PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE MICROESFERAS DE GLÚTEN DE TRIGO PARA A ENCAPSULAÇÃO E LIBERAÇÃO CONTROLADA DE RODAMINA.
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1 PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE MICROESFERAS DE GLÚTEN DE TRIGO PARA A ENCAPSULAÇÃO E LIBERAÇÃO CONTROLADA DE RODAMINA. Larissa Andreani 1*, Rodrigo Cercená 2, Betina G. Z. Ramos 3, Valdir Soldi 4 Departamento de Química da Universidade Federal de Santa Catarina 1* larissaandreani@gmail.com; 2 rodrigoqmc@ig.com.br; 3 betina@ativanet.com.br ; 4 vsoldi@qmc.ufsc.br Preparation and characterization of wheat gluten microspheres for encapsulation and controlled release of Rhodamine. In this study, wheat gluten microspheres were prepared using the emulsification/solvent evaporation method, and rhodamine was used as model substance, in order to analyze the process of release. The microspheres were characterized by differential scanning calorimetry (DSC) and scanning electron microscopy (SEM). The in vitro release rates of rhodamine were evaluated in phosphate buffer solution (ph 7.4) at 25ºC. The DSC results showed that rhodamine is molecularly dispersed in gluten matrix. This is confirmed by SEM, since it was not possible to observe rhodamine in the microsphere cross-sections, probably because rhodamine was in the amorphous state. The in vitro release profile of rhodamine is in agreement with the results of DSC and SEM. Introdução Glúten de trigo é um termo geral para as proteínas insolúveis em água da farinha de trigo 1. O trigo é composto por quatro tipos de proteínas: albuminas, globulinas, gliadinas e gluteninas. As albuminas e globulinas são aproximadamente 15% das proteínas, enquanto cerca de 85% é composto de gliadinas e gluteninas, que no trigo estão na proporção de 1:1, aproximadamente 2. As gliadinas são solúveis em etanol 70% enquanto que as gluteninas são insolúveis em etanol. As gliadinas são polipeptídeos de cadeias simples com pesos moleculares similares, mas as gluteninas são formadas por subunidades mais complexas, dando origem a uma ampla distribuição de massa molar 3. Uma característica interessante é que proteínas de glúten podem sofrer ligações dissulfeto quando sob aquecimento, ou seja, o glúten pode ser reticulado quando aquecido. Ali e colaboradores (1997) 4 estudaram o efeito de diferentes tratamentos térmicos nas propriedades de filmes de glúten de trigo. Este estudo demonstrou que durante o tratamento térmico ocorreu a formação de ligações covalentes nos filmes de glúten, além de ocorrer uma diminuição na hidrofilicidade dos sistemas estudados. O sistema de liberação controlada de princípios ativos (SLC), por exemplo, de fármacos, apresenta vantagens em comparação com um sistema de administração convencional de medicamentos (cápsulas, soluções) devido a manutenção do nível terapêutico por períodos mais prolongados. Em um sistema de administração convencional, os níveis plasmáticos aumentam além do necessário atingindo níveis tóxicos e diminuem rapidamente à medida que o fármaco é
2 metabolizado, caindo em pouco tempo para níveis abaixo do terapêutico. Além disso, o fármaco geralmente permeia através do organismo e não atinge o alvo onde é requisitado 5. Já em um SLC, além de haver a possibilidade de atingir alvos específicos, a concentração do fármaco é mantida constante no organismo e permanece durante mais tempo em níveis terapêuticos. Yu e Lee (1997) 6 utilizaram o glúten em um sistema core-shell para a microencapsulação de pirrolnitrina através da técnica de coacervação. Os autores obtiveram microcápsulas com tamanhos entre 5 e 80 µm, sendo que estas microcápsulas eram irregulares no formato, ou seja, não foram obtidas partículas esféricas. Entretanto, não existem relatos na literatura sobre a utilização de glúten na formação de microesferas pela técnica de emulsificação/evaporação do solvente. Neste estudo foram preparadas microesferas através da técnica de emulsificação/evaporação de solvente com vistas a utilização em sistemas controlados de substâncias ativas. Particularmente, neste estudo foi utilizada a rodamina como substância modelo, e após incorporada ao sistema esta foi liberada em tampão fosfato a 25 ºC. Experimental Preparação das microesferas: As microesferas foram preparadas pela técnica de emulsificação/evaporação do solvente. Inicialmente, foram preparadas soluções de glúten 10% (m/v) em uma solução água/etanol 55/45 (v/v) (fase interna). O ph desta solução foi ajustado para 3 com HCl 1 M, e então a solução foi aquecida a 45 ºC por 20 minutos, sob agitação constante. Posteriormente, foi adicionado 1% (v/v) de Tween 80 à solução, que ficou então sob agitação a temperatura ambiente por 24 horas. Nesta etapa o corante rodamina também foi adicionado à solução (3% m/m), para a preparação de microesferas com rodamina encapsulada. Paralelamente, também foi preparada uma solução de óleo mineral com adição de 1% (v/v) de Span 80 (fase continua ou externa). O Tween 80 e o Span 80 têm como função estabilizar a dispersão das gotas na forma de emulsão, prevenindo a agregação e a coalescência. A solução de polímero (fase interna) foi então gotejada na solução de óleo mineral (fase continua), utilizando-se 450 rpm de velocidade de agitação. Após esta etapa, para o endurecimento das microesferas formadas, a solução resultante foi aquecida a 120ºC (para a evaporação da fase interna e reticulação do polímero), sob agitação constante, durante 4 horas. Por fim, as microesferas resultantes foram filtradas, lavadas com etanol, secas em estufa (a 40 C por 24 horas) e armazenadas para futuras caracterizações.
3 Determinação da eficiência de encapsulação: A eficiência de encapsulação (EE) é estimada como sendo a diferença percentual entre a concentração de fármaco inicialmente adicionado na formulação e a concentração retida no interior das partículas, após determinação quantitativa do mesmo nas microesferas. A quantificação do fármaco foi realizada por espectroscopia UV-VIS, medindo a absorbância das soluções em 554 nm. Para determinar a quantidade de agente ativo encapsulado nas microesferas foi necessário inicialmente a construção de uma curva de calibração (concentração vs. absorbância) usando NaOH 0,1M como solvente, feita com o agente ativo a ser liberado. De posse da curva, uma massa conhecida de microesferas com rodamina encapsulada foi totalmente dissolvida em solução de NaOH 0,1M, e então foi possível dosar a quantidade de substância encapsulada através da medida de absorbância desta solução. Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC): A calorimetria exploratória diferencial da rodamina, microesferas de glúten e microesferas de glúten com rodamina encapsulada foram realizadas num aparelho DSC-50 Shimadzu, sob atmosfera de nitrogênio (50 cm 3 min -1 ) a uma taxa de aquecimento de 10 ºC min -1. Aproximadamente 10 mg das amostras foram aquecidas até 110 ºC e em seguida sofreram choque térmico. Após esta etapa, as amostras foram novamente aquecidas de 25ºC a 300 ºC, sendo que esta segunda varredura foi usada para a determinação dos valores de temperatura de transição vítrea (T g ) e temperatura de fusão (T m ). Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV): No presente estudo, esta técnica foi empregada para analisar a morfologia das microesferas formadas, sua porosidade, a distribuição dos fármacos nas microesferas e o tamanho das partículas. Algumas microesferas foram seccionadas transversalmente para a visualização da estrutura interna das partículas. As amostras foram cobertas com ouro por sputtering, com um metalizador modelo D2 Diode Sputtering System, logo antes de efetuar-se a análise. Foi utilizado um microscópio Philips modelo XL 30. Estudo da Velocidade de Liberação de Rodamina: Inicialmente foi preparada uma curva de calibração de rodamina em solução tampão fosfato (ph 7,4) para futura determinação da concentração de rodamina liberada. Uma massa conhecida de microesferas (0,6 g) contendo em média 9 mg de rodamina encapsulada foi suspensa em uma solução de tampão fosfato (ph 7,4) e mantida sob agitação
4 constante a 25 ºC. Em intervalos de tempo pré-determinados foram retiradas alíquotas do meio de liberação, e efetuadas leituras das absorbâncias a 554 nm destas amostras em um espectrofotômetro Perkin Elmer UV-VIS 11/BIO Lambda. Resultados e Discussão Na figura 1 é mostrada a curva de calibração feita com rodamina em solução de NaOH 0,1M, utilizada para determinar a quantidade de rodamina encapsulada nas microesferas. A eficiência de encapsulação encontrada foi de 49%, um valor relativamente baixo, porém em concordância com outros valores de eficiência de encapsulação para a rodamina descritos na literatura 7,8. Este valor baixo de eficiência de encapsulação pode ser devido à alta hidrofilicidade da rodamina, que portanto tende a migrar para a superfície da microesfera juntamente com a água, durante o processo de evaporação da fase interna. Tendo em vista a eficiência de encapsulação da rodamina, podemos determinar a quantidade de rodamina presente nas microesferas de glúten com sendo de 14,85 µg/mg de microesferas. 1,0 0,8 Parameter Value A -0,03375 B 0,2094 Absorbância 0,6 0,4 0,2 0, Concentração (µg/ml) Figura 1. Curva de calibração de rodamina em solução de NaOH 0,1M. As curvas de DSC são apresentadas na figura 2. Podemos observar que a rodamina pura tem um pico endotérmico bem definido em 206 ºC, referente à temperatura de fusão (T m ), mostrando que esta substância tem característica cristalina. Já o DSC das microesferas de glúten mostra um evento térmico em 163ºC, referente à temperatura de transição vítrea (T g ) deste material. Não foi possível observar nenhum pico relacionado a T m para as microesferas de glúten, mostrando que este polímero é em sua maioria amorfo. Na curva de DSC das microesferas de glúten encapsuladas com rodamina, não foi possível observar nenhum pico relacionado com a fusão da rodamina encapsulada. Isso pode ser devido em
5 parte à baixa concentração de rodamina nas microesferas. Além disso, a rodamina pode estar interagindo com o polímero, se dispersando molecularmente na matriz de glúten e adquirindo desta forma uma característica amorfa. Este resultado pode ser confirmado pela diminuição da T g (158 ºC) observada nesta curva em relação à curva de microesferas sem rodamina, indicando que existem moléculas de rodamina entre as cadeias de glúten, diminuindo a interação polímero-polímero e facilitando a mobilidade das cadeias poliméricas. 163 ºC A B 158 ºC endo C Temperatura (ºC) 206 ºC Figura 2. Curvas de DSC para microesferas de glúten (A), microesferas de glúten com rodamina encapsulada (B) e rodamina (C). Utilizando a microscopia eletrônica de varredura (MEV) foi possível observar a morfologia das microesferas formadas, sua porosidade, a distribuição da rodamina nas microesferas e o tamanho das partículas. Observou-se que utilizando a técnica de emulsificação/evaporação do solvente foi possível obter partículas perfeitamente esféricas. A superfície das microesferas feitas com glúten (figura 3) apresenta rugosidade. Quando esta técnica é aplicada, a rugosidade das microesferas aumenta quanto maior for a velocidade com que ocorre a eliminação do solvente da fase interna da emulsão durante o processo de microencapsulação. O tamanho médio destas microesferas é de 13,99 ± 1,72 µm. Observando-se a fratura para a microesfera de glúten é possível observar a presença de pequenos poros no interior das microesferas.
6 (A) (B) (C) Figura 3. Microscopia eletrônica de varredura para a superfície de microesferas de glúten com ampliação de (A)500x, (B) 3000x e fratura de microesfera com ampliação de 2000x (C). Na figura 4 estão representadas as micrografias para as microesferas com adição de 3% de rodamina na formulação das microesferas, com eficiência de encapsulação de 31%. Observa-se a presença de alguns cristais de rodamina na superfície das microesferas, porém no interior das mesmas não foi observado nenhum cristal. Este resultado surge em parte devido a provável migração da rodamina para a superfície das microesferas, conforme já mencionado anteriormente. Além disso, a rodamina presente no interior das microesferas pode estar dispersa molecularmente, como já citado, e portanto não é possível a sua visualização. Estas microesferas apresentaram um tamanho médio de 24,80 ± 4,09 µm. (A) (B) (C) Figura 4. Microscopia eletrônica de varredura para a superfície de microesferas de glúten com rodamina encapsulada com ampliação de (A)500x, (B) 1600x e fratura de microesfera com ampliação de 4000x (C). Na figura 5 é apresentado o perfil de liberação de rodamina a partir de microesferas de glúten. Num estudo de liberação realizado durante 24 horas verificou-se que apenas 10% (aproximadamente 0,9 mg) da quantidade total de rodamina encapsulada foi liberada. Nas primeiras 2 horas já havia sido liberado ao meio receptor 8% da quantidade total de rodamina encapsulada, o
7 equivalente a 80% da liberação total de rodamina nessas 24 horas. Este comportamento de rápida liberação inicial pode ser denominado efeito burst e está associado aos cristais de rodamina presentes na superfície das microesferas, que são solubilizados rapidamente no meio de liberação. Uma grande parte da rodamina encapsulada não foi liberada para o meio de liberação nas primeiras 24 horas, o que indica a ocorrência de interações entre a rodamina e a matriz polimérica. Esses 90% restantes de rodamina encapsulada poderão ser liberados para o meio através do processo de difusão pela matriz polimérica ou pelo fenômeno da erosão da matriz,. Entretanto, estudos mais aprofundados serão necessários para a determinação do perfil de liberação e conhecimento do mecanismo envolvido Rodamina liberada (%) Tempo (min) Figura 5. Perfil de liberação de rodamina a partir de microesferas de glúten. Conclusões Através da calorimetria exploratória diferencial podemos concluir que a rodamina encontrase dispersa molecularmente na matriz de glúten. Esse resultado é confirmado por MEV, onde não foi possível observar rodamina no interior das microesferas de glúten, provavelmente por essas se encontrarem no estado amorfo. O perfil de liberação in vitro da rodamina também concorda com as conclusões acima, já que apenas uma pequena parte da rodamina encapsulada, que estava na superfície da microesfera, foi liberada. Agradecimentos Os autores agradecem a CAPES, CNPq e UFSC pelo apoio financeiro.
8 Referências Bibliográficas 1. P. S. T. Palmu, Tese de Doutorado, Universidade Estadual de Campinas, P. A. Bobbio, F. O. Bobbio, Química do Processamento de Alimentos. 2ª Edição, São Paulo: Editora Varela, H. Singh; F. MacRitchie. Journal of Cereal Science 2001, 33, Y. Ali; V. M. Ghorpade; M. A. Hanna. Industrial Crops and Products: an International Journal, 1997, 6, J. Irissin-Mangata; G. Bauduin; B. Boutevin; N. Gontard. European Polymer Journal, 2001, 37, J. Folkman; D. M. Long. Journal of Surgical Research, 1964, 4, D. C. Bibby; N. M. Davies, I. G. Tucker. International Journal of Pharmaceutics, 1999, 187, C. Berkland, M. J. Kipper, B. Narasimhan, K. Kim, D. W. Pack. Journal of Controlled Release, 2004, 94,
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