopreservation using 1.5 M DMSO or PROH had no effect on viable caprine preantral follicles, and this outcome was also achieved with ovine follicles after using 1.5 M DMSO (Amorim et al., 2007). Hence, we suggest that carnivore preantral follicles are less resistant to freezing-thawing with these cryoprotectants at 1.5 M than their counterparts from small ruminants. Percentages of viable follicles were much lower than those of morphologically normal follicles in every treatment. This proves that a more precise determination of the proportions of follicles with adequate quality for subsequent applications such as in vitro culture may rely on viability assessment. In this context, we have further analyzed follicles cryopreserved in DMSO using a more accurate method. For this purpose, labeling of non-viable cells with disruption of plasma membrane was performed again by using ethidium homodimer-1, which enabled a better visualization of dead cells through fluorescent staining of nuclei. Concomitantly, identification of viable cells was performed through detection of esterase activity with calcein-am. These fluorescent probes have been successfully used to assess viability of bovine early-staged follicles (Schotanus et al.,1997; Van den Hurk et al., 1998) and after cryopreservation of caprine preantral follicles (Santos et al., 2006, 2007). In the present study, results of this assay were similar to values observed with trypan blue testing, which thus proved to be a reliable, practical and quick method for preliminary viability assessment of preantral follicles. Accordingly, Poeschmann et al. (2008) observed a significant correlation between both methods while analyzing viability of feline preantral follicles. Despite a significant decrease of viable follicles was observed after freezingthawing in the present study, we consider that preservation rates with the use of DMSO to freeze canine preantral follicles are by this time high and can be further improved. Since these follicles proved to not be affected by exposure to DMSO at 1.5 M at the described conditions, concentration of this cryoprotectant could be increased up to a threshold on which cytotoxic and/or osmotic effects are still inexistent and protection against cryoinjuries is maximum. It must also be considered for such adjustment that during cell dehydration, a delicate balance must be maintained between the removal of free water that can form ice crystals and the removal of bound water, because excessive loss of the latter results in loss of structural support to proteins and lipids (Wright et al., 2004). The use of isolated follicles could also enhance results, since

117 117 mammalian cells frozen in situ are more susceptible to damage caused by this process than cells in suspension (Armitage et al., 1995; Armitage and Juss, 1996). Once established, knowledge on cryopreservation of canine preantral follicles could be applied to endangered canids in order to lengthen the genetic lifespan of each rare female. To this end, development of in vitro culture systems capable to promote growth and maturation of this vast pool of oocytes has to be accomplished. However, at present, such systems still do not lead to normal full follicle development in nonrodent species, for which oocyte growth is a long-term, coordinated and complex process, and the time required to reach the mature stage is thought to be up to several months. Currently, xenotransplantation into immunodeficient recipients seems to be one the most promising ways for obtaining oocytes from ovaries for further exploration of assisted reproduction techniques (Jewgenow and Paris, 2006). Ishijima et al. (2006) transplanted canine ovarian tissue into non-obese diabetic severe combined immunodeficient mice and observed a significant shift from primordial to primary follicles, in which the proliferating cell nuclear antigen could be detected. In addition, Fassbender et al. (2007) demonstrated the survival of cat ovarian cortex tissue transplanted under the kidney capsule of athymic nude rats. Follicular development was monitored through high-resolution ultrasonography, and cumulus oocytes complexes could be collected and in vitro matured. In conclusion, cryopreservation of canine preantral follicles can be accomplished through slow freezing and rapid thawing using 1.5 M DMSO or PROH. However, only DMSO provided maintenance of high percentages of viable follicles with intact ultrastructure. Further studies are necessary to evaluate developmental capacity of such follicles, which demands the establishment of in vitro culture systems or use of transplantation approaches. Acknowledgements During the period of this work, Claudio A. P. Lopes received financial support from the National Council for Scientific and Technological Development (CNPq; doctoral scholarship) and the Coordination for Improvement of Graduate Personnel (CAPES; fellowship for studies abroad, PDEE, grant 5212/06-5), both institutions of the Brazilian Government. José Ricardo de Figueiredo was also recipient of a grant from CNPq. We would like to express our appreciation to the Center for Zoonosis Control (CCZ) of Fortaleza Municipality (Brazil) and to the veterinary clinics of the animal shelter Tierheim-Berlin and Tierklinik-Biesdorf (Germany), which gently provided the canine ovaries.

118 118 References Armitage, W.J., Juss, B.K. (1996). The influence of cooling rate on survival of frozen cells differs in monolayers and in suspensions. Cryo Letters 17, Armitage, W.J., Juss, B.K. and Easty, D.L. (1995). Differing effects of various cryoprotectants on intercellular junctions of epithelial (MDCK) cells. Cryobiology 32, Amorim, C. A., Rondina, D., Rodrigues, A. P. R., Gonçalves, P. B. D., Figueiredo, J. R., Giorgetti, A. (2004). Cryopreservation of isolated ovine primordial follicles with propylene glycol and glycerol. Fertil. Steril. 81, Amorim, C. A., Rondina, D., Lucci, C. M., Giorgetti, A., Figueiredo, J. R., Gonçalves, P. B. (2007). Cryopreservation of Sheep Primordial Follicles. Reprod. Dom. Anim. 42, Bordes, A., Lornage, J., Demirci, B., Franck, M., Courbiere, B., Guerin, J. F., Salle, B. (2005). Normal gestations and live births after orthotopic autograft of vitrifiedwarmed hemi-ovaries into ewes. Hum. Reprod. 20, Bosch, P., Hernandez-Fonseca H.J., Miller, D.M., Wininger, J.D., Massey, J.B., Lamb, S.V., Brackett, B. G. (2004). Development of antral follicles in cryopreserved cat ovarian tissue transplanted to immunodeficient mice. Theriogenology 61, Candy, C.J., Wood, M.J., Whittinghan, D.G. (1997). Effect of cryoprotectants on the survival of follicles in frozen mouse ovaries. J. Reprod. Fertil. 110, Carroll, J., Gosden, R. G. (1993). Transplantation of frozen-thawed mouse primordial follicles. Hum. Reprod. 8, Cocero, M. J., de la Espina, S. M. D., Aguilar, B. (2002). Ultrastructural Characteristics of Fresh and Frozen-Thawed Ovine Embryos Using Two Cryoprotectants. Biol. Reprod. 66, Donnez, J., Dolmans, M., Demylle, D., Jadoul, P., Pirard, C., Squifflet, J., Martinez- Madrid, B., Van Langendonckt, A. (2004). Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. Lancet 364, Eppig, J.J., Schroeder, A.C. (1989). Capacity of mouse oocytes from preantral follicles to undergo embryogenesis and development to live young after growth, maturation, and fertilization in vitro. Biol. Reprod. 41, Fassbender, M., Hildebrandt, T.B., Paris, M.C., Colenbrander, B., Jewgenow K. (2007). High-resolution ultrasonography of xenografted domestic cat ovarian cortex. J. Reprod. Dev. 53,

119 119 Figueiredo, J.R., Hulshof, S.C.J., Van den Hurk, R., Ectors, F.J., Fontes, R.S., Nusgens, B., Bevers, M.M., Beckers, J.F. (1993). Development of a combined new mechanical and enzymatic method for the isolation of intact preantral follicles from fetal, calf and adult bovine ovaries. Theriogenology 40, Figueiredo, J.R., Rodrigues, A.P.R., Santos, R.R., Lopes, C.A.P., Silva, J.R.V. (2006). State of art of the biotechnique of in vitro manipulation of enclosed in ovarian in preantral follicles. Acta Sci. Vet. 34, Ishijima, T., Kobayashi, Y., Lee, D.S., Ueta, Y.Y., Matsui, M., Lee, J.Y., Suwa, Y., Miyahara, K., Suzuki, H. (2006). Cryopreservation of canine ovaries by vitrification. J. Reprod. Dev. 52, Jain,J. K., Paulson, R. J., (2006). Oocyte cryopreservation. Fertil. Steril. 86, Jewgenow, K., Paris, M.C.J. (2006). Preservation of female germ cells from ovaries of cat species. Theriogenology 66, Jewgenow, K., Penfold, L. M., Meyer, H. H., Wildt, D. E. (1998). Viability of small preantral ovarian follicles from domestic cats after cryoprotectant exposure and cryopreservation. J. Reprod. Fertil. 112, Khuroo, A. A., Dar, G.H., Khan, Z. S., Malik, A. H. (2007). Exploring an inherent interface between taxonomy and biodiversity: Current problems and future challenges. J. Nat. Conserv. 15, Lucci, C. M., Kacinskis, M. A., Lopes, L. H. R., Rumpf, R., Báo, S. N. (2004). Effect of different cryoprotectants on the structural preservation of follicles in frozen zebu bovine (Bos indicus) ovarian tissue. Theriogenology 61, Mullen, S. F., Li, M., Li, Y., Chen, Z., Critser, J. K. (2008). Human oocyte vitrification: the permeability of metaphase II oocytes to water and ethylene glycol and the appliance toward vitrification. Fertil. Steril. 89, Myers, N., Mittermeier, R.A., Mittermeier, C.G., da Fonseca, G.A.B., Kent, J. (2000). Biodiversity hotspots for conservation priorities. Nature 403, Poeschmann, M., Fassbender, M., Lopes, C., Dorresteijn, A., Jewgenow, K. (2008). Viability assessment of primordial follicles of domestic cats to develop cryopreservation protocols for ovarian tissue. Reprod. Domest. Anim. 43 (Suppl.1), 25. Rodrigues, A. P. R., Amorim, C. A., Costa, S. H. F., Matos, M. H. T., Santos, R. R., Lucci, C. M., Báo, S. N., Ohashi, O. M., Figueiredo, J. R. (2004). Cryopreservation of caprine ovarian tissue using dimethylsulphoxide and propanediol. Anim. Reprod. Sci. 84,

120 120 Rodrigues, A.P.R., Amorim, C.A., Costa, S.H.F., Santos, R.R., Lucci, C.M., Nunes, J.F., Figueiredo, J.R. (2005). Cryopreservation and short-term culture of isolated caprine primordial follicles. Small Rumin. Res. 56, Santos, R. R., Rodrigues, A. P. R., Costa, S. H. F., Silva, J. R. V., Matos, M. H. T., Lucci, C. M., Báo, S. N., Van den Hurk, R., Figueiredo, J. R. (2006). Histological and ultrastructural analysis of cryopreserved sheep preantral follicles. Anim. Reprod. Sci. 91, Santos, R.R., Tharasanit, T., van Haeften, T., Figueiredo, J.R., Silva, J.R.V., van den Hurk, R. (2007). Vitrification of goat preantral follicles enclosed in ovarian tissue by using conventional and solid-surface vitrification methods. Cell Tissue Res. 327, Schotanus, K., Hage, W.J., Vanderstichele, H., van den Hurk, R. (1997). Effects of conditioned media from murine granulosa cell lines on the growth of isolated bovine preantral follicles. Theriogenology 48, Smitz, J., Cortvrindt, R. (1998). Follicle culture after ovarian cryostorage. Maturitas 30, Telfer, E.E. (2001). In vitro development of pig preantral follicles. Reprod. Suppl. 58, van den Hurk, R., Spek, E. R., Hage, W. J., Fair, T., Ralph, J. H., Schotanus, K. (1998). Ultrastructure and viability of isolated bovine preantral follicles. Hum. Reprod. Update 4, Wright, D. L., Eroglu, A., Toner, M., Toth, T. L. (2004). Use of sugars in cryopreserving human oocytes. Reprod. Biomed. Online

121 CAPÍTULO V Potencial de anticorpos anti-zona pelúcida para a imunoesterilização de cães: efeitos sobre folículos pré-antrais in vitro Potential of anti-zona pellucida antibodies for the immunosterilization of dogs: effects on preantral follicles in vitro Journal of Reproduction and Development (Submetido, 2008)

122 122 Potential of anti-zona pellucida antibodies for the immunosterilization of dogs: effects on preantral follicles in vitro Lopes CAP ABD, Niu Y C, Alves AMCV A, Chaves RN A, Campello CC A, Jewgenow K B, Figueiredo JR A A Faculty of Veterinary, PPGCV, LAMOFOPA, State University of Ceará, Fortaleza, Brazil. Postal address: Av. Paranjana 1700, Campus do Itaperi, CEP , Fortaleza, CE, Brazil. B Institute for Zoo and Wildlife Research, Berlin, Germany. Postal address: Postfach , D-10252, Berlin, Germany. C Kunming Primate Research Center and Kunming Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, China. Postal address: 32 Jiao Chang Dong Lu, Kunming, Yunnan , China. D Corresponding author. lopes@izw-berlin.de Resumo A superpopulação de cães constitui um grave problema em diversas cidades do mundo, que tem sido controlado através da eliminação sistemática de animais sem responsáveis, que podem atuar como reservatórios de zoonoses. A esterilização de cadelas através de imunização contra as proteínas da zona pelúcida (ZP), estrutura que reveste os oócitos, é uma alternativa promissora para o controle reprodutivo desta espécie. O objetivo deste estudo foi avaliar in vitro o potencial de um antisoro contra ZP suína (pzp) de induzir degeneração de folículos pré-antrais caninos e/ou de bloquear a ligação espermática à ZP. Folículos pré-antrais foram isolados de ovários caninos e cultivados in vitro com soro antipzp. Oócitos obtidos de folículos antrais foram tratados com o mesmo soro e co-incubados com sêmen canino de modo a se analisar a ligação espermática. A avaliação da viabilidade após o cultivo revelou que o soro anti-pzp foi efetivo para induzir degeneração de folículos pré-antrais maiores que 100 µm, conforme comparação com o controle (soro pré-imune), mas não teve efeito sobre folículos menores. Este processo parece envolver a ativação do sistema complemento sérico. Anticorpos anti-pzp também se mostraram capazes de bloquear a ligação espermática. Diante do exposto, concluímos que anticorpos anti-pzp podem promover a eliminação de folículos pré-antrais caninos e inibir a ligação espermática, constituindo-se, assim, uma importante perspectiva para o controle efetivo da reprodução em cães. Palavras-chave: Imunocontracepção, anticorpos, canino, zona pelúcida, folículos pré-antrais.

123 123 Abstract Overpopulation of dogs in urban areas is a critical issue worldwide, which has been controlled by means of systematic euthanasia of unowned animals that can act as zoonoses reservoirs. Sterilization of bitches through immunization against proteins of the zona pellucida (ZP), the egg coat, is a promising alternative for the reproduction control in this species. The aim of this work was to evaluate in vitro the potential of an antiserum against porcine ZP (pzp) to cause degeneration of canine preantral follicles and/or blocking of sperm binding. Preantral follicles were isolated from bitch ovaries and in vitro cultured with anti-pzp serum. Oocytes from antral follicles were also obtained, treated with the same serum and coincubated with dog semen in order to analyze sperm binding. Viability assessment after culture showed that anti-pzp serum was effective to induce degeneration of preantral follicles larger than 100 µm as compared to the control (pre-immune serum), but had no effect on smaller follicles. This process might involve activation of the serum complement system. Anti-pZP antibodies also proved capable of blocking sperm binding. In conclusion, anti-pzp antibodies can promote the elimination of canine preantral follicle and inhibit sperm binding, which is an important prospect for effective control of reproduction in dogs. Keywords: Immunocontraception, antibodies, canine, zona pellucida, preantral follicles. Introduction Overpopulation of dogs is a critical problem is many cities around the world, which is characterized by the occurrence of large groups of surplus animals without a responsible owner. Since these individuals can act as zoonoses reservoirs, health authorities perform systematic euthanasia in order to control this subpopulation. Each year, this situation results in millions of deaths at shelters and spending in the billions of dollars (Frank e Carlisle-Frank, 2007). Despite efforts in recent years to identify reliable methods of pharmacologic and chemical sterilization for dogs, surgical methods have remained the mainstay. Although these procedures are often viewed as routine surgeries, complications may result from inappropriate techniques, and efforts should be made to follow good surgical and aseptic standards (Howe, 2006). In addition, such methods can be too time consuming and expensive to be performed on a large-scale (Kutzler e Wood, 2006), and hence are not logistically and economically feasible to be applied to large canine populations, as is the case in metropolis.

124 124 In this context, immunocontraception arises as a promising perspective for the control of reproduction in dogs. This approach consists of directing the body s immune response towards functionally and structurally important molecules that are involved in mammalian reproduction. Sperm surface antigens, the zona pellucida (ZP), gonadotropins (LH and FSH) or their receptors, and the gonadotropin releasing hormone (GnRH) have been identified and are used as targets for immunocontraceptive vaccines in carnivores. At present, the best contraceptive vaccines are zona pellucida based, which has been shown to cause longlasting contraception in several wildlife species (Jewgenow et al., 2006). The ZP consists of an extracellular glycoprotein matrix which surrounds the mammalian oocytes and plays fundamental roles in the fertilization process through the regulation of sperm binding, induction of the acrossome reaction and of the block to polyspermy (Wassarman, 2008). Active immunization against ZP proteins inhibits fertility in many species by interfering with sperm egg interaction during fertilization, and affecting the growing pool of ovarian follicles. The synthesis of ZP takes place during oocyte growth. Therefore, a immune reaction against ZP can induce destruction of early ovarian oocytes, leading sometimes to irreversible infertility (Ringleb et al., 2004). Loss of primordial follicles is a common outcome of the immunization against one ZP glycoprotein (ZP3), which might occur due to the elimination of growing follicles by anti-zp antibodies followed by accelerated recruitment of the quiescent follicles (Aitken, 2002). The aim of the present study was to evaluate in vitro the potential of serum containing anti-pzp antibodies to cause degeneration of canine preantral follicles. It was also tested the capacity of these antibodies to block canine sperm binding to homologous ZP. Material e Methods All chemicals were obtained from Sigma-Aldrich (Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, Germany) unless stated otherwise and were of the highest purity available. Animals and gonad collection Ovaries and testes were obtained from dogs at the veterinary clinic of the animal shelter of the City of Berlin (Tierheim Berlin - Tierschutzverein für Berlin und Umgebung Corporation e.v.). Following excision, ovaries were placed into 15 ml of HEPES-buffered Minimum Essential Medium (MEM, osmolarity 280 mosmol/l) at 4ºC. Testes were stored at

125 125 the same temperature without any medium. Gonads were transported to the laboratory in thermoflasks within 4 h and then immediately processed. Collection of oocytes, preantral follicles and spermatozoa Ovaries were dissected in M199 containing Earle s salts, supplemented with 3 mg/ml BSA, 0.6 mg/ml sodium lactate, 1.4 mg/ml Hepes, 0.25 mg/ml sodium pyruvate, 0.1 mg/ml cysteine and mg/ml gentamicin. Grade 1 oocytes displaying an even dark ooplasm surrounded by a multilayered cumulus cell mass were selected, vortexed for 3 min to detach cumulus cells and then washed three times. Canine preantral follicles were isolated using the mechanical method described by Figueiredo et al. (1993). Briefly, using a tissue chopper (The Mickle Laboratory Engineering Co., Gomshal, Surrey, UK) adjusted to a sectioning interval of 100 µm, ovarian cortex was cut into small pieces, which were placed in MEM and suspended 40 times using a large Pasteur pipette (diameter of about 1600 µm) and subsequently 40 times with a smaller Pasteur pipette (diameter of approximately 600 µm) to dissociate preantral follicles from the stroma. The obtained material was passed through 500- and 100-μm nylon mesh filters, resulting in a suspension containing preantral follicles smaller than 100 μm in diameter. This procedure was carried out within 10 min at room temperature (RT, approximately 25 C). Preantral follicles with a diameter of 100 to 200 μm were isolated from canine ovaries as described by Mao et al. (2004). Briefly, ovarian cortical tissue (<1 mm thickness) was sliced from the ovarian surface, placed in HEPES-buffered α-mem and visualized under a dissecting microscope (SMZ 645 Nikon, Tokyo, Japan) equipped with an ocular micrometer. Follicles were then manually isolated with a 28-gauge needle and surgical blade. Those displaying normal morphology, no sign of oocyte retraction and well-organized layers granulosa cells adhered to an intact basement membrane were selected. Canine spermatozoa were obtained from caudae epididymides by mincing them in 1ml TALP medium (Tyrode s salt solution containing 6 mg/ml BSA, 1.2 mg/ml Hepes, 1.1 mg/ml sodium lactate, 0.11 mg/ml sodium pyruvate). Sperm cells were centrifuged at 500 g for 7 min and resuspended in ml TALP medium. After estimation of sperm concentration and motility, a final concentration of 1 x 10 5 motile sperm cells/ml was established by addition of TALP medium.

126 126 In vitro culture of canine preantral follicles with anti-pzp serum Serum containing anti-pzp polyclonal antibodies was produced through immunization of rabbits as previously described by (Jewgenow et al. 2000). Canine preantral follicles (n=2,560) were isolated as described previously and divided into two groups according to the diameter (<100 µm or 100 µm) and in vitro cultured with 10% pre-immune serum (control) or anti-pzp serum. The used medium consisted of α-mem (osmolarity: 300 mosm/l, ph: 7.2) supplemented with 1% ITS (6.25 µg/ml insulin, 6.25 µg/ml transferrin and 6.25 ng/ml selenium), glutamine (2 mm), hypoxanthine (2 mm) and bovine serum albumin (BSA,1.25 mg/ml). Assessment of preantral follicles viability Viability of canine preantral follicles was assessed before and after in vitro cultured through a test based on the simultaneous determination of live and dead cells by calcein-am and ethidium homodimer-1, respectively. Whilst the former compound detected intracellular esterase activity of viable cells, the latter marked nucleic acids in non-viable cells with damaged plasma membrane. The test was performed by adding by adding 4 μm calcein-am and 2 μm ethidium homodimer-1 (Molecular Probes, Invitrogen, Karlsruhe, Germany) to isolated follicles, followed by incubation at 37 C for 10 min. After being labeled, follicles were washed three times in MEM, mounted on a glass microscope slide in 5 μl antifading medium (DABCO, Sigma, Deisenhofen, Germany) to prevent photobleaching, and finally examined using an a DMLB fluorescence microscope (Leica, Germany). The emitted fluorescent signals calcein-am, and ethidium homodimer were collected at 488 and 568 nm, respectively. Oocytes and granulosa cells were considered live if the cytoplasm was stained positively with calcein-am (green) and chromatin was not labelled with ethidium homodimer (red). In vitro test for sperm binding test Denuded oocytes were incubated for 1 h at 37.5 C with pre-immune serum (control), anti-pzp serum (undiluted or diluted 1:10 or 1:20) or in HEPES-buffered MEM (positive control). Afterwards, oocytes were transferred to separate insemination drops containing 400 ml of IVF medium (TALP solution containing 10mg/ml heparin) and 1 x 10 5 motile spermatozoa/ml. After h of co-incubation at 39 C in an atmosphere of 5% CO 2, oocytes were washed three times in DPBS with 3 mg/ml BSA to remove loosely attached

127 127 spermatozoa and finally placed into DPBS supplemented with 4% (w/v) paraformaldehyde and 0.02% (v/v) Triton-X100 for min at 39 8C. After washing twice again, oocytes were stained with 10mg/ml Hoechst for 45 min, mounted on slides and the number of attached sperm heads was counted under fluorescence excitation using a DMLB Leica Microscope (Wetzlar, Germany). Statistical analysis All experiments were replicated five times. Kolmogorov-Smirnov and Bartlett s tests were applied to verify normal distribution of data and homogeneity of variances respectively. Afterwards, analysis of variance (ANOVA) was performed using the GLM procedure of the software SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Differences of percentages of viable preantral follicles between treatments were determined by Student Newman Keuls (SNK) test. For the sperm binding experiments, differences between groups were assessed by the non-parametric Mann Whitney test. Data were expressed as means ± standard error of the mean (SEM) and differences were considered statistically significant when P <0.05. Results Effect of anti-pzp serum on viability of canine preantral follicles Viability of canine preantral follicles was assessed before and after in vitro culture through a test based on the simultaneous determination of live and dead cells by calcein-am and ethidium homodimer-1, respectively. Percentages of viable follicles observed in each treatment are showed in Figure 1.

128 128 a Figure 1. Percentages of viable canine preantral follicles before (fresh control time 0 h) and after in vitro culture for 24 h with in medium containing no serum or 10% pre-immune serum (control) or anti-pzp. (a, b) different letters indicate significant differences (P <0.05) between values within a follicular category (<100 µm or 100 µm). After in vitro culture for 24 h in medium without serum, with 10% pre-immune serum (control) or anti-pzp serum, it was observed a significant reduction (P <0,05) of the percentages of viable follicles with diameter smaller than 100 µm in comparison to the fresh control (time 0h). No significant difference (P >0,05) was found among the different culture groups (P >0,05). With respect to the group of follicles with diameter of µm, a significant decrease (P <0,05) of the percentages of viable follicles was also seen after in vitro culture in medium without serum or with either sera in comparison to the fresh control. Moreover, it was noticed that the presence of anti-pzp serum led to a massive reduction of the percentages of viable follicles, which were significantly lower (P <0,05) than those obtained with the addition of pre-immune serum (control) or with culture medium alone. It is noteworthy that along with the oocyte, no single follicular cell could survive, which is an important outcome considering the potential of remaining granulosa cells to develop cysts (Mahi-Brown et al., 1998). In figure 2, viable and non-viable follicles analyzed using fluorescent labels are presented.

129 129 A B Fig. 2. Viability evaluation of canine preantral follicles using fluorescent probes. (A) A follicle in vitro cultured for 24 h with pre-immune serum (control) and classified as viable since cells were labeled by calcein-am (green fluorescence). The arrow indicates a thick zona pellucida surrounding the oocyte. (B) A follicle cultured with anti-pzp serum and considered non-viable as cells were marked with ethidium homodimer-1 (red fluorescence). Scale bars represent 20 µm. Effect of anti-pzp antibodies on canine sperm binding to homologous oocytes The capacity of anti-pzp antibodies to block binding of dog spermatozoa to bitch oocytes was assessed through an in vitro test which consisted of co-incubation of oocytes treated with pre-immune (control) or hyperimmune serum with sperm followed by counting of Hoechst stained sperm heads bound to oocytes under a fluorescence microscope (fig. 3).

130 130 ZP ZP A B ZP ZP C D Fig. 3. Assessment of anti-pzp antibodies ability to inhibit canine oocyte-sperm interaction. (A) Oocyte incubated in MEM (positive control) displaying several bound spermatozoa; (B) oocyte treated with pre-immune serum (control); (C) oocyte treated with anti-pzp serum showing no bound spermatozoon; (D) oocyte treated with anti-pzp diluted 1:10. ZP: zona pellucida.