UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO GUSTAVO LEITE LOPES

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO GUSTAVO LEITE LOPES ESTUDO ELETROFORÉTICO E ELETROLÍTICO DA ERLIQUIOSE CANINA EM CAMPOS DOS GOYTACAZES, RJ CAMPOS DOS GOYTACAZES 2008

2 GUSTAVO LEITE LOPES ESTUDO ELETROFORÉTICO E ELETROLÍTICO DA ERLIQUIOSE CANINA EM CAMPOS DOS GOYTACAZES, RJ Dissertação apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Produção Animal na área de Concentração de Clínica Médica Veterinária. ORIENTADOR: Prof. Antônio Peixoto Albernaz CAMPOS DOS GOYTACAZES 2008

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4 Deus, que sempre me deu muita força e Fé para atingir os meus objetivos.

5 AGRADECIMENTOS A Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, por ter me dado condições de chegar até aqui Aos meus pais e familiares, por sempre me incentivarem e acreditarem em meu potencial. Ao meu orientador Prof. Antônio Peixoto Albernaz, pela paciência, amizade e dedicação. A banca examinadora pela atenção e dedicação na avaliação do trabalho em questão. A minha noiva Monique Jorge Gomes, pelo incentivo, amizade e carinho. Aos técnicos Josias Alves Machado (Técnico nível médio UENF) e Orlando Augusto Melo Júnior (Técnico de nível superior UENF) a quem devo muito respeito e admiração pelo companheirismo e dedicação que tiveram comigo. Aos animais que tanto colaboram com as descobertas da ciência. Aos colegas de profissão por colaboram com este trabalho.

6 RESUMO LOPES, GUSTAVO LEITE; Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro; fevereiro de 2008; ESTUDO ELETROFORÉTICO E ELETROLÍTICO DA ERLIQUIOSE CANINA EM CAMPOS DOS GOYTACAZES, RJ; Professor orientador: Antonio Peixoto Albernaz. A Erliquiose canina é uma doença infecciosa com significativa prevalência em várias regiões do Brasil, inclusive na região Norte fluminense. As bactérias Erhlichia canis e Anaplasma platys são as principais causadoras da enfermidade, sendo pertencentes à família Anaplasmatacea e a ordem Rickettsiales. A doença é transmitida pelo carrapato Rhipicephalus sanguineus e apresenta três formas clínicas: aguda, subaguda e crônica. A eficácia do tratamento depende de um diagnóstico precoce, este é reforçado pela suspeita clínica e confirmado pela identificação microscópica do agente etiológico em lâmina, ou, por imunofluorescência indireta, ELISA e PCR. O fármaco mais utilizado no tratamento é a doxiciclina. O prognóstico é variável, e é fato que quanto mais precocemente for diagnosticada a doença, maiores são as chances de êxito no tratamento e recuperação. Objetivou-se melhor conhecimento da doença e consequentemente informações mais sedimentadas acerca do paciente infectado. Foram realizados testes de eletroforese e mensuração de sódio e potássio em sessenta cães na cidade de Campos dos Goytacazes, RJ, divididos em dois grupos de trinta animais, sendo: grupo controle e grupo positivo (Ehrlichia spp. ou Anaplasma spp.). Os dados foram tabulados e analisados estatisticamente. Evidenciou-se hipoalbuminemia e hipergamaglobulinemia no grupo positivo, as concentrações de sódio e potássio mantiveram-se dentro da normalidade neste grupo. Concluiu-se que a erliquiose canina em Campos dos Goytacazes, RJ não alterou a capacidade renal de manutenção de equilíbrio hídrico-eletrolítico e suscitou evidente reação imunológica no paciente infectado. Palavras-Chave: Norte fluminense, patologia clínica, caninos, hemoparasitoses.

7 ABSTRACT LOPES; GUSTAVO LEITE; Universidade Estadual do Norte Fluminense; february 2008; ELECTROPHORETIC AND ELECTROLYTIC STUDY OF CANINE EHRLICHIOSIS IN CAMPOS DOS GOYTACAZES, RJ; Professor orientador: Antônio Peixoto Albernaz. Canine Ehrlichiosis is a major infectious disease whose prevalence has been increased significantly in several regions of Brazil mainly in Norte Fluminense. Usually transmitted by ticks Rhipicephalus sanguineus has as etiological agent a microorganism belonging to the family of Anaplasmatacea, being Erhlichia canis and Anaplasma platys the species most commonly found. The disease may present clinics in three stages: acute, sub-acute and chronic. The effectiveness of treatment depends on an early diagnosis. The diagnosis is based and reinforced by the clinical suspect confirmed by microscopic identification of the causative agent in blade, or by indirect immunofluorescence, ELISA and PCR. The drug most used in the treatment of canine Ehrlichiosis has been doxycycline. The prognosis is variable, it is known that the earlier diagnosis is made there are more chances of success in treatment. As goal to create the grant to improve knowledge of the disease were performed electrophoresis tests and measurement of sodium and potassium in 60 dogs in the city of Campos dos Goytacazes - RJ, divided into 2 groups, one called control group and other positive group for canine Ehrlichiosis. Looking to the distribution of serum proteins with the result the positive group for canine Ehrlichiosis there was a hypoalbuminemia with a hypergammaglobulinemia, besides sodium and potassium concentration that not demonstrated alteration when compared with the control group. Keywords: Norte Fluminense, clinical pathology, dogs, hemathological parasitosis

8 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 9 2 JUSTIFICATICA 11 3 REVISÃO DE LITERATURA Histórico Taxionomia Agentes etiológicos mais importantes da região Ehrlichia canis Anaplasma platys Transmissão da Ehrlichia canis e Anaplasma platys Forma de multiplicação intra-celular Caracterização clínica da doença Alterações laboratoriais Alterações hematológicas Alterações no eritrograma Alterações no leucograma Alterações na plaquetometria Alterações bioquímicas Proteínas séricas Sódio (Na + ) e potássio (K + ) Diagnóstico Prognóstico Tratamento e profilaxia 20 4 MATERIAL E MÉTODOS Amostragem Coleta de material e procedimento laboratorial Coleta e acondicionamento Procedimento laboratorial Pesquisa de hemoparasitas 23

9 Eletroforese de proteínas séricas Procedimento Mensuração de Proteínas Totais Mensuração de sódio e potássio Análise estatística 25 5 RESULTADOS Eletroforese de proteínas séricas e eletrólitos DISCUSSÃO Eletroforese de proteínas séricas Sódio (Na + ) e potássio (K + ) CONCLUSÕES 32 8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 33

10 9 1. INTRODUÇÃO A Erliquiose canina é uma doença diagnosticada com freqüência na rotina do médico veterinário e os caninos domésticos podem ser afetados, apresentando distribuição mundial (WANER et al., 1997; CASTRO et al., 2003). O agente etiológico é uma bactéria intracelular obrigatória, da ordem Rickettisiales, sendo a Ehrlichia spp. e a Anaplasma platys os gêneros comumente observados no Brasil, infectando leucócitos e plaquetas (ALMOSNY ; MASSARD, 2002; STICH et al., 2002; BULLA et al., 2004). Hoskins (1991) relatou que a Rickettsiose canina é transmitida por carrapatos Rhipicephalus sanguineus que infectam os hospedeiros quando se alimentam e sua secreção salivar é inoculada no local da picada (GROVES et al., 1975 e MCDADE, 1990). O diagnóstico pode ser baseado em achados clínicos e laboratoriais. Os achados clínicos incluem febre, anorexia, depressão, perturbações cardíacas e respiratórias, hemorragias, linfadenopatia, esplenomegalia e anorexia (INOKUMA et al. 2002; MYLONAKIS et al., 2002; STICH et al., 2002), e os laboratoriais são: trombocitopenia, anemia, leucopenia e hipergamaglobulinemia (DAGNONE et al., 2003; SKOTARCZAK, 2003; BULLA et al., 2004). O diagnóstico da riquetisiose canina pode ser confirmado por meio de esfregaços sangüíneos corados pelo método May-Grunwald-Giemsa mediante à visualização do parasita em microscopia óptica no interior de plaquetas e/ou no citoplasma de monócitos circulantes, coletase preferencialmente sangue periférico de animais suspeitos (EWIN et al., 1996; ALMOSNY, 1998). Na cidade de Campos dos Goytacazes RJ esta doença vem sendo encontrada com freqüência. Miranda et al. (2004) e Fajardo (2005), observaram respectivamente 557 e 1300 canídeos suspeitos de erliquiose, onde 69 e 170 apresentaram-se positivos a partir de avaliação hematoscópica em esfregaço sanguíneo, o que corresponde à ocorrência de 12,4% e 13%. Segundo Skotarczak (2003) a infecção por Ehrlichia canis é caracterizada por três fases: aguda, sub-clínica, e crônica. A fase aguda ocorre entre o 8º e o 20º dia após a transmissão, com alterações clínicas de dispnéia, depressão, anorexia leve perda de peso e febre. As alterações laboratoriais são trombocitopenia, leucopenia, anemia branda, e hipergamaglobulinemia. A fase subclínica ocorre num período

11 10 entre 40º e o 120º dias, podendo não apresentar nenhum sinal clínico, ou ainda, apresentando apenas leve trombocitopenia como alteração laboratorial. A fase crônica é caracterizada por epistaxe, petéquias edema e pancitopenia, podendo ocorrer óbito (SWANGO et al., 1989; RIKIHISA et al., 1993; ALMOSNY, 1998). O presente trabalho objetivou criar subsídios para melhor conhecimento da doença, observando-se a distribuição das proteínas séricas, além da concentração do sódio e potássio em cães infectados por Ehrlichia spp ou Anaplasma spp, e com os resultados, suscitar protocolos terapêuticos mais seguros.

12 11 2. JUSTIFICATIVA A doença é freqüentemente observada na espécie canina. Os testes laboratoriais relacionados ao seu diagnóstico, como hemograma, pesquisa de hemoparasitas, a técnica de cultivo in vitro e a imunofluorescência indireta e PCR (polymerase chain reaction), merecem aprimoramento, portanto, há evidente possibilidade de serem criadas informações que possam sedimentar uma avaliação investigativa clínico-laboratorial na nossa região.

13 12 3. REVISÃO DE LITERATURA 3.1 Histórico Segundo Castro et al. (2003), a Erliquiose monocítica canina foi descrita em cães por Donatien & Lestoquard, em 1935 na Argélia. Desde então, foi identificada em grande parte do mundo, com maior freqüência nos paises tropicais. (IQBAL e RIKIHISA et al., 1991; ALMOSNY, 1998; CASTRO et al., 2003) Em 1945, o microorganismo Ehrlichia canis foi renomeado por Moshkovski em homenagem a Paul Ehrlich (MCDADE, 1990). A disseminação mundial da doença ocorreu em cães militares no final da década de 60, na Guerra do Vietnã, onde os mesmos foram acometidos com hemorragia grave (HUXSOLL, 1976; ALMOSNY, 1998). Aproximadamente 160 cães da raça Pastor Alemão contraíram a erliquiose na guerra do Vietnã. (HOILIEN et al., 1981; RIKIHISA et al.,1991). A Erliquiose canina foi descrita no Brasil pela primeira vez na cidade de Belo Horizonte, em 1973, citado por Costa et al. (1973). Carrilo et al. (1976) relataram a doença em cães da polícia militar do Rio de Janeiro, o primeiro caso da doença no estado. Miranda et al. (2004), observaram na cidade de Campos dos Goytacazes, RJ 557 canínos suspeitos de Rickettsiose dos quais 69 apresentaram-se positivos após avaliação microscópica óptica, correspondendo a uma ocorrência de 12,4% na citada região. Na mesma região, Fajardo (2005) estudou 1300 caninos suspeitos de Rickettsiose e constatou que 170 foram positivos após avaliação microscópica óptica, caracterizando freqüência de 13% Taxionomia DumLer et al. (2001) avaliando as características genéticas das bactérias contidas na ordem Rickettisiales, descreveram uma reestruturação da classificação taxionômica destas, algumas modificações foram sugeridas, dente elas, a reorganização dos gêneros Ehrlichia spp. e Anaplasma spp., alteração importante foi

14 13 a renomeação da espécie Ehrlichia platys, passando a ser denominada Anaplasma platys. Abaixo descreve-se a classificação taxionômica postulada pelos autores citados para as espécies existentes em Campos dos Goytacazes, RJ. Ordem: Rickettsiales, Família: Anaplasmatacea, Gênero: Ehrlichia, Espécie: Ehrlichia canis. Ordem: Rickettsiales, Família: Anaplasmatacea, Gênero: Anaplasma, Espécie: Anaplasma platys Agentes etiológicos mais importantes na região Ehrlichia canis A Ehrlichia canis é uma bactéria intracelular, infecta monócitos e granulócitos, causando doença denominada Erliquiose canina ou Pancitopenia tropical (RIKIHISA et al., 1993; BULLA et al., 2004). Apresenta-se em três formas: Mórulas, que se apresentam em forma de colônias arredondadas com grânulos que se apresentam, como corpúsculo elementares de coloração azul escuro quando corados pelo Giemsa. Os corpúsculos elementares apresentam tamanhos variados, podendo ser visualizados em vacúolos no citoplasma de monócitos. Os corpúsculos iniciais são caracterizados pela sua forma granular, sendo compostos por múltiplos grânulos no citoplasma de monócitos, estes grânulos precisam ser diferenciados das granulações azurófilas, que podem ocorrer em citoplasma de mononucleares de cães sadios (Immelman e Button (1973) apud ALMOSNY, 1998). A multiplicação da bactéria nos cães ocorre por divisão binária. (HILDEBRANDT et al., 1972; ALMOSNY, 1998).

15 14 Segundo Stich et al. (2002) as alterações clinico-laboratoriais observadas em 30 cães experimentalmente infectados foram febre, depressão, anorexia, leucopenia e trombocitopenia Anaplasma platys (Ehrlichia platys) A Anaplasma platys é uma rickettsia específica das plaquetas de cães, causando trombocitopenia persistente (INOKUMA et al., 2002). Podem ser visualizadas em esfregaços sangüíneos corados por Giemsa, apresentam-se como uma granulação de coloração basofílica, medindo entre 0.4 a 1,2 mm, podendo ser arredondada, oval ou achatada, é rodeada por membrana dupla e se reproduz por fissão binária (RISTIC e HUXSOLL, 1984; INOKUMA et al., 2003). GAUNT et al. (1990) observaram redução da agregação plaquetária associada a E. platys. afirmaram, após observação da medula óssea, haver hiperplasia megacariocítica, caracterizando uma trombocitopenia regenerativa. Nos achados laboratoriais pode ocorrer um leve decréscimo nos valores de eritrócitos e leucócitos e uma acentuada trombocitopenia com valores próximos a plaquetas por milímetro cúbico de sangue (HOSKINS, 1991). 3.4 Transmissão da Ehrlichia canis e Anaplasma platys O carrapato Rhipicephalus sanguineus é o principal agente transmissor da doença no cão. As bactérias da ordem Rickttsiales são transmitidas pela saliva do carrapato, ocorrendo quando os carrapatos infectados se alimentam, e sua secreção salivar é inoculada no local da picada (ALMOSNY, 1998; INOKUMA et al. 2002; STICH et al. 2002; BULLA et al. 2004; FISHMAN et al. 2004). No carrapato, o microorganismo se multiplica nos hematócitos e células da glândula salivar, onde penetram no trato digestivo (RIKIHISA et al., 1991). Alvarado et al. (2003) descreveram que a Trombocitopenia cíclica infecciosa dos cães pode ser transmitida por injeção de sangue contendo Anaplasma platys obtido durante o período parasitêmico e em condições naturais pode ser transmitida pela picada de um carrapato infectado (Rhipicephalus sanguineus).

16 15 Segundo Maretzi et al. (1994), os carrapatos da espécie Dermacentor variabilis estão relacionados a Rickettsia rickettsii. 3.5 Forma de multiplicação intra-celular Quando as bactérias são inoculadas no animal parasitado são fagocitadas pelos monócitos, aonde irão se multiplicar, formando dentro dos fagossomas os corpúsculos elementares. Estes corpúsculos vão se replicar por divisão binária, vindo a formar um pequeno número de estruturas compactas formadas por corpúsculos elementares, formando estruturas pleomórficas, que são os corpúsculos iniciais. Nos próximos 7 a 12 dias estes corpúsculos iniciais se desenvolvem no interior da inclusão madura, que é característica do gênero Ehrlichia. As mórulas se rompem liberando vários corpúsculos elementares que finalmente irão infectar novas células (SWANGO et al., 1989, McDADE, 1990; ALMOSNY, 1998). A B C Figura 1 Esfregaço sanguíneo de cão, corado com Panótico rápido, contendo Ehrlichia spp. ou Anaplasma spp. na forma de corpúsculo inicial em monócito canino (seta A), corpúsculo elementar em neutrófilo felino (seta B) e mórula em monócito canino (seta C). Aumento de 1000x, objetiva de imersão. Fonte: Gustavo Leite Lopes (2006). 3.6 Caracterização clínica da doença Os animais com erliquiose apresentam alterações clínicas graves, que podem variar conforme o estágio da doença. Estas alterações clínicas são febre, depressão, anorexia, edema de membros, hemorragias petequiais, uveites, vômito, diarréia, magreza, hepatomegalia, esplenomegalia, linfadenopatia, distúrbios cardíacos,

17 16 respiratórios e nervosos (HARRUS et al., 2001; ALMOSNY ; MASSARD, 2002; INOKUMA et al., 2002; STICH et al., 2002; CASTRO et al., 2003; DAGNONE et al., 2003). A anorexia leva a uma hipoalbuminemia com perda de fluidos sangüíneos, como conseqüência ocorre um aumento na viscosidade do sangue propiciando as vasculites (HARRUS et al., 1996b). A E. canis possui predileção por células encontradas na micro vascularização dos pulmões, rins e meninges de cães (HOSKINS, 1991; HARRUS et al., 1998) sendo a epistaxe causada por hemorragias características dos pulmões ou da mucosa nasal (RIKIHISA et al., 1993), a E. sennetsu está predominantemente localizada nos linfonodos, causa grave linfadenopatia (HOSKINS, 1991; RIKIHISA et al., 1991). Skotarczak (2003) descreveu que a Ehrliquiose monocítica canina (EMC) apresenta três fases: aguda, subclínica e crônica. A primeira delas começa após o 8 o dia após infecção, ocorrendo febre, depressão, dispnéia e anorexia, ocorre inclusive trombocitopenia, leucopenia, leve anemia e hipergamaglobulinemia. A fase subclínica ocorre entre 40 o e 120 o dias, ou até alguns anos sem sinais clínicos, com leve trombocitopenia. A fase crônica, se caracterizada por, epistaxe, edema e com achados laboratoriais semelhante à fase aguda. 3.7 Alterações laboratoriais Segundo Dagnone et al. (2003), os achados laboratoriais em cães com Rickettsiose são principalmente a trombocitopenia, leucopenia e anemia Alterações Hematológicas Alterações no eritrograma. Em cães infectados com E. canis, comumente ocorre uma anemia normocítica normocrômica, que caracteriza redução na resposta medular (HARRUS et al., 1996b; ALMOSNY ; MASSARD, 2002; MIRANDA et al., 2004). Anemias mais severas podem ocorrer de acordo com estágio da doença (WANER et al., 1997)

18 Alterações no leucograma Em geral as alterações hematológicas podem variar de acordo com o estágio da doença, podendo ser: leucopenia com declínio nos números de neutrófilos (WANER et al., 1997), linfocitopenia, eosinopenia, hipoalbominemia, hipergamaglobulinemia (HARRUS et al., 1996b; WANER et al., 1997; ALMOSNY, 1998; DAGNONE et al., 2003). A monocitose é um achado freqüente na Ehrliquiose canina, geralmente com a presença de monócitos ativados e/ou sinais de eritrofagocitose (HOSKINS, 1991; HARRUS et al., 1997). Na cidade de Campos dos Goytacazes, Miranda et al. (2004), observaram que 69 animais positivos apresentaram leucocitose neutrofílica com DNNE leve, neutrofilia relativa e absoluta, linfocitopenia relativa e absoluta Alterações na plaquetometria Para Martin et al. (2005) uma das maiores causas de trombocitopenia são as infecções por rickettsias do gênero Ehrlichia. Trombocitopenia com um moderado aumento no tamanho de plaquetas podem ser observado em cães infectados por Anaplasma platys (HARRUS et al., 1996b; WANER et al., 1997; ALMOSNY, 1998; DAGNONE et al., 2003) Alterações bioquímicas Proteínas séricas Harrus et al. (1996a) descreveram algumas possíveis causas de alterações nas frações das proteínas do soro. Para a hipoalbuminemia, os autores descreveram como possíveis causas a: anorexia, vasculite e proteinúria. As globulinas α1 e α2 podem se apresentar aumentadas devido a inflamações agudas, afecções hepáticas, necrose e até neoplasias. Já as β1 e β2 globulinas o mesmo autor citou que não possuem uma explicação exata para suas alterações séricas, entretanto KANEKO et al, 1997 e TRHALL, 2007 descreveram que estas podem estar elevadas quando ocorre doença crônica.

19 18 A pré-albumina é uma proteína produzida no fígado, com a função de transportar a tiroxina e a vitamina A. Sua diminuição pode sugerir diminuição na síntese ou maior eliminação renal (HARRUS et al., 1996a). Vários fatores incluindo parasitários e doenças infecciosas podem influenciar na flutuação de uma única proteína do soro, sendo estas mensuradas através de eletroforese (ABATE et al., 2000). A hiperproteinemia na fase inicial da infecção é devido a hipergamaglobulinemia, ocorrendo posteriormente uma hipoalbuminemia devido à má nutrição, causa renal, doença hepática associada e devido ao edema secundário a vasculite (HOSKINS, 1991; WOODY ; HOSKINS, 1991). O aumento da α1 globulina, segundo Abate et al. (2000), pode estar relacionado a uma inflamação aguda, e as α2 globulinas, também estão aumentadas devido à inflamações agudas, necrose tecidual, neoplasias e até em inflamações crônicas e subclínicas, onde podem estar aumentadas as α1 e α 2 globulinas. Segundo Abate et al. (2000) vários fatores, incluindo infecciosos e parasitários, podem influenciar na concentração de uma ou mais proteínas no soro. Ao comparar os valores de proteínas do soro de cães saudáveis com cães apresentando ehrliquiose canina, os mesmos mostraram-se diminuídos para albumina e α1 globulinas (HARRUS et al., 1996a; WANER et al., 1997). Os valores de α2 globulina, β1, β2 globulinas, gama globulinas e proteínas totais apresentaramse superiores aos parâmetros normais (HARRUS et al., 1996a; WANER et al., 1997; ALMOSNY e MASSARD, 2002). As elevações das γ-globulinas podem ser devidas a processos denominados gamapatias policlonais e monoclonais (GONZÁLES et al, 2006). As gamapatias policlonal está relacionada com processos inflamatórios de tipo crônico, como infecções-infestações crônicas ou doenças imunomediadas. As gamapatias monoclonais são produzidas por proliferação clonais de células neoplásicas da série de linfócitos B (tumores de células plasmáticas) e em leucemia linfocítica crônica de células B (GONZÁLES et al, 2006; THRALL 2007). No que se trata de gamapatias policlonais e monoclonais para cães portadores de Ehrlichiose canina, pode estar relacionadas a infecções secundárias (ALMOSNY ; MASSARD, 2002).

20 Sódio (Na + ) e potássio (K + ). Segundo Hoskins, (1991), na fase aguda da erliquiose, elevações séricas dos valores de uréia, são atribuídas a azotemia pré-renal, pois a densidade elevada seria um indicativo de habilidade em concentrar líquidos, caracterizando um leve dano glomerular, podendo até levar a uma hipocalemia (MILLER et al. 2005). Ochiai et al. (2006) descreveram que o potássio e o cloro, sendo ambos cotransportados, participam de estímulos fisiológicos fundamentais, como por exemplo a regulação do volume globular. Os mesmos autores citaram ainda que falhas neste mecanismo de transporte podem ocasionar perda de cloreto de potássio e conseqüente aumento da resistência vascular. Certas bombas de membrana trocam uma espécie de molécula ou íons de um lado da membrana para o outro. O transporte de Na + e K + é mantido pela bomba de Na + e K +, ocorre constantemente o transporte de íons Na + para o meio extra-celular e o transporte concomitante de íons K + em sentido contrário (RANDAL et al., 2000). A concentração de K + é cerca de 10 a 20 vezes mais alta no interior da célula e para Na +, é o oposto. Porem o número de íons Na + transportados para fora da célula, é equivalente ao que entra (RANDAL et al., 2000; GUYTON ; HALL, 2001). Ito et al. (2006) enfatizaram que o sódio quando aplicado em concentração elevada (solução salina hipertônica) é capaz de aliviar edemas cerebrais, portanto é importante no protocolo terapêutico utilizado nestas situações em pacientes caninos. Os mesmos autores descreveram que o sódio participa ativamente no processo de transporte de água do espaço intracelular e cérebro espinhal para os capilares cerebrais, portanto é evidente a importância do trabalho renal. Segundo Cunningham (1999) o potencial de repouso da membrana é o resultado indireto dos gradientes de concentração de íons existentes nos dois lados da membrana plasmática, são causados pela atividade da ATPase de Na + / K +, relatou ainda que em parte, este potencial de membrana é resultado na assimetria nas quantidades de íons bombeados pela ATPase de Na + / K +, postulou inclusive que a maior parte do potencial de membrana deve-se ao fluxo passivo de K através dos canais sem portões (canais de saída de K + ), o que estabelece uma força elétrica direcionada (voltagem) que equilibra a força de concentração, finalmente afirmou que estes processos vão causar um equilíbrio nas cargas elétricas que vão acabar equilibrando a força de concentração.

21 Diagnóstico O diagnóstico pode ser feito por vários métodos: baseado em sinais clínicos, visualização de formas reprodutivas da bactéria no interior de monócitos, neutrófilos e plaquetas de esfregaço de sangue periférico, detecção de anticorpos para E. canis pela técnica de imunofluorescência indireta de anticorpos (IFA), técnica de cultivo in vitro e ELISA (HOSKINS, 1991; ALMOSNY ; MASSARD, 2002). Martin et al. (2005) citou que o PCR é um método diagnóstico bastante eficaz, pois a visualização de mórulas em esfregaço sanguíneo pode ser de baixa acurácia, principalmente se o animal estiver com pouca concentração plaquetária Prognóstico Para obter um maior êxito no tratamento, a doença deve ser diagnosticada o mais breve possível. Quanto antes se inicia o tratamento na fase aguda, melhor o prognóstico (WOODY ; HOSKINS, 1991; BIRCHARD e SHERDING 2003; MYLONAKIS et al. 2003). O prognóstico para a Rickettsiose canina é excelente com um tratamento adequado, caso a doença esteja em uma fase mais avançada ou mesmo na fase crônica, entretanto, se existir hipoplasia medular o prognóstico passa a ser desfavorável (MYLONAKIS et al. 2003). Com o inicio do tratamento no tempo adequado, a resposta clínica ocorre geralmente 48 horas após o uso da doxiciclina, mas na forma crônica pode levar 3 a 4 semanas (BIRCHARD e SHERDING, 2003) Tratamento e profilaxia Uma variedade de agentes terapêuticos foram utilizados, dentre eles a sulfonamidas, penicilina, cloranfenicol, tetraciclinas, dipropionato de imidocarb, foram utilizados para tratamento, com os mais variados graus de sucesso (IQBAL e RIKIHISA, 1994) As tetraciclinas são clinicamente o mais efetivo, por isso são as mais utilizadas para o tratamento (ALMOSNY 1998; HARRUS et al., 1998)

22 21 A doxiciclina, um sintético similar à tetraciclina, inibe a síntese protéica da bactéria, sendo mais utilizada nas dose de 5 a 10 mg/kg de peso, na administração oral ou endovenosa de 12 em 12 horas por 7 a 10 dias (IQBAL e RIKIHISA, 1994). Segundo Harrus et al. (2001), o tratamento longo de 28 a 42 dias com doxiciclina oral, eliminou a rickettsia em três dos quatro cães infectados estudados. Para animais mais debilitados, recomenda-se a realização de um tratamento de suporte, principalmente na fase crônica, utilizando fluidoterapia, transfusões sangüíneas podem ser utilizadas, dependendo de cada caso (ALMOSNY; MASSARD, 2002) Em curto prazo, doses de antiinflamatórios ou doses imunossupressivas de prednisona ou dexametasona, podem ajudar na doença imunomediada secundária, entretando o uso prolongada pode atrapalhar no tratamento (ALMOSNY 1998; ALMOSNY; MASSARD, 2002). O controle do carrapato constitui o melhor meio de prevenção contra as doenças rickettsiais canina (BIRCHARD e SHERDING, 2003).

23 22 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Amostragem Foram utilizados 60 cães, sendo 30 cães positivos para Erliquiose canina e 30 cães clinicamente sadios, portanto, assintomáticos, todos adultos (idade variando entre um e sete anos), sem definição de raça, machos e fêmeas, domiciliados em Campos dos Goytacazes, RJ. Foram divididos em dois grupos: Positivos, composto de 30 animais, denominado grupo P o Neste grupo estão os animais infectados, ou seja, aqueles que apresentaram confirmação da doença (presença de formas reprodutivas intra-celulares) em avaliação de esfregaço sangüíneo à microscopia óptica, independente da fase clínica. Assintomáticos, composto de 30 animais, caracterizando o grupo controle, denominado grupo C. o Neste grupo estão os animais sem a presença de formas reprodutivas intra-celulares em avaliação de esfregaço sangüíneo e sem nenhum tipo de alteração clínico-laboratorial Coleta de material e procedimento laboratorial Coleta e acondicionamento Foram coletados 3mL de sangue total da veia cefálica de cada animal com a utilização de agulha hipodérmica (25x7mm) e seringas descartáveis (3 ml), armazenado um tubo sem anticoagulante, com gel separador de coágulo, visando realização de eletroforese de proteínas séricas e mensuração de sódio e potássio. A pesquisa de hemoparasitas foi feita mediante a coleta da primeira gota de sangue capilar da região auricular de cada animal, com auxílio de contenção mecânica local, objetivando confecção de esfregaço sanguíneo.

24 Procedimento laboratorial Pesquisa de hemoparasitas Os esfregaços foram corados utilizando-se corante Panótico NEWPROV. Posteriormente foram avaliados à microscopia óptica, em objetiva de imersão, avaliando suas bordas e franja (cauda) com o intuito de visualizar o hemoparasita. Figura 2 Esfregaço sanguíneo corado com Panótico NEWPROV, contendo uma forma reprodutiva de Ehrlichia spp. ou Anaplasma spp (seta) parasitando neutrófilo segmentado de canino. Aumento de 100x, objetiva de imersão. Fonte: Gustavo Leite Lopes (2006) Figura 3 - Esfregaço sanguíneo corado com Panótico NEWPROV, contendo uma forma reprodutiva de Anaplasma spp. (seta) parasitando plaqueta de canino. Aumento de 100x, objetiva de imersão. Fonte: Gustavo Leite Lopes ( 2006)

25 Eletroforese de proteínas séricas A eletroforese de proteínas séricas foi realizada em equipamento da marca CELM, modelo SE Procedimento 1. Colocar 80 ml de tampão tris, na cuba. 2. Aplicar 0,4 µl de cada soro no filme de agarose. 3. Colocar op filme de agarose no porta filme. 4. Colocar o porta filme na cuba e deixar por 20 minutos a 100 volts. 5. Retirar a tampa do filme e o porta filme, colocando-a sobre uma folha de papel filtro para eliminar o excesso de tampão das bordas do filme. 6. Retirar o filme do porta filme. 7. Mergulhar o filme em 200 ml de corante (Amido Black) por 5 minutos sem agitação. 8. Retirar o filme do corante e colocar em 200 ml de descorante por mais 5 minutos. 9. Retirar o excesso de descorante do filme e seca-lo com secador de cabelo com aquecimento. 10. Ler no scaner Mensuração de Proteínas Totais Proteínas totais. A análise foi realizada em equipamento semi-automatizado da marca Merck, modelo Microlab 200/Merck, com kits reagentes da marca LABTEST Mensuração de sódio e potássio A mensuração de sódio e potássio foi realizada através de espectrofotometria de chama, utilizando equipamento da marca Benfer, modelo BSC 150.

26 Análise Estatística Os dados foram tabulados e analisados estatisticamente utilizando-se o Teste de Scott-Knott (p 0,05) para comparação dos valores médios obtidos (SAS, 1996).

27 26 5. RESULTADOS Os resultados estão dispostos nas tabelas 1 e 2, disponibilizadas abaixo. 5.1 Eletroforese de proteínas séricas e eletrólitos Tabela 1 Valores médios e desvios-padrão da avaliação eletroforética protéica em 30 positivos para Ehrlichia spp. ou Anaplasma spp. e 30 caninos assintomáticos. na cidade de Campos dos Goytacazes, RJ. Proteínas Totais e frações / média ± desvio-padrão Proteínas Totais e frações Animais positivos / n=30 Animais assintomáticos / n=30 Proteínas Totais (g/dl) 7,07 ± 1,62 A 6,72 ± 0,76 A Albumina (g/dl) 1,36 ± 0,85 A 2,18 ± 1,04 B α 1 (g/dl) 0,86 ± 0,62 A 0,91 ± 0,56 A α 2 (g/dl) 0,76 ± 0,37 A 0,65 ± 0,24 A β (g/dl) 0,91 ± 0,60 A 0,98 ± 0,62 A γ (g/dl) 2,78 ± 1,59 A 1,23 ± 0,76 B Letras diferentes na horizontal demonstram diferença significativa (p 0,05). α 1 - Alfa 1 globulinas α 2 Alfa 2 globulinas β - Beta globulinas γ Gama globulinas

28 27 Tabela 2 Valores médios e desvios-padrão da concentração de sódio e potássio em 30 positivos para Ehrlichia spp. ou Anaplasma spp. e 30 caninos assintomáticos na cidade de Campos dos Goytacazes, RJ. Sódio e Potássio / média ± desvio-padrão Animais assintomáticos / Eletrólitos Animais positivos / n=30 n=30 Sódio (meq/l) 144,20 ± 9,15 A 145,86 ± 3,61 A Potássio (meq/l) 4,88 ± 0,69 A 4,74 ± 0,44 A Letras diferentes na horizontal demonstram diferença significativa (p 0,05).

29 28 6. DISCUSSÃO Eletroforese de proteínas séricas. Comparando os resultados das médias entre os grupos P e C no que se refere à concentração de proteínas totais, não houve diferença significativa Harrus et al. (1996a) realizaram testes em 42 animais sendo divididos em três grupos, um grupo controle, e o outro grupo de animais positivos divididos em pancitopênicos e não pancitopênicos. O grupo pancitopênico não apresentou diferença significativa comparando com os valores dos animais do grupo controle, no que se refere à concentração de proteínas séricas, corroborando com o que foi observado no presente trabalho. Entretanto, em outros trabalhos, em relação à concentração de proteínas totais, evidenciou-se diferença entre os grupos positivos para Erliquiose e grupos compostos por animais sadios (HARRUS et al., 1996a, 1998; ALMOSNY, 1998; ALMOSNY ; MASSARD, 2002). Hoskins (1991) descreveu que é aceitável observar hiperproteinemia, o que deve estar relacionado a uma hipergamaglobulinemia, ocorrendo posteriormente uma hipoalbuminemia devido à má nutrição, disfunção renal, diminuição da captação das proteínas, doença hepática associada e devido ao edema secundário ao processo de vasculite. A hiperproteinemia também esta relacionada à redução da função plaquetária (ALMOSNY ; MASSARD, 2002). Vale ressaltar que vários fatores incluindo parasitários e doenças infecciosas podem influenciar na flutuação de uma única proteína do soro, sendo estas mensuradas através de eletroforese (ABATE et al., 2000). Houve diferença significativa em relação às médias das concentrações de albumina entre os grupos, sendo que a média do grupo P foi mais baixa do que o grupo C. Almosny (1998) descreveu que os níveis de albumina tendem a uma redução em relação ao grupo controle de seu experimento, após a segunda semana de inoculação da E. canis.

30 29 Uma diminuição na concentração sérica da albumina pode atuar como um mecanismo compensatório para manter o estado hiperglobulinêmico objetivando prevenir inclusive, a viscosidade do sangue (WOODY ; HOSKINS, 1991). A cirrose hepática segundo FRANKLIN et al, 1951, foi evidenciada a concentrações muito baixas de albumina, que resultado de uma síntese defeituosa, equilibro dietético alterado, queda da concentração de proteínas, e perdas de albumina em fluido ascítico. Harrus et al. (1996a) descreveram que de em experimento realizado com 42 beagles infectados experimentalmente com erliquiose, verificou-se, em seis destes, uma albuminúria temporária durante a fase aguda da erliquiose, relatou-se ainda que como as moléculas de albumina são menores do que as moléculas de globulinas, elas passam mais facilmente pelas membranas glomerulares lesadas, portanto uma doença glomerular grave, pode acarretar uma hipoalbuminemia (THRALL, 2007). No que se refere as Alfa globulinas 1 e 2, não houve diferença significativa entre os grupos P e C. Harrus et al. (1996b) citaram que em 57 cães de caça da raça beagle não houve diferença significativa no que se refere aos valores das α globulinas 1 e 2, ao comparar as médias do grupo pancitopênico positivos para erliquiose com as médias dos animais do grupo controle. Entretanto, em pesquisa realizada por Harrus et al. (1996a), onde foram observados testes em 42 cães, sendo 15 saudáveis e 27 soropositivos para erliquiose canina, sendo estes divididos em pancitopênicos e não pancitopênicos, demonstrou que o grupo de soropositivos/não pancitopênicos apresentou maior concentração de α2 globulinas. As α1 e α2 globulinas podem estar aumentadas devido liberação de fatores como α1-antitripsina (AT) e α1-βácido glicoproteínas (AGP), em resposta a processos inflamatórios agudos, nefrite, traumatismo, tumores, infestação parasitária e animais tratados com corticoide (KANEKO et. al, 1997; ABATE et al., 2000; CAMACHO et al, 2005; GONZÁLEZ et al., 2006). Uma queda na concentração de α1 e α2 globulinas pode estar associada à hemólise intravascular (GONZÁLEZ et al., 2006). Os valores médios de βglobulinas dos grupos P e C não apresentaram diferença significativa.

31 30 No experimento realizado por Harrus et al. (1996a), as médias da β1 globulina, não apresentaram diferença significativa entre os grupos controle, positivos/pancitopênicos e positivos/não pancitopênicos. Entretanto, o mesmo Harrus et al. (1996a), no mesmo experimento, declarou que só houve diferença significativa na concentração das β2 globulinas, sendo que o grupo não pancitopênico teve uma média mais alta do que o grupo controle. As betaglobulinas podem estar aumentadas em doença inflamatória aguda, síndrome nefrótica, doença hepática (HARRUS et al., 1996a, THRALL 2007). Segundo Camacho et al, 2005, o resultado da concentração das β-globulinas em cães soropositivos para outras hemoparasitoses, como Babesia canis, foram maiores do que os valores observados no grupo controle. No presente experimento, no que se refere à comparação dos valores médios das γ globulinas, observou-se diferença significativa entre os grupos P e C, sendo as médias maiores no grupo P. Em experimento realizado por Waner et al. (1997), onde foi inoculada a Ehrlichia canis experimentalmente em 9 cães de caça da raça Beagle, evidenciou-se aumento na concentração de γ globulinas em 6 destes cães, em comparação com o grupo controle. As hipergamaglobulinemias podem estar associadas a diversos fatores, como infecções crônicas, neoplásicas, cirrose hepática, erliquiose crônica e demais processos infecciosos denominados gamopatias que podem ser monoclonais e policlonais (FRANKLIN et al, 1951; HARRUS et al., 1996a; HARRUS et al., 1996b; KANEKO et, al. 1997; CAMACHO et al, 2005; GONZÁLEZ et al., 2006; THRALL 2007). Segundo Camacho et al. (2005) e Gonzáles et al. (2006), as gamopatias monoclonais e policlonais são diferenciadas mediante o proteinograma. Para isso compara-se a fração globulina com base na fração albumina. Se o pico do gráfico da eletroforese tiver base larga comparada com albumina, conterá diferentes proteínas (policlonal), se for similar a albumina (estreita), estará integrada por uma só proteína (monoclonal) Sódio (Na + ) e potássio (K + ). Os resultados mostrados na tabela 1, em relação ao sódio e potássio, mostraram que não houve diferença significativa entre os grupos P e C.

32 31 Reforçando esse achado, Almosny ; Massard (2002) relataram que em alguns pacientes portadores de erliquiose, a concentração de uréia é mantida dentro dos parâmetros de normalidade, portanto, pode-se concluir que a funcionalidade renal é mantida, o que foi evidenciado a partir dos valores de sódio e potássio obtidos nesta abordagem. A normopotassemia e a normonatremia indicaram que há equilíbrio orgânico e que este, tem como importante contribuinte o bom funcionamento dos néfrons (GONZÁLEZ et al. 2006) corroborando com o que foi encontrado no presente relato. A concentração sérica de sódio e potássio mantida dentro dos padrões de normalidade caracteriza-se como uma das principais funções dos rins, o está diretamente ligado ao trabalho de transporte de íons que ocorre na região tubular (CUNNINGHAM 1999; GUYTON ; HALL, 2001). Entretanto, Hoskins (1991) e Miller et al. (2005) citaram que na fase aguda da erliquiose, elevações séricas dos valores de uréia são atribuídas a uma azotemia pré-renal, elevando a densidade, o que, neste caso, caracteriza dano glomerular, podendo até levar a uma hipopotassemia. Hoskins (1991), afirmou que a cronicidade observada em alguns pacientes caninos portadores de erliquiose pode resultar em grave dano hepático e renal, o que certamente suscitaria um pane orgânica. Woody ; Hoskins, (1991) citaram que na erliquiose canina nefropatias podem ser observadas, o que alteraria a capacidade dos rins em reabsorver praticamente 99 % do sódio filtrado pelos glomérulos, resultando em um aumento excreção do sódio filtrado e uma diminuição na concentração de sódio reabsorvido (JEONG et, al, 2006; THRALL et, al, 2007). Na maioria das espécies, uma hiperpotassemia pode ocorrer em animais com falência renal, podendo também resultar em vários outros distúrbios, dentre eles, defeitos na bomba de sódio-potássio e cardiotoxidade (KANEKO et, al. 1997; JEONG et, al. 2006; THRALL et, al, 2007).

33 32 7. CONCLUSÕES A Erliquiose canina, em Campos dos Goytacazes, RJ, apesar de seu potencial reconhecidamente agressivo, não alterou a capacidade renal de manutenção do equilíbrio hídrico-eletrolítico, especialmente relacionada à concentração de sódio e potássio nos animais estudados. Os cães portadores de Erliquiose, em Campos dos Goytacazes, RJ, demonstraram evidente capacidade reacional imunológica, haja vista a hipergamaglobulinemia evidenciada. Os exames laboratoriais utilizados mostraram-se adequados e absolutamente relevantes em relação à avaliação clínico-laboratorial do paciente canino suspeito de erliquiose. A continuidade dos estudos relacionados ao tema deve ser valorizada, principalmente devido à existência da cronicidade da doença.

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