Júlia Movilla Pires INTERAÇÕES AGUDAS DO CHÁ DE AYAHUASCA COM AGENTES USADOS EM ANESTESIA (PROPOFOL E MORFINA), OBSERVADAS EM MODELOS ANIMAIS

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1 Júlia Movilla Pires INTERAÇÕES AGUDAS DO CHÁ DE AYAHUASCA COM AGENTES USADOS EM ANESTESIA (PROPOFOL E MORFINA), OBSERVADAS EM MODELOS ANIMAIS Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo, para obtenção do título de Mestre em Ciências São Paulo 2009

2 Júlia Movilla Pires INTERAÇÕES AGUDAS DO CHÁ DE AYAHUASCA COM AGENTES USADOS EM ANESTESIA (PROPOFOL E MORFINA), OBSERVADAS EM MODELOS ANIMAIS Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo, para obtenção do título de Mestre em Ciências Orientador: Prof. Dr. José Luiz Gomes do Amaral Co-orientador: Prof. Dr. Elisaldo Luiz de Araújo Carlini Colaborador: Prof. Dr. Fúlvio Rieli Mendes São Paulo 2009

3 AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE. Pires, Júlia Movilla Interações agudas do chá de ayahuasca com agentes usados em anestesia (propofol e morfina), observadas em modelos animais/ Júlia Movilla Pires. São Paulo, xxiii, 87f. Tese (Mestrado) Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Ciências. Título em inglês: Acute interactions obtained from ayahuasca tea when in association with drugs used in anesthetic procedures (propofol and morphine), observed in animal models. 1. Ayahuasca. 2. Interações farmacológicas. 3. Morfina. 4. Propofol 5. IMAO

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5 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE CIRURGIA/DISCIPLINA DE ANESTESIOLOGIA, DOR E MEDICINA INTENSIVA Chefe do Departamento: Lydia Massako Ferreira Coordenador do Curso de Pós-graduação: Prof. Dr. Fausto Miranda Jr.

6 Esta tese foi realizada no Departamento de Psicobiologia da Universidade Federal de São Paulo Escola Paulista de Medicina, com o apoio financeiro da Associação Fundo de Incentivo à Psicofarmacologia (AFIP) e da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo Curso de Pós-Graduação em Cirurgia, disciplina de Anestesiologia, Dor e Medicina Intensiva da Universidade Federal de São Paulo.

7 Ao amado Cuca Becker do meu coração.

8 A todos os meus amados cães, gatos, ratos...

9 A visão completa de Deus é a do intelecto unido ao sentimento, isto é, a do cientista que também sabe orar, e a do místico que também sabe pensar. Pietro Ubaldi

10 AGRADECIMENTOS Ao padrinho Prof. Eurípedes, apóstolo da bondade, pelos grandes amparos recebidos e fidelidade na amizade. Pelo grande exemplo de generosidade em vida, ensinando e auxiliando ao próximo incondicionalmente sem jamais desejar o engrandecimento de si mesmo. Aos animais que mais uma vez serviram ao homem com seu sangue e suor, para que desfrutássemos de melhorias. Que Deus os abençoe! A FAPESP pela bolsa ao aluno e financiamento do projeto. A AFIP pelo apoio financeiro. Ao Laboratório Cristália pela doação das amostras de morfina e propofol. Ao Prof Dr. Maurício Yonamine da Universidade Federal de São Paulo, pelo doseamento dos constituintes do chá de ayahuasca. Ao Dr. Wilson Gonzaga que gentilmente cedeu a amostra de chá. Ao Depto de Biofísica (INFAR) por permitir utilizar o laboratório para liofilização da amostra de chá. Aos Professores e membros da banca: Prof. Dr. Reinaldo Takahashi, Prof. Dr. José Roberto Leite, Profa. Dra. Flávia Machado Ribeiro e suplente Prof. Dr. Luis Carlos Marques, pela participação e sugestões. Aos colegas de grupo pelo convívio diário alegre e amistoso, especialmente à Juliana e Bruno que muito contribuíram no auxílio à experimentos. Também desejo agradecer aos colegas: Andréia, Melina, Eliane Baziloni e Perla Romanus pelos grandes auxílios em experimentos pesarosos. Aos Professores e alunos do departamento: Dra Gina Negri, Dr. José Carlos Galduróz, Dra Eliana Rodrigues, Dr. Ricardo Tabach, Dra Solange Nappo, Dr. Joaquim Maurício Duarte-Almeida, Tharcila, Marna, Daniel, Graziella e Lyvia pela amizade, amparo e auxílio sempre prestados com muita boa vontade. Aos demais alunos e doutores do grupo CEBRID, principalmente Zila pela boa companhia. A Cláudia Masur Carlini, pelos doces beijos. x

11 Aos funcionários do CEBRID: Hebert, Patrícia, Mara, Jane, Aline, Marlene, Elena e Clara, por resolverem todas as questões burocráticas, por serem prestativos e pelos sorrisos. A secretária do Depto de Cirurgia, Solange Montosa da Silva, pelas gentilezas, pela simpatia e pela rapidez com que me prestou auxílio nos serviços burocráticos. A todos os técnicos e bioteristas, em especial ao Cristiano Rezende e Tomé, pela bondade, dedicação, fidelidade e disciplina com que auxiliam, e ao Gilbertinho da Bioquímica que sempre sanou minhas dúvidas com prontidão. Ao grupo de pessoas responsáveis pela limpeza e cozinha. Obrigada por cuidarem tão bem de nós! A todos os funcionários da secretaria de pós-graduação, pelo bom humor e presteza no auxílio. Ao Dr. Reinaldo Nóbrega de Almeida e Dra Mônica Levy Andersen, pela presteza, receptividade e simpatia. A Cristina Jorge, nossa bibliotecária diligente. A todos os demais alunos, professores e funcionários do Depto de Psicobiologia por terem compartilhado do humor, de cafezinhos inesquecíveis e de idéias construtivas ao longo destes anos de convívio. xi

12 AGRADECIMENTOS ESPECIAIS Ao amigo e professor Elisaldo Luiz de Araújo Carlini, pela oportunidade oferecida, por me tutelar e amparar. Muito obrigada por compartilhar comigo seus preciosos e ricos conhecimentos amealhados ao longo dos anos. Muito obrigada por se preocupar em ensinar aos jovens. Obrigada por ensinar o Brasil. O que é o NOBEL, senão o esforço extremo de nossas almas na busca do melhor em benefício do próximo. Tenha a certeza de que NOBEL verdadeiro, aquele que somente é oferecido por Deus, você já o conquistou. Ao Prof. Dr. Fúlvio Rieli Mendes, pelo auxílio e ensinamentos prestados ao longo dos anos, traduzidos em imensos esforços, experimentos assistidos e aturadas correções... Ao Prof Dr. José Luiz Gomes do Amaral pela grande oportunidade de estudar, recebendo-me sempre tão bem, orientando-me e direcionando-me sempre para o melhor. xii

13 Lista de abreviações: AYA chá de ayahuasca DMT dimetiltriptamina FDA food and drug administration GABA ácido gama amino butírico IMAO inibidor ou inibidores da MAO ip intraperitoneal MAO - monoaminoxidase ISRS inibidores seletivos da recaptação de serotonina MAO monoaminoxidase UDV União do vegetal UTI unidade de terapia intensiva Unidades de medidas utilizadas: µl microlitro g grama ou gramas h hora ou horas kg kilograma mg miligramas min minutos ml mililitro rpm rotações por minuto seg segundos xiii

14 Lista de figuras: Figura 1: cozimento do chá de ayahuasca...3 Figura 2: plantas componentes do chá de ayahuasca...4 Figura 3: estruturas químicas dos principais alcalóides encontrados no chá de ayahuasca...7 Figura 4: caixa de arame utilizada para observação dos sinais apresentados pelos animais no teste do screening farmacológico...20 Figura 5: aparelho de rota-rod...21 Figura 6: caixa utilizada para registro da atividade locomotora...22 Figura 7: posição de decúbito dorsal...23 Figura 8: aparelho da placa quente...27 Figura 9: contorção abdominal...28 Figura 10: efeito do propofol no teste do rota-rod...37 Figura 11: efeito da associação do chá de ayahuasca com propofol no teste do rota-rod...38 Figura 12: efeito do chá de ayahuasca no teste da atividade motora...39 xiv

15 Figura 13: efeito da associação do chá de ayahuasca com morfina no teste da atividade motora...41 Figura 14: efeito da associação do chá de ayahuasca com propofol no teste do tempo de sono...44 Figura 15: efeito da associação do chá de ayahuasca com propofol no teste do tempo de grooming...45 Figura 16: efeito da associação do chá de ayahuasca com morfina no teste da placa quente...47 Figura 17: efeito do propofol no teste da placa quente...48 Figura 18: efeito da associação do chá de ayahuasca com morfina no teste de indução de writhes após 30 min de tratamento com o chá...49 Figura 19: efeito da associação do chá de ayahuasca com morfina no teste de indução de writhes após 90 min de tratamento com o chá...50 Figura 20: efeito da associação do chá de ayahuasca com morfina no teste de indução de writhes com novas doses de chá e morfina...51 Figura 21: efeito do chá de ayahuasca no teste da formalina...52 Figura 22: efeito da associação do chá de ayahuasca com morfina no teste da formalina...53 Figura 23: efeito da associação do chá de ayahuasca com morfina no teste do trânsito intestinal...54 xv

16 Lista de tabelas: Tabela 1: sumário de grupos utilizados e testes realizados...15 Tabela 2: resultados do doseamento do chá de ayahuasca realizado pelo Departamento de Análises Toxicológicas da USP...33 Tabela 3: sumário de observações do screening farmacológico do chá de ayahuasca...35 Tabela 4: medida do tempo de latência e do tempo de sono de camundongos pré-tratados com chá de ayahuasca, induzidos por hexabarbital...42 Tabela 5: sumário de resultados obtidos...58 xvi

17 RESUMO O chá de ayahuasca (AYA) é uma bebida com propriedades psicoativas preparada a partir do cozimento de duas plantas: o cipó Banisteriopsis caapi (Spruce ex Griseb.) C.V. Morton (Malpighiaceae) e as folhas de Psychotria viridis (Ruiz & Pav.) (Rubiaceae). A DMT, presente nas folhas da P. viridis, é o principal componente alucinógeno do chá, mas quando ingerida é rapidamente inativada pela MAO-A presente nos intestinos, o que é evitado com a associação das ß-carbolinas inibidoras da MAO que estão presentes na B. caapi. Apesar do aumento do número de usuários deste chá, ainda existem poucos estudos a respeito das possíveis interações de seus princípios ativos com outras drogas, o que torna cada vez mais importante conhecer as possíveis interações entre o chá e fármacos empregados na clínica. No presente trabalho foi avaliada a possível interação do chá de ayahuasca com dois agentes de muita importância em anestesia: propofol e morfina. As doses utilizadas no estudo foram obtidas a partir da dose média consumida pelo ser humano nos rituais (equivalente a 120 mg/kg, encontrada em 70 ml do chá), definidas como 1 vez (1X) até 20 vezes (20X) ou 2400 mg/kg. No teste do screening farmacológico (SF) os animais apresentaram alguns sinais de toxicidade, quando administrado por via ip (diminuição da atividade motora, hipersensibilidade a estímulos e tremor intenso). A administração oral do chá (1X e 10X) não provocou alterações no teste do rotarod, mas no teste da atividade motora, os animais que receberam AYA 10X apresentaram efeito bifásico (diminuição inicial da ambulação até 30 min, seguida de aumento entre 2h e 4h). A dose de 10X aumentou o tempo de sono induzido pelo hexabarbital e diminuiu o tempo de grooming, em experimento onde este parâmetro foi quantificado. Em relação à associação chá de ayahuasca com morfina, no teste do SF observou-se que os animais apresentaram cauda de Straub mais intensa e duradoura quando comparado com o grupo morfina; ataxia e tremores quando comparados com o grupo AYA. No teste da atividade motora, o grupo que recebeu AYA 1X + morfina apresentou menor atividade locomotora do que o grupo que recebeu apenas a morfina, porém após 2h houve aumento da locomoção em relação a todos os outros. Os resultados obtidos no teste da placa quente demonstram uma xvii

18 potencialização dos efeitos da morfina, embora estes resultados não sejam confirmados pelo teste de contorções abdominais (CA) e formalina. Também não foi demonstrada qualquer interação no grupo administrado com a associação de chá e morfina no teste do trânsito intestinal. O chá isoladamente não apresentou efeito antinociceptivo no teste da placa quente, mas apresentou efeito antinociceptivo central e periférico nos testes de CA e formalina. Ao se avaliar qualitativamente o efeito da associação AYA e propofol, no teste do SF observou-se uma potencialização dos tremores induzidos pelo chá, que se manifestaram mais intensos e prolongados. No teste do rota-rod foi observado uma tendência de prejuízo no grupo que recebeu o chá e em seguida o anestésico. Já no teste do tempo de sono, AYA 1X diminuiu este parâmetro, portanto, interferindo com os efeitos do propofol. Em síntese, o conjunto de resultados indica alguma interação no que se refere à associação do chá de ayahuasca com a morfina e o propofol. Essas interações foram discretas e necessitariam de experimentação clínica apropriada para verificar sua ocorrência no ser humano. xviii

19 SUMÁRIO Dedicatória...vii Agradecimentos...x Lista de abreviações...xiii Lista de figuras...xiv Lista de tabelas...xvi Resumo...xvii 1. INTRODUÇÃO O uso da bebida ayahuasca no Brasil Farmacologia da ayahuasca Interações dos IMAO com outras substâncias JUSTIFICATIVA DO ESTUDO OBJETIVOS MATERIAIS Animais Drogas e reagentes Esquema de testes realizados MÉTODOS Preparo do liofilizado do chá de ayahuasca Doseamento dos componentes do chá de ayahuasca Preparação das soluções padrão Extração dos alcalóides da ayahuasca Análise usando cromatografia gasosa acoplada com a espectrometria de massas...17 xix

20 5.3 Rendimento do chá de ayahuasca e definição das doses Caracterização do liofilizado do chá Teste do screening farmacológico do chá de ayahuasca Teste do rota-rod...21 Experimento 1: avaliação do efeito do chá de ayahuasca isoladamente...21 Experimento 2: avaliação do efeito do propofol isoladamente...21 Experimento 3: avaliação do efeito da associação do chá de ayahuasca com propofol Medida da atividade motora...22 Experimento 1: avaliação do efeito do chá isoladamente...22 Experimento 2: avaliação do efeito da associação do chá de ayahuasca com morfina Indução de sono por hexabarbital...23 Experimento 1: avaliação do tempo de sono após a associação do chá com hexabarbital...24 Experimento 2: avaliação do tempo de sono induzido por hexabarbital 24h após administração do chá de ayahuasca Avaliação do tempo de sono induzido pelo propofol...25 Experimento 1: indução de sono pelo propofol isoladamente...25 Experimento 2: efeito do chá de ayahuasca sobre o tempo de sono induzido pelo propofol Teste do tempo de grooming...26 xx

21 5.11 Teste da placa quente...27 Experimento 1: avaliação do efeito da associação do chá de ayahuasca com morfina...27 Experimento 2: avaliação do efeito do propofol isoladamente Indução de writhes por ácido acético...28 Experimento 1: avaliação do efeito do chá de ayahuasca isoladamente e associado com morfina...28 Experimento 2: avaliação do efeito da associação entre o chá de ayahuasca com morfina em doses subefetivas...29 Experimento 3: avaliação do efeito da associação do chá de ayahuasca com morfina após 90 min de tratamento Teste da formalina Experimento 1: avaliação do efeito do chá de ayahuasca isoladamente...30 Experimento 2: avaliação do efeito da associação do chá de ayahuasca com morfina Teste do trânsito intestinal ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS RESULTADOS Doseamento dos componentes do chá de ayahuasca Caracterização do liofilizado do chá Screening farmacológico...34 Experimento 1: efeito do chá de ayahuasca isoladamente...34 Experimento 2: efeito da associação do chá de ayahuasca com morfina...35 Experimento 3: efeito da associação do chá de ayahuasca com propofol...36 xxi

22 7.4 Teste do rota-rod...37 Experimento 1: efeito do chá de ayahuasca isoladamente...37 Experimento 2: efeito do propofol isoladamente...37 Experimento 3: efeito da associação do chá de ayahuasca com propofol Medida da atividade motora...39 Experimento 1: efeito do chá de ayahuasca isoladamente...39 Experimento 2: efeito da associação do chá de ayahuasca com morfina Medida do tempo de sono induzido por hexabarbital Experimento 1: medida do tempo de sono após a associação do chá de ayahuasca com hexabarbital...42 Experimento 2: avaliação do tempo de sono induzido por hexabarbital 24h após administração do chá de ayahuasca Medida do tempo de sono induzido pelo propofol...44 Experimento 1: efeito do chá de ayahuasca sobre o tempo de sono induzido pelo propofol Teste do tempo de grooming...45 Experimento 1: efeito do chá de ayahuasca sobre o tempo de grooming induzido pelo propofol Teste da placa quente...46 Experimento 1: efeito da associação do chá de ayahuasca com morfina...46 Experimento 2: efeito do propofol isoladamente...48 xxii

23 7.10 Teste de contorções abdominais...49 Experimento 1: efeito da associação do chá de ayahuasca 1X e 10X com morfina 1 mg/kg após 30 min de tratamento com o chá de ayahuasca...49 Experimento 2: efeito da associação do chá de ayahuasca 0,5X com morfina 0,25 mg/kg após 30 min de tratamento com o chá de ayahuasca...50 Experimento 3: efeito da associação do chá de ayahuasca 1X e 10X com morfina 1 mg/kg após 90 min de tratamento com o chá de ayahuasca Teste da formalina...52 Experimento 1: efeito do chá de ayahuasca isoladamente...52 Experimento 2: efeito da associação do chá de ayahuasca com morfina Teste do trânsito intestinal...54 Experimento1: efeito do chá de ayahuasca isoladamente e associado com morfina DISCUSSÃO CONCLUSÃO ANEXO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...72 Abstract xxiii

24 Introdução 1. INTRODUÇÃO 1.1 O uso da bebida ayahuasca no Brasil A ayahuasca é um termo de origem Quechua 1, utilizado para designar uma bebida com propriedades psicoativas, preparada através do cozimento de duas plantas (Figura 1), o cipó Banisteriopsis caapi (Spruce ex Griseb.) C.V. Morton (Malpighiaceae) e as folhas de Psychotria viridis (Ruiz & Pav.) (Rubiaceae) (Figura 2). No Brasil a B. caapi é conhecida popularmente por mariri e a P. viridis por chacrona, ou rainha. Quanto aos termos Aya, este quer dizer pessoa morta, alma, espírito e waska significa corda, liana, cipó ou vinho, portanto, traduzindo poderíamos dizer que significa vinho da alma, vinho dos mortos, ou corda dos mortos (Rivier & Lindgren, 1972). Esta bebida, segundo seus usuários, libera a alma de seu confinamento corporal (Schultes & Hofmann, 1993). É preparada na forma de chá, e também é conhecida popularmente como Caapi, Daime ou Hoasca (Brasil), Dapa, Kahi, Miki, Yage (Colômbia), Oasca, Vegetal, Natem (Equador) (Schultes & Hofmann, 1993; McKenna et al., 1984a; Riba et al., 2001). O preparo e o uso da ayahuasca são originários do conhecimento e das práticas ritualísticas de populações indígenas das bacias do rio Orinoco (Colômbia e Venezuela) e Amazonas (Bolívia, Brasil, Equador, e Peru). Para essa cultura, os efeitos psicoativos da bebida propiciavam aos seus usuários uma forma de comunicação com o mundo espiritual, auxiliando no diagnóstico e no tratamento de enfermidades, ou seja, uma beberagem utilizada com fins cerimoniais e medicinais (Rivier & Lindgren, 1972; Schultes & Hofmann, 1993; Riba et al., 2006). Mac Ray (1995) relata que a ayahuasca começou a ser consumida no início do século XX dentro de um novo contexto, quando por volta de 1930, em Rio Branco (Acre), Raimundo Irineu Serra passou a agregar seguidores de uma nova doutrina religiosa, o Santo Daime. Para essa doutrina, a ayahuasca ganhou um papel de destaque, passando a ser consumida por todos os indivíduos presentes nos cultos religiosos, inclusive gestantes e crianças. Nos anos 60, em Porto Velho (Rondônia) começou a ganhar visibilidade um 1 Língua do antigo Império Inca 1

25 Introdução segundo grupo religioso, a União do Vegetal (UDV), que também passou a fazer uso da ayahuasca. Esses dois movimentos foram agregando um número cada vez maior de seguidores, e se disseminando por outros estados do Brasil. Esses movimentos passaram a ser chamados de religiões ayahuasqueiras, e também estão presentes nos Estados Unidos e Europa. O uso ritualizado da ayahuasca é legalmente aceito no Brasil, legitimado juridicamente desde 1987, segundo pareceres do Conselho Federal de Entorpecentes (CONFEN), (Mourão, 1995), sendo que atualmente existem mais de filiados ao Centro União do Vegetal. No Brasil desenvolveram-se religiões não indígenas que fazem uso da ayahuasca, e que estão se expandindo para Europa e América. Estas religiões reelaboraram as antigas tradições com influências do cristianismo, espiritismo Kardecista e religião afro-brasileira (Labate & Araújo, 2002). Cerca de uma vez por semana, ou uma vez a cada duas semanas os participantes se reúnem para a realização de um culto sagrado e ingerem cerca de um copo da bebida momentos antes do início. O ritual acontece em um ambiente rico em estímulos visuais e auditivos (musical) que, somados aos efeitos psicoativos do chá, propiciam uma viagem espiritual dirigida (Mac Rae, 1992). Trabalhos da literatura relatam que através do uso do chá, os usuários passam a apresentar mais segurança, confiança, bem estar, otimismo, menos fadiga, astenia, ansiedade, medo e raiva, e que essas alterações benéficas alcançadas, sejam psicológicas ou moral, não ocorrem somente pelo uso do chá, mas também principalmente pelo contexto religioso no qual está inserido (Grob et al., 2002; McKenna, 2004; Santos et al., 2006; Santos et al., 2007). Acredita-se que o uso crônico da ayahuasca possa ter aplicações terapêuticas para o tratamento do alcoolismo, tabaco, drogas de abuso e possivelmente outras desordens, e que por si só também possa ter efeitos positivos e terapêuticos no psiquismo dos indivíduos. Segundo Grob et al., 1996, que realizou um trabalho avaliando as condições de saúde clínica e psiquiátrica de 15 indivíduos que utilizavam este chá regularmente em contexto religioso no mínimo por 10 anos, estes apresentaram resultados de ausência de diagnóstico psiquiátrico, dependência ou abuso de substâncias. Também foi verificada uma nítida associação temporal entre o início do consumo ritualístico da bebida e abstinência completa das drogas utilizadas pelos usuários, sem a 2

26 Introdução recaída do uso pelas mesmas, ou dependência pelo chá. Aqui podemos visualizar claramente a existência de um suporte religioso e social, além dos efeitos farmacológicos produzidos. Segundo trabalho de Doering-Silveira et al. (2005a), em estudo clínico conduzido com 84 adolescentes brasileiros, usuários e não usuários do chá, os adolescentes usuários ingeriram menos álcool (46,3%) do que em relação aos não-usuários (74,4%), em um período de um ano. Em outro estudo de Doering-Silveira et al. (2005b) conduzido com adolescentes (15 a 19 anos) durante contexto religioso, não foram encontradas diferenças estatísticas significantes entre o grupo não-usuário e grupo usuário em relação aos testes neuropsicológicos, indicando uma boa tolerabilidade ao chá. Os adolescentes usuários apresentaram escores menores para ansiedade e menos problemas de atenção que os não-usuários. Em outro estudo, também foram encontradas baixas freqüências de sintomas psiquiátricos entre os usuários quando comparados com o grupo de não-usuários (Da Silveira et al., 2005). Figura 1: cozimento do chá de ayahuasca. Fonte: Google 3

27 Introdução (A) (B) Figura 2: plantas componentes do chá de ayahuasca: (A) Banisteriopsis caapi (cipó) e (B) Psychotria viridis (rainha). Fonte: Google. 4

28 Introdução 1.2 Farmacologia da ayahuasca A principal espécie de cipó utilizado para preparar a bebida ayahuasca é a Banisteriopsis caapi, embora dependendo do local, outras espécies sejam adicionadas a essa bebida, como algumas da família das Solanáceas, tais como Nicotiana sp., Brugmansia sp., e Brunfelsia sp. A rainha normalmente é representada pela Psychotria viridis, ou por alguma planta do gênero Psychotria, mas também, dependendo do local, pode ser adicionada a Diplopterys cabrerana (Malpighiaceae) que possui dimetiltriptamina (DMT) como principal alcalóide (Riba, 2003). Os principais componentes ativos do chá de ayahuasca (Figura 3) são: DMT (dimetiltriptamina) e os alcalóides da harmala: harmina, harmalina, tetrahidro-harmina, e em quantidades traços harmol e harmalol (Rivier & Lindgren, 1972; McKenna et al., 1984b; Callaway et al., 1999). No entanto, os principais efeitos da bebida são atribuídos ao sinergismo que ocorre entre os princípios ativos presentes nas duas plantas (Callaway et al., 1999; Ott, 1999). A DMT presente nas folhas da P. viridis, é o principal componente alucinógeno do chá, sendo uma potente substância alucinógena quando fumada ou injetada. Quando ingerida por via oral é rapidamente inativada pela monoaminoxidase A (MAO-A) presente nos intestinos e fígado (McKenna et al., 1984b), o que é evitado com a associação das ß-carbolinas inibidoras da MAO (IMAO). O pico da concentração de DMT ocorre entre uma hora a duas horas após a ingestão do chá, gerando os efeitos visionários mais intensos (Callaway et al., 1999), enquanto que a experiência total do chá dura em média 4h (Grob et al., 2002). Os efeitos psicoativos da DMT são atribuídos a sua ação no sistema serotonérgico (Callaway et al., 1994; Strassman, 1996). De acordo com Smith et al. (1998) e Riba et al. (2001), sugere-se que a DMT funciona como um agonista para receptores 5-HT 2A e 5-HT 2C, semelhante à serotonina. O pico plasmático da DMT está associado com imagens coloridas e confusas, processos complexos de pensamento e estado geral de consciência aguçado (Simões et al., 2007). A harmina e a harmalina, são os principais alcalóides IMAO presentes no cipó B. caapi (Callaway 2005a). Possuem estrutura β-carbolina, e são capazes de inibir a MAO reversivelmente por várias horas (preferencialmente a MAO-A em oposição à MAO-B). Essas β-carbolinas também podem funcionar 5

29 Introdução como agonistas serotonérgicos, pois segundo Grella et al. (2003), foi evidenciada a afinidade das β-carbolinas pelos receptores 5-HT 2A e 5-HT 2C. A tetrahidro-harmina, embora inibindo fracamente a MAO de maneira não significante, pode contribuir com os efeitos psicoativos, impedindo a recaptação de serotonina nas plaquetas e em neurônios pré-sinápticos (Callaway et al., 1999). As β-carbolinas, além de aumentarem os níveis de serotonina no cérebro, aumentam também os níveis de dopamina (Cazenave, 2000; Costa et al., 2005). Por outro lado, quando administrados juntos (alcalóides da harmala e a DMT), ocorre o sinergismo. A harmina e a harmalina, ao inibirem a MAO-A intestinal, diminui a desaminação/oxidação (degradação) da DMT, aumentando assim a sua biodisponibilidade e, portanto, seus efeitos psicoativos. Além dos efeitos psicoativos, a ayahuasca provoca efeitos purgativos (vômito e diarréia) que são considerados tônicos pelos usuários. Náuseas, vertigens, nervosismo, transpiração excessiva e tremor brando também podem ocorrer (Schultes & Hoffmann 1993; Callaway et al., 1999). Plantas que possuem grupamentos triptamínicos são conhecidas por apresentar propriedades eméticas, antimicrobianas e anti-helmínticas. Há relatos de que estas plantas também são utilizadas por populações indígenas para combater malária, leishmaniose e doença de Chagas (Rodríguez et al., 1982; Pomilio et al. 1999). 6

30 Introdução (A) (B) (C) (D) Figura 3: estruturas químicas dos principais alcalóides encontrados no chá de ayahuasca: (A) dimetiltriptamina, (B) harmina, (C) harmalina e (D) tetrahidroharmina. 7

31 Introdução 1.3 Interações dos IMAO com outras substâncias Apesar do crescente uso da ayahuasca, ainda existem poucos estudos a respeito das possíveis interações de seus princípios ativos com outras substâncias (Callaway & Grob, 1998). Alguns autores acreditam que ocorrem interações entre a ayahuasca e alimentos ou bebidas ricos em tiramina (queijos maduros e produtos com fermento concentrado). Isso representaria um fator de risco para os usuários da bebida, devido ao fato de que a tiramina é normalmente inativada pela MAO intestinal e hepática. Quando a MAO se encontra inibida, grandes quantidades de tiramina passam para a circulação sistêmica, alcançando as terminações nervosas simpáticas e promovendo a liberação de noradrenalina das fendas sinápticas, que já se encontra em quantidades maiores que o normal devido a inibição da MAO intraneural, gerando hipertensão e outros efeitos (Stahl, 2002). Contudo, MacKenna (2004) destaca que não há relatos descritos desta interação. É importante ressaltar que pelo fato dos alcalóides da harmala (harmina e harmalina) serem IMAO-A, estes podem causar sérios riscos quando do uso simultâneo com determinados medicamentos, tais como a meperidina (Stockley, 2007), e com inibidores seletivos da recaptação de serotonina (ISRS), cuja interação gera elevação da concentração de serotonina na fenda sináptica podendo promover a síndrome serotonérgica, que pode atingir gravidade considerável (Callaway & Grob, 1998). A síndrome serotonérgica caracteriza-se por apresentar inicialmente sintomas tais como euforia, náusea, confusão seguida de tremores, vômitos, convulsões, perda da consciência e possivelmente levar a morte, em casos extremos (Teixeira-Silva et al., 2006) O metabolismo da harmina e da harmalina ocorre pelo sistema citocromo P 450, particularmente pela isoenzima CYP 2D6 (Yu et al., 2003; Callaway, 2005a). Estudos com este sistema de metabolização são de grande importância, pois muitas interações clinicamente importantes entre drogas ocorrem devido à inibição ou indução das enzimas P 450, que atuam aumentando ou diminuindo o efeito farmacológico e a toxicidade de fármacos (Streck & Costa, 1999; Rang et al., 2001). Segundo Callaway (2005a), ISRS, antipsicóticos e tabaco são substâncias metabolizadas pelo CYP 2D6, por isso devem ser evitados concomitantemente com o chá de ayahuasca. 8

32 Introdução Segundo Strassman & Qualls (1994) a DMT provoca aumento da pressão sanguínea, da frequência cardíaca, da temperatura; e midríase em humanos. Já em um estudo realizado com voluntários da UDV que fazem uso do chá de ayahuasca durante rituais, não foi registrada nenhuma evidência de toxicidade aguda ou após o uso repetido durante o contexto religioso (Grob et al., 2002). O presente trabalho verificou se o tratamento prévio e agudo com o chá de ayahuasca interfere com os efeitos da morfina ou do propofol, agentes utilizados em processos cirúrgicos. Coller et al. (2009) apontam o envolvimento da isoenzima CYP2D6 no metabolismo da morfina. Entretanto, segundo Armstrong & Cozza (2003), a morfina é metabolizada e eliminada do organismo principalmente através de reações de conjugação com o ácido glicurônico, sem que haja uma grande participação do sistema P 450. Entre os medicamentos utilizados em anestesia, com comprovada interação com os IMAO, destaca-se a morfina, que tem seus efeitos depressores intensificados e grau de analgesia aumentado (Jenkins & Graves, 1965; Graig & Stitzel, 1994; Stockley, 2007). A administração de IMAO deve ser interrompida pelo menos 15 dias antes da administração de morfina (Graig & Stitzel, 1994). Estudos da literatura relatam que existe risco de interações medicamentosas entre ISRS e IMAO, mas interações entre drogas serotonérgicas e alcalóides da harmala não tem sido relatadas (Callaway & Grob, 1998). Por outro lado, o propofol (alquilfenol), também muito utilizado em anestesia de curta duração, é aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA) como efetivo e seguro, não sendo citadas até o momento as possíveis interações com os IMAO (Drugs, 2006). O propofol é descrito como substrato para as enzimas CYP2B6 e CYP 2C8/9 (Cozza et al., 2003; Bachmann et al., 2006), o que traz a possibilidade de que o chá possa interferir com a metabolização e, consequentemente, com os efeitos deste. 9

33 Introdução Embora existam outras drogas coadjuvantes do processo anestésico, foram escolhidas a morfina e o propofol para este trabalho. A primeira porque é a droga clássica representante dos opióides, e detentora de mecanismo de ação já bem definido; e o propofol, que além de ser um dos anestésicos mais usados, proporciona indução de anestesia, despertar e recuperação mais rápidos do que em relação a outras drogas, sendo também muito utilizado em UTI. 10

34 Justificativa 2. JUSTIFICATIVA DO ESTUDO A interação entre drogas é bastante comum, podendo ocorrer devido a modificações da biodisponibilidade de uma droga na presença de uma segunda, ou por combinação do efeito das duas. É conhecido ainda o fato de alguns alimentos modificarem a absorção ou metabolismo de certos fármacos, como já foi relatado para o suco de grape fruit (Citrus paradisi), pomelo (Citrus grandis) (Kantola et al., 1998; Nowak, 2008), suco de maçã, laranja e romã (Kamath et al., 2005; Farkas et al., 2008; Saruwatari et al., 2008). Um dos parâmetros ainda pouco investigado é o risco de interação entre o chá de ayahuasca com outras drogas, como já foi descrito para alguns fitoterápicos, como o Hypericum perforatum (Roby et al., 2000), Ginkgo biloba (Fugh- Berman, 2000) que em geral interferem com o sistema enzimático P 450. As -carbolinas presentes no chá de ayahuasca, devido a sua ação inibidora sobre a MAO, interferem com a absorção e metabolização de substratos da MAO, como é o caso da DMT, também presente no chá. Não se conhece, entretanto, qual o efeito do chá sobre outras enzimas metabolizadoras, em especial as enzimas do sistema P 450, as quais metabolizam um grande número de fármacos e também as β-carbolinas. Diante do crescente número de usuários do chá de ayahuasca, conhecer as possíveis interações entre o chá e fármacos empregados na clínica passa a ser cada vez mais importante. Existem muitas citações em literatura alertando para o fato de que fitoterápicos empregados no período pré-operatório podem afetar o ato anestésico, podendo potencializar ou inibir a hipnose, a analgesia, o miorrelaxamento, ou ainda interferir na estabilidade cardiovascular (Kaye et al., 2000; Leak 2000; Kaye et al., 2007). Complementando esta informação com um dos vários exemplos da literatura, temos o Hypericum perforatum que prolongou o efeito hipnótico, quando utilizado antes da cirurgia e foi apontado como possível causa de colapso cardiovascular (Leak, 1999; Irefin & Sprung, 2000; Vale, 2002). Segundo Crowe & McKeating (2002), é possível que o H. perforatum tenha aumentado a sedação por interagir centralmente com os agentes anestésicos e opióides. 11

35 Justificativa A interação entre drogas com pequena margem de segurança, ou que são usadas em circunstâncias onde existe risco de vida para o paciente são especialmente críticas. Neste sentido, existe a necessidade de serem estabelecidos os parâmetros de segurança para o paciente que irá se submeter a uma cirurgia, que será tratado com analgésicos ou anestésicos, principalmente quando fez uso prévio deste chá. Uma vez que já se conhece o efeito inibidor dos alcalóides ß-carbolínicos do chá sobre a MAO; e visto a possibilidade de interação dos IMAO com a morfina, torna-se importante, portanto, verificar se o uso prévio do chá de ayahuasca poderá interferir com a morfina, e também com o propofol, anestésico muito utilizado em cirurgias. Ressalta-se que até o momento não existem na literatura médica dados que permitam avaliar a segurança do procedimento anestésico em pacientes que façam uso da bebida ayahuasca. Embora o número de pacientes de procedimentos operatórios que sejam usuários do chá possa ser pequeno, conhecer a possível interação entre os anestésicos e o chá e seus riscos não deixa de ser importante. O uso de fitoterápicos ou plantas in natura deve ser notificado ao médico anestesista para que haja maior segurança em relação a imprevistos. Segundo informação de um usuário do chá, é procedimento comum que seja ingerido um copo de chá antes do indivíduo se submeter a uma cirurgia, com a finalidade de diminuir a ansiedade e manter a calma (comunicação pessoal), o que torna ainda mais relevante este estudo. 12

36 Objetivos 3. OBJETIVOS Mostrar através de experimentos com animais de laboratório as respostas comportamentais da possível interação da bebida (chá de ayahuasca) com dois agentes usados em anestesia: propofol e morfina. Para tanto, os efeitos destes agentes foram avaliados em diversos modelos animais e comparados com grupos de animais tratados adicionalmente com o liofilizado do chá de ayahuasca ou com água (grupo controle). 13

37 Materiais 4. MATERIAIS 4.1 Animais Foram utilizados camundongos albinos da linhagem Suíça, adultos (3-4 meses), pesando entre g. Os animais foram provenientes do biotério do Departamento de Psicobiologia, UNIFESP e mantidos em salas com controle de temperatura (23 ± 2 C) e ciclo claro/escuro de 12h com água e comida ad libitum. Ao término dos experimentos os animais foram eutanasiados em câmara de CO 2. No teste do trânsito intestinal os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical. O projeto foi aprovado pelo Comitê de ética da UNIFESP (protocolo n o 1494/06) seguindo as normas recomendadas pelo International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals de Geneva, Drogas e reagentes Ácido acético, bicarbonato de sódio, carvão vegetal, formaldeído, goma arábica (Labsynth), hexabarbital sódico (Sigma-Aldrich), propofol (Propovan, ampolas doadas pelo Laboratório Cristália) e sulfato de morfina (Dimorf, ampolas doadas pelo Laboratório Cristália). O hexabarbital foi dissolvido em solução de bicarbonato de sódio (ph 9) através de agitação (magnética), sonicação, aquecimento e resfriamento. Sempre que a solução precipitava, ela era novamente aquecida e esfriada para administrar aos animais. O chá de ayahuasca foi gentilmente cedido pelo Dr. Wilson Gonzaga da Costa, médico psiquiatra presidente da Associação Beneficente Luz de Salomão e ex-integrante do Santo Daime, segundo o qual o chá foi produzido em Manaus. A concentração de DMT e -carbolinas no chá foi previamente quantificada (ver item 5.2). Todas as drogas foram administradas aos camundongos em volume de 0,1 ml para cada 10g de peso corporal. 14

38 Materiais 4.3 Esquema de testes realizados O protocolo experimental consistiu inicialmente em avaliar o efeito do chá de ayahuasca isoladamente em diversos modelos experimentais e em seguida comparar os efeitos da morfina e propofol isoladamente e associados com o chá. Os testes onde foram investigados os efeitos da associação do chá com cada droga foram determinados em função dos efeitos esperados ou observados para cada uma das drogas isoladamente. A Tabela 1 traz um sumário dos testes empregados e associações realizadas em cada um. Tabela 1: sumário de grupos utilizados e testes realizados. Teste Chá AYA + morfina AYA + propofol Screening farmacológico X X X Rota-rod X X Atividade motora X X Tempo de sono X X Grooming X X Placa quente X X Indução de writhes X X Formalina X X Trânsito intestinal X X (X): experimentos realizados. 15

39 Metodologia 5. MÉTODOS 5.1 Preparo do liofilizado do chá de ayahuasca O chá de ayahuasca foi concentrado com o auxílio de um rotaevaporador modelo FISATON, até o chá atingir um volume de cerca de 10% do volume inicial. Em seguida o concentrado foi colocado em frasco apropriado e congelado a 40ºC em banho de gelo seco e acetona, e colocado em um liofilizador, a -4 ATM de pressão por cerca de 48h para a obtenção do resíduo seco (liofilizado). O liofilizado obtido foi armazenado em frasco âmbar, dentro de um dessecador em geladeira. Quantidades apropriadas foram pesadas e diluídas em água destilada, no momento dos testes. 5.2 Doseamento dos componentes do chá de ayahuasca As concentrações de DMT e alcalóides β-carbolinas (harmina, harmalina e tetrahidro-harmina) foram dosadas em colaboração com o Prof. Dr. Maurício Yonamine da Universidade de São Paulo (USP), conforme metodologia descrita abaixo (Pires et al. 2009a) Preparação das soluções padrão Soluções padrão (10 mg/ml) de dimetiltriptamina, harmina, harmalina e tetrahidro-harmina, foram preparadas com metanol em um balão volumétrico. As concentrações injetadas no cromatógrafo gasoso foram de 1 mg/ml, as quais foram obtidas através da diluição da solução estoque Extração dos alcalóides da ayahuasca Uma amostra contendo 0,5 ml de ayahuasca em um tampão de borato (ph 9.0; 3,0 ml) contendo difenidramina (100 µl de uma solução contendo 1,0 mg/ml) como padrão interno, foi colocada em um cartucho de C18 sob vácuo e acondicionada com metanol (2,0 ml), água deionizada (1,0 ml) e tampão de borato (ph 9.0; 3,0 ml). O cartucho foi lavado, posteriormente com água deionizada (1,0 ml) e com uma solução de acetonitrila-água (1:9; 1,0 ml). O cartucho foi secado sob vácuo durante 7 min, e os alcalóides foram extraídos 16

40 Metodologia com metanol (2,0 ml). Foi injetado no cromatógrafo gasoso 1,0 µl desta solução. Os alcalóides extraídos foram identificados através da comparação de seus respectivos tempos de retenção com aqueles obtidos com os padrões analisados nas mesmas condições cromatográficas. A quantificação foi baseada sobre a integração da área do pico obtida com o padrão interno Análise usando cromatografia gasosa acoplada com a espectrometria de massas A análise de dimetiltriptamina, harmina, harmalina e tetrahidro-harmina foi realizada usando um cromatógrafo gasoso Agilent modelo 6890, equipado com um detector de nitrogênio-fósforo e um injetor automático 7683 (Little Falls, DE, USA). A separação cromatográfica foi obtida com uma coluna capilar fundida com sílica HP ultra 2 (25 m x 0,2 mm x 0,33 micrometros de espessura) usando nitrogênio ultra puro como gás de arraste com um fluxo constante de 0,6 ml/min. Foi injetado 1 µl de amostra no modo split (razão 1:20). As temperaturas do injetor e detector foram de ºC, respectivamente. A temperatura do forno foi mantida a 150ºC durante 1,0 minuto, com uma taxa de aquecimento programada para 10ºC/min até 250ºC, sendo mantido em 250ºC durante 7 min. O limite de detecção e menor limite de quantificação foram determinados por um método empírico que consistiu na análise de uma série de soluções aquosas contendo quantidades decrescentes de dimetiltriptamina, harmina, harmalina e tetrahidro-harmina. 17

41 Metodologia 5.3 Rendimento do chá de ayahuasca e definição das doses As doses do chá de ayahuasca utilizadas neste trabalho foram estabelecidas em função das doses consumidas pelo homem durante um ritual. De acordo com o Dr. Wilson, que forneceu o chá de ayahuasca, o volume ingerido nas sessões ritualísticas varia em função da concentração do chá. Além disso, cada seita ou cada pessoa ingere uma quantidade diferente de chá dependendo dos efeitos que pretende obter. Todo esse procedimento ocorre com a autorização do mestre, que é a pessoa que acompanha os rituais para orientação dos participantes. Assim, utilizou-se para o cálculo da dose unitária o volume médio consumido durante um ritual, de aproximadamente 70 ml, de acordo com o volume apontado pelo Dr. Wilson (medido em um copinho plástico). Uma vez que a liofilização de 100 ml do chá de ayahuasca produziu um rendimento de 12g, verificou-se que o chá encontra-se na concentração de 0,12g/mL. Calculase, portanto, que em um copo de 70 ml há 8,4g de sólido, o que significa que um homem de 70 kg (peso médio) estará recebendo o equivalente a 120 mg/kg (8,4g/70 kg). Esta dose foi escolhida como a dose unitária do trabalho. Doses equivalentes a 0,1X (12 mg/kg), a ritualística 1X (120 mg/kg) e 10X (1200 mg/kg) foram escolhidas para a realização dos testes. A dose equivalente a 10 vezes a dose unitária ingerida em ritual foi escolhida com a finalidade de obter-se eventualmente um efeito farmacológico mais visível. Foi ainda utilizada a dose de 2400 mg/kg (20X) na triagem farmacológica inicial. 18

42 Metodologia 5.4 Caracterização do liofilizado do chá Foram analisados os seguintes parâmetros do chá liofilizado: cor, odor, sabor e ph. O ph foi determinado em phmetro CORNIG 125, previamente calibrado com soluções tampão de fosfato ph 7 e biftalato ph 4, utilizando soluções do chá, nas concentrações de 0,12 g/ml e 1,2 g/ml. 5.5 Teste do screening farmacológico do chá de ayahuasca Os camundongos foram distribuídos em grupos de cinco para cada uma das seguintes doses do extrato: 0,1X (12 mg/kg), 1X (120 mg/kg), 10X (1200 mg/kg) e 20X (2400 mg/kg) administradas por via oral (gavagem), além de um grupo controle que recebeu água. Para testar a administração por via intraperitoneal (ip), os animais foram distribuídos em grupos de três camundongos para cada uma das seguintes doses: 0,1X, 1X, 10X. Numa segunda etapa, o mesmo experimento foi realizado avaliando os efeitos do propofol, ou morfina isolados ou em associação com o chá. O chá de ayahuasca 1X foi administrado 30 min antes do propofol 50 e 140 mg/kg (ip), ou morfina 10 e 20 mg/kg (ip) ou salina (ip). Os animais foram colocados em gaiolas de arame (Figura 4), com dois ou três animais por gaiola, e observados aos 5, 15, 30, 60, 120, 180, 240 min e 24h após a administração das drogas, anotando-se a presença ou ausência de sinais de acordo com o protocolo rotineiramente empregado no Departamento de Psicobiologia, tais como: micção, defecação, writhes, pêlos arrepiados, atividade locomotora, tremor, convulsões, ataxia, perda do reflexo de postura, sensibilidade dolorosa, ptose palpebral, cauda de Straub, abdução das patas posteriores, estereotipia, bocejos, sono, grooming excessivo, tônus muscular, lacrimejamento, exoftalmia, salivação e morte (Carlini, 1972; Mendes, 2000). Ao fim de 24h os animais foram eutanasiados e o fígado, rins e coração examinados macroscopicamente, e comparados com os controles. 19

43 Metodologia Este experimento serviu para estipular doses para os demais testes e traçar um perfil inicial da atividade da droga testada. Os sinais apresentados não foram quantificados numericamente, ou seja, foi realizada uma observação qualitativa e anotado o número de camundongos que apresentou o sinal observado. Figura 4: gaiola de arame utilizada para observação dos sinais apresentados pelos animais no teste do screening farmacológico. Foto: Júlia Movilla. 20

44 Metodologia 5.6 Teste do rota-rod Este teste consiste em avaliar a coordenação motora dos camundongos que são colocados sobre uma barra giratória a 12 rpm (rotações por min) aos tempos 0 (basal), 30, 60 e 120 min após a administração das drogas (Carlini & Burgos, 1979; Mendes et al., 2002) (Figura 5). Realizou-se uma pré-seleção de camundongos nesse aparelho 24h antes do teste, separando para o estudo somente aqueles que conseguiram permanecer na barra por 60 seg em até 3 tentativas. Experimento 1: avaliação do efeito do chá de ayahuasca isoladamente Grupos de 10 animais receberam por via oral água (controle) ou chá de ayahuasca (1X e 10X) e foram avaliados conforme descrito anteriormente. Experimento 2: avaliação do efeito do propofol isoladamente Grupos de 5 animais receberam por via ip propofol nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg, e em seguida avaliados no aparelho de rota-rod. Experimento 3: avaliação do efeito da associação do chá de ayahuasca com propofol O chá de ayahuasca (10X) foi administrado 30 min antes do propofol (50 e 100 mg/kg) ou salina (ambos via ip), e avaliados no aparelho de rota-rod, pelos mesmos tempos descritos em 5.6. Figura 5: aparelho de rota-rod. Foto: Google. 21

45 Metodologia 5.7 Medida da atividade motora O teste consiste em colocar os animais em caixas acrílicas individuais dotadas de células fotoelétricas (Figura 6). O número de interrupções dos feixes de luz foi registrado aos 15, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 e 240 min, conforme descrito por Carlini (1972) e Mendes (2000), porém sendo a contagem não-cumulativa. Experimento 1: avaliação do efeito do chá isoladamente Grupos de camundongos receberam por via oral água (grupo controle) ou o chá de ayahuasca 10X. Em seguida foram imediatamente colocados nas caixas de atividade motora e avaliados conforme descrito acima. Experimento 2: avaliação do efeito da associação do chá de ayahuasca com morfina Grupos de 8 camundongos receberam por via oral água (grupo controle) ou o chá de ayahuasca (1X). Após 30 min receberam morfina (5 mg/kg) ou salina (ambas via ip), sendo imediatamente colocados nas caixas para avaliação. Figura 6: caixa utilizada para registro da atividade locomotora. Foto: Júlia Movilla. 22

46 Metodologia 5.8 Indução de sono por hexabarbital Este teste mede o efeito de drogas sobre o sono induzido pelo hexabarbital. Foi registrado o tempo entre a administração do barbitúrico e a perda do reflexo de endireitamento (início do estado hipnótico, ou latência de sono) e o tempo que o animal levava para recuperar o reflexo de endireitamento (tempo de sono). A perda do reflexo de endireitamento (Figura 7) é a incapacidade do animal voltar à posição normal quando colocado em decúbito dorsal. O critério para a recuperação deste reflexo foi fixado quando o animal por três vezes consecutivas saía da posição de decúbito dorsal imposta ao mesmo (Carlini et al., 1986; Mendes et al., 2002). Figura 7: posição de decúbito dorsal. Foto: Daniel de Santi. 23

47 Metodologia Experimento 1: avaliação do tempo de sono após a associação do chá com hexabarbital Grupos de 6 camundongos foram tratados por via oral com água (grupo controle) ou com o chá de ayahuasca (1 e 10X, oral). Trinta minutos após foram tratados com hexabarbital sódico 80 mg/kg (ip) e colocados novamente na caixa-moradia. Assim que iniciavam o sono os animais eram colocados em decúbito dorsal sob a bancada e o tempo total de sono registrado, conforme descrito anteriormente. Experimento 2: avaliação do tempo de sono induzido por hexabarbital 24h após administração do chá de ayahuasca Este teste foi realizado com a finalidade de verificar se o chá de ayahuasca, administrado 24h antes, interfere no efeito do hexabarbital, o que poderia indicar alteração da metabolização hepática por um suposto efeito hepatotóxico. Para tanto, o hexabarbital foi administrado por via ip 24h após administração aguda do chá de ayahuasca 10X (n=10 / grupo). O tempo de sono foi registrado da mesma forma que descrito anteriormente. 24

48 Metodologia 5.9 Avaliação do tempo de sono induzido pelo propofol Neste experimento, o propofol foi empregado como droga indutora de sono, usando o mesmo protocolo descrito para o hexabarbital (item 5.8). Experimento 1: indução de sono pelo propofol isoladamente Inicialmente foi realizado um experimento para escolha da dose de propofol. Foram testadas as seguintes doses (n=5): 100, 140, 175 e 200 mg/kg (ip), baseado em doses já descritas na literatura (Irifune et al., 2003; Anwar & Abdel-Rahman, 1998). As doses de 100 mg/kg e 200 mg/kg foram descartadas. A primeira porque dos 5 animais testados 3 não dormiram e a segunda porque provocou a morte de um animal (dados não mostrados). Portanto as doses escolhidas para teste foram de 140 e 175 mg/kg. Experimento 2: efeito do chá de ayahuasca sobre o tempo de sono induzido pelo propofol Grupos de 7-10 camundongos foram pré-tratados com o chá de ayahuasca 1X e 10X ou água e após 30 min tratados com propofol nas doses de 140 e 175 mg/kg (via ip), incluindo os grupos controle pré-tratados com água. O tempo de sono foi registrado da mesma forma que descrito anteriormente. 25