ESTUDO DO MECANISMO DE LIBERAÇÃO DE CLORIDRATO DE DILTIAZEM EM MICROESFERAS DE GLÚTEN DE TRIGO.
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- Fátima Peixoto Fidalgo
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1 ESTUDO DO MECANISMO DE LIBERAÇÃO DE CLORIDRATO DE DILTIAZEM EM MICROESFERAS DE GLÚTEN DE TRIGO. Larissa Andreani 1*, Rodrigo Cercená 1, Betina G. Z. Ramos 2, Valdir Soldi 1 1 Grupo de Estudos em Materiais Poliméricos (Polimat), Departamento de Química larissaandreani@gmail.com 2 Laboratório de Bioquímica de Macromoléculas, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Santa Catarina Florianópolis-SC O objetivo deste trabalho foi avaliar o mecanismo através do qual o fármaco modelo cloridrato de diltiazem (DZ) é liberado a partir de microesferas de glúten de trigo preparadas com adição ou não de polietileno glicol. Para tanto, foi determinada a eficiência de encapsulação de diltiazem nas microesferas preparadas (72,82% e 96,67% para microesferas sem e com PEG, respectivamente). Os ensaios de liberação in vitro foram realizados utilizando como meio de liberação uma solução tampão Clark-Lubs (ph 1,2) e solução tampão fosfato (ph 7,4) a 37ºC. Observou-se que para ambos os sistemas houve a ocorrência de efeito burst nas duas primeiras horas de liberação. Na tentativa de elucidar o mecanismo de liberação, os sistemas foram tratados com base em dois modelos matemáticos bastante conhecidos: o modelo de Higuchi e a lei das potências. Com base nos resultados obtidos, pode-se afirmar que o mecanismo de liberação das microesferas não é controlado exclusivamente por difusão. Palavras-chave: microesferas, glúten de trigo, sistemas de liberação controlada, cloridrato de ditiazem, mecanismo de liberação. Study of the release mechanism of diltiazem hydrochloride in wheat gluten microspheres. The purpose of this work was to evaluate the mechanism by which the model drug diltiazem hydrochloride (DZ) is released from wheat gluten microspheres prepared with or without polyethylene glycol. For this purpose, it was determined the encapsulation efficiency of diltiazem in the prepared microspheres, 72.82% and 96.67% in microspheres without and with PEG, respectively. The in vitro release tests had been carried out using as release medium a Clark- Lubs buffer solution (ph 1.2) and phosphate buffer solution (ph 7.4) at 37ºC. It was observed that for both systems there was the occurrence of burst effect in the first two hours of release. In the attempt to elucidate the release mechanism, the systems had been treated based in two well known mathematical models: the Higuchi model and the power law. Based on the results obtained, it can be affirmed that the microsphere release mechanism is not exclusively diffusion-controlled. Keywords: microspheres, wheat gluten, controlled release systems, diltiazem hydrochloride, release mechanism. Introdução Nos anos 70 polímeros biodegradáveis foram sugeridos como materiais apropriados para liberação de fármacos, já que não necessitavam de remoção [1]. A partir de então, a liberação controlada de fármacos passou a ser uma das aplicações mais importantes e mais versáteis dos polímeros biodegradáveis [2]. As proteínas, como biopolímeros, apresentam as características de biodegradabilidade e biocompatibilidade necessárias a um dispositivo de liberação in vivo, sendo portanto adequadas para a utilização em sistemas de liberação controlada de fármacos. Dentro da classe das proteínas, as derivadas de plantas apresentam a vantagem de serem materiais renováveis produzidos em grande quantidade todo ano. Entre estas proteínas podemos destacar o glúten de trigo, que além de possuir todas as características citadas, ainda apresenta uma das mais rápidas degradações entre os
2 polímeros. Estas propriedades do glúten, que é geralmente obtido como um subproduto agrícola da indústria de processamento de alimentos, o tornam um bom candidato para a utilização como dispositivo de liberação controlada [3]. Entre as vantagens do uso de sistemas poliméricos para a encapsulação de fármacos frente à administração convencional, podemos citar a manutenção de níveis plasmáticos constantes na faixa de concentração terapêutica por meio da contínua liberação do fármaco, além da proteção do fármaco contra a umidade, calor e oxidação e mascaramento do sabor e odor desagradáveis de substâncias ativas. Além disso, há a possibilidade do direcionamento do fármaco a alvos específicos e a possibilidade de encapsulação de substâncias hidrofílicas e hidrofóbicas [4]. O fármaco utilizado como modelo nesse estudo é o cloridrato de diltiazem (DZ), pois este fármaco antihipertensivo tem uma meia vida biológica relativamente curta, de 3 a 4 horas, e requer uma alta freqüência de administração. Portanto, tentativas têm sido feitas para se desenvolver formulações de liberação lenta de diltiazem [5,6]. Na preparação de um novo sistema polimérico para a liberação controlada de agentes ativos, é muito importante a determinação da velocidade e do mecanismo de liberação da substância encapsulada para um melhor entendimento acerca da estrutura do sistema utilizado e dos mecanismos envolvidos na liberação. Portanto, o intuito do presente trabalho foi estudar o mecanismo pelo qual ocorre a liberação de cloridrato de diltiazem a partir de microesferas de glúten de trigo. Para tanto, as equações de Higuchi e lei das potências foram utilizadas. O modelo de Higuchi assume que o agente ativo (AA), substância que exerce o efeito farmacológico, é liberado a partir de uma matriz homogênea com um coeficiente de difusão constante [7]. A equação (1) é conhecida como equação de Higuchi, onde M t é a quantidade de substância liberada no tempo t, M é a quantidade de substância liberada em tempo infinito (que deve ser igual à quantidade de AA inicialmente adicionado ao sistema), e K é uma constante que reune a difusividade do agente ativo na matriz polimérica, a concentração inicial do agente ativo e a solubilidade da substância no polímero [8]. M t = M 1 2 kt (1) Um segundo método que descreve o comportamento da liberação de pricípios ativos a partir de sistemas poliméricos é a lei das potências, apresentada na equação (2), onde M t e M são a quantidade de substância liberada no tempo t e no tempo infinito, respectivamente, K é uma constante relacionada às características estruturais e geométricas da matriz polimérica e n é o
3 expoente de liberação, indicativo do mecanismo de liberação do agente ativo [8-10]. A tabela 1 reune as informações obtidas através da utilização da lei das potências: M t = M kt n (2) Tabela 1. Correlação entre os valoes de n e o mecanismo de transporte. Valor de n Mecanismo de Transporte do Fármaco 0,43 Difusão Fickiana 0,85 Transporte caso-ii (liberação de ordem zero) 0,43 < n > 0,85 Transporte Anômalo n < 0,43 Difusão parcial através da matriz e poros n > 0,85 Super caso-ii Experimental Preparação das Microesferas As microesferas foram preparadas pela técnica de emulsificação/evaporação do solvente, conforme descrito pelo nosso grupo na literatura [11]. Inicialmente, foram preparadas soluções de glúten 10% (m/v) em uma solução água/etanol 55/45 (v/v) (fase interna). O ph desta solução foi ajustado para 3 com HCl 1 M, e então a solução foi aquecida a 45ºC por 20 minutos, sob agitação constante [12]. Posteriormente, foi adicionado 1% (v/v) de Tween 80 à solução, que ficou então sob agitação a temperatura ambiente por 24 horas. Nesta etapa o fármaco modelo cloridrato de diltiazem também foi adicionado à solução (5% m/m), para a preparação de microesferas com DZ encapsulado. Também nesta etapa as microesferas de Gluten/PEG 95/05 foram preparadas com a adição de 5% (m/m) de polietieno glicol (PEG 400). Paralelamente, preparou-se uma solução de óleo mineral com adição de 1% (v/v) de Span 80 (fase continua ou externa). A solução de polímero (fase interna) foi então gotejada na solução de óleo mineral (fase continua), utilizando-se 450 rpm de velocidade de agitação. Após esta etapa, para o endurecimento das microesferas formadas, a solução resultante foi aquecida a 120ºC (para a evaporação da fase interna e reticulação do polímero), sob agitação constante, durante 4 horas. Por fim, as microesferas resultantes foram filtradas, lavadas com etanol, secas em estufa (a 40 C por 24 horas) e armazenadas para futuras caracterizações.
4 Determinação da eficiência de encapsulação: A eficiência de encapsulação (EE) é estimada como sendo a diferença percentual entre a concentração de fármaco inicialmente adicionado na formulação e a concentração retida no interior das partículas, após determinação quantitativa do mesmo nas microesferas. Para determinar a quantidade de cloridrato de diltiazem contido nas microesferas preparadas, utilizou-se a espectroscopia no UV/VIS. Inicialmente, construiu-se uma curva de calibração (absorbância vs. concentração) com o AA em questão dissolvido em NaOH 0,1M. De posse da curva de calibração dissolveu-se cerca de 10 mg, exatamente pesados, das microesferas preparadas com DZ em NaOH 0,1M, e esta solução ficou sob agitação em banho térmico a 37 C durante 24 horas. Após este período, as microesferas foram totalmente dissolvidas, e o AA encapsulado foi transferido para a solução. Procedeu-se então à medida da absorção da solução em espectroscopia de UV/VIS em 238 nm. Este procedimento foi feito em triplicata. Estudo da Velocidade de Liberação in vitro de cloridrato de diltiazem A liberação in vitro de cloridrato de diltiazem foi realizada de forma a simular o trânsito no trato gastrointestinal. Desta forma, os testes foram feitos a 37ºC, em ph 1,2 (tampão Clark-Lubs) [13] durante 2 horas, para simular as condições de tempo de trânsito estomacal, e em ph 7,4 (tampão fosfato), para simular o trânsito intestinal [14]. Construiu-se uma curva de calibração contendo cloridrato de diltiazem dissolvido em tampão Clark-Lubs e em solução tampão fosfato, para futura determinação da concentração de cloridrato de diltiazem liberado. Adicionou-se então a 100 ml do tampão apropriado 0,3 g de microesferas de glúten e de microesferas de Glúten/PEG 95/05, contendo em média e µg de cloridrato de diltiazem encapsulado, respectivamente. As soluções, feitas em triplicata, foram mantidas sob agitação constante de 150 rpm. Em intervalos de tempo prédeterminados foram retiradas alíquotas de 1 ml do meio de liberação. Estas amostras foram diluídas para 10 ml e efetuou-se leituras das absorbâncias a 238 nm. Após a medida, 1 ml da solução diluída foi devolvida ao meio de liberação, para garantir a manutenção das condições sink. De posse dos dados de velocidade de liberação, efetuou-se o tratamento matemático de Higuchi e lei das potências, e determinou-se o mecanismo de liberação predominante nas microesferas. Resultados e Discussão A eficiência de encapsulação de cloridrato de diltiazem em microesferas de glúten de trigo foi de 72,82% ± 1,85. Já para as microesferas de Glúten/PEG 95/05, a EE encontrada foi de 96,67% ± 3,56. Estes valores de EE sugerem uma interação entre o diltiazem e a matriz de glúten de trigo, pois observa-se que o DZ, mesmo apresentando elevada solubilidade em água, se mantém na matriz de
5 glúten durante a etapa de evaporação do solvente. As microesferas com PEG apresentaram maior eficiência de encapsulação em comparação com as microesferas sem a presença de PEG, possívelmente devido à maior ocorrência de porosidade, conforme descrito em trabalhos anteriores [11]. Este aumento na porosidade resulta em maior área superficial disponível nas microesferas para incorporar o diltiazem. Diltiazem Liberado (%) Tempo (min) Figura 1. Perfil de liberação in vitro de DZ a partir de microesferas de Glúten/PEG 95/05 ( ) e microesferas de glúten de trigo ( ) a 37ºC em ph 1,2. Na Figura 1 observa-se os perfis de liberação a 37ºC e ph 1,2 de microesferas de glúten de trigo e microesferas de Glúten/PEG 95/05 com cloridrato de diltiazem encapsulado, simulando-se o tempo de trânsito estomacal. Foram aplicadas correlações exponenciais de primeira ordem nos dois gráficos (linha pontilhada), obtendo-se os valores 0,9247 para o sistema sem PEG e 0,9074 para o sistema na presença de polietileno glicol. Através destes valores de coeficiente de correlação e da própria observação das curvas, nota-se que os perfis de liberação são bastante similares e homogêneos. Nos primeiros 15 minutos, a liberação de diltiazem foi de 24% e 31% para o sistema sem PEG e com PEG, respectivamente. Após 2 horas, pouco diltiazem adicional havia sido liberado, e no total as microesferas de glúten de trigo liberaram 30% de diltiazem, enquanto as microesferas de Glúten/PEG 95/05 liberaram 37%. Nota-se que o sistema preparado com a presença de PEG apresentou uma liberação ligeiramente maior durante estas duas horas. Este efeito está relacionado à maior porosidade conferida às microesferas quando preparadas com PEG, desta forma facilitando a difusão das moléculas de diltiazem para fora das partículas. Além disso, sabe-se que plastificantes possuem a propriedade de se colocarem entre as cadeias poliméricas facilitando a sua mobilidade,
6 característica esta que também auxilia na liberação mais rápida de fármaco a partir do dipositivo polimérico [15] Diltiazem Liberado (%) Diltiazem Liberado (%) ,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 Tempo (dias) Tempo (dias) Figura 2. Perfil de liberação in vitro de DZ a partir de microesferas de Glúten/PEG 95/05 ( ) e microesferas de glúten de trigo ( ) a 37ºC em ph 7,4. No insert, as primeiras 12 horas de liberação. Na Figura 2 estão apresentados os perfis de liberação in vitro de cloridrato de diltiazem a 37ºC em ph 7,4 para as microesferas de glúten de trigo e Glúten/PEG 95/05. Para o sistema de microesferas de glúten de trigo, constatou-se que todo o diltiazem presente nas microesferas foi liberado após 10 dias, enquanto que para o sistema com a presença de PEG a liberação completa ocorreu em 8 dias. Considerando a eficiência de encapsulação destes sistemas, nota-se que o sistema com PEG libera mais diltiazem, já que possui mais fármaco encapsulado em sua matriz. Mas avaliando-se apenas a liberação relativa destes dois sistemas, observa-se que, após 3 dias, a liberação de diltiazem é bastante similar em ambos os sistemas. Por exemplo, 50% de diltiazem foi liberado em aproximadamente 26 horas para o sistema sem a presença de polietileno glicol, enquanto esta mesma quantidade de fármaco foi liberada em 21 horas para o sistema com PEG. Após o terceiro dia, nenhuma diferença no perfil e na velocidade de liberação pode ser observada entre os sistemas, sugerindo que nesta etapa o principal fator que afeta estas variáveis é a temperatura, e não a presença ou ausência de PEG. Observando-se o insert da Figura 2, nota-se uma diferença no comportamento de liberação nas 12 horas iniciais para ambos os sistemas estudados. A liberação das microesferas de Glúten/PEG 95/05 é muito mais homogênea, enquanto a microesfera de glúten de trigo apresenta um efeito burst (liberação rápida do agente ativo que está adsorvido na superfície da partícula) bem caracterizado nas primeiras 2 horas de testes. Após 9 horas, 31% e 44% de diltiazem foram liberados a partir das microesferas de glúten e Glúten/PEG 95/05, respectivamente. Foram aplicadas correlações exponenciais de primeira ordem nos perfis de liberação da Figura 2, sendo que para o
7 tempo total de liberação os resultados obtidos foram de 0,9897 e 0,9973 para os sistemas sem e com PEG, respectivamente. Para os gráficos representando apenas as 12 primeiras horas de liberação, os coeficientes de correlação encontrados foram de 0,9635 e 0,9691, sugerindo que houve um mecanismo de liberação similar nestes sistemas, conforme pode ser confirmado visualmente. 1,2 1,0 R 2 =0,9731 R 2 =0,9227 0,8 R 2 =0,9511 M t /M inf 0,9 R 2 =0,8725 M t /M inf R 2 =0,8548 0,4 0,8 R 2 =0,7506 0,1 0,2 0,3 t 1/2 0, t 1/2 (A) (B) Figura 3. Gráfico da quantidade de DZ liberado em função do tempo para microesferas de glúten de trigo ( ) e Glúten/PEG 95/05 ( ) considerando o modelo matemático de Higuchi em ph 1,2 (A) e ph 7,4 (B). Os sistemas de liberação (microesferas de glúten e Glúten/PEG 95/05) de cloridrato de diltiazem em tampão Clark-Lubs e tampão fosfato analisados de acordo com o modelo matemático de Higuchi estão apresentados na Figura 3. Para a liberação de DZ em ph 1,2 (Figura 3A) observa-se uma característica linear para ambos os sistemas estudados. Apesar da linearidade apresentada, os valores de coeficiente de correlação (R 2 ) encontrados quando utilizou-se a equação de Higuchi mostraram-se bastante baixos (0,9227 e 0,8725 para as microesferas de glúten e Glúten/PEG, respectivamente), indicando que este modelo não é adequado para a análise do mecanismo de liberação deste sistema nas condições de estudo. Para o estudo da liberação de DZ em ph 7,4 (Figura 3B) observou-se uma quebra da linearidade aproximadamente 8 horas após o início da liberação, provavelmente devido à existêcia de 2 regiões com diferentes velocidades de liberação, a primeira mais rápida e a segunda, lenta. Também para esse sistema a equação de Higuchi mostrou-se inadequada, apresentando valores de coeficiente de correlação muito baixos. Apenas o sistema Glúten/PEG 95/05 em ph 7,4 na região de liberação lenta (após as 8 horas iniciais) apresentou um valor de R 2 aceitável (0,9731), mas ainda assim esse valor não é elevado o suficiente para que possamos determinar com confiança seu mecanismo de liberação através da equação de Higuchi. Os
8 baixos valores de correlação encontrados sugerem que o mecanismo de liberação não está associado à difusão, mas apenas por esta análise não podemos afirmar qual o tipo de mecanismo envolvido nesse sistema. Como o modelo de Higuchi mostrou-se inadequado para a análise do sistema em estudo, optou-se por analisar o sistema por meio da lei das potências (Figura 4). Conforme discutido previamente, neste modelo o índice n define o mecanismo de liberação do fármaco. Na Figura 4A novamente observou-se uma boa linearidade nos resultados da liberação de DZ em ph 1,2. Os valores de coeficiente de correlação encontrados (0,9319 e 0,9119 para as microesferas de glúten e Glúten/PEG, respectivamente) são considerados satisfatórios pela lei das potências, e ambos os valores de n indicam que o mecanismo responsável por esta liberação combina o intumescimento e a difusão através de poros hidrofílicos. Para a liberação em ph 7,4 (Figura 4B), novamente houve uma quebra na linearidade, por volta das 8 horas de liberação, relacionado à presença de duas regiões com velocidades de liberação diferentes. Os valores de R 2 para as primeiras 8 horas de liberação para ambos os sistemas foi insatisfatório, e portanto não podemos chegar a nenhuma conclusão sobre o mecanismo de liberação deste período através da utilização da lei das potências. Já para a região de liberação mais lenta foi possível obter valores de coeficiente de correlação satisfatórios, e seus valores de n indicam novamente que a liberação ocorre através de um mecanismo que envolve a difusão através da matriz intumescida e também por poros hidrofílicos. 0,00 0,0 R 2 =0,9857 n=0,3003 log M t /M inf -0,05-0,10 R 2 =0,9119 n=0,0773 R 2 =0,9319 n=0,0932 log M t /M inf -0,4-0,8 R 2 =0,7258 n=0,0691 R 2 =0,8512 n=0,2162 R 2 =0,9772 n=0,2941-2,0-1,6-1,2 log t log t (A) (B) Figura 4. Gráfico da quantidade de DZ liberado em função do tempo para microesferas de glúten de trigo ( ) e Gluten/PEG 95/05 ( )considerando o modelo matemático da lei das potências em ph 1,2 (A) e ph 7,4 (B).
9 Conclusões Baseando-se nos resultados discutidos acima, pode-se concluir que as microesferas preparadas com glúten de trigo podem ser usadas como um sistema de liberação controlada. Polietileno glicol, agindo como um plastificante, foi utilizado com sucesso para modular a velocidade de liberação, além de colaborar no aumento da eficiência de encapsulação destas microesferas. Para o cloridrato de diltiazem, a liberação total se deu em 10 dias para o sistema sem PEG a 37ºC, e em 8 dias para o sistema com PEG nesta mesma temperatura. Todas as formulações testadas apresentaram efeito burst nas primeiras 2 horas de liberação. O modelo de Higuchi mostrouse inadequado na determinação do mecanismo de liberação de DZ através das microesferas estudadas. Já a lei das potências sugere que, após as primeiras 8 horas de testes, o mecanismo de liberação não é controlado exclusivamente por difusão. Aparentemente, o mecanismo de liberação é uma combinação do intumescimento e da difusão através de poros hidrofílicos. Quanto as primeiras 8 horas de testes, são necessários novos estudos envolvendo diferentes modelos matemáticos para que seja possível a determinação do real mecanismo de liberação desta etapa. Agradecimentos Os autores agradecem à UFSC, à CAPES e ao CNPq pelo auxílio financeiro. Referências Bibliográficas 1. R. Jalil; J. R. Nixon J. Microencapsulation 1990, 7(3), R. L. Oréfice; M. M.Pereira; H. S. Mansur, Biomateriais: fundamentos e aplicações. Cultura Médica, Rio de Janeiro, A. Jerez; P. Partal; I. Martínez; C. Gallegos; A. Guerrero Biochem. Eng. J. 2005, 26, P. J. Watts, M. C. Davies, C. D. Melia Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1990, 7(3), M. A. Bayomi; S. A. Al-Suwayeh; A. M. El-Helw; A. F. Mesnad Pharm. Acta Helv. 1998,73, N. Follonier; E. Doelker; E. T. Cole J. Controlled Release 1995, 36, T. Higuchi J. Pharm. Sci. 1961, 50, J. Siepmann; N. A. Peppas Adv. Drug Delivery Rev. 2001, 48, N. A. Peppas Pharm. Acta Helv. 1985, 60, J.M. Llabot; R. H. Manzo; D. A. Allemandi Int. J. Pharm. 2004, 276, L. Andreani; R. Cercená; B. G. Zanetti-Ramos; V. Soldi Mater. Sci. Eng., C 2009, 29(2), N. Gontard; S. Guilbert; J. L. Cuq J. Food Sci. 1993, 58, 206.
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