AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA ALIMENTAR NA PRODUÇÃO DE PASTELARIA SALGADA

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1 UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA ALIMENTAR NA PRODUÇÃO DE PASTELARIA SALGADA Parâmetros microbiológicos, verificação e controlo de produtos Mestrado em Segurança Alimentar Lúcia Marlene Cardoso Alves Orientação: Professora Doutora Cristina Saraiva VILA REAL, 2013

2 UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA ALIMENTAR NA PRODUÇÃO DE PASTELARIA SALGADA Parâmetros microbiológicos, verificação e controlo de produtos Mestrado em Segurança Alimentar Lúcia Marlene Cardoso Alves Orientação: Professora Doutora Cristina Saraiva Composição do Júri: Presidente: Arguente: Orientadora: VILA REAL, 2013

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4 Agradecimentos No fim de mais uma etapa não poderia deixar de agradecer a quem de alguma forma me ajudou na realização deste trabalho: Ao professor Doutor Carlos Sequeira, na qualidade de reitor da Universidade de Trás-os- Montes e Alto Douro. À Professora Doutora Cristina Saraiva, orientadora desta tese de Mestrado, por toda a amizade, ajuda, dedicação, orientação, espírito crítico, pelos seus ensinamentos prestados, pela sua palavra amiga, pela pessoa fantástica que é e por fazer com que tudo se concretizasse um muito obrigada do fundo do coração. À Professora Doutora Irene Oliveira por toda ajuda prestada, nomeadamente na parte do tratamento estatístico dos dados no SPSS 20, deste trabalho. A todos os professores do Mestrado em Segurança Alimentar, principalmente à Professora Doutora Alexandra Esteves, à Professora Doutora Maria da Conceição Fontes, ao Professor Doutor Luís Patarata e ao Professor Doutor António Silva, porque sempre se mostraram disponíveis para me ajudar. À D. Ana Leite, ao Sr. Felisberto Borges e à D. Fátima pela colaboração indispensável na realização de algumas tarefas laboratoriais, pelo carinho, amizade e simpatia, assim como o apoio demonstrado que sempre foi muito bem aceite. Aos SAS da UTAD, particularmente à Drª Elsa Justino e ao Engº Antero, pela disponibilidade e facilidades concedidas para a realização da componente prática. À minha mãe Maria José por ser a pessoa que eu mais admiro, por ser o meu exemplo de vida, pela mulher lutadora, determinada corajosa e cheia de força, por todo o seu amor, carinho, atenção, dedicação e confiança depositada em mim. Por ser o meu ponto de abrigo e porque a amo acimo de tudo. Ao meu pai José pelo seu amor, amizade, companheirismo e dedicação prestada ao longo da vida, pela sua tranquilidade e carisma único. Ao meu irmão Armando, pela sua amizade, carinho, companheirismo, pela pessoa fantástica, maravilhosa e inteligente que é e por sempre me acompanhar e ajudar ao longo da vida. À minha madrinha Maria de Jesus e avó Palmira, pelo seu amor, pelas suas palavras sábias e conselheiras, amizade e carinho. Ao meu namorado Michel Gouveia pelos dias incansáveis a apoiar-me e estimular para que tudo concretiza-se, pela compreensão e ajuda demonstradas nos momentos mais difíceis, por tudo o que fez por mim, pelo seu amor, pela pessoa maravilhosa que é e acima de tudo por me fazer muito feliz e realizada. Obrigada por existires. A todos os meus amigos simplesmente pela amizade, que tanto prezo e que é tão importante na vida e ajuda prestada em especial à Carina Coelho, Maria João, Kamila Soares, Francisco Gonçalves e Juliana. I

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6 Índice Índice de Tabelas... VIII Índice de Gráficos... IX Índice de Quadros... XI Índice de Figuras... XI Resumo... 1 Abstract... 3 I. INTRODUÇÃO... 5 II. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 9 II.1.Segurança de alimentos prontos para o consumo II.1.1. Importância da segurança alimentar II.1.2. Boas Práticas de Fabrico e Boas Práticas de Higiene II.1.3. Legislação Alimentar II.1.4. Sistema HACCP II Origem, aplicação e vantagens do sistema HACCP II Etapas preliminares para posterior elaboração de um sistema HACCP II Validação das medidas de controlo II Processo de validação II.2. ISO - Organização Internacional de Normalização II.2.1. Normas ISO versus Vantagens II.2.2. ISO 22000: II.3. Medidas de controlo no processamento e confeção de alimentos II.3.1. Avaliação de Risco Microbiológico II.3.2.Microrganismos de deterioração II

7 II Bactérias do ácido lático II Bolores e Leveduras II Enterobacteriaceae II Pseudomonas spp II.3.3. Microrganismos patogénicos Salmonella sp II Escherichia coli II Staphylococcus aureus II Listeria monocytogenes II Bacillus cereus II Clostridium perfringens II Clostridium botulinum III. TRABALHO EXPERIMENTAL III.1. Introdução III.2. Material e Métodos III.2.1. Descrição dos estabelecimentos de confeção dos pastéis salgados III.2.2. Fluxograma dos pastéis salgados de carne e de peixe III.2.3. Identificação dos principais perigos alimentares e determinação de PCC na confeção de pastéis salgados III.2.4. Verificação e controlo do processo de fabrico de pastéis salgados III Amostragem III Preparação, embalagem e acondicionamento das amostras III Medição das temperaturas e tempos de confeção III Determinações microbiológicas III Preparação das diluições e sementeira III Contagem de bactérias do ácido lático III Contagem de Enterobacteriaceae III

8 III Contagem de Pseudomonas spp III Contagem de fungos III Contagem de microrganismos mesófilos (aeróbios totais a 30ºC) III Contagem de microrganismos psicrotróficos (aeróbios totais a 7ºC) III Contagem de coliformes totais III Contagem de Escherichia coli III Contagem de Staphylococcus aureus coagulase positiva III Contagem de Clostridium perfringens III Contagem de Bacillus cereus III Pesquisa de Salmonella sp III Pesquisa de Listeria monocytogenes III.2.5. Análise de Dados III.3. Resultados e Discussão III.3.1. Identificação de perigos e determinação de PCC III.3.2. Verificação e controlo do processo de fabrico de pastelaria salgada III Análise comparativa das contagens microbianas obtidas por lote e estabelecimento III Bactérias do Ácido Lático (BAL) III Pseudomonas spp III Enterobacteriaceae III Coliformes totais III Mesófilos III Fungos III Psicrotróficos III Bacillus cereus III Staphylococcus aureus III Escherichia coli III Listeria monocytogenes III Clostridium perfringens III Contagens microbianas médias obtidas nos ingredientes utilizados no fabrico de pastelaria salgada e do produto final III Contagens médias de microrganismos nos diferentes ingredientes na confeção de pastéis salgados de peixe no estabelecimento universitário A IV

9 III Contagem médias de microrganismos nos diferentes ingredientes na confeção de pastéis salgados de peixe no estabelecimento universitário B III Contagem médias de microrganismos nos diferentes ingredientes na confeção de pastéis salgados de carne no estabelecimento universitário A III Contagem médias de microrganismos nos diferentes ingredientes na confeção de pastéis salgados de carne no estabelecimento universitário B III Controlo do Binómio Tempo e Temperatura III Confeção do recheio III Processo de fritura III Controlo microbiológico do processo de fritura III.3.3. Características microbiológicas do produto final ao longo do armazenamento em congelação III Evolução das contagens microbianas do produto final de peixe e de carne III Efeito do Tempo de armazenamento, Estabelecimento e Tempo x Estabelecimento nas contagens microbianas dos produtos finais de peixe e de carne ultracongelados III Psicrotróficos III Coliformes totais III Mesófilos III Fungos III Pseudomonas spp III Enterobacteriaceae III Bactérias do ácido lático IV. CONCLUSÃO V. BIBLIOGRAFIA ANEXOS ANEXO V

10 Lista de abreviaturas DOA- De Origem Alimentar a w - Atividade de água BAL - Bactérias do ácido láctico ufc- unidades formadoras de colónia BPH- Boas práticas de Higiene BPF- Boas práticas de fabrico EM- Estados membros UE- União Europeia CE- Comissão Europeia PCC- Pontos de controlo críticos CAC- Codex Alimentarius Comission ASAE- Autoridade de Segurança Alimentar e Económica EUA: Estados Unidos da América FAO- Food and Agriculture Organization FDA- Food and Drug Administration HACCP- Hazard Analysis Critical Control Points ICSMF- International Commission on Microbiological Specifications for Foods INSA- Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge ISO- International Organization of Standardization NASA- National Aeronautics and Space Administration PDCA- Plan, Do, Check, Act WHO- World Health Organization VI

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12 Índice de Tabelas TABELA 1: PCR CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO (ADAPTADA DE TALON ET AL., 2007) TABELA 2: IDENTIFICAÇÃO E ANÁLISE DE PERIGOS DA ETAPA DE AQUISIÇÃO E RECEÇÃO DAS MATÉRIAS-PRIMAS TABELA 3: IDENTIFICAÇÃO E ANÁLISE DE PERIGOS DA ETAPA DE ARMAZENAMENTO À TEMPERATURA AMBIENTE TABELA 4: IDENTIFICAÇÃO E ANÁLISE DE PERIGOS DA ETAPA DE ARMAZENAMENTO EM REFRIGERAÇÃO/CONGELAÇÃO TABELA 5: IDENTIFICAÇÃO E ANÁLISE DE PERIGOS DA ETAPA DE PREPARAÇÃO TABELA 6: IDENTIFICAÇÃO E ANÁLISE DE PERIGOS DA ETAPA DE CONFEÇÃO DO RECHEIO E DA MASSA TABELA 7: IDENTIFICAÇÃO E ANÁLISE DE PERIGOS DA ETAPA DE COMBINAÇÃO DO RECHEIO COM A MASSA TABELA 8: IDENTIFICAÇÃO E ANÁLISE DE PERIGOS DA ETAPA DE PANAR TABELA 9: IDENTIFICAÇÃO E ANÁLISE DE PERIGOS DA ETAPA DE ARMAZENAMENTO EM ULTRACONGELAÇÃO TABELA 10: IDENTIFICAÇÃO E ANÁLISE DE PERIGOS DA ETAPA DE FRITURA TABELA 11: MONITORIZAÇÃO DO PCC1 (FRITURA) TABELA 12: MÉDIAS (± DESVIO PADRÃO) PARA AS CONTAGENS DE MICRORGANISMOS, EXPRESSOS EM LOG (UFC/G), OBTIDOS NOS DIFERENTES INGREDIENTES E PROCESSO FINAL DOS PASTÉIS SALGADOS DE PEIXE NO ESTABELECIMENTO A TABELA 13: MÉDIAS (± DESVIO PADRÃO) PARA AS CONTAGENS DE MICRORGANISMOS, EXPRESSOS EM LOG (UFC/G), OBTIDOS NOS DIFERENTES INGREDIENTES E NO PRODUTO FINAL DOS PASTÉIS SAGADOS DE PEIXE NO ESTABELECIMENTO B TABELA 14: MÉDIAS (± DESVIO PADRÃO) PARA AS CONTAGENS DE MICRORGANISMOS, EXPRESSOS EM LOG (UFC/G), OBTIDOS NOS DIFERENTES INGREDIENTES NA CONFEÇÃO DOS PASTÉIS SALGADOS DE CARNE NO ESTABELECIMENTO A TABELA 15: MÉDIAS (± DESVIO PADRÃO) PARA AS CONTAGENS DE MICRORGANISMOS, EXPRESSOS EM LOG (LOG UFC/G), OBTIDOS NOS DIFERENTES INGREDIENTES E PRODUTO FINAL DOS PASTÉIS SALGADOS DE CARNE NO ESTABELECIMENTO B TABELA 16: TEORES DE PSICROTRÓFICOS (MÉDIA±DESVIO PADRÃO) OBTIDOS PARA OS PASTÉIS SALGADOS DE PEIXE (P1) E DE CARNE (P2) NO ESTABELECIMENTO A (EA) E B (EB) AO LONGO DO TEMPO DE ARMAZENAMENTO EM CONGELAÇÃO TABELA 17: TEORES DE COLIFORMES (MÉDIA±DESVIO PADRÃO) OBTIDOS PARA OS PASTÉIS SALGADOS DE PEIXE (P1) E DE CARNE (P2) NO ESTABELECIMENTO A (EA) E B (EB) AO LONGO DO TEMPO DE ARMAZENAMENTO EM CONGELAÇÃO TABELA 18: TEORES DE MESÓFILOS (MÉDIA±DESVIO PADRÃO) OBTIDOS PARA OS PASTÉIS SALGADOS DE PEIXE (P1) E DE CARNE (P2) NO ESTABELECIMENTO A (EA) E B (EB) AO LONGO DO TEMPO DE ARMAZENAMENTO EM CONGELAÇÃO VIII

13 TABELA 19: TEORES DE FUNGOS (MÉDIA±DESVIO PADRÃO) OBTIDOS PARA OS PASTÉIS SALGADOS DE PEIXE (P1) E DE CARNE (P2) NO ESTABELECIMENTO A (EA) E B (EB) AO LONGO DO TEMPO DE ARMAZENAMENTO EM CONGELAÇÃO TABELA 20: TEORES DE PSEUDOMONAS SPP. (MÉDIA±DESVIO PADRÃO) OBTIDOS PARA OS PASTÉIS SALGADOS DE PEIXE (P1) E DE CARNE (P2) NO ESTABELECIMENTO A (EA) E B (EB) AO LONGO DO TEMPO DE ARMAZENAMENTO EM CONGELAÇÃO TABELA 21: TEORES DE ENTEROBACTERIACEAE (MÉDIA±DESVIO PADRÃO) OBTIDOS PARA OS PASTÉIS SALGADOS DE PEIXE (P1) E DE CARNE (P2) NO ESTABELECIMENTO A (EA) E B (E2) AO LONGO DO TEMPO DE ARMAZENAMENTO EM CONGELAÇÃO TABELA 22: TEORES DE BACTÉRIAS DO ÁCIDO LÁTICO (MÉDIA±DESVIO PADRÃO) OBTIDOS PARA OS PASTÉIS SALGADOS DE PEIXE (P1) E DE CARNE (P2) NO ESTABELECIMENTO A (EA) E B (EB) AO LONGO DO TEMPO DE ARMAZENAMENTO EM CONGELAÇÃO Índice de Gráficos GRÁFICO 1: TEORES MICROBIOLÓGICOS DE BAL EM LOG (UFC/G) NAS DIFERENTES MATÉRIAS- PRIMAS E PRODUTO FINAL POR LOTE DE PASTÉIS SALGADOS DE PEIXE E ESTABELECIMENTO A E B GRÁFICO 2: TEORES MICROBIOLÓGICOS DE BAL EM LOG (UFC/G) NAS DIFERENTES MATÉRIAS- PRIMAS E PRODUTO FINAL POR LOTE DE PASTÉIS SALGADOS DE CARNE E ESTABELECIMENTO A E B GRÁFICO 3: TEORES MICROBIOLÓGICOS DE PSEUDOMONAS SPP. EM LOG (UFC/G) NAS DIFERENTES MATÉRIAS-PRIMAS E PRODUTO FINAL POR LOTE DE PASTÉIS SALGADOS DE PEIXE E ESTABELECIMENTO A E B GRÁFICO 4: TEORES MICROBIOLÓGICOS DE PSEUDOMONAS SPP. EM LOG (UFC/G) NAS DIFERENTES MATÉRIAS-PRIMAS E PRODUTO FINAL POR LOTE DE PASTÉIS SALGADOS DE CARNE E ESTABELECIMENTO A E B GRÁFICO 5: TEORES MICROBIOLÓGICOS DE ENTEROBACTERIACEAE EM LOG (UFC/G) NAS DIFERENTES MATÉRIAS-PRIMAS E PRODUTO FINAL POR LOTE DE PASTÉIS SALGADOS DE PEIXE E ESTABELECIMENTO A E B GRÁFICO 6: TEORES MICROBIOLÓGICOS DE ENTEROBACTERIACEAE EM LOG (UFC/G) NAS DIFERENTES MATÉRIAS-PRIMAS E PRODUTO FINAL E PRODUTO FINAL POR LOTE DE PASTÉIS SALGADOS DE CARNE E ESTABELECIMENTO A E B GRÁFICO 7: TEORES MICROBIOLÓGICOS DE COLIFORMES TOTAIS EM LOG (UFC/G) NAS DIFERENTES MATÉRIAS-PRIMAS E PRODUTO FINAL POR LOTE DE PASTÉIS SALGADOS DE PEIXE E ESTABELECIMENTO A E B IX

14 GRÁFICO 8: TEORES MICROBIOLÓGICOS DE COLIFORMES TOTAIS EM LOG (UFC/G) NAS DIFERENTES MATÉRIAS-PRIMAS E PRODUTO FINAL POR LOTE DE PASTÉIS SALGADOS DE CARNE E ESTABELECIMENTO A E B GRÁFICO 9: TEORES MICROBIOLÓGICOS DE MESÓFILOS EM LOG (UFC/G) NAS DIFERENTES MATÉRIAS-PRIMAS E PRODUTO FINAL POR LOTE DE PASTÉIS SALGADOS DE PEIXE E ESTABELECIMENTO A E B GRÁFICO 10: TEORES MICROBIOLÓGICOS DE MESÓFILOS EM LOG (UFC/G) NAS DIFERENTES MATÉRIAS-PRIMAS E PRODUTO FINAL POR LOTE DE PASTÉIS SALGADOS DE CARNE E ESTABELECIMENTO A E B GRÁFICO 11: TEORES MICROBIOLÓGICOS DE FUNGOS EM LOG (UFC/G) NAS DIFERENTES MATÉRIAS-PRIMAS E PRODUTO FINAL POR LOTE DE PASTÉIS SALGADOS DE PEIXE E ESTABELECIMENTO A E B GRÁFICO 12: TEORES MICROBIOLÓGICOS DE FUNGOS EM LOG (UFC/G) NAS DIFERENTES MATÉRIAS-PRIMAS POR LOTE DE PASTÉIS SALGADOS DE CARNE ESTABELECIMENTO A E B GRÁFICO 13: TEORES DE PSICROTRÓFICOS EM LOG (UFC/G) NAS DIFERENTES MATÉRIAS- PRIMAS E PRODUTO FINAL POR LOTE DE PASTÉIS SALGADOS DE PEIXE E ESTABELECIMENTO A E B GRÁFICO 14: TEORES DE PSICROTRÓFICOS EM LOG (UFC/G) NAS DIFERENTES MATÉRIAS- PRIMAS E PRODUTO FINAL POR LOTE DE PASTÉIS SALGADOS DE CARNE E ESTABELECIMENTO A E B GRÁFICO 15: TEORES DE BACILLUS CEREUS EM LOG (UFC/G) NAS DIFERENTES MATÉRIAS- PRIMAS E PRODUTO FINAL POR LOTE DE PASTÉIS SALGADOS DE PEIXE E ESTABELECIMENTO A E B GRÁFICO 16: TEORES DE BACILLUS CEREUS EM LOG (UFC/G) NAS DIFERENTES MATÉRIAS- PRIMAS E PRODUTO FINAL POR LOTE DE PASTÉIS SALGADOS DE CARNE E ESTABELECIMENTO A E B GRÁFICO 17: TEORES DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EM LOG (UFC/G) NAS DIFERENTES MATÉRIAS-PRIMAS POR LOTE DE PASTÉIS SALGADOS DE PEIXE E ESTABELECIMENTO A E B GRÁFICO 18: TEORES DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EM LOG (UFC/G) NAS DIFERENTES MATÉRIAS-PRIMAS E PRODUTO FINAL POR LOTE DE PASTÉIS SALGADOS DE CARNE E ESTABELECIMENTO A E B GRÁFICO 19: TEORES DE ESCHERICHIA COLI EM LOG UFC/G NAS DIFERENTES MATÉRIAS- PRIMAS E PRODUTO FINAL POR LOTE DE PASTÉIS SALGADOS DE CARNE E ESTABELECIMENTO A E B GRÁFICO 20. TEORES MICROBIOLÓGICOS DE LISTERIA MONOCYTOGENES EM LOG (UFC/G) NAS DIFERENTES MATÉRIAS-PRIMAS E PRODUTO FINAL POR LOTE DE PASTÉIS SALGADOS DE PEIXE E ESTABELECIMENTO A E B X

15 GRÁFICO 21: TEORES MICROBIOLÓGICOS DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS EM LOG (UFC/G) NAS MATÉRIAS-PRIMAS E PRODUTO FINAL POR LOTE DE PASTÉIS SALGADOS DE PEIXE E ESTABELECIMENTO A E B GRÁFICO 22: TEORES MICROBIOLÓGICOS DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS EM LOG (UFC/G) NAS MATÉRIAS-PRIMAS E PRODUTO FINAL POR LOTE DE PASTÉIS SALGADOS DE PEIXE E ESTABELECIMENTO A E B GRÁFICO 23: TEMPO E TEMPERATURA MEDIDA NA CONFEÇÃO DOS RECHEIOS DE CARNE E DE PEIXE GRÁFICO 24: TEMPO E TEMPERATURA MEDIDA NA CONFEÇÃO DOS RECHEIOS DE CARNE E DE PEIXE GRÁFICO 25: TEORES MICROBIOLÓGICOS DOS PASTÉIS SALGADOS DE PEIXE ANTES E APÓS O PROCESSO DE FRITURA GRÁFICO 26: TEORES MICROBIOLÓGICOS DOS PASTÉIS SALGADOS DE CARNE ANTES E APÓS O PROCESSO DE FRITURA GRÁFICO 27: TEORES MICROBIOLÓGICOS NO PRODUTO FINAL DE PEIXE CONFECIONADOS NO ESTABELECIMENTO UNIVERSITÁRIO A, APÓS CONFEÇÃO E NO 1º, 2º, 3º E 4º MÊS DE CONGELAÇÃO GRÁFICO 28: TEORES MICROBIOLÓGICOS NO PRODUTO FINAL DE CARNE CONFECIONADOS NO ESTABELECIMENTO UNIVERSITÁRIO A, APÓS CONFEÇÃO E NO 1º, 2º, 3º E 4º MÊS DE CONGELAÇÃO GRÁFICO 29: TEORES MICROBIOLÓGICOS NO PRODUTO FINAL DE PEIXE CONFECIONADOS NO ESTABELECIMENTO UNIVERSITÁRIO B, APÓS CONFEÇÃO E NO 1º, 2º, 3º E 4º MÊS DE CONGELAÇÃO GRÁFICO 30: TEORES MICROBIOLÓGICOS NO PRODUTO FINAL DE CARNE CONFECIONADOS NO ESTABELECIMENTO UNIVERSITÁRIO B, APÓS CONFEÇÃO E NO 1º, 2º, 3º E 4º MÊS DE CONGELAÇÃO Índice de Quadros QUADRO 1. VALORES GUIA PARA AVALIAÇÃO DA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DE ALIMENTOS COZINHADOS PRONTOS A COMER Índice de Figuras FIG 1. ÁRVORE DE DECISÃO COM A DETERMINAÇÃO DOS PCC, FIG 2. FLUXOGRAMA COM O DIAGRAMA DE FABRICO DE PASTÉIS SALGADOS DE CARNE E PEIXE XI

16 Resumo Os pastéis salgados de carne e de peixe constituem um alimento pronto a comer bastante apreciado pelo consumidor e muito utilizado em unidades de restauração, incluindo cantinas universitárias e catering. Devem ter-se cuidados particulares na preparação e confeção do produto, adotando sempre boas práticas de higiene e de fabrico, bem como a implementação de um sistema HACCP. Este trabalho teve como objetivos a identificação de perigos e a determinação dos Pontos Críticos de Controlo (PCC) durante processo de fabrico dos pastéis salgados de carne e de peixe; a avaliação das caraterísticas microbiológicas das matéria-primas utilizadas (peixe cru, peixe cozido, peixe desfiado, recheio de peixe, salsa, pão ralado, ovo, carne crua, recheio de carne) na sua elaboração e do produto final antes e após o processo de fritura; o controlo do binómio tempo e temperatura para a confeção dos recheios e da fritura e, ainda as caraterísticas microbiológicas do produto final armazenado em congelação ao longo de 4 meses. Para tal, foram utilizados 6 lotes de pastéis salgados de carne e 6 lotes de pastéis salgados de peixe, provenientes de duas cantinas universitárias. Após recolha e acondicionamento em sacos estéreis, as amostras foram transportadas em sistema de refrigeração para o laboratório e de seguida efetuadas as respetivas análises microbiológicas. No caso do estudo do produto final congelado, as amostras foram mantidas em congelação (-18ºC) e analisadas mês a mês durante 4 meses. Em todas as amostras, procedeu-se à pesquisa de Salmonella spp., Listeria monocytogeneses e Staphylococcus coagulase positiva e, contagem de microrganismos aeróbios totais a 30 ºC, BAL, Pseudomonas spp., bolores e leveduras, coliformes totais, Enterobacteriaceae, Escherichia coli, Bacillus cereus e Clostridium spp. e Clostridium perfringens. Após o levantamento de perigos e determinação de PCC, foi considerado um PCC na etapa de fritura, sendo esta apontada como etapa de processamento a controlar. Os resultados deste trabalho revelaram que contagem de microrganismos mesófilos e psicrotróficos, BAL, Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp. e fungos nos ingredientes utilizados para a elaboração dos pastéis salgados foram nitidamente mais elevados na salsa, atingindo teores de microrganismos psicrotróficos de 6,65 log (ufc/g), possivelmente devido à sua incorreta higienização. No pão ralado os teores de mesófilos atingiram 5,48 log (ufc/g); na carne crua valores de 5,10 log (ufc/g) foram obtidos para as contagens de psicrotróficos e no peixe cru valores de 5,03 log (ufc/g) foram obtidos nas contagens de mesófilos. Em algunas matérias-primas foram detetados a presença de microrganismos patogénicos, com teores médios de Bacillus cereus no ovo, na salsa e no produto final de peixe de 0,33 log (ufc/g); Staphylococcus aureus coagulase positiva no produto final de peixe e de carne, na carne crua e na salsa com valores médios de 0,63 log (ufc/g), 0,65 log (ufc/g) e 0,53 log (ufc/g) respetivamente; Escherichia coli foi detetada no produto final de carne com teores médios de 0,91 log (ufc/g); Clostridium perfringens foi detetada no ovo e na salsa com valores médios de 0,33 e 0,59 log 1

17 (ufc/g) respetivamente. O peixe cru apresentou teores médios de Listeria monocytogenes de 0,75 log (ufc/g). Na confeção dos recheios para os pastéis de peixe e de carne foi efectuado o registo de temperaturas, que verificámos serem superiores a 75 ºC durante 20 minutos; por sua vez, no processo de fritura, registou-se uma temperatura interna de confeção de 75 C durante pelo menos 2 minutos. O recheio de carne após confeção obtiveram-se teores de mesófilos de 1,71 e 1,76 log (ufc/g), enquanto que no recheio de peixe detetaram-se teores de Enterobacteriaceae de 1,10 e 1,23 log (ufc/g), indicando que a confeção do recheio não foi eficaz na destruição da totalidade dos microrganismos presentes. Contudo no produto final frito, obteve-se em geral ausência de microrganismos deteriorativos e ausência total de microrganismos patogénicos em unidade logaritimica de ordem 1.Os teores microbiológicos no fim de cada mês ao longo dos 4 meses de congelação, mantiveram mais ou menos constante, considerando-se as suas caraterísticas microbiológicas satisfatórias, pelo que julgamos que deverá ser permitida uma vida útil de armazenamento em congelação de pelo menos 4 meses. No geral, os pastéis salgados apresentaram uma boa qualidade microbiológica, cumprindo os critérios microbiológicos estabelecidos no Regulamento (CE) nº 2073/2005 e nos Valores Guia de Santos et al. (2005), no entanto algumas etapas da sua confeção podem e devem ser melhoradas. A segurança dos produtos alimentares é então garantida pela implementação de medidas preventivas, tais como o cumprimento de Boas Práticas de Fabrico e a aplicação do Sistema de Identificação de Perigos e Pontos Críticos de Controlo (HACCP), constituindo as análises microbiológicas uma parte do sistema. Palavras-chave: Pastéis salgados, controlo microbiológico, PCC, HACCP, temperatura, deterioração. 2

18 Abstract The savory meat and fish pastries are a ready to eat food very appreciated by the consumer and widely used in restoration units, including university canteens and catering. It should be taken particular care in its preparation and confection, always adopting good hygiene practices and manufacturing, as well as the implementation of a HACCP system. The main aims of this study are the identification of hazards and evaluation of the Critical Control Points (CCP) during the process of manufacture; the evaluation of the microbiological characteristics of each ingredient (raw fish, cooked fish, shredded fish, fish stuffing, parsley, breadcrumbs, eggs, raw meat, meat stuffing, pie) used in its preparation, as well as the microbiological quality of the product before and after the frying process; the control of the binomial time and temperature for the confection of fillings and frying, and also the microbiological characteristics of the final product stored in a freezer over 4 months. For that, were used 6 lots of meat savory pastries and 6 lots of fish savory pastries from two university canteens. After collecting in sterile bags, samples were transported in cooling system for the laboratory and then were made the respective microbiological analyzes. For the study of the frozen end product, the samples were kept frozen (-18 C) and analyzed at monthly intervals during 4 months. In all samples, were realized the analysis of Salmonella sp., Listeria monocytogenes and Staphylococcus coagulase positive and total of aerobic counts to 30 º C, lactic acid bacteria, Pseudomonas spp., yeast and molds, total coliforms, Enterobacteriaceae, Escherichia coli, Bacillus cereus, and Clostridium spp. and Clostridium perfringens. PCC were considered by key step in deep frying, which are indicated as processing step to control. The results of this study revealed that counts of mesophilic and psychrotrophic, BAL, Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp. and fungi in the ingredients used in the preparation of savory pastries were considerably higher in parsley, reaching levels of psychrotrophic of 6.65 log (cfu/g), possibly due to its improper hygiene. In breadcrumbs contents of mesophilic reached 5.48 log (cfu/g) in 5.10 values raw meat log (cfu/g) were obtained for the psychrotrophic population and fish raw values of 5.03 log (cfu/g) were obtained in Mesophilic microorganisms. In some ingredients were detected the presence of pathogenic microorganisms, at levels ranging from Bacillus cereus in egg, parsley and final product of fish of 0.33 log (cfu/g); coagulase-positive Staphylococcus aureus in the final product of fish and meat in raw meat and parsley with average values of 0.63 log (cfu/g), 0.65 log (cfu/g), 0.62 and 0.53 log (cfu/g) respectively; Escherichia coli was detected in the final 3

19 product of meat with average grades of 0.91 log (cfu/g), Clostridium perfringens was detected in egg and parsley with average values of 0.33 and 0.59 log (cfu/g) and 0.59 log (cfu/g) respectively. In forcemeat confection was obtained after concentration of mesophilic 1.71 and 1.76 log (cfu/g) whereas the filling of fish was sensed Enterobacteriaceae contents of 1.10 and 1.23 log (cfu/g), indicating that the confection of the filling was not effective in the destruction of all microorganisms. However in the final fried product, generally were obtained the absence of microorganisms of spoilage and total absence of pathogenic organisms in the order of 1 logarithmic unit. The microbiological levels at the end of each month over 4 months of freezing remained more or less constant, considering its microbiological characteristics satisfactory and it should be allowed to judge that a shelf life in frozen storage for at least 4 months.in general, savory pastries had a good microbiological quality, meeting the criteria set out in Regulation (EC) No 2073/ 2005 and according guide levels indicated by Santos et al (2005), however some of its confection steps can and should be improved. The safety of food is then ensured by the implementation of preventive measures, such as compliance with Good Manufacturing Practice and Identification System of Hazards and Critical Control Points (HACCP), constituting the microbiological analysis a part of the system. Keywords: Pastels salted, microbiological control, PCC, HACCP, spoilage. 4

20 I. INTRODUÇÃO 5

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22 I. Introdução A evolução das sociedades permitiu uma oferta de géneros alimentícios cada vez mais diversificados e sujeitos a um processamento cada vez mais intenso, verificando-se uma crescente preocupação do consumidor com a segurança dos alimentos que consome, de modo a salvaguardar a sua saúde (ICMSF, 2006). Os operadores económicos e as entidades fiscalizadoras têm ao seu dispor vários suportes legais que regulam e orientam para a verificação e o controlo dos processos de fabrico dos alimentos, de forma a garantir a obtenção de produtos seguros e a estabelecer a confiança dos consumidores nos produtos alimentares adquiridos. A análise microbiológica dos produtos alimentares tem um importante papel neste âmbito, uma vez que o seu objetivo primordial consiste em detetar a presença de microrganismos patogénicos e/ou de suas toxinas em alimentos que constituam um risco para a saúde dos consumidores. Contudo, do ponto de vista industrial, outras razões devem ser considerados, nomeadamente a estimativa da vida de prateleira do produto, a avaliação da qualidade da matéria-prima e a determinação da via de contaminação nas linhas de processamento (Mossel et al., 1995). A maioria dos surtos de toxinfeções de origem alimentar têm como principal causa a negligência durante a preparação e confeção de alimentos em empresas do setor alimentar, cantinas, residências e outros locais onde os alimentos são preparados para consumo humano. Os pastéis salgados de carne e de peixe estão inseridos no grupo de alimentos prontos a comer, que são muito utilizados em unidades de restauração, incluindo as cantinas universitárias e catering, devendo ter-se cuidados particulares na sua confeção, adotando sempre boas práticas de higiene e de fabrico, bem como a implementação de um sistema de autocontrolo (Jouve et al., 1998). O autocontrolo tem assim como objetivo garantir a segurança dos produtos alimentares, através da implementação de medidas preventivas, tais como o cumprimento de Boas Práticas de Fabrico e a aplicação de um Sistema de Identificação de Perigos e Pontos Críticos de Controlo (HACCP), bem como a realização de análises microbiológicas que constituem uma parte do sistema (Pierson & Corlett, 1992). Neste sentido, este trabalho teve como objetivos: 1) a identificação de perigos e a determinação dos principais Pontos Críticos de Controlo (PCC) durante o seu processo de fabrico; 2) a avaliação das caraterísticas microbiológicas de cada ingrediente (matéria-prima) utilizado na sua elaboração, determinar a qualidade microbiológica dos pastéis salgados de carne e de peixe após confeção, e 3) a avaliação das características microbiológicas de pastéis de carne e de peixe armazenados a temperatura de congelação ao longo de 4 meses. 7

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24 II. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 9

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26 II.1.Segurança de alimentos prontos para o consumo II.1.1. Importância da segurança alimentar A crescente industrialização, aliada a novas técnicas de processamento, assim como a emergência de novos agentes patogénicos, causaram alterações na epidemiologia de doenças de origem alimentar (DOA) (Forsythe, 2002; Jouve et al., 1998). As DOA causadas por agentes patogénicos constituem um problema de saúde pública a nível mundial, cujo controlo tornou-se um dos principais objetivos das sociedades (ICMSF, 2006). O crescente aumento na incidência de algumas doenças transmitidas por alimentos tem sido imputada a diversos fatores, inclusive, o crescimento populacional, rápida urbanização, mudanças nos hábitos de preparação de alimentos, aumento do número de estabelecimentos de serviços alimentares, aumento do consumo de alimentos fora de casa, falta de formação dos manipuladores de alimentos e consumidores para se obterem alimentos seguros, viagens de negócios e lazer, bem como o aumento do poder de compra (Garayoa et al., 2011; Motarjemi et al., 1999). Estas doenças variam de acordo com os diferentes países, pois dependem dos hábitos alimentares, processamento de alimentos, preparação, manipulação, técnicas de armazenamento e sensibilidade da população (ICMSF, 2006). Com a globalização as DOA adquiriram uma nova dimensão devido ao facto de muitos produtos alimentares serem produzidos num país e serem importados e consumidos noutro (Martins & Germano, 2008). Esta evolução das sociedades proporcionou uma oferta de produtos alimentares cada vez mais diversificados e sujeitos a um processamento cada vez mais intenso, verificando-se uma crescente preocupação do consumidor com os alimentos que consome e receio que estes não sejam seguros para a sua saúde (ICMSF, 2006). Deste modo para a salvaguarda da saúde dos consumidores e confiança nos produtos alimentares adquiridos, tornou-se fundamental que os poderes políticos oferecessem garantias da sua salubridade, através de procedimentos de avaliação, regulamentação e controlo cada vez mais apertados (Azevedo, 2000). Ao longo da cadeia alimentar, cada etapa é tendente à contaminação, desde a produção primária de alimentos até este estar pronto para consumo (WHO, 2007). A contaminação alimentar consiste na introdução de um agente biológico, químico ou físico num alimento, ou devido à presença natural de um contaminante não adicionado intencionalmente ao alimento, que podem comprometer a sua segurança (FAO, 1999). As DOA são originadas pela ingestão de produtos contaminados por bactérias patogénicas, fungos, vírus, parasitas ou toxinas 11

27 produzidas por microrganismos (WHO, 2007). As principais fontes na origem de surtos de DOA são os ingredientes contaminados, as contaminações cruzadas, devido a manipulações inadequadas, preparações efetuadas com antecedência, armazenamento à temperatura ambiente, cocção/processamento térmico inadequados, manipuladores infetados e más condições higio-sanitárias (Soares, 2007). Segundo Bean e Griffin (1990) as DOA têm sido associadas com o armazenamento inadequado ou reaquecimento (50%), alimentos armazenados de forma inadequada (45%) e contaminação cruzada (39%). A aplicação de boas práticas de higiene (BPH) e boas práticas de fabrico (BPF), autocontrolo eficaz, formação de produtores, manipuladores e consumidores, bem como um sistema de vigilância são uma forma de evitar ou reduzir os riscos (Soares, 2007). Através da análise de notificações de DOA, constatou-se que a maioria dos surtos são resultado de negligência na confeção de alimentos por parte dos operadores de pequenas empresas do setor alimentar (DTI, 1999), na sua maioria dos retalhistas e restaurantes em particular, definido como 'micro'empresas, uma vez que empregam menos de 10 manipuladores de alimentos (Mortlock et al., 1999). A falta de formação adequada e educação dos manipuladores de alimentos dentro destas empresas podem representar significativos riscos para a saúde pública. Uma boa formação em higiene alimentar é fundamental para a segurança dos alimentos e é uma parte essencial da análise dos perigos e pontos críticos de controlo (HACCP) (Bryan, 1991). Porém não é só o desconhecimento sobre a segurança alimentar, mas também a falta de aplicação do conhecimento adquirido (Bryan, 1988; Ehiri e Morris, 1994). A importância da segurança alimentar nos dias de hoje tem um papel preponderante, um relatório publicado pela EFSA, (2007), mostra que, em 2006, 22 Estados-Membros comunicaram 5710 surtos alimentar que envolveram um total de 53, 568 pessoas, resultando em 5525 internamentos (10,3% de todas as pessoas envolvidas) e 50 mortes (0,1%). Em 2006, Portugal apresentou 13 focos de DOA (0,2% de surtos notificados do total europeu), envolvendo 177 pessoas com 69 internamentos (EFSA, 2007). Em 2008, 25 Estados- Membros comunicaram 5332 surtos alimentares envolvendo pessoas, resultando em 6230 internamentos e 32 mortes (EFSA, 2010). Em 2008, Portugal registou 35 surtos (0,7% de surtos notificados do total europeu), envolvendo 457 pessoas com 272 hospitalizações. Portugal tem uma das menores taxas relatadas de DOA na UE, no entanto, em 2008, tinha a maior proporção entre os casos hospitalizados e notificados (67,6%) em Estados-Membros da UE (EFSA, 2010). Os alimentos e os sistemas de informação da origem dos surtos não estão harmonizados a nível da UE, portanto, diferenças no número e tipo de surtos de DOA entre os 12

28 Estados-Membros não podem ser consideradas como o reflexo exato dos diferentes níveis de segurança alimentar entre os países (EFSA, 2006). Vários países mostraram que as instalações de serviços de restauração coletiva e alimentos são a causa mais frequente de surtos (Adams & Moss, 2008; Todd & Michael et al., 2007). Os dados publicados pela Comissão da EFSA, mostram que, em 2010, 48,7% dos surtos alimentares verificados foram associados com serviços de catering ou cantinas (EFSA, 2010). Também em Portugal, no ano de 2008, dos 11 surtos notificados 9 deles foram associados com serviços de catering e cantinas (EFSA, 2009). Em 2009 a ocorrência de zoonoses e surtos de origem alimentar apresentados por 27 Estados- Membros da União Europeia revelaram que foram notificados casos de salmonelose em humanos. Salmonella sp. presente em alimentos, foi detetada maioritariamente em carnes de aves frescas e carne de porco. Campilobacteriose foi a infeção zoonótica mais frequente com casos humanos, sendo a carne de frango fresca o principal veículo de transmissão deste agente. O número de casos de Listeriose em humanos aumentou 19,1%, comparativamente ao ano de 2008, com 1645 casos em Por sua vez Listeria monocytogenes raramente foi detetada acima do limite de segurança permitido para alimentos pronto a comer. Os Estados-Membros comunicaram 3573 casos associados de Escherichia coli verotoxigénica (VTEC), 7595 casos de Iersiniose e 401 casos de Brucelose em humanos, enquanto as bactérias VTEC foram encontrados principalmente em bovinos e em carne bovina e Yersinia em suínos e carne de porco (EFSA, 2011). Num relatório resumido da União Europeia (UE) sobre a ocorrência de surtos DOA, indica um total de 5550 surtos, com casos humanos, 4356 hospitalizações e 46 mortes, mostrando também que 63,6% das doenças transmitidas por alimentos foram associados com serviço de catering (EFSA, 2009). II.1.2. Boas Práticas de Fabrico e Boas Práticas de Higiene A aplicação de BPH e BPF em empresas do setor alimentar são fundamentais para proteger os consumidores de DOA. Os manipuladores de alimentos devem ter o conhecimento e as competências necessárias que lhes permitam aplicar essas práticas, sendo essas obrigatórias na UE, segundo os regulamentos gerais de higiene (UE, 2004). Em Portugal, na legislação em vigor, nomeadamente o Regulamento (CE) nº 852/2004 relativo à higiene dos géneros alimentícios, refere-se a aplicação geral dos procedimentos baseados nos princípios HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Points Análise de Perigos e Pontos Críticos de 13

29 Controlo). A não aplicação dessas práticas, é considerado falta de conhecimento ou negligência (ASAE, 2007). As BPF referem-se aos princípios, procedimentos e meios fundamentais indispensáveis para fornecer um ambiente adequado para a produção de alimentos com qualidade aceitável. Por outro lado, as BPH descrevem as medidas básicas de higiene que os estabelecimentos devem manter, constituindo os pré-requisitos para outros sistemas, em particular o HACCP, devendo ser sempre aplicadas e documentadas, visto constituírem a base para a produção higiénica de alimentos (Jouve et al., 1998). Uma boa formação é a chave para garantir que os trabalhadores tenham consciência e conhecimento necessário para cumprir as exigências das BPH, embora estes nem sempre resultem numa mudança positiva no comportamento de manipulação de alimentos (Clayton e Peters, 2002). A necessidade de formação dos manipuladores de alimentos é uma parte essencial do conceito HACCP e é assim reconhecida pela legislação da UE (UE, 2004) e por organizações internacionais como a OMS (WHO, 2000). No entanto, estudos recentes têm demonstrado que o nível de conhecimentos, atitudes e práticas dos manipuladores de alimentos precisa ser melhorado (Bas & et al., 2006; Bolton et al., 2008; Gomes-Neves et al., 2007; Marais et al., 2007; Walker et al. Forsythe, 2003). É de extrema importância a existência de um manual de BPF descrevendo como estas são realizadas por cada unidade de processamento com a finalidade de garantir uma melhoria contínua e a avaliação das instalações de processamento. As BPF englobam todas as ações que devem ser realizadas e as condições que devem ser cumpridas, a fim de garantir que a produção de alimentos seguros para o consumo humano (Senai, 2001). A implementação de BPF é um processo contínuo baseado nos conceitos de gestão do ciclo PDCA (Plan, Do, Check and Act). Considerando o ciclo PDCA, a implementação de BPF pode ser dividido em quatro etapas: diagnóstico inicial, definir as tarefas e executar, aplicar as ações corretivas às não-conformidades e reavaliação das ações corretivas implementadas. O diagnóstico inicial e reavaliação de medidas corretivas implementadas são geralmente realizados por auditoria das instalações de processamento, utilizando uma lista de verificação com base na legislação que regulamenta as BPF no país. Os benefícios reais e a eficácia da implementação de BPF para a qualidade e segurança alimentar são avaliados por meio de indicadores. Vários indicadores podem ser usados para avaliar a eficácia da implementação de BPF, tais como indicadores microbiológicos, custos de pré e pós-implementação de BPF, entre outros (Amoa-Awua et al., 2007; Lockis et al., Sant ana, 2011; Martins e Germano, 2008; Santana et al., 2009). 14

30 II.1.3. Legislação Alimentar O código dos alimentos, também designado em Latim como Codex Alimentarius, foi criado em 1963, estabelecido pela Comissão do Codex Alimentarius em conjunto com a Food and Agriculture Organization (FAO) e a World Health Organization (WHO), para assegurar a higiene dos alimentos, consistindo num conjunto de normas alimentares, códigos de boas práticas e princípios gerais. Em 1991, o CAC iniciou a criação de um documento sobre a metodologia HACCP, chamado Guias para Aplicação do Sistema HACCP. O sistema HACCP foi criado com o objetivo de evitar efeitos indesejáveis causados por toxinfeções alimentares e garantir a segurança alimentar para os consumidores. Os seus princípios foram detalhados nas orientações do Codex Alimentarius (CAC, 1997a) e a legislação alimentar da UE incorporou esses princípios no início de 1990, através da Diretiva 93/43/CEE, relativa à higiene dos géneros alimentícios. Esta Diretiva (Regulamento de Higiene Alimentar) tornou obrigatória a adoção do sistema HACCP, com transposição para a legislação nacional pelo Decreto-lei nº67/98 de 18 de Março. O sistema HACCP na UE foi convertido num sistema de autocontrolo que tem como base somente os sete princípios do HACCP. Em 1997, surgiu o livro verde sobre os Princípios Gerais da Legislação Alimentar na UE, que tem como princípios a promoção da comunicação entre fornecedores e consumidores, a necessidade de melhorar a aplicação da lei e a comunicação entre os Estados-Membros sobre práticas de concorrência desleal, adoção de regulamentos sobre livre concorrência, com vista a eliminar as diversidades legais e culturais dos vários países e assim atingir uma total harmonização. Em Janeiro de 2000 publicou-se o Livro Branco sobre Segurança Alimentar, consistindo numa abordagem completamente nova da forma de garantir elevados padrões da segurança alimentar na UE, devido à necessidade de reconquistar a confiança dos consumidores após as sucessivas crises alimentares (Queimada, 2007). No ano de 2002 foram revistos os princípios gerais da legislação alimentar, assim como os procedimentos relativos à segurança dos géneros alimentícios que se aplicam aos alimentos para animais (Regulamento CE nº178/2002), estabelecendo um controlo ao longo de toda a cadeia alimentar, from the farm to the fork (CE, 2004). Em 2004, criaram-se uma série de regulamentos comunitários, nos quais foram reestruturados e atualizados as normas das várias Diretivas criadas entre 1964 e 1994 e posteriormente derrogadas ou alteradas pela Diretiva 2004/41/CE. Nesse pacote legislativo encontra-se o Regulamento (CE) nº852/2004, que estabelece regras gerais destinadas aos operadores das empresas do setor alimentar no que se refere à higiene dos géneros alimentícios, pressupondo a adoção dos princípios da análise dos perigos e do 15

31 controlo dos pontos críticos. O Regulamento (CE) nº853/2004 estabelece regras específicas para os operadores relativamente à higiene dos géneros alimentícios de origem animal, complementando assim o anterior. O Regulamento (CE) nº854/2004 estabelece regras específicas de organização dos controlos oficiais de produtos de origem animal. O Regulamento (CE) nº882/2004 inclui regras gerais para a realização de controlos oficiais destinados a verificar o cumprimento das normas que apontam a prevenção, eliminação ou redução para níveis aceitáveis dos riscos e a garantia da existência de práticas leais no comércio e a defesa dos consumidores, incluindo a rotulagem (Gomes, 2007). O Regulamento (CE) nº2073/2005 estabelece os critérios microbiológicos para determinados alimentos, informações sobre métodos de colheita de amostras, métodos analíticos e limites microbiológicos, e foi alterado pelo Regulamento (CE) nº1441/2007 relativo a critérios microbiológicos aplicáveis aos géneros alimentícios. II.1.4. Sistema HACCP II Origem, aplicação e vantagens do sistema HACCP O sistema HACCP inicialmente teve origem na questão da segurança microbiológica dos alimentos que eram fornecidos ao programa espacial. Este sistema foi originalmente desenvolvido pela Pilsbury Company, em colaboração com a NASA e os laboratórios do Exército dos EUA. O conceito de Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controlo (HACCP) para a segurança alimentar, requer o controlo sobre perigos materiais e/ou outras substâncias nos alimentos que os tornam prejudiciais para a a saúde pública. O foco principal da estratégia é o controlo e eliminação de perigos biológicos, químicos e físicos (Keener, 2001). O sistema HACCP assenta na aplicação de boas práticas, designadas também como programa de pré-requisitos, com vista a controlar os perigos associados com a envolvente à unidade de restauração, assegurando condições ambientais e operacionais básicas, essenciais à produção de alimentos seguros. Por outro lado o sistema HACCP visa o controlo de perigos diretamente associados com o processo produtivo (FAO, 2001). Nos programas de pré-requisitos, básicos, operacionais e funcionais, associados com a envolvente do estabelecimento de restauração, são necessários requisitos para um sistema HACCP eficaz (Notermans et al.,1998; Bolton et al., 2004) tais como: Instalações e equipamentos; Higiene e saúde do pessoal; 16

32 Manipulação segura; Gestão de resíduos; Limpeza e desinfeção; Qualidade da água; Manutenção da cadeia de frio; Controlo de pragas; Controlo de fornecedores; Controlo à receção; Formação; Seleção de fornecedores; Boas Práticas de Fabrico; Embalagem e rotulagem; Rastreabilidade e procedimentos de retirada do mercado. O sistema HACCP aplica-se à gestão da segurança alimentar, utilizando uma abordagem de controlo de pontos críticos na manipulação de alimentos (FAO, 1998), focando-se na identificação e controlo das etapas do processo de fabrico que afetam mais significativamente a segurança alimentar dos alimentos produzidos. A especificação de limites críticos de controlo, utilizados para garantir que o perigo é eliminado e/ou reduzido a níveis aceitáveis, constitui uma parte importante do HACCP (Gaze et al., 2002). Este sistema também produz outros benefícios da sua aplicação, tais como o uso eficaz dos recursos e a resposta rápida a problemas de segurança alimentar. Por outro lado a aplicação deste sistema pode resultar numa gestão de riscos mais centrado pelas autoridades reguladoras de controlo de alimentos, podendo assim promover o comércio internacional e, consequentemente aumentar a confiança do consumidor em termos de segurança alimentar (FAO, 1998). Sendo assim, o sistema HACCP é um instrumento para ajudar os operadores do setor alimentar a atingir um alto padrão de segurança alimentar. Além disso, os requisitos do sistema HACCP deverão tomar em consideração os sete princípios contidos no Codex Alimentarius. Os Princípios do Codex Alimentarius Gerais de Higiene Alimentar estabelecem uma base firme para garantir o controlo eficaz dos alimentos e higiene alimentar em toda cadeia alimentar desde a produção primária até o consumidor, sendo fundamental o controlo da higiene em cada fase (FAO, 1998). 17

33 A aplicação bem-sucedida do HACCP requer o total comprometimento e envolvimento da gestão e dos trabalhadores. A abordagem HACCP é reconhecida internacionalmente como sendo eficaz em assegurar a segurança e adequação dos alimentos para consumo humano e no comércio internacional. A implementação do sistema HACCP em cada país permite que a sua indústria de exportação de alimentos possa cumprir a exigência recentemente adotada por alguns países importadores relacionada com a garantia da aplicação do HACCP para produtos alimentares (FAO, 1998). Princípios do HACCP O sistema de segurança HACCP, ou Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controlo é um sistema composto por sete princípios (FAO, 1998). Princípio 1: efetuar uma análise dos perigos; Princípio 2: determinar os pontos de controlo críticos (PCC); Princípio 3: estabelecer limites críticos de controlo; Princípio 4: estabelecer um sistema para monitorização do controlo dos PCC; Princípio 5: estabelecer a ação corretiva a efetuar quando a monitorização indica que um PCC em particular está fora de controlo; Princípio 6: estabelecer procedimentos de verificação para confirmar que o sistema HACCP funciona eficazmente; Princípio 7: estabelecer documentação relativa a todos os procedimentos e registos apropriados para os princípios enunciados. II Etapas preliminares para posterior elaboração de um sistema HACCP Na elaboração de um plano HACCP apropriado e eficaz é necessário passar por 14 etapas. Estas etapas podem ser agrupadas em três conjuntos diferentes, tais como, etapas preliminares, aplicação dos princípios HACCP e revisão do sistema. Em seguida de forma continuada é necessária a manutenção do sistema HACCP implementado de forma continuada. (MDN, 2003). 1ª Etapa: Seleção da equipa de HACCP Para o desenvolvimento de um plano HACCP eficaz é necessário a compreensão do conceito HACCP bem como os benefícios do sistema e custos associados. A equipa HACCP a ser constituída deverá ser multidisciplinar, limitar o estudo a um processo ou produto específico, deve descrever qual o segmento da cadeia alimentar que está envolvido e as classes gerais de perigos a abordar (FAO, 1998; CAC, 2003). 18

34 2ª Etapa: Descrição do produto A descrição do produto deve ser completa e elaborada, abrangendo todas as informações de segurança pertinentes, como a composição físico/química (a w, ph, entre outras), condições de durabilidade, embalagem e armazenamento e método de distribuição (FAO, 1998; CAC, 2003). 3ª Etapa: Identificação e uso pretendido O uso pretendido deve ter como base as expectativas de utilização por parte do consumidor, sendo importante nesta etapa a identificação dos potenciais consumidores do produto. Em casos específicos, os grupos mais vulneráveis da população, por exemplo, instituições de solidariedade e hospitais, pode ter que ser considerado (FAO, 1998; CAC, 2003). 4ª Etapa: Elaboração do fluxograma A elaboração do fluxograma deve ser efetuada pela equipa de HACCP, esta deve abranger todas as etapas da operação. Na aplicação do HACCP a uma dada etapa, deve-se ter em conta as etapas anteriores e posteriores à etapa específica (FAO, 1998; CAC, 2003). 5ª Etapa: Verificação do fluxograma A equipa HACCP deve fazer a verificação in loco do fluxograma e garantir que está completamente ajustado à realidade, sendo o mais completo possível e proceder à sua alteração sempre que necessário (FAO, 1998). A confirmação do diagrama de fluxo deve ser realizado por uma pessoa ou pessoas com conhecimento suficiente da operação de processamento (CAC, 2003). 6ª Etapa: Identificação dos perigos potenciais associados a cada etapa, realizar uma análise de riscos, e considerar todas as medidas para controlar perigos identificados (Princípio 1) Todos os perigos que podem ser esperados em cada etapa da produção primária, transformação, fabrico e distribuição até ao ponto de consumo devem ser identificados pela equipa HACCP. Posteriormente a equipa HACCP deverá proceder a uma análise de risco para identificar os riscos que devem ser eliminados ou reduzidos a níveis aceitáveis, sendo essenciais para a produção de um alimento seguro (CAC, 2003). A análise de risco, na sua realização deve sempre que possível, incluir: a provável ocorrência de perigos e a gravidade dos seus efeitos prejudiciais á saúde, classificados como moderado, tolerável e intolerável; procedimentos de avaliação qualitativa e/ou quantitativa da presença de perigos; a multiplicação ou a sobrevivência de microrganismos de interesse; produção ou persistência nos alimentos de toxinas, agentes químicos ou físicos e condições que levaram ao anterior. As 19

35 medidas de controlo devem ser consideradas e se já existirem, estas devem ser aplicadas pela equipa de HACCP a cada perigo, podendo ser necessária a aplicação de mais que uma medida de controlo para controlar um perigo(s) específico(s) e mais do que um perigo pode ser controlado através de uma medida de controlo específica (FAO, 1998). 7ª Etapa: Determinação dos Pontos Críticos de Controlo (Princípio 2) A árvore de decisão elaborada pelo Codex (figura 1) tem sido útil para explicar a lógica e a profundidade de compreensão necessária para determinar os PCC. Esta não é específica para todas as operações de alimentação, por exemplo, abate, e, por isso deve ser usadas em conjunto com profissionais, e modificadas em alguns casos. A determinação dos PCC é um procedimento no processamento de alimentos que tem como objetivo o seu controlo, de modo a prevenir, eliminar e / ou reduzir para um nível aceitável o perigo de um determinado alimento que põe em risco a compromete a sua segurança (Bolton et al., 2008) Pode haver mais do que um PCC, cujo controlo é aplicado para tratar o mesmo perigo. A aplicação de uma árvore de decisão deve ser flexível, dependendo do tipo de operação (abate, produção, processamento, armazenamento, distribuição ou outra), sendo utilizada para orientação ao determinar um PCC (FAO, 1998). A determinação dos PCC é efetuada através da resposta às questões da árvore de decisão e de acordo com as recomendações do Codex Alimentarius, estas devem ser respondidas para cada perigo, em cada etapa do processo. 20

36 Q1: Existem medidas preventivas para o perigo identificado? Modificação da fase ou etapa do processo Sim Não O controlo nesta fase é necessário para a segurança do produto? Sim Q2: Esta etapa foi especificamente concebida para eliminar ou reduzir a probabilidade de ocorrência do perigo para níveis aceitáveis? Não Esta etapa não é um PCC. Não Sim Esta etapa é um PCC. Q3: Pode ocorrer contaminação ou o perigo identificado pode aumentar até níveis inaceitáveis? Sim Não Esta etapa não é um PCC. Q4: Existe alguma fase posterior que possa eliminar ou reduzir o perigo a níveis aceitáveis? Sim Não Esta etapa é um PCC. Esta etapa não é um PCC. Fig 1. Árvore de Decisão com a determinação dos PCC (adaptada de CAC, 1997b). 8ª Etapa: Estabelecimento de limites críticos para cada PCC (Princípio 3) Os limites críticos devem ser especificados e validados, se possível para cada PCC. Em alguns casos mais do que um limite crítico será elaborado em uma determinada etapa. Os critérios que são frequentemente utilizados incluem medições de temperatura, o tempo, o nível de humidade, ph, a w, de cloro disponível, e os parâmetros sensoriais, tais como a aparência visual e textura (FAO, 1998; Bolton e Maunsell, 2004). 21

37 9ª Etapa: Estabelecimento de um sistema de monitorização para cada PCC (Princípio 4) A monitorização é utilizada como medida ou observação programada de um PCC e os seus limites críticos. Esta monitorização deve estar apta para detetar falhas no controlo em determinado PCC, assim como, fornecer a informação a tempo adequado, que permita fazer ajustes que garantam o controlo do processo, evitando a violação dos limites críticos. Tais ajustes devem ser efetuados sempre que possível antecipadamente e quando os resultados de monitorização assinalam uma tendência de perda de controlo de um PCC. A avaliação dos dados obtidos da vigilância devem ser corretamente avaliados por uma pessoa competente e com conhecimentos e autoridade para efetuar as ações corretivas quando indicado. A monitorização quando não é contínua, deve permitir que a quantidade ou a frequência de monitorização sejam suficientes para garantir que o PCC é controlado (FAO, 1998; Bolton e Maunsell, 2004; CAC, 2003). A produção segura de alimentos com base na aplicação dos princípios do HACCP depende da eficácia do controlo e da monitorização dos sistemas implementados em cada um de seus PCC. Assim, obtemos um método disponível para estimar a eficácia do plano HACCP na determinação dos PCC de forma a fornecer uma medida quantitativa da aptidão do plano de HACCP (Dome nech et al., 2008). 10ª Etapa: Estabelecimento de ações corretivas (Princípio 5) As ações corretivas específicas devem ser desenvolvidas para cada PCC no sistema HACCP, a fim de lidar com os desvios quando eles ocorram e estas devem garantir que o PCC está sob controlo. Os procedimentos de desvio devem ser devidamente documentados com manutenção de registos no HACCP (FAO, 1998). 11ª Etapa: Estabelecimento de procedimentos de verificação (Princípio 6) O estabelecimento de procedimentos de verificação, auditoria, métodos, procedimentos e testes, incluindo amostragem aleatória e análise são utilizados para determinar se o sistema HACCP está a funcionar corretamente, assim a frequência da verificação deve ser suficiente para confirmar que o sistema HACCP está a funcionar de forma eficaz. Estas atividades de verificação incluem a revisão do sistema de HACCP e seus registos e dos desvios e destino dos produtos como a confirmação que os PCC estão sob controlo (CAC, 2003). De um modo geral, a verificação é a determinação que o procedimento seja realizado de acordo com o desenho pretendido, ou seja, a verificação é a determinação de que o sistema HACCP está no cumprimento do plano HACCP (FAO, 1998; CAC, 2003). 22

38 12ª Etapa: Estabelecimento de documentação e manutenção de registos (Princípio 7) A manutenção de registos eficientes e precisos é essencial para a aplicação de um sistema HACCP. Os procedimentos do HACCP devem ser devidamente documentados e a manutenção de registos deve ser adequado à natureza e dimensão da operação (FAO, 1998). Como exemplos de documentação podemos considerar a análise dos perigos, a determinação dos PCC e a determinação dos limites críticos. Como exemplos de registos temos as atividades de monitorização do PCC, os desvios e ações corretivas associadas e as modificações do sistema HACCP (CAC, 2003). A última etapa de revisão do sistema HACCP, consiste numa revisão periódica ou extraordinária, sempre que ocorram alterações que a fundamentem, como é o caso de novos produtos ou introdução de novos processos. A validação consiste na determinação de que o plano de HACCP é preciso em todos os seus elementos e que os perigos indicados foram controlados em cada PCC. As atividades de validação devem incluir sempre que possível, ações para confirmar a eficácia de todos os elementos do plano HACCP. Um bom exemplo podem ser os estudos de desafio, ou seja testes microbiológicos usados para provar (validar) que o processo de pasteurização vai eliminar por exemplo a Salmonella em ovoprodutos (Sperber, 1998). II Validação das medidas de controlo O controlo dos perigos potencialmente associados a alimentos envolve a aplicação de medidas de controlo na cadeia alimentar, desde a produção primária, passando pelo processamento, até o consumo. A validação dessas medidas adquirirem importância acrescida. Sendo através deste processo de validação que se demonstra que as medidas de controlo selecionadas são realmente capazes e consistentes de atingir o nível pretendido de controlo dos perigos (FAO/WHO, 2008). A validação segundo o Comitê Consultivo Nacional dos EUA sobre Critérios Microbiológicos para Alimentos (NACMCF) é definida como o elemento de verificação focada na recolha e avaliação de informação científica e técnica para determinar se o plano HACCP é capaz de controlar os riscos, quando este é devidamente implementado (NACMCF, 1998). A frequência da monitorização e onde a monitorização ocorre também é importante ser validado, assim como equipamentos de processamento, dispositivos de monitorização e sistemas de registos eletrónicos com o intuito de garantir que o sistema cumpre com precisão e confiabilidade no controlo dos perigos (NFPA, 2002). É importante fazer uma distinção clara entre o papel da indústria e o papel da autoridade competente para 23

39 validar as medidas de controlo. A indústria é responsável pela validação das medidas de controlo, enquanto a autoridade competente assegura que a indústria tem sistemas eficazes de validação e as medidas de controlo são devidamente validadas. Os governos podem fornecer orientações para a indústria sobre realização de estudos de validação e como as medidas de controlo validadas poderão ser aplicadas. Os governos ou organizações internacionais podem também realizar estudos de validação de apoio a decisões da gestão de risco ou fornecer informações sobre medidas de controlo para serem validadas, especialmente onde os recursos não estão disponíveis para realizar tais estudos. Estas orientações apresentam informações sobre o conceito e natureza da validação, as tarefas antes da validação, o processo de validação, e a necessidade de revalidação. Estas orientações também abordam a diferença entre a monitorização, validação e verificação (FAO/WHO, 2008). II Processo de validação Para validação das medidas de controlo podem ser usados individualmente ou em combinação, as seguintes abordagens conforme apropriado. Referência a publicações científicas A utilização de publicações científicas documentando a eficácia de uma medida de controlo para posterior validação, é uma das abordagens mais usuais (Scott, 2005). Estas publicações podem encontrar-se em diversas fontes, nomeadamente em literatura científica, orientação do governo, BPH e medidas de controlo do sistema HACCP que cumprem os objetivos estipulados e que tenham sido validadas pelas autoridades competentes ou autoridades independentes científicas, normas ou diretrizes internacionais, assim como estudos de métodos de validação da indústria incluindo no fabrico de equipamentos. É importante que seja assegurado que a informação obtida permita que a sua aplicação num sistema de controlo de segurança alimentar seja sólida e viável (FAO/WHO, 2008). Alguns exemplos de publicações que podem ser estudos de validação específicos que avaliam o efeito dos parâmetros no perigo de interesse, são a inativação de microrganismos patogénicos durante um processo térmico como a fritura dos pastéis salgados, o efeito de um composto antimicrobiano sobre a multiplicação de um agente patogénico, o controlo do ph em saladas que pode determinar o crescimento de Listeria monocytogenes num determinado alimento, tendo o processador que garantir o ph desejado e verificar esse valor durante a produção. 24

40 Dados experimentais cientificamente válidos que mostram a adequação das medidas de controlo. A execução de ensaios experimentais cientificamente válidos para documentar a adequação da medida de controlo consiste numa abordagem comum para a validação (Scott, 2005). Estes podem ser testes de desafio de um laboratório no qual imitam as condições do processo e ensaios industriais ou piloto de aspetos particulares de um sistema de processamento de alimentos, como a utilização de ensaios-planta para documentar a deteção ou a remoção de um perigo físico ou químico, também a demonstração quantitativa e registo de redução logarítmica de um agente patogénico específico por um processo de destruição de microrganismo, constitui um exemplo de validação de uma medida de controlo através da utilização de ensaios experimentais (Scott, 2005, FAO/WHO, 2008). Quando ocorre o risco de um perigo associado com a multiplicação do agente patogénico até teores inaceitáveis, existe a necessidade de impedir a multiplicação e revalidado e documentado usando adequadamente ensaios experimentais criados para o efeito, um exemplo é o o controlo da a w de um produto para evitar a multiplicação de Staphylococcus aureus, podendo esta validação ser obtida através da demonstração de que a a w do produto sob as pressupostas condições de armazenamento e distribuição será igual ou menor do que a w estipulada (FAO/WHO, 2008). Por vezes pode ser necessário o cálculo de margens de segurança para explicar a incerteza ou variabilidade da medida de controlo ou uma combinação das medidas de controlo de forma a atingir o nível de controlo desejado (FAO/WHO, 2008). Conhecimento histórico O conhecimento histórico em alguns casos é importante, pois pode servir como a base para a medida de controlo validado, pois não deve ser exigido às empresas que estas mostrem estudos que comprovem a eficácia desses parâmetros do processo (Scott, 2005). Recolha de dados durante condições de funcionamento na operação alimentar Esta abordagem envolve a recolha de dados químicos, biológicos ou físicos relacionados com os perigos a controlar durante o seu funcionamento num determinado período, sendo delineada para demonstrar que uma planta pode rotineiramente atender a parâmetros cientificamente documentados (Scott, 2005). Quando a produção de alimentos é aumentada pode haver a necessidade validar essas medidas o uso de produto acabado e/ou recolha de amostras ambientais e de teste. A amostragem deve basear-se na utilização de técnicas de amostragem apropriadas, os planos de amostragem e metodologia de ensaio. Os dados recolhidos devem ser suficientes para as análises estatísticas necessárias (FAO/WHO, 2008). 25

41 A modelagem matemática. A utilização de modelagem matemática tem como objetivo a integração matemática dos dados científicos sobre o modo como os fatores influenciam o desempenho ou a combinação de medidas de controlo, afetam a sua capacidade para alcançar o resultado pretendido de segurança alimentar. Na indústria são muito utilizados os modelos matemáticos, incluindo os modelos de crescimento de organismos patogénicos ou a utilização de modelos alternativos de valores-z na determinação das condições de processamento térmico. O modelo matemático deve ser corretamente validado, para ser eficiente, o que por pode levar à exigência de testes adicionais. Esta validação deve ter em consideração os limites de incerteza/variabilidade associados com as previsões dos modelos (FAO/WHO, 2008). Também são utilizados os modelos científicos de crescimento e inativação microbiológica, como o Programa de Serviço de Pesquisa Agrícola do USDA de Modelagem de Microrganismos Patogénicos (PMP). Pesquisas. As pesquisas a par com outras abordagens podem ser utilizadas para validar as medidas de controlo, conforme apropriado, demonstrando o nível esperado de como o controlo de perigos pode ser alcançado, um exemplo, é a compreensão e avaliação da informação que consta no rótulo pelos consumidores antes ou durante o desenho do rótulo pode ser considerada uma abordagem de validação para a rotulagem. No entanto, para assegurar que as pesquisas sejam estatisticamente válidas os dados devem ser precisos e adequados e utilizados unicamente por um operador do setor alimentar ou autoridade competente (FAO/WHO, 2008; Scott, 2005). Etapas envolvidas no processo de validação Depois de concluir as tarefas necessárias antes da validação, o processo de validação de medidas de controlo inclui as seguintes etapas: - Decidir sobre a abordagem ou a combinação de abordagens; - Definir os parâmetros e critérios de decisão que irá demonstrar que uma medida de controlo ou a combinação de medidas de controlo, se adequadamente implementado (s), é capaz de controlar de forma consistente o perigo para o resultado especificado. - Reunir informações relevantes de validação e realizar os estudos, quando necessário; - Analisar os resultados; - Documentar e analisar a validação; Os resultados de uma validação, devem assim demonstrar que uma medida de controlo ou a combinação de medidas de controlo, são capazes de controlar o perigo para o resultado especificado se devidamente aplicada, e assim, pode ser implementada, ou não é capaz de 26

42 controlar o perigo para o resultado especificado e não deve ser implementada. Este último pode levar a reavaliação de formulação do produto, os parâmetros do processo, ou outras ações adequadas. A Informação obtida no processo de validação poderá ser útil na conceção de processos de verificação e de controlo. Por exemplo, se uma medida de controlo ou uma combinação das medidas de controlo produz uma redução de um agente patogénico bem em excesso de redução necessária para o controlo de perigo, pode ser possível para diminuir a frequência de, por exemplo, frequência de análises microbiológicas de produto final (FAO/WHO, 2008). II.2. ISO - Organização Internacional de Normalização A ISO é uma federação mundial de organismos nacionais de normalização, que desenvolve Normas Internacionais realizadas por comités técnicos da ISO (AFNOR, 2005). Permite desenvolver e editar normas internacionais, foi criada em 1946, iniciando as suas atividades em 1947 com um Secretariado Central em Genebra, na Suíça, que coordena todo o sistema. A ISO é uma rede dos institutos de normalizações nacionais de 162 países, um membro por país, sendo Portugal representado pelo IPQ (Instituto Português da Qualidade). É uma organização não-governamental que faz uma ponte entre o público e o setor privado, com vários institutos membros que fazem parte da estrutura governamental dos seus países ou são obrigados pelos seus governos. Por outro lado, outros membros têm as suas raízes exclusivamente no setor privado, tendo sido formadas por parcerias nacionais de associações do setor (FAO, 2011). II.2.1. Normas ISO versus Vantagens Uma norma é um documento que fornece requisitos, especificações, diretrizes ou características que podem ser usados para garantir que materiais, produtos, processos e serviços são consistentemente adequados para a sua finalidade. As normas internacionais são ferramentas estratégicas e diretrizes para ajudar as empresas enfrentar alguns dos desafios mais exigentes da economia moderna. Estas visam garantir operações de negócios o mais eficientes possíveis, trazendo benefícios tecnológicos, económicos e sociais. Estas normas ajudam a harmonizar as especificações técnicas de produtos e serviços tornando a indústria mais eficiente. As normas internacionais têm vantagens na economia de custos, ajudando a otimizar operações, a melhorar a qualidade e a aumentar a satisfação do cliente, eliminando as 27

43 barreiras comerciais com abertura dos mercados mundiais, aumentando a produtividade, com vantagens competitivas e reduzindo os impactos negativos que ajudam o meio ambiente. A conformidade com as Normas Internacionais garante a qualidade, os produtos a serem seguros com a eficiência não alusivas para o ambiente, oferecendo assim confiança aos consumidores (ISO, 2009). II.2.2. ISO 22000:2005 A segurança do consumidor quando se trata de regulamentação da segurança alimentar é primordial, contudo, os reguladores precisam realizar avaliações de eliminação de riscos que ponham em causa a segurança alimentar dos consumidores, e as implicações de custo de estratégias de aplicação na indústria, para mitigar os custos ocorridos pela indústria, sem comprometer a segurança do consumidor (Dzifa et al., 2011). O aumento significativo de doenças provocadas por alimentos contaminados em países desenvolvidos e os seus custos associados, fizeram com que houvesse necessidade de criar um padrão, assim a ISO 22000, veio permitir que todos os tipos de organizações envolvidas na produção e obtenção de alimentos, no transporte e armazenamento, operadores e subcontratados para estabelecimentos de serviços de retalho de alimentos em conjunto com produtores de equipamento de embalagem, materiais, agentes de limpeza, aditivos e ingredientes implementassem uma gestão da segurança alimentar ao longo de toda a cadeia alimentar, variando entre produtores de alimentos, Isto resultou num número de países que desenvolveram normas nacionais para o fornecimento de alimentos seguros e empresas individuais e agrupamentos no setor alimentar que desenvolveram os seus próprios padrões ou programas para auditar os seus fornecedores (Frost, 2005). As normas ISO, na sua maioria são verticais, isto é, estritas para um produto, método ou processo em particular. Por outro lado, a norma ISO 22000:2005, à semelhança da norma ISO 9001:2008, é uma norma horizontal, consiste numa norma genérica para sistemas de gestão, que pode ser aplicada a qualquer fase da cadeia alimentar (Magalhães, 2007). De forma a promover a segurança alimentar, foram desenvolvidas um número de normas especificamente para a área alimentar (transformação) em indústrias, no qual a certificação é possível e muitas vezes é exigida pelos retalhistas. Estas incluem o British Retail Consortium global da segurança alimentar (BRC), o International Food Standard (IFS), a Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controlo (HACCP), a Qualidade dos Alimentos Seguros (SQF) 2000 e a 28

44 ISO 22000: A norma BRC foi desenvolvida em 1998, para responder às necessidades dos retalhistas do Reino Unido e os fabricantes de marca, no entanto, o padrão ganhou popularidade a nível mundial (por exemplo, na Europa e América do Norte). O IFS, por outro lado foi elaborado pelo retalhista alemão e francês e associações de grossistas, e os seus homólogos italianos, e tem como objetivo criar um sistema de avaliação consistente para todas as empresas fornecedoras de alimentos. O Programa SQF criado pelo Instituto de Marketing de Alimentos (FMI), combina segurança alimentar e certificação de gestão da qualidade para todos os participantes da cadeia envolvidos na produção e processamento de alimentos. O HACCP foi concebido pelo Conselho Nacional de Peritos holandeses, para especificar os requisitos para sistemas baseados em HACCP. Contudo apesar da diversidade existente de normas, não era possível a utilização de uma certificação única aceite por todas, pelo que a elaboração da norma ISO 22000:2005 veio permitir a resolução desta situação, definindo um conjunto de requisitos para um sistema de gestão da segurança alimentar e, por se tratar de uma norma ISO, com o reconhecimento internacional facilitado face aos outros referenciais nesta matéria (Magalhães, 2006; Oliveira, 2006). A ISO 20000:2005 é um padrão global desenvolvido para harmonizar, a nível global, os requisitos para gestão da segurança alimentar, para as empresas do setor alimentar (além de fabricantes de alimentos) e combina a comunicação interativa, o sistema de gestão da qualidade, os programas de pré-requisitos e princípios HACCP. Esta norma é complementada com os programas pré-requisitos sobre a segurança alimentar para o fabrico de alimentos para formar o novo Sistema de Certificação de Segurança Alimentar (FSSC) para fabricantes de alimentos (Magalhães, 2007). A publicação da ISO 22000:2005 teve como principal objetivo a complementação de uma abordagem global focada na satisfação dos clientes proveniente da ISO 9001:2000 com uma abordagem focada na segurança alimentar dos produtos/serviços fornecidos e não a sua substituição. No entanto, tem-se verificado que algumas organizações têm optado pela substituição da ISO 9001:2000 pela ISO 22000:2005. Uma organização do setor alimentar com um sistema de gestão da qualidade certificado de acordo com a ISO 9001:2000 terá que cumprir com todos os requisitos legais, incluindo os associados à segurança alimentar. Para assegurar o cumprimento destes requisitos dos produtos/serviços, a organização pode optar pela implementação da ISO 22000:2005, assegurando assim a conformidade com a metodologia HACCP (Magalhães, 2007). 29

45 A certificação de um sistema de gestão da segurança alimentar de acordo com a ISO 22000:2005, por um organismo competente, irá confirmar o cumprimento destes requisitos pela organização. A ISO 22000:2005 não é uma norma de certificação do produto, mas sim de certificação de um sistema de gestão focado na segurança alimentar do produto/serviço fornecido. Com a implementação da ISO 22000:2005, uma organização do setor alimentar não pode ignorar que existem requisitos do cliente para além da segurança alimentar. Esses requisitos são identificados pela metodologia de gestão da qualidade da ISO 9001:2000. Com esta norma pretende-se atingir a qualidade da organização, focando os seus esforços na satisfação do cliente. Para isso, todas as áreas da organização deverão estar envolvidas, incluindo as áreas não operacionais, tais como os recursos humanos, a área financeira, os sistemas de informação, entre outras. A abordagem por processos é um dos princípios da ISO 9001:2000. A utilização desta abordagem é também recomendada pela ISO/TS 22004:2005 Food Safety Managment Systems Guidance on the application of ISO 22000:2005. A colaboração de representantes especializados de organizações internacionais e com alguma ajuda da Comissão do Codex Alimentarius, em conjunto estabelecido pelas Nações Unidas, Organização para a Alimentação e a Agricultura (FAO) e Organização Mundial da Saúde (OMS), tem sido fundamental para desenvolver o padrão dentro de ISO por peritos da indústria alimentar (Frost, 2005). A ISO traz assim uma maior facilidade para implementar o HACCP para a higiene alimentar, com uma forma harmonizada, não variando de acordo com o país, alimentos ou produto em causa, para as empresas de todo o mundo. É importante assegurar um bom controlo e uma boa comunicação ao longo de toda a cadeia, já que os alimentos chegam aos consumidores através de cadeias de abastecimento, a que se associam diversos tipos de organizações, bem como prolongar-se através de várias fronteiras, de forma a evitar perigos de segurança alimentar e custos consideráveis para os fornecedores da cadeia de alimentos (Frost, 2005). II.3. Medidas de controlo no processamento e confeção de alimentos O controlo da qualidade microbiológica dos alimentos inclui uma grande quantidade de ciência básica de forma a permitir a compreensão e a resolução dos problemas microbiológicos associados com os alimentos, tais como: a determinação da qualidade microbiológica dos alimentos e dos seus ingredientes usando técnicas apropriadas; a avaliação da microbiota envolvida na deterioração dos alimentos; a identificação da microbiota 30

46 patogénica e suas fontes. Para além disso, o controlo eficiente dos microrganismos deteriorativos e patogénicos em alimentos, depende do desenvolvimento de métodos rápidos para isolar e identificar os agentes envolvidos; de novas tecnologias adaptadas ao processamento de alimentos; da elaboração de procedimentos eficazes de tratamento para controlar a deterioração e problemas de ocorrência de patogénicos em instalações de processamento de alimentos; do uso eficaz de microrganismos desejáveis para a produção de alimentos fermentados e probióticos e o conhecimento de problemas microbiológicos associados a alimentos importados (Ray, 2005). As medidas de controlo têm assim como principal objetivo a destruição dos microrganismos durante o processamento, impedindo a sua multiplicação, usando as condições de armazenamento adequadas através da aplicação de critérios microbiológicos. Uma medida de controlo é qualquer ação e/ou atividade que possa ser utilizada para prevenir ou eliminar um perigo para a segurança alimentar ou reduzi-lo a um nível aceitável (FAO/WHO, 2008). Estas podem ser diferenciadas em três categorias: 1) as que atuam nos níveis iniciais de contaminação microbiológica, cujo controlo pode passar por uma seleção de ingredientes, não utilizando alimentos com uma história de contaminação ou toxicidade, como o leite cru, ou usar critérios microbiológicos para a rejeição de ingredientes ou produtos inaceitáveis; 2) as que reduzem, através da destruição e inativação de microrganismos por congelação, desinfeção, pasteurização, irradiação, entre outros tratamentos; e por fim 3) as que previnem o seu aumento, efetuando a separação entre alimentos crus e alimentos prontos a consumir, incutindo boas práticas de higiene pessoal dos operadores de forma a minimizar as contaminações, ou prevenindo o desenvolvimento e multiplicação dos microrganismos, através da utilização de temperaturas de arrefecimento e manutenção adequadas, do correto armazenamento de matérias-primas e produtos finais, a manutenção dos níveis de ph, a w, ou conservantes, os quais vão impedir o seu aumento (ICMSF, 2002). Cada vez mais percebemos que um bom sistema de gestão e segurança alimentar tendo como base uma série de medidas de controlo, tais como a seleção das matérias-primas, o manuseamento higiénico antes do processamento, a correta aplicação desse processamento e a aplicação de boas práticas de higiene (BPH) e Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controlo (HACCP), é do que os testes do produto final, devido às limitações dos planos de amostragem (ICMSF, 2002; Legan et al., 2001). Os critérios microbiológicos definem a aceitabilidade de um produto com base na presença/ausência de microrganismos (e/ou suas toxinas ou número de microrganismos) por 31

47 unidade (s) de massa, volume, área ou lote (Reg. Nº 1441/2007). Existem três tipos de critérios microbiológicos que podem ser distinguidos, embora o Codex Alimentarius reconheça apenas um, que são o Padrão Microbiológico, um critério obrigatório que está incluído numa lei ou portaria, a Orientação microbiológica, um critério consultivo usado para informar os produtores de alimentos quanto aos limites que podem ser alcançados, aquando da aplicação de BPF e por último a Especificação Microbiológica, consiste numa parte de um acordo comercial entre o comprador e o fornecedor. Os Padrões microbiológicos devem ser estabelecidos de acordo com os princípios do Codex Alimentarius e são aplicados pelas autoridades reguladoras em pontos definidos da cadeia alimentar onde se espera aumentar o grau de proteção dos consumidores. No caso dos operadores do setor alimentar, os critérios de segurança e de higiene permitem auxiliar na verificação de conformidade com as regulamentações existentes e na verificação e/ou validação da eficácia das medidas preventivas, ou seja, BPH e Análise de Perigos e Pontos Crítico de Controlo. A segurança dos produtos alimentares é assim principalmente assegurada por controlo inicial de fontes de perigo do produto e pelo controlo de processos (ICMSF, 2004). II.3.1. Avaliação de Risco Microbiológico A análise microbiológica de um produto alimentar tem como objetivo principal detetar a presença de microrganismos patogénicos em alimentos que podem colocar em risco a saúde dos consumidores. Contudo, do ponto de vista industrial, outras razões devem ser consideradas, tais como: a estimativa da vida de prateleira do produto, a avaliação da qualidade da matéria-prima, a avaliação das vias de contaminação nas linhas de processamento, entre outros. A escolha da análise a ser feita, isto é, os critérios microbiológicos a adotar, depende do objetivo e da dificuldade das técnicas para realizar a análise requerida. Este facto permitiu o aparecimento do conceito de "indicador microbiológico", como um meio para evitar as dificuldades relacionadas com a deteção de bactérias patogénicas. Em geral, estas estão presentes nos alimentos em números baixos e a sua identificação exige em geral a utilização de numerosos testes bioquímicos e fisiológicos. Alternativamente, outros microrganismos ou grupos de microrganismos, sem significância taxonómica (por exemplo, coliformes fecais, enterococos), mas com hábitos ecológicos semelhantes com os agentes patogénicos são detetados e designados de Organismos índice (Mossel et al.,1995), e cada um deles inclui, em geral, vários géneros e espécies de bactérias. Os "indicadores específicos de deterioração" também são utilizados para medir a presença ou 32

48 atividade de deterioração de microrganismos em alimentos, geralmente denominado como "indicadores de deterioração". Dado que medem diretamente a presença ou atividade de microrganismos deteriorativos, são chamados de "marcadores microbiológicos", existindo também os marcadores de produtos químicos e físicos (Loureiro e Querol, 1999). O potencial de deterioração de um microrganismo consiste na capacidade de uma cultura pura em produzir os metabolitos associados com a deterioração de um produto particular, (Gram, 1989). Assim, deve ser avaliado e os teores do organismo alcançados em alimentos naturalmente deteriorados são capazes de produzir a quantidade de metabolitos associados com a deterioração. A deterioração é caracterizada por uma alteração num produto alimentar que o torna inaceitável para o consumidor, de um ponto de vista sensorial. Isto pode ser dano físico, as alterações químicas (oxidação, mudanças de cor) ou o aparecimento de sabores e odores indesejáveis resultantes do crescimento microbiano e metabolismo do produto. A deterioração microbiana é, de longe, a causa mais comum da deterioração e pode manifestar-se como o crescimento visível (colónias), como alterações texturais (degradação de polímeros) ou em odores e sabores desagradáveis. Apesar de cadeias de frio, conservantes químicos e uma compreensão muito melhor de deterioração microbiana de alimentos, ocorrem em quase todos os alimentos produzindo globalmente perdas devido à contaminação microbiológica (Anonymous, 1985). II.3.2.Microrganismos de deterioração II Bactérias do ácido lático A designação de bactérias do ácido lático (BAL) teve origem no facto deste grupo de microrganismos serem capazes de produzir ácido lático como produto final da fermentação de hidratos de carbono (Stamer, 1979, citado por Jay, 2005). As BAL são Gram positivas, não esporuladas, catalase negativas, geralmente não possuem citocromos, sendo um grupo de bactérias características de habitats não aeróbios, apesar de serem aerotolerantes. Algumas BAL, apesar de serem microrganismos mesófilos, podem multiplicar-se a temperaturas inferiores a 5 ºC ou superiores a 45 ºC e multiplicam-se na sua maioria a ph entre 4,0 e 4,5, podendo algumas desenvolver-se a ph de 3,2 e outras acima de 9,6. (Stamer, 1979, citado por Jay, 2005). 33

49 As BAL estão associadas a habitats ricos em nutrientes, como vários produtos alimentares tais como leite, carne, legumes, plantas, frutos, bem como no solo, águas residuais entre outros (Chambel, 2001; Whittenbury, 1964; Holzapfel e Wood, 1995). Os géneros mais importantes de BAL são Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Weissella, Carnobacterium, Tetragenococcus e Bifidobacterium. Espécies destes géneros podem ser encontradas no trato gastrointestinal do homem e dos animais, e também em alimentos fermentados. Estirpes utilizadas como probióticos geralmente pertencem à espécie do género Lactobacillus, Enterococcus e Bifidobacterium. Algumas características fisiológicas são de interesse para a sua função como probióticos, uma condição prévia é a sobrevivência no trato gastrointestinal. Isto baseia-se na sua resistência ao ph baixo e aos sais biliares (Kérouanton et al., 1998; Ringo e Gatesoupe, 1998). As características fisiológicas com importância para considerações taxonómicas são os padrões de fermentação de hidratos de carbono, resistência a diferentes concentrações de NaCl, o crescimento em diferentes meios de cultura e em temperaturas definidas e a resistência a antibióticos. Na indústria alimentar, as BAL têm um papel bastante importante, devido às diferentes formas como podem ser aplicadas, desde o controlo do processo fermentativo na produção de alimentos fermentados até à sua utilização como probióticos na saúde humana e animal (Chambel, 2001). Segundo Klaenhammer et al. (2002) (citado por Inês, 2008), as aplicações das BAL na indústria alimentar reincidem principalmente em seis géneros/espécies benéficas e não patogénicas, sendo elas Lactococcus (leite), Lactobacillus (leite, carne, vegetais e cereais), Leuconostoc (vegetais, leite), Pediococcus (vegetais, carne) e Streptococcus thermophilus (leite). As BAL, em especial Lactobacillus tem uma maior importância na indústria alimentar, devido à sua aplicação como conservantes naturais. As bacteriocinas têm origem na produção de substâncias de estrutura da proteína por bactérias durante a sua multiplicação, possuindo atividade antimicrobiana, sendo utilizadas principalmente em produtos lácteos, ovos, vegetais e carnes. As bacteriocinas produzidas por BAL, a nisina A e sua variante natural, nisina Z são bastante eficazes contra agentes microbianos causadores de toxinfeções alimentares e de deterioração. A nisina foi a única bacteriocina a ser autorizada oficialmente para utilização na indústria de alimentos aprovada em todo o mundo (Deegan et al., 2006; Moll et al., 1999). 34

50 II Bolores e Leveduras Os bolores e leveduras são organismos de extrema importância, pois estes são utilizados na produção de produtos farmacêuticos, enzimas, ácidos orgânicos e de alimentos, e alguns deles estão associados a várias doenças que afetam os seres humanos e outros animais e têm um papel importante na natureza como decompositores. Os alimentos associados a alterações de origem fúngica são caracterizados por um baixo valor de a w ou um valor de ph baixo (Garcia- Cela et al., 2012). A faixa de ph para a multiplicação dos bolores encontra-se entre valores de 1,5 a 9,0 e das leveduras entre valores de 2,0 a 8,5. Os bolores e leveduras podem produzir um elevado número de enzimas: lipases, proteases e carbohidrases, podendo estas atividades enzimáticas originarem compostos com sabores a bolor e odores a cortiça, álcool e frutos secos (Bigelis, 1992, citado por Filtenborg et al., 1996). As leveduras são fungos unicelulares que desempenham um papel fundamental na biotecnologia moderna e alguns deles podem atuar como agentes patogénicos. A identificação tradicional de leveduras tem sido alcançada pela aplicação de testes morfológicos e fisiológicos que determinam os perfis de produção de enzimas e as características de crescimento (Loureiro e Querol, 1999). As leveduras são responsáveis pela deterioração microbiológica em diversos produtos alimentares, tais como, os produtos refrigerados, incluindo o leite e os produtos lácteos fermentados, saladas e maioneses, produtos de panificação, compotas e conservas, produtos à base de fruta, carne e peixe crus (Betts et al., 1999), sendo responsável por perdas económicas significativas (Thomas, 1993). Também a contaminação e deterioração por bolores têm sido responsáveis pela eliminação de elevadas quantidades de alimentos, representando um grande problema, especialmente nos países em desenvolvimento, em que Penicillium, Aspergillus e Fusarium são os fungos com maior importância que levam à deterioração de produtos alimentares (Nickelsen e Jakobsen., 1997). Esta deterioração é traduzida nos alimentos por um crescimento visível de hifas, esporulação sobre a sua superfície, bem como alteração no sabor ou textura devido à formação de metabolitos e/ou por meio da formação de micotoxinas (Nielsen et al., 2000; Pitt e Hocking, 1997; van Egmond e Speijers, 1999). Os principais grupos de alimentos contaminados por bolores são os cereais e seus derivados, nozes e frutas. Por outro lado, os fungos produtores de micotoxinas são Aspergillus, Penicillium, Fusarium e Alternaria. No entanto, apesar de existirem milhares de micotoxinas, as mais importantes para a saúde pública são as aflatoxinas (AFs), ocratoxina A, patulina, 35

51 fumonisinas, a zearalenona e tricotecenos (Garcia-Cela et al., 2012). A Aflatoxina B1 e B2 e fumitoxinas produzidas por Aspergillus flavus e A. fumigatus são alguns exemplos de micotoxinas produzidas (Singh et al., 1991). A importância das leveduras na saúde foi mencionada por Fleet nas obras da década de 80, referindo-se, pela primeira, à necessidade de reavaliar o impacto de leveduras de origem alimentar de leveduras na saúde pública, referindo relatos ocasionais de gastroenterite causadas pela ingestão de alimentos em que os agentes etiológicos suspeitos eram leveduras, assim como o desenvolvimento de alergias em humanos (Fleet, 1992). De modo a evitar e minimizar os riscos de saúde pública causado pela deterioração por bolores e leveduras, foi aprovada a adição de conservantes alimentares (Anon, 1995), que são conservantes frequentemente encontrados em alimentos sendo eles maioritariamente ácidos fracos, que incluem o ácido acético em picles, molhos de salada e maionese, o ácido propiónico em pão e produtos de padaria, os sulfitos adicionados aos vinhos e sidra fermentada e o ácido sórbico e/ou ácido benzoico em produtos de confeitaria, doces e refrigerantes, sendo as suas propriedades antimicrobianas aumentadas em ph ácido proporcional à concentração de ácido não dissociado (Stratford e Eklund, 2003). II Enterobacteriaceae A família Enterobacteriaceae é constituída por bactérias Gram-negativas em forma de bastonete, anaeróbias facultativas, não formadoras de esporos, multiplicando-se tanto a temperaturas baixas como a temperaturas elevadas de 50 ºC. Em alimentos a temperaturas de 5ºC a sua multiplicação é diminuta ou muito lenta apesar de alguns autores já terem referido o seu desenvolvimento a temperaturas entre 3 ºC a 6 ºC. A sua multiplicação ocorre entre valores de ph que variam de 4,4 a 9,0 (Moss, 1982; Nesbakken, 2005). Enterobacteriaceae estão amplamente distribuídas na natureza, encontrando-se no solo, água, vegetação e no trato intestinal dos animais, bem como em alimentos, ingredientes e matériasprimas (Moss, 1982). Os membros desta família constituem um grande grupo relacionado bioquímica e geneticamente, demonstrando grande heterogeneidade ecológica e de hospedeiros. A família é dividida em vários géneros, com base nas propriedades genéticas e antigénicas e, mais tradicionalmente, nas características bioquímicas e de patogenicidade, como se segue: Escherichia, Shigella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Erwinia, Serratia, Hafnia, Edwardsiella, Proteus, Procidencia, Morganella, Yersinia, entre outros. Todos 36

52 fermentam a glucose, e aqueles que fermentam a lactose são considerados como bactérias coliformes. A presença de grupos de indicadores de contaminação, tais como os coliformes totais ou Enterobacteriaceae, é um dos testes mais comuns no laboratório da microbiologia alimentar, em parte devido à relativa facilidade e rapidez com que os testes podem ser realizados. Este método contribui para a segurança alimentar e quando encontrado algum desses microrganismos demonstra uma falha do processo ou uma contaminação pós-processo (Moss, 1982). Este grupo de bactérias está envolvido em diversas causas de infeções primárias do trato gastrintestinal humano, nomeadamente certas estirpes de E. coli e Salmonella, Shigella flexneri, S. boydii, S. sonnei, S. dysenteriae e Yersinia enterocolitica. As técnicas atuais de enumeração de Enterobacteriaceae são baseadas em métodos de cultura, utilizando meios seletivos, contudo existem as contagens de falsos positivos resultantes da multiplicação de não enterobactérias, bem como falsos-negativos que poderão surgir devido à incapacidade de algumas células de Enterobacteriaceae se multiplicarem. Estas bactérias multiplicam-se bem em extrato de carne, e normalmente em meio agar MacConkey (Brenner, 1984). Os produtos processados de carne crua são facilmente suscetiveis à contaminação por bactérias Enterobacteriaceae, constituindo assim um importante desafio bacteriano em todo o mundo. As espécies mais predominantes associadas a casos de intoxicação alimentar associados a alguns produtos à base de carne são Salmonella, E. coli, Proteus e Klebsiella. O aumento da incidência de infeções de origem alimentar em produtos à base de carne, levou a uma necessidade iminente para o seu controlo e/ou profilaxia, de modo a evitar surtos de intoxicação alimentar, garantindo a segurança alimentar e a proteção da saúde pública (Al- Mutairi, 2011). II Pseudomonas spp. Pseudomonas spp. são bactérias móveis (raramente imóveis), em forma de bastonetes Gramnegativos, retos ou ligeiramente curvos, catalase positiva, oxidase positiva ou negativa e são caracterizadas pela sua elevada versatilidade metabólica, devido à presença de um sistema enzimático complexo. São aeróbicas, tendo um tipo de metabolismo respiratório com o oxigénio como aceitador final de eletrões. Em alguns casos, pode ser utilizado o nitrato como um aceitador de eletrões alternativo, permitindo que a multiplicação ocorra em anaerobiose e a maioria das espécies não crescem em condições ácidas, com ph inferior a 4,5. A sua classificação em novas famílias e géneros tem por base as características fenotípicas 37

53 (parâmetros de crescimento) e as características genotípicas (%G+C, hibridização DNA- DNA, análise da sequência do gene 16S rrna) (Jeppesen,1995; Palleroni, 2005). O género Pseudomonas é classificado no domínio Bacteria, phylum Proteobacteria, insere-se na classe Gammaproteobacteria, na família Pseudomonaceae, e ordem Pseudomonadales (Brenner et al., 2005), encontrando-se amplamente distribuído em ambientes naturais, podendo ser encontrado no solo, água doce, ambientes marinhos, entre outros e inclui espécies que podem ser patogénicos para plantas, animais e seres humanos. Também têm sido isolados a partir de instrumentos clínicos, soluções asséticas, cosméticos e produtos médicos e em vários alimentos, onde constituem importantes microrganismos de deterioração. Pseudomonas spp. podem representar uma minoria da microbiota total no início da vida de prateleira, no entanto, sob certas condições, como a alta a w, ph neutro, temperatura adequada e um bom fornecimento de oxigénio, a sua capacidade de multiplicação rápida determina o seu domínio. Desta forma, um meio seletivo para a sua deteção pode ser de grande valor na avaliação do potencial de vida útil do produto. A importância atribuída a algumas espécies reside no facto de serem consideradas patogénicas para seres humanos e animais e outras como fitopatógenos do setor agrícola (Jeppesen, 1995; Palleroni, 1991, 1993; Ridgway e Safarik, 1990). Pseudomonas aeruginosa foi descoberta por Schroeter em 1872 e o seu género foi proposto por Migula em No ano de 2008, 95 espécies de Pseudomonas foram publicadas (Palleroni, 2005). Pseudomonas aeruginosa tem sido considerada o agente mais importante deste género que causa infeções oportunistas numa série de indivíduos (Gutiérrez et al., 2007), bem como um dos principais agentes patogénicos nosocomiais e uma das principais causas de infeção respiratória crónica em indivíduos com doenças crónicas, tais como a fibrose cística e doença pulmonar obstrutiva crónica. Este agente patogénico é dos mais difíceis de tratar, devido ao seu elevado nível de resistência a antibióticos, acompanhado da sua extraordinária capacidade de desenvolver mutações de resistência adicionais cromossómicas (Nicolau e Oliver, 2010). Outras espécies deste género que podem ser agentes patogénicos humanos, incluindo Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mendocina, Pseudomonas putida e Pseudomonas stutzeri (Aumeran et al., 2007; Carpenter et al., 2008; Hsueh et al., 1998; Mert et al., 2007; Reisler e Blumberg, 1999). Como resultado, é particularmente importante diferenciar as diferentes espécies deste género. O agrupamento inicialmente baseava-se na produção de pigmentos fluorescentes sob radiação UV, como exemplo P. fluorescens, posteriormente formaram-se grupos de espécies patogénicas e não 38

54 patogénicas, que é o exemplo de P. aeruginosa, um patógenico oportunista dos seres humanos e um patogénico de plantas (P. syringae) (Palleroni, 2005; 2008). As espécies psicrotróficas de Pseudomonas são um problema de deterioração significativa de alimentos, nomeadamente em carne refrigerada, peixe, marisco e produtos láteos. Na indústria alimentar e de bebidas estas podem ser fonte de contaminação devido á sua capacidade de desenvolvimento em sistemas de água (Franzetti e Scarpellini, 2007). II.3.3. Microrganismos patogénicos Salmonella sp. Salmonella sp. são pequenos bastonetes Gram-negativos, não esporulados, anaeróbios facultativos, que apresentam mobilidade. São microganismos mesófilos e têm uma temperatura ótima de multiplicação entre 35 e 37 ºC, no entanto a maioria dos serótipos Salmonella multiplicam-se entre 5 e 47 ºC (Gray e Fedorka-Cray, 2002). A sua destruição ocorre a temperatura e tempo de pasteurização e são sensíveis a ph baixo (4,5 ou inferior), e não se multiplicam a um nível de a w de 0,94, em especial combinada com um ph igual ou inferior a 5,5. Estas multiplicam-se em meios contendo glicose e são produtoras de gás. De um modo geral, fermentam dulcitol, mas não a lactose, utilizam o citrato como fonte de carbono, produzem sulfureto de hidrogénio, lisina e ornitina descarboxilase, indol e são negativos para a urease. As células sobrevivem sob congelação e em anaerobiose por um longo tempo, podendo multiplicar-se em muitos alimentos sem afetar a sua qualidade e respetiva aceitação (Ray, 2005). A classificação taxonómica de Salmonella veio simplificar o espectro, agrupando todas as estirpes patogénicas ou não patogénicas em apenas duas espécies, Salmonella enterica (patogénica) e Salmonella bongori (não patogénica). S. enterica, por sua vez foi dividida em seis subespécies, enterica, salamae, arizonae, diarizonae, indica e houtenae (I, II, IIIa, IIIb, IV e VI) (Brenner et al., 2000). Através da composição dos antígenos lipopolissacarídeos O, flagelares H e Vi, foi possível a classificação de mais de serótipos (Uzzau et al., 2000). S. enterica subsp. enterica é dividida em cinco serogrupos: A, B, C, D e E, em que cada serogrupo contém múltiplos serótipos e compreende 99% dos isolados de serótipos em amostras clínicas (Old, 1992). Os serótipos de Salmonella adaptadas para os seres humanos causam infeções em humanos, mas raramente afetam animais, sendo os mais representativos typhi, paratyphi A, B, e C e sendai. A presença de diferentes serótipos de Salmonella depende do estado imunológico dos pacientes e, consequentemente, pode originar febre, bacteriémia tifóide e enterocolite. Esta é 39

55 originada principalmente por S. enterica serótipo Typhimurium (Ukuku e Fett, 2002, 2006; Zhang et al, 2003). Salmonelose consiste numa infeção gastrintestinal que ocorre aquando da ingestão de de serótipos da espécie Salmonella enterica (El-Gazzar e Marth, 1992). Os microrganismos invadem a mucosa do intestino delgado, proliferam nas células epiteliais, e produzem uma toxina, resultando numa reação inflamatória e acumulação de fluido no intestino (Ray, 2005). Esta capacidade dos agentes patogénicos em invadir e danificar as células é atribuída à produção de um fator citotóxico termoestável que é geralmente auto-limitada, contudo, através da invasão bacteriana esta pode progredir para uma bacteriémia. Os sintomas manifestam-se 12 a 36 horas após o consumo de alimentos contaminados, (Chimalizeni et al., 2010), através de sintomas gerais de gastroenterite, cólicas abdominais, diarreia, náuseas, vómitos, calafrios e febre, podendo também ocorrer a desidratação e dor de cabeça. Os casos de bacteriémia são mais graves podendo levar à morte (El-Gazzar e Marth, 1992). A mortalidade por salmonelose em países desenvolvidos, onde a infeção invasiva é rara, menor que 5%, normalmente a incidência é baixa, menor que 2%. Por outro lado, em países menos desenvolvidos a doença invasiva é mais frequente, levando a uma mortalidade de 18 a 24%. A salmonelose não tifóide tem uma incidência anual de 1,3 bilhão de em todo o mundo, no qual cerca de 3 milhões dos indivíduos morrem (Chimalizeni et al., 2010). Os produtos de origem animal, como a carne cozida ou crua, ovos crus ou produtos que contenham ovos crus ou sub-pasteurizados, laticínios, tais como manteiga, gelados e queijo, assim como alguns produtos à base de vegetais, podem conter Salmonella sp. (FDA, 1992 e Organização Mundial de Saúde, 2002). Segundo Pui et al. (2011), Salmomella sp. encontra-se entre os patogénicos de origem alimentar mais frequentemente isolados a partir de frutas frescas e vegetais. O aumento de surtos associados a uma grande variedade de frutas e vegetais frescos, incluindo maçã, melão, manga, alface, coentro, sumo de laranja não pasteurizado, aipo e salsa provocou uma crescente preocupação nos países industrializados (Pui et al., 2011). II Escherichia coli Escherichia coli pertence à família Enterobacteriaceae e são microrganismos Gram-negativos que habitam no trato intestinal dos animais, saudáveis ou doentes. Sendo uma bactéria Gramnegativa o seu invólucro é composto por três camadas, a membrana citoplasmática, o peptidoglicano ou camada de mureína e a membrana exterior (Nanninga, 1998). Este 40

56 microrganismo possui uma cápsula constituída por uma camada viscosa de polímeros, essencialmente por polissacarídeos, permitindo-lhe sobreviver a condições ambientais adversas e a sua adesão a superfícies (Jawetz et al., 2005). Escherichia coli apresenta uma dimensão típica de 0,5 µ de diâmetro e 1,5 µ de comprimento, apresentando uma forma de bastonete e flagelos perítricos, podendo também ser constituído por fímbrias ou pili, proveniente da membrana citoplasmática, através do qual permite a transferência de DNA, durante a conjugação, sem que ocorra a formação de esporos. É uma bactéria mesófila que pode multiplicar-se a temperaturas entre 8 e 48 ºC, sendo a temperatura ótima de desenvolvimento de 39 ºC. A sua multiplicação ótima ocorre entre valores de ph de 6 e 8 (Neidhardt et al., 1990). Escherichia coli foi identificada pela primeira vez em 1885, pelo pediatra Alemão Theodor Escherich. Foi designada por este como Bacterium coli, isolada a partir de fezes de recémnascidos, daí advém o nome coli, devido ao seu habitat natural ser o cólon e Bacterium pela sua forma de bastonete. Este nome do género a que pertence foi alterado mais tarde, em homenagem ao seu descobridor, para Escherichia (Ramos, 2002). Escherichia coli foi, por muito tempo, considerada uma bactéria comensal do intestino grosso da maioria dos animais de sangue quente. Normalmente após 48 horas do nascimento, o intestino humano é colonizado por Escherichia coli, podendo aderir ao muco que cobre o intestino grosso e, quando estabelecida, esta estirpe pode persistir durante meses ou anos. Esta estirpe quando estabelecida pode sofrer alterações durante um longo período, de semanas a meses, ou ser mais rápido quando ocorre uma infeção entérica ou quimioterapia antimicrobiana que perturba a flora normal. Apesar de existir uma vasta quantidade de informação sobre a existência dessas alterações e sobre a ecologia de Escherichia coli no intestino do ser humano, ainda não se conseguiu estabelecer o mecanismo de ocorrência dessas alterações (Todar, 2008). As estirpes de Escherichia coli são, na sua maioria inofensivas e benéficas para o ser humano, pois são utilizadas como fontes das vitaminas B12 e K, essenciais ao ser humano. Por outro lado, algumas das suas estirpes patogénicas são extremamente perigosas, podendo mesmo causar a morte, sendo muito diferentes das comensais, pois apresentam fatores de virulência únicos (Ramos, 2002). Escherichia coli fisiologicamente tem características de versatilidade, e adapta-se bem ao seu habitat característico (Neidhardt et al., 1990), crescendo em meios com glucose, principal constituinte dos compostos orgânicos. 41

57 Escherichia coli é um bom indicador de contaminação fecal e da água, devido ao facto de apresentar diversas resistências a fatores ambientais e ter uma presença regular no intestino humano e fezes (Todar, 2008). II Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus são cocos Gram-positivos, geralmente em forma de cachos, imóveis, não capsulados e não esporulados. A maioria das estirpes fermentam o manitol e têm produção de coagulase termonuclease e hemolisina, contudo diferem na sua sensibilidade para os bacteriófagos. Staphylococcus aureus são anaeróbios facultativos, mas multiplicam-se rapidamente em condições aeróbias (Ray, 2005). Estudos demonstram que o S. aureus tem a capacidade de sobrevivência e desenvolvimento a concentrações de NaCl elevadas e baixa a w (0,83-0,86), e de valores de ph entre 4 e 10, com uma multiplicação ótima entre 6 a 7 e a temperaturas numa faixa de 6 a 48,5 ºC, sendo a temperatura ótima de desenvolvimento entre 35 a 41 ºC (Adams e Moss, 2008, citado por Rodriguez-Caturla et al., 2012). O género Staphylococcus inclui mais de 30 espécies, que são hospedeiros adaptados, e metade das espécies conhecidas habitam somente em humanos e outros animais, sendo um maior número encontrado na superfície da pele. Em locais húmidos, o teor de S. aureus por cm 2 pode alcançar 10 3 a 10 6 ufc/g, e em habitats secos, 10 a 10 3 ufc/g (Kloos e Bannerman, 1994). Estes estão naturalmente presentes no nariz, garganta, pele e pêlo (penas) de seres humanos saudáveis e animais, no entanto tem como fonte principal de contaminação dos alimentos as mãos de manipuladores de alimentos (Le Loire et al., 2003; Smyth et al., 2004, citado por Schelin et al., 2011). Este pode também estar presente em infeções, assim como, feridas na pele e abcessos em seres humanos, animais e aves (Ray, 2005). A intoxicação alimentar causada por S. aureus, é atribuída à ingestão de alimentos que contêm enterotoxinas de estafilococos termotolerantes, em doses muito baixas de ng (Asao et al., 2003, citado por Rodriguez-Caturla et al., 2012). Fatores ambientais, como ph, a w, tipo de alimento, temperatura e condições de processamento têm sido sugeridos como tendo um papel importante na produção desta enterotoxina (Schelin et al., 2011). A enterotoxina produzida por Staphylococcus aureus (enterotoxina estafilocócica) é a toxina mais frequentemente relatada em casos intoxicação alimentar por estafilococos (Kérouanton et al., 2007). Estudos publicados apontam níveis perigosos de S. aureus a partir de 6 log (ufc/g) em alimentos contaminados para produção de enterotoxina estafilocócica (Lindqvist et al., 2002). A intoxicação alimentar por S. aureus ocorre devido 42

58 libertação de enterotoxinas na corrente sanguínea, provocando a síndrome do choque tóxico por alimentos (Behling et al., 2010). Os principais sintomas de doença ocorrem devido à estimulação do sistema nervoso autónomo pelas toxinas (Kloos e Bannerman, 1994). Os sintomas manifestam-se dentro de 1 a 6 horas, e sendo estes dependentes da resistência do indivíduo, assim como a quantidade de alimento contaminado consumido e a quantidade de toxina no alimento ingerido (Behling et al., 2010). Os sintomas resultam em náuseas, salivação e vómitos, cólicas abdominais, diarreia, surdez, cefaleias, prostração, e, por vezes, uma diminuição da temperatura do corpo. Alguns indivíduos podem não apresentar todos estes sintomas. Em casos mais graves, dor de cabeça, dores musculares e alterações transitórias da pressão arterial e frequência cardíaca podem também ocorrer (Behling et al., 2010). Os alimentos mais suscetíveis são ricos em proteínas, carne, presunto em lata, salame, bacon, carne assada, saladas, produtos de panificação contendo creme, molhos e queijo. A manipulação excessiva dos alimentos, o uso incorreto de temperaturas, higiene deficiente dos utensílios e equipamento e superfícies são fatores predisponentes à contaminação (Kloos e Bannerman, 1994). II Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes é uma bactéria Gram-positiva, anaeróbia facultativa, não formadora de esporos, multiplica-se a temperaturas de 0 a 45 C e ph de 4,1 a 9,6, podendo sobreviver nos alimentos durante longos períodos de tempo (Hanawa et al., 1995, citado por Lungu et al., 2009). Na cultura a fresco, as células podem formar cadeias curtas, com produção de hemólise, fermentação da ramnose mas não da xilose e fermentação da glicose sem que ocorra a produção de gás. É uma bactéria psicrotrófica, com multiplicação entre 1 e 44 C, sendo a sua temperatura de crescimento ótimo a C. Entre os 7 e os 10 C, esta multiplica-se de forma relativamente rápida (Ray, 2005). Listeria monocytogenes é um microrganismo ubiquitário, tendo sido isolada a partir da superfície das águas, vegetação em decomposição, solos, esgotos, e silagem, e encontrada em todos os continentes, exceto na Antártida. Estima-se que a principal fonte da bactéria no solo seja a partir de fezes de animais (Griffiths, 2003). A ampla tolerância deste microrganismo a uma ampla gama de temperaturas, incluindo a refrigeração e ph, mas também pela sua capacidade de formar biofilmes, permite a sua colonização, distribuição e adaptação a ambientes diversos (Jeong e Frank, 1994, citado por Medrala et al., 2003). L. monocytogenes 43

59 está frequentemente presente em alimentos crus, mas também pode ser encontrada como um resultado de pós-contaminação em alimentos pronto a comer em produtos à base de carne cozida (Goulet et al, 1993; Ryser, 1999). Estas podem ainda entrar em plantas através da água do mar e contaminar a produção de peixes, utensílios e pessoal, contaminando assim a linha de processamento e produtos finais. Contudo, são poucos os relatos de surtos ou casos esporádicos, devido ao consumo de peixe ou frutos do mar (Lennon et al., 1984; Facinelli et al., 1989). Podem também multiplicar-se em vários alimentos, em produtos congelados e secos, com conteúdos de sal elevado e ph 5,0 e baixa tensões de oxigénio. No processo de pasteurização são sensíveis a temperaturas de 71,7 C, durante 15 segundos ou 62,8 C durante 30 minutos (Griffiths, 2003). O género Listeria inclui sete espécies, e estes compreendem L. monocytogenes, L. innocua, L. welshimeri, L. seeligeri, L. ivanovii, L. murrayi e L. grayi (McLauchlin e Jones, 1999). Listeria monocytogenes é um agente causador de listeriose em humanos e animais e foi isolado por cientistas britânicos da Universidade de Cambridge em 1924, a partir do sangue de coelhos infetados. Embora amplamente reconhecida como um causa de aborto em mulheres grávidas e meningite, encefalite e septicémia (Ryser, 2002). O grupo de pessoas sensíveis incluem mulheres grávidas, fetos, bebés, idosos com imunidade reduzida devido a doenças, e as pessoas que tomam medicamentos especiais, como esteróides e agentes quimioterápicos (Smerdon et al., 2001; Ray, 2005). Contudo, este microrganismo não era reconhecido como um agente patogénico de origem alimentar até Ao contrário da maioria de outras doenças transmitidas por alimentos, os resultados de infeções por L. monocytogenes pode ser particularmente devastador com uma taxa de mortalidade de cerca de 20% (Ryser, 2002). A ingestão de alimentos contaminados por L. monocytogenes, em pessoas ditas saudáveis pode ou não produzir sintomas. Na maioria dos casos, os sintomas aparecem após a ingestão e inicialmente febre, dores musculares, por vezes, gastrointestinais, diarreia, náuseas (FDA,2003; Ray, 2005). Caso a infeção se dissemine para o sistema nervoso, os sintomas podem manifestar-se em dor de cabeça, rigidez do pescoço, confusão, perda de equilíbrio, ou convulsões. Em determinados casos, podem ser atingidos outros sistemas de órgãos. No caso de mulheres grávidas infetadas, com um simples síndrome gripal, fica comprometido o estado do recém-nascido, pois o agente patogénico pode invadir órgãos e tecidos do feto através da placenta. Estas infeções durante a gravidez podem ainda levar a parto prematuro, à infeção do recém-nascido, ou mesmo nado-morto (FDA, 2003). Os sintomas incluem bacteriémia 44

60 (septicémia), meningite, encefalite e endocardite. A taxa de mortalidade em fetos, infetados recém-nascidos, e em indivíduos imunocomprometidos é muito elevado. A dose infeciosa considerada é de células (Ray, 2005). Listeria monocytogenes é vista como um problema significativo para a indústria alimentar, pois a listeriose causa infeções graves em animais domésticos e humanos (Gray e Killinger, 1996). As infeções provocadas por L. monocytogenes são na sua maioria de origem alimentar. Estas têm origem, principalmente em alimentos pronto a comer como produtos de leite cru, salsichas ou peixe fumado (Swaminathan e Gerner-Schmidt, 2007). O consumo de alimentos crus, termicamente processados, com longo armazenamento em refrigeração e o abuso de temperaturas em alimentos prontos-a-comer são apontados como as principais causas de listeriose. No entanto, também já foi isolada L. monocytogenes a partir de outros alimentos, incluindo saladas, comida vegetariana crua ou queijo macio produzido a partir de leite pasteurizado e não-pasteurizado (Ray, 2005). II Bacillus cereus Bacillus cereus é um bastonete Gram-positivo com mobilidade, aeróbio, formador de esporos no meio das células. Bacillus cereus é anaeróbio facultativo, com grandes células vegetativas, tipicamente com 1,0 µm por 3,0 a 5,0 µm em cadeia. Estes desenvolvem-se a uma gama de temperatura de 8 a 55 ºC, com um desenvolvimento ótimo de 28 a 35 ºC, não sendo tolerante a baixo ph e com multiplicação favorável a ph de 4,9 a 9,3, a w de 0,95 ou valores superiores e a concentração de NaCl inferior a 10% (Adams e Moss, 2008; Ray, 2005). As células e esporos de B. cereus são comuns no solo, sendo frequentemente encontrado em solos com baixa quantidade de nutrientes, assim como sobre o arroz e palha. Esta característica e a capacidade de formação de esporos conferem-lhe a capacidade de se disseminar com facilidade (Priest et al., 1989). B. cereus foi isolado a partir de vários tipos de produtos, incluindo pão (Kaur, 1986, citado por Samapundo et al., 2011), produtos de carne (Konuma et al, 1988, citado por Samapundo et al., 2011) e especiarias (Iurlina et al., 2006, citado por Samapundo et al., 2011). Bacillus cereus é responsável por dois tipos de doenças veiculadas por alimentos, pois produzem pelo menos dois tipos de enterotoxinas (emética e entérica). A intoxicação emética, ocorre devido à ingestão da toxina cereulide pré-formada no alimento, e a infeção diarréica causada pela ingestão de células bacterianas/esporos que produzem enterotoxinas no intestino delgado, com difícil identificação, pois estas estirpes têm mecanismos complexos e variados que provocam a infeção (EFSA, 2004). Estas toxinas são 45

61 produzidas durante a multiplicação de células na gama de temperaturas de multiplicação e ficam retidas nas células, e quando as células sofrem a lise celular as toxinas são libertadas. Estas encontram-se no trato gastrointestinal, mas também nos alimentos, sendo causa de gastroenterites. Para originar uma gastroenterite, é necessário ingerir um grande número de Bacillus cereus (Ray, 2005). As DOA causadas por B. cereus foram associadas na sua generalidade a 5-8 log células/esporos por grama de alimento, apesar de em alguns surtos, terem sido relatados números mais baixos de 3-4 log/g (EFSA, 2004). Na doença na forma emética, os sintomas iniciais ocorrem 1 a 5 horas após a ingestão de alimentos contaminados, podendo continuar durante 6 a 24 horas, e pode manifestar-se com vómitos e náuseas, diarreia e cólicas abdominais. A este tipo de doença estão associados pratos de arroz e produtos de massas confecionados a temperaturas indevidas e arrefecimento lento e armazenamento de alimentos entre C (Lui, 2001; Ray, 2005). A intoxicação por Bacillus cereus está implícita numa enorme variedade de alimentos. A maioria dos surtos notificados teve origem no consumo de alimentos tratados termicamente em unidades de restauração e catering (EFSA, 2004). II Clostridium perfringens Clostridium perfringens é uma bactéria Gram-positiva, formadora de esporos, anaeróbia, sem mobilidade. A temperatura de multiplicação varia de 15 e 50 C, sendo a temperatura ótima de 45 C. O tempo de geração para a maioria das estirpes a temperaturas entre 33 e 49 C é inferior a 20 min, tendo sido relatada de 8 min (Labbé, 2000). Clostridium perfringens causa gangrena gasosa humana e dois tipos de doenças transmitidas por alimentos, a do Tipo A causando enterite diarreica, mais comum entre as de seu tipo no mundo industrializado e muito grave a do Tipo C, que causa enterite necrótica humana (Granum, 1990). As bactérias também são a causa de muitas doenças animais, tais como a enterite necrótica e enterotoxémia em aves (Songer, 1996). C. perfringens podem produzir mais de 13 toxinas diferentes, embora cada bactéria produza apenas um subconjunto destes. A produção de quatro principais toxinas letais são usadas para isolados de tipo (A a E), e três deles estão localizados em plasmídeos (Canard et al., 1992; Katayama et al., 1996). C. perfringens é um microrganismo ubiquitário encontrado em praticamente todos os ambientes testados, incluindo o solo, água, leite, pó, esgotos e no intestino de seres humanos e animais (Hatheway, 1990), sendo encontrada em alimentos crus e processados, nomeadamente em produtos de carne crua e especiarias (Labbé, 2000). A principal razão de 46

62 contaminação de alimentos por C. perfringens ocorre em pratos de carne, armazenados após a confeção, com arrefecimento e reaquecimento insuficiente (Granum, 1990). As características deste microrganismo, que contribuem para a sua capacidade de causar doença de origem alimentar, incluem a formação de esporos resistentes ao calor e à sua capacidade de sobrevivência a temperaturas normais de confeção (Meer et al., 1997). A maioria dos casos de intoxicações alimentares, envolvendo C. perfringens é relatada em restaurantes, hospitais e lares para idosos e têm sido tipicamente associados a idosos e após um tratamento com antibióticos. Os sintomas de intoxicação alimentar por C. perfringens manifestam-se 8 a 24 horas após a ingestão de alimentos contaminados, provocando sintomas como a diarreia aguda e dor abdominal (Brown, 2000). A enterotoxina de C. perfringens (CPE) é produzida durante a esporulação de células vegetativas no intestino do hospedeiro e a formação das camadas de revestimento de esporos, afetando o intestino delgado, interrompendo o equilíbrio iônico da membrana traduzindo-se em diarreia (McClane, 1997). A incidência de diarreia induzida por CPE aumenta consoante o número de indivíduos imunocomprometidos na população (doença, o tratamento e idade) (Meer et al., 1997). As DOA causadas por C. perfringens podem ser facilmente controladas através de limpeza e desinfeção adequadas (Labbé, 2000). II Clostridium botulinum Clostridium botulinum é um bastonete Gram-positivo, anaeróbio, ocorrendo como células individuais ou pequenas cadeias, muitos são móveis, formadores de esporos e produtores de uma potente neurotoxina botulinum potencialmente letal que, quando ingerido, pode causar uma doença grave ou morte (Peck et al., 2011). São sensíveis a ph baixo (<4,6), a w baixo (0,93), e concentração de sal moderadamente elevado (5,5%). Os esporos não germinam na presença de nitrito (250 ppm) e são altamente resistentes a temperaturas. Contudo, a sua destruição ocorre à temperatura de 115 ⁰C, dado que as células vegetativas são destruídas com calor moderado (pasteurização). As toxinas formam-se durante a multiplicação bacteriana. As estirpes de Clostridium botulinum podem ser proteolíticas ou não proteolíticas (Anonymous, 1987; Pierson e Reddy, 1998). Os esporos são resistentes ao calor e podem sobreviver em alimentos que são incorretamente ou minimamente processados. São reconhecidos sete tipos (A, B, C1 +2, D, E, F e G) de C. botulinum, com base na especificidade antigénica da toxina (neuro) produzida por cada uma das estirpes. Os tipos A, B, E e F são os causadores do botulismo humano. Os tipos C e D causam a maioria dos casos de botulismo em animais, 47

63 sendo os mais afetados as aves silvestres e domésticas, bovinos, equinos e algumas espécies de peixes (Arne e Krüger, 2012). Esta neurotoxina produz sintomas neurológicos, juntamente com alguns sintomas gástricos. Os esporos de Clostridium botulinum estão amplamente distribuídos no solo, esgotos, sedimentos de pântanos, lagos e águas costeiras, plantas e conteúdo intestinal dos animais e peixes. As frutas e vegetais podem ser contaminados com esporos do solo, peixes de água e sedimentos, entre outros. Os esporos do tipo A e B são mais prevalentes no solo, esgotos e matérias fecais de animais, por outro lado os esporos do tipo E são geralmente encontrados em ambientes marinhos (Bean et al., 1990). Existem várias formas de botulismo humano, as mais comuns incluem botulismo alimentar, uma intoxicação devido à ingestão de neurotoxina pré-formada em alimentos; o botulismo infantil, que consiste numa infeção por germinação de esporos de C. botulinum produzindo a neurotoxina no trato gastrointestinal da criança, onde a proteção e a microflora competitiva é pouco desenvolvida e o botulismo de feridas, que consiste numa infeção com esporos de C. botulinum, que crescem e produzem a toxina em feridas profundas anaeróbicas. Contudo existem ainda outras formas raras de botulismo, nomeadamente o botulismo infecioso adulto, assemelhando-se ao botulismo infantil, o botulismo inalatório e botulismo iatrogénico, uma consequência do tratamento com toxina botulínica (Lindström et al., 2006). A intoxicação por botulismo pode variar de uma doença suave ou grave ao ponto de ser fatal dentro de 24 horas, a rapidez do seu aparecimento, a sua gravidade, está dependente da quantidade de toxina ingerida (Shapiro et al., 1998). Os sintomas do botulismo são particularmente do fórum neurológico, inicialmente com a visão turva, levando a uma paralisia flácida descendente bilateral, em casos mais graves pode levar à paralisia flácida dos músculos respiratórios ou cardíacos. A taxa de mortalidade causada pelo botulismo é de aproximadamente 5 a 10% dos casos (Setlow e Johnson, 1997). O maior número de surtos está associado com frutas e produtos hortícolas, peixes, ovos de peixes e fumados de peixe. Os principais alimentos implicados nos surtos foram as conservas caseiras (Ray, 2005). 48

64 III. TRABALHO EXPERIMENTAL 49

65 50

66 III.1. Introdução O controlo microbiológico das matérias-primas e dos produtos finais é utilizado como indicador para garantir a segurança alimentar. Geralmente, os critérios microbiológicos podem ser aplicados por parte das autoridades reguladoras e/ou operadores de empresas do setor alimentar para estabelecer se os requisitos das matérias-primas, ingredientes, produtos finais e lotes são aceitáveis ou inaceitáveis. Os critérios microbiológicos também são usados para determinar que os processos são consistentes com os princípios gerais de Higiene Alimentar e para verificar a eficácia do sistema HACCP (CAC, 1997a). Este sistema veio permitir assegurar a segurança dos alimentos, que pode ser aplicada em toda a cadeia alimentar, desde a produção primária até ao consumo final, sendo este sistema mundialmente considerado como um meio eficaz e racional (Dome nech et al., 2008). Cada vez mais existe uma consciencialização e preocupação por parte dos operadores, de que certos agentes patogénicos podem persistir em ambientes de processamento de alimentos, contaminar os alimentos durante o processamento e levar a doenças transmitidas pelos mesmos (ICMSF, 2002; Tompkin, 2002). Assim sendo, a avaliação das características microbiológicas das matérias-primas e produtos finais e a aplicação de medidas corretivas, caso necessário, a alimentos prontos a comer, como é o caso dos pastéis salgados de carne e peixe, são dependentes do ambiente no qual os alimentos são preparados e manipulados. Ao longo da sua confeção, o controlo de tempo e temperatura de cocção e arrefecimento, até ao seu armazenamento são etapas importantes, pois o controlo inadequado da temperatura nos alimentos é um dos fatores mais comuns de DOA ou deterioração dos mesmos. Os sistemas de controlo devem assegurar que a temperatura é controlada de forma eficaz, tendo em conta a natureza dos alimentos, o período pretendido de vida útil, o método de embalagem e processamento e a forma como o produto se destina a ser usado, como por exemplo neste caso, pronto a comer. Os sistemas devem ainda especificar os limites toleráveis para o tempo e as variações de temperatura, utilização de dispositivos de gravação de temperatura, devendo estes ser verificados em intervalos regulares e testados para a exatidão (CAC, 2003). O nosso trabalho teve como objetivos: - Verificar e controlar das etapas do processo de fabrico de pastelaria salgada com maior importância na contaminação do produto final, recorrendo à análise microbiológica de matérias-primas e produtos intermédios; - Identificar os perigos e determinar os PCC do processo de fabrico da pastelaria salgada, tendo em atenção os binómios de tempo e temperatura de confeção para posterior avaliação 51

67 do nível de risco associado a este tipo de alimento pronto a comer produzido em cantinas escolares; - Avaliar as características microbiológicas da pastelaria salgada congelada, ao longo de 4 meses através dos seguintes parâmetros: pesquisa de Salmonella sp., Listeria monocytogenes e de Staphylococcus aureus coagulase positiva e, contagem de microrganismos aeróbios totais a 30 ºC, BAL, Pseudomonas spp., bolores e leveduras, coliformes totais, Enterobacteriaceae, Escherichia coli, Bacillus cereus, Clostridium spp. e Clostridium perfringens, por forma a avaliar o seu estado de conservação. O intuito global deste trabalho foi também o de poder melhorar algumas das etapas ao longo do processo de fabrico dos pastéis salgados de carne e de peixe das cantinas e bares universitários, efetuar a verificação e validação do sistema HACCP de forma a garantir produtos cada vez mais seguros para o consumidor. III.2. Material e Métodos III.2.1. Descrição dos estabelecimentos de confeção dos pastéis salgados Os pastéis salgados foram confecionados em duas Cantinas Universitárias A e B, situadas no Norte do país que fornecem refeições a estudantes e funcionários docentes e não docentes. Estes pastéis são vendidos nas cantinas universitárias incorporados nas refeições e nos bares. III.2.2. Fluxograma dos pastéis salgados de carne e de peixe Os pastéis salgados de carne e de peixe constituem alimentos prontos a comer, feitos a partir de carne de bovino e de peixe (pescada), respetivamente, estufados juntamente com alguns temperos, nomeadamente a salsa, sendo posteriormente passados por ovo e enrolados em pão ralado e fritos. Ao longo do seu processamento, estes alimentos passam por várias etapas que podem ser observadas no seu fluxograma de fabrico (figura 2). A figura 2 caracteriza o fluxo do processo com a sequência de todos os passos inerentes ao fabrico dos pastéis salgados de peixe e de carne desde a receção das matérias-primas até à fritura. 52

68 Receção de matériasprimas Armazenamento em refrigeração / congelação Preparação dos ingredientes principais Desfiamento do peixe (Pastéis de peixe) Armazenamento não refrigerado Higienização da salsa Cozedura dos ingredientes principais Preparação da base do recheio Confeção da massa Confeção do recheio Arrefecimento/ batimento Combinação do recheio com a massa Panar Ultracongelação Armazenamento em congelação PCC1 Fritura Fig 2. Fluxograma com o diagrama de fabrico de pastéis salgados de carne e peixe confecionados em 2 cantinas universitárias. No pastel salgado de carne, o recheio é elaborado a partir de carne de vaca moída e no pastel salgado de peixe a partir de pescada cozida e desfiada, estufados respetivamente, com cebola, leite, farinha e alguns temperos, nomeadamente a salsa. A confeção dos recheios compreende um processamento térmico dos materiais crus a uma temperatura aproximadamente dos 80 ºC cerca de 20 minutos. Em seguida procede-se ao envolvimento da massa, preparada à base de 53