Avaliação do perfil de mutações e resistência aos inibidores de transcriptase reversa e protease em pacientes pediátricos infectados pelo HIV-1

Transcrição

1 Avaliação do perfil de mutações e resistência aos inibidores de transcriptase reversa e protease em pacientes pediátricos infectados pelo HIV-1 CAMILA ALVES TONAMI Botucatu 2014

2 Camila Alves Tonami Avaliação do perfil de mutações e resistência aos inibidores de transcriptase reversa e protease em pacientes pediátricos infectados pelo HIV-1 Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista Julio de Mesquita Filho, Campus de Botucatu, para obtenção do titulo de Mestre em Pesquisa e Desenvolvimento: Biotecnologia Médica Orientadora: Profa. Dra. Rejane Maria T. Grotto Botucatu 2014

3 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE - CRB 8/5651 Tonami, Camila Alves. Avaliação do perfil de mutações e resistência aos inibidores de transcriptase reversa e protease em pacientes pediátricos infectados pelo HIV-1 / Camila Alves Tonami. - Botucatu, 2014 Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina de Botucatu Orientador: Rejane Maria T. Grotto Capes: AIDS (Doença) em crianças - Tratamento. 2. Crianças - Doenças - Diagnóstico. 3. HIV (Virus). 4. Agentes antirretrovirais. Palavras-chave: Crianças; HIV-1; Mutações; Resistência.

4 Dedicatória Dedicatória

5 Dedicatória Dedico essa dissertação aos meus pais Cyro e Neide e aos meus irmãos Jorge e Daniel.

6 Agradecimentos Agradecimentos

7 Agradecimentos Agradeço primeiramente a meu pai e a minha mãe, que me educaram e me deram a oportunidade de estudar em bons colégios, o que me possibilitou realizar meu sonho de estudar medicina e trabalhar em uma área que me dá muita satisfação. Aos meus irmãos por estarem presentes sempre. À Profa Dra Maria Inês de Moura Campos Pardini, pela oportunidade oferecida a mim e ajuda nas ideias iniciais para elaboração do meu mestrado. À minha orientadora, Profa. Dra. Rejane Maria T. Grotto, pelos ensinamentos durante o mestrado, pela dedicação, apoio, incentivo e por ter me mostrado mais profundamente uma parte importante do atendimento ao paciente, a parte do Laboratório. Ao Prof Dr Jaime Olbrich Neto, por todo o incentivo, apoio, e ajuda durante todas as etapas do meu mestrado. A Profa. Dra. Lenice do Rosário de Souza, pelo apoio e ajuda avaliando os exames dos pacientes do meu estudo. A todos os funcionários do Laboratório de Biologia Molecular que realizaram os exames dos pacientes do meu estudo, e que estavam dispostos a me ajudar em todos momentos que precisei de resultados laboratoriais, em especial a Sarita, Aline e Maércio, envolvidos diretamente no meu estudo. Aos professores que compõem o curso de Mestrado Profissional do Programa de Pós-Graduação em Pesquisa e Desenvolvimento (Biotecnologia Médica). À Janisse, secretária do programa de pós-graduação pela disponibilidade e prontidão em ajudar em todos os momentos, durante o mestrado. Aos colegas da turma de mestrado pela amizade e pelos bons momentos que dividimos durante as disciplinas. Aos meus amigos, que me deram apoio, orientações e que tiveram paciência em aguentar meus momentos de ausência, de estresse e nervosismo durante o período do mestrado.

8 Resumo Resumo

9 Resumo Apesar dos grandes avanços que conduziram a um declínio da infecção pelo HIV em crianças, a terapêutica antirretroviral vem sendo limitada pela emergência de resistência. Neste contexto, a finalidade deste estudo foi avaliar o perfil de mutações e resistência aos inibidores de transcriptase reversa análogos de nucleosídeos (ITRN) e não análogos de nucleosídeos (ITRNN) protease (IP) das variantes virais circulantes em pacientes pediátricos atendidos no Ambulatório de Imunologia Pediátrica da Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP. Foram avaliados dezenove pacientes, sendo dezesseis com falha terapêutica e, três virgens de tratamento. RNA viral plasmático foi utilizado como fonte para genotipagem das regiões genômicas da transcriptase reversa (TR) e protease (PR) do HIV. Os resultados demonstraram prevalência do subtipo B (78,95%). As mutações de resistência aos ITRNs encontradas em maior frequência foram L214F (73,7%), M184V (42,1%), R211K (42,1%), M41L (31,5%), T215Y (31,5%), L210W (21%), V118I (21%). As mutações K103N e Y188L encontradas em 26,3% e 10,5% dos pacientes foram as mais freqüentes entre as mutações associadas ao uso dos ITRNNs. Quanto aos IPs as mutações mais frequentes foram M36I (63,1%), L63P (52,6%), E35D (47,3%), R41K (31,5%), I13V (31,5%), M46V (26,3%), L90M (26,3%), I93L (26,3%), V77I (26,3%), V82A (21,1%), I54V (21,1%). No que se relaciona ao perfil de resistência, 3TC, AZT, EFV e NVP foram os ITR com menor potencial de uso devido à resistência. Já os IPs apresentam grande potencial de utilização na população estudada, o que se justifica pela alta barreira genética destes medicamentos. Dos três pacientes não tratados, um apresentava resistência a EFV e NVP, sugerindo ocorrência de resistência transmitida. Novos estudos devem ser conduzidos a fim de avaliar o real significado destes achados. Palavras-chave: HIV-1, crianças, mutações, resistência.

10 Abstract Abstract

11 Abstract Although great progresses lead a decline of the HIV infection in children, the antiretroviral therapy has found obstacles as the resistance emergency. In this context the goal of this study was evaluate to the profile of mutations and genotypic resistance to the Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors (NRTI), Nonnucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors (NNRTI) and Protease Inhibitors (PI) in children assisted in the Pediatric Immunology Ambulatory, Botucatu School of Medicine. Patients (19) were evaluated (16 with therapeutic failure and 3 naïve). Viral RNA was used as source to RT and PR genomic regions genotyping. Subtype B was the most frequent (78.95%) in thi study. The NRTI resistance mutations found were L214F (73.7%), M184V (42.1%), R211K (42.1%), M41L (31.5%), T215Y (31.5%), L210W (21%), V118I (21%). K103N and Y188L were found in 26.3% e 10.5% and we are associated with NNRTI use. About the PI the mutations most frequent were M36I (63.1%), L63P (52.6%), E35D (47.3%), R41K (31.5%), I13V (31.5%), M46V (26.3%), L90M (26.3%), I93L (26.3%), V77I (26.3%), V82A (21.1%), I54V (21.1%). The ARVs resistance analysis showed that 3TC, AZT, EFV and NVP have the lower potential for use due to resistance. PI presented great potential for use due to high genetic barrier. From three naïve patients one presented resistant viral variants to EFV and NVP, suggesting transmitted resistance. New studies should be performed to evaluate these findings. Key-Words: HIV-1, children, mutations, resistance

12 Abreviaturas e Símbolos Abreviaturas e Símbolos

13 Abreviaturas e Símbolos HIV: LTR: gag: env: gp: pol: Vírus da Imunodeficiência Humana Long terminal repeats (repetições terminais longas) group specific antigen (Antígeno grupo específico) envelope glicoproteína polymerase vpr: viral protein r (proteína viral r) tat: vif: nef: transcriptional transactivator (transativador da transcrição) viral infectiv factor (fator de infectividade viral) negative efector (fator regulatório negativo) vpu: viral protein u (proteína viral u) vpx: viral protein x (proteína viral x) TCD4: linfócitos TCD4 CRF: circulating recombinant forms (formas recombinantes circulantes) CDC: CMV: LIP: HAART: ITRN: Centro de Controle e Prevenção de Doenças citomegalovírus pneumonia intersticial linfocítica Highly Active Antiretroviral Therapy (terapia antirretroviral altamente ativa) Inibidor de Transcriptase Reversa Análogo de Nucleosídeos ITRNN: Inibidor de Transcriptase Reversa Não Análogo de Nucleosídeos IP: IP/r: AZT: ABC: 3TC: Inibidor de Protease Inibidor de Protease com ritonavir Zidovudina Abacavir Lamivudina

14 Abreviaturas e Símbolos d4t: ddi: TDF: FTC: NVP: EFV: ETR: DLV: LPV/r: FPV: TPV: DRV: IDV: NFV: SQV: ATV: T-20: RAL: ETR: TR: PR: Estavudina Didanosina Tenofovir Emtricitabina Nevirapina Efavirenz Etravirina Delavirdina Lopinavir/ritonavir Fosamprenavir Tipranavir Darunavir Indinavir Nelfinavir Saquinavir Atazanavir Enfuvirtida Raltegravir Etravirina Transcriptase Reversa Protease RENAGENO: Rede Nacional de Genotipagem TARV: ARV: Terapia antirretroviral Antirretroviral

15 Sumário Sumário

16 Sumário INTRODUÇÃO Inibidores da Transcriptase Reversa Análogos de Nucleosídeos (ITRN) Inibidores da Transcriptase Reversa Não-Análogos de Nucleosídeos (ITRNN) Inibidores de Protease Inibidores de Fusão Inibidores de Integrase OBJETIVOS CASUÍSTICA E MÉTODOS METODOLOGIA RESULTADOS E DISCUSSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 54

17 Introdução 16 Introdução

18 Introdução 17 Nos últimos anos verifica-se uma tendência de declínio nos casos de aids em crianças menores de cinco anos, sendo detectada uma taxa de 3,4 casos por habitantes em 2012, em contraste a 5,4 casos por habitantes de 2011, porém a taxa de prevalência da infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) na população jovem mostra uma tendência crescente. A taxa de detecção de casos de aids na faixa etária de 15 a 24 anos no Brasil em 2012 foi de 11,8 casos por habitantes, 10,9 casos por habitantes em 2011 e uma taxa de incidência de 9,5 casos por habitantes no ano de Foram notificados 4118 casos nessa faixa etária, a maioria na Região Sudeste (39,8%), seguidos pela Região Nordeste (20,3%), Sul (19%), Norte (12,4%) e Centro-Oeste (8,5%) (BRASIL, 2013). Entre 1980 e 2011 foram notificados casos de aids em crianças menores de cinco anos, os quais se distribuíam de forma heterogênea pelo país, (52,3%) na região Sudeste, (24,8%) na região Sul, (12,4%) na região Nordeste, 771 (5,4%) na região Norte e 723 (5,1%) na região Centro-Oeste (BRASIL, 2011). Ao longo dos últimos 10 anos, observou-se uma redução de 35,8% da taxa de incidência de aids em menores de cinco anos, o que reforça a eficácia da política de redução da transmissão vertical do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) aplicada pelo Ministério da Saúde (BRASIL, 2013). Em relação às regiões do país, registrou-se aumento da taxa de incidência de aids em crianças menores de cinco anos nas regiões Norte e Nordeste, com queda nas regiões Sudeste, Sul e Centro-Oeste. Entretanto, em relação aos adolescentes com idade entre 13 e 24 anos, há uma tendência crescente no número de casos, com transmissão por relação sexual (63,7%), ou pelo uso de drogas injetáveis (17,6%). Com relação aos casos de aids em menores de treze anos, foram notificados 277 casos no Brasil em 2012, sendo 99,6% por transmissão vertical (BRASIL, 2013). Apesar do declínio no número de casos de transmissão vertical no Brasil, esta via de transmissão ainda se faz presente entre casos descobertos tardiamente em crianças acima de 13 anos. Em 2010, dos 518 casos de transmissão vertical diagnosticados no país, 165 foram em adolescentes de 13 anos ou mais (31,8%). O número de casos notificados no período de 1980 a

19 Introdução 18 junho de 2011 em menores de 13 anos foi , dentre esses casos, casos (85,8%) foram por transmissão vertical (BRASIL, 2011). O HIV é um retrovírus da família Lentiviridae, capaz de provocar infecção latente em longo prazo e efeitos citopáticos em curto prazo. Uma partícula infecciosa do HIV consiste de dois filamentos de RNA idênticos, de aproximadamente 9,2Kb de comprimento, envoltos por um capsídeo protéico, o qual é, ainda, circundado por um envelope lipoprotéico (ABBAS; LITCHMAN, 2005). Foram identificados dois tipos de HIV, HIV-1 e HIV-2. O HIV-1 é subdividido em M (Major), O (Outlier) e N (New), sendo o grupo M ainda subdividido em subtipos A-D, F-H, J e K com diferentes distribuições geográficas. O subtipo A predomina em áreas da África Central e Oriental, e Europa Oriental, o subtipo B nas Américas, Europa Central e Ocidental, Austrália e, em vários países do sudoeste da Ásia, norte da África e Oriente Médio. O subtipo C está presente nos países nos quais o vírus HIV-1 representa 80% das infecções, no sul da África e Índia (BUONAGURO; TORNESELLO; BUONAGURO; 2007). O genoma do HIV (Figura 1) possui a estrutura básica a todos os retrovírus conhecidos, sendo seu genoma de RNA flanqueado por duas regiões longas não traduzidas, as Long Terminal Repeats (LTRs). O genoma do HIV é constituído por sequências gag (group-specific antigen), que codificam as proteínas estruturais do core; sequências env (envelope), codificando as glicoproteínas gp120 e gp41 do envelope, necessárias para infecção das células; e sequências pol (polymerase) codificando a transcriptase reversa, protease e integrase, necessárias para replicação viral. Além destes genes comuns aos retrovírus, o HIV-1 também incorpora seis outros genes regulatórios e/ou acessórios incluindo vpr (viral protein r), que promove o transporte nuclear do DNA viral, tat (transcriptional transactivator), faz a extensão dos transcritos virais, vif (viral infectivy fator), responsável por elevar a infectividade viral, nef (negative effector), que regula negativamente a expressão do CD4 na superfície das células hospedeiras e, facilita liberação do vírus pelas células, e vpu (viral proteins u), que também regula negativamente a expressão de CD4 na superfície das células do hospedeiro. O HIV-2 contém

20 Introdução 19 esses genes com exceção do vpu, o qual é substituído pelo vpx (ABBAS; LITCHMAN, 2005). Figura 1: Representação esquemática do genoma do HIV, evidenciando os três genes estruturais gag, env e pol e; os genes acessórios e regulatórios (vif, vpr, vpu, tat, rev e nef) além das duas sequências terminais longas (LTR) que flanqueiam o genoma viral. Referência: Adaptado de A replicação do vírus tem início pela ligação da gp120 do envelope viral às moléculas de CD4 na superfície da célula alvo. Depois desta interação inicial, ocorrem mudanças conformacionais na gp120 que permitem a interação com correceptores CCR5 e/ou CXCR4. A fusão do envelope viral e da membrana da célula hospedeira ocorre pela ação da gp41. Uma vez que o vírus penetra na célula, tem início a replicação viral (DYBUL, 2005). O genoma de RNA é transcrito para DNA de dupla fita pela transcriptase reversa viral e, o DNA é direcionado ao núcleo celular. A integrase viral catalisa a integração do DNA viral no genoma celular. O DNA do HIV integrado ao genoma celular (provírus) pode permanecer transcricionalmente inativo durante meses ou anos, originando uma infecção latente. O início da transcrição gênica do HIV nas células T se relaciona à ativação fisiológica da célula T por antígenos ou citocinas, conduzindo a elevação da carga viral. O produto do gene pol é uma proteína precursora que é clivada para formar sequencialmente as enzimas transcriptase reversa, protease e integrase. O gene gag codifica uma poliproteína de 55KD que pela ação da protease viral é clivada proteoliticamente nos polipeptídios p24, p17 e p15, necessários para a montagem das novas partículas virais. A produção do vírus maduro está associada à lise da célula e constitui um efeito citopático do HIV (DYBUL, 2005).

21 Introdução 20 Figura 2: Esquema ilustrativo da estrutura do HIV, evidenciando duas fitas idênticas de RNA viral, enzima transcriptase reversa no interior do capsídeo, o qual é circundado pelo envelope lipoproteico com as proteinas gp120 e gp41. Referência: A cada ciclo replicativo viral ocorrem mutações no genoma viral, as quais não são corrigidas pela ausência de atividade de reparo da transcriptase reversa, o que contribui para a alta variabilidade genética do HIV. Assim as altas taxas de replicação com elevadas chances de mutações e recombinações conduzem a erros na incorporação dos nucleotídeos que não são corrigidos (BEBENEK, 1998). O acúmulo de mutações no genoma do HIV resulta em populações distintas, mas geneticamente relacionadas em um mesmo indivíduo, são as quasispecies (COFFIN, 1995; HEMELAAR et al., 2004). As mutações que ocorrem durante a replicação viral em variantes circulantes em indivíduos infectados com dois ou mais subtipos de vírus podem conduzir ao aparecimento de formas recombinantes circulatórias (CRF), contribuindo ainda mais para a variabilidade genética do vírus. A circulação de múltiplos subtipos do HIV e CRFs eleva a probabilidade de superinfecção e, conduz a formação de vírus recombinantes podendo alterar também as enzimas protease e transcriptase reversa, principais alvos dos antirretrovirais (BUONAGURO; TORNESELLO; BUONAGURO, 2007). Apesar dos recentes avanços no ramo diagnóstico e terapêutico obtidos com o desenvolvimento de metodologias mais sensíveis para diagnóstico e acompanhamento da doença e, da liberação de novas drogas para a utilização

22 Introdução 21 clínica, a infecção pelo HIV ainda constitui um problema de saúde pública (UNAIDS, 2007). Na ausência de uma terapêutica eficiente os pacientes infectados pelo HIV apresentam uma queda crescente do nível de células T CD4 e um controle de viremia ineficaz verificado pelos níveis elevados da carga viral plasmática. Neste cenário, o paciente apresenta um quadro que clinicamente pode ser definido como aparecimento de doenças oportunistas de natureza infecciosa e neoplasias (MOIR; CHUN; FAUCI, 2010). Na criança este quadro é, ainda, mais complexo. A progressão da doença na infecção pelo HIV é mais rápida em crianças que em adultos sendo o período de latência menor e, os parâmetros laboratoriais (contagem de células T CD4 e carga viral plasmática) menos sensíveis para conduzir o risco de progressão, especialmente em menores de 12 meses de idade. Devido ao elevado risco de progressão da doença e evidência de eficácia do tratamento precoce, é recomendado iniciar o tratamento em todas as crianças menores de 12 meses, independente dos sintomas clínicos, classificação imunológica ou carga viral (BRASIL, 2009). Nos maiores de 12 meses, o tratamento deve ser iniciado considerando primariamente critérios clínicos. O centro de controle e prevenção de doenças (CDC) utiliza um sistema de classificação para os pacientes infectados que categoriza condições clínicas em N, A, B ou C, os pacientes infectados são incluídos na categoria N quando assintomáticos, na categoria A com linfadenopatia generalizada e/ou com infecção aguda; categoria B quando possuem anemia, neutropenia, plaquetopenia, sepse, meningite, pneumonia, candidíase oral, diarréia, infecção pelo citomegalovirus (CMV), infecção pelo herpes vírus, pneumonia intersticial linfocítica (LIP), febre persistente, nefropatia, toxoplasmose, herpes zoster, varicela, e categoria C quando apresentam infecções bacterianas graves recorrentes, pneumonia por Pneumocystis jiroveci, linfoma, perda de peso maior que 10%, Kaposi, histoplasmose, encefalopatia, criptococose, criptosporidose (Tabela 1) (BRASIL, 2009).

23 Introdução 22 Após a classificação clínica, realiza-se a classificação imunológica da doença, considerando os níveis de linfócitos TCD4, em ausente (1), moderada (2) ou grave (3) (Tabela 2) (BRASIL, 2009). Assim, em maiores de 12 anos o tratamento está indicado naqueles que estão incluídos na categoria clínica B, ou seja, que apresentem sinais e sintomas moderados ou C, aqueles com sinais e sintomas graves associados ou não a critérios laboratoriais, principalmente os níveis de linfócitos TCD4 (Tabela 3). Para as crianças incluídas na categoria A ou N, sem repercussões clínicas, a indicação do tratamento deve ser considerada se a carga viral se mostrar acima de cópias de RNA/mL e, os níveis absoluto e relativo de CD4 atingirem valores definidos para cada faixa etária (BRASIL, 2009). Tabela 1: Classificação utilizada para os pacientes infectados pelo HIV segundo condições clínicas Categoria CLASSIFICAÇÃO CLÍNICA N Ausência de sintomas A linfadenopatia, hepatomegalia, esplenomegalia, parotidite IVAS B Hemoglobina inferior a 8g/dl; neutrófilos inferior a 1.000, plaquetas inferior a , sepse, meningite, pneumonia, candidíase oral, miocardiopatia,diarréia, CMV, HSV, LIP, febre persistente, nefropatia,toxoplasmose, zoster, varicela. C Infecções bacterianas graves múltiplas, ou recorrentes, pneumonia por Pneumocystis jiroveci, linfoma de Kaposi, perda de peso superior a 10%, histoplasmose, encefalopatia, micobactérias disseminadas, criptococose, criptosporidíase. HIV: Vírus da Imunodeficiência Humana; IVAS: infecção das vias aéreas superiores; CMV: citomegalovírus; HSV: Herpes Simples Vírus; LIP: pneumonia intersticial linfocítica. Fonte: Adaptada de Recomendações para Terapia Antirretroviral em Crianças e Adolescentes, MS, 2009

24 Introdução 23 Tabela 2: Classificação imunológica da infecção pelo HIV, segundo os níveis de linfócitos T CD4 CONTAGEM DE LINFÓCITOS TCD4 CLASSIFICAÇÃO IDADE Inferior a 12 meses De 1 a 5 anos Superior a 5 anos AUSENTE (1) >1500 (>25%) 1000 ( 25%) 500 ( 25%) MODERADA (2) (15-24%) (15-24%) (15-24%) GRAVE (3) <750 (<15%) <500 (<15%) <200 (<15%) Fonte: Adaptada de Recomendações para Terapia Antirretroviral em Crianças e Adolescentes, MS, 2009 Tabela 3: Critérios de indicação da terapêutica antirretroviral em crianças e adolescentes IDADE CRITÉRIOS RECOMENDAÇÃO <12 meses Independentemente de manifestações Tratar clinicas, CD4 e carga viral 12 e <36 meses Critérios clínicos: categoria CDC B* ou C Critérios laboratoriais: - CD4: <25% ou <750 células/mm3 - Carga viral: > cópias/ml Tratar Tratar Considerar tratamento 36 e <60 meses Critérios clínicos: categoria CDC B* ou C Critérios laboratoriais: CD4: <20% ou <500 células/mm3 - Carga viral: > cópias/ml Tratar Tratar Considerar tratamento >5 anos Critérios clínicos: Categoria CDC B* ou C Critérios laboratoriais: - CD4: <15% ou <350 células/mm3 - Carga viral: > cópias/ml Tratar Tratar Considerar tratamento HIV: Vírus da Imunodeficiência Humana; CDC: Centro de Controle e Prevenção de Doenças; B: com sinais e sintomas moderados; C: com sinais e sintomas graves. *exceto LIP, plaquetopenia, tuberculose pulmonar, febre persistente, pneumonia episódio único.

25 Introdução 24 A abordagem terapêutica na infecção pelo HIV inclui redução da replicação viral, profilaxia das infecções secundárias e tratamento das complicações infecciosas e não infecciosas. As principais mudanças nas últimas décadas foram o desenvolvimento de novas classes de drogas e advento de terapia combinada altamente ativa (HAART) com três ou mais drogas, o que reduziu a mortalidade e morbidade de crianças e adultos infectados pelo HIV (BRASIL, 2009). Os objetivos do tratamento em crianças são: prolongar a vida, reduzindo a mortalidade e morbidade, melhorando a qualidade de vida; assegurar crescimento e desenvolvimento adequados; preservar, melhorar ou reconstituir o funcionamento do sistema imunológico, reduzindo ocorrência de infecções oportunistas que constituem a principal causa de mortalidade; suprimir a replicação do HIV, a níveis inferiores a 40 cópias de RNA viral/ml pelo maior tempo possível, prevenindo ou interrompendo a progressão da doença; utilizar regimes terapêuticos que facilitem adesão e que apresentem baixa toxicidade (BRASIL, 2009). O desenvolvimento de métodos de quantificação de RNA viral propiciou a investigação e comprovação da superioridade da terapia combinada utilizando duas ou mais classes de antirretrovirais. As vantagens da terapia combinada incluem a sinergia entre as drogas, atuação em diferentes etapas do ciclo de replicação viral e redução da emergência de resistência viral com melhora da sobrevida. Ao escolher o esquema deve-se considerar eficácia, supressão sustentada da replicação viral, toxicidade, adesão e limitação para esquemas subseqüentes (BRASIL, 2009). O esquema preferencial é a utilização de dois Inibidores da Transcriptase Reversa Análogos de Nucleosídeos (ITRN) e um Inibidor de Transcriptase Reversa Não Análogos de Nucleosídeos (ITRNN), sendo nevirapina a droga de escolha em crianças menores de três anos e, efavirenz para crianças maiores de três anos e adolescentes pela ausência de dados sobre a utilização da nevirapina em crianças menores de três anos. Um esquema alternativo consiste na utilização de dois ITRN e um inibidor de protease reforçado pelo ritonavir (IP/r) sendo de primeira escolha Lopinavir/Ritonavir (BRASIL, 2009).

26 Introdução 25 Os medicamentos atualmente disponíveis incluem: 1-Inibidores da Transcriptase Reversa Análogos de Nucleosídeos (ITRN): 1.1-Zidovudina (AZT): análogo da timidina; inibe competitivamente a incorporação da timidina ao DNA viral pela ação da transcriptase reversa. Foi o primeiro antirretroviral aprovado nos Estados Unidos em 1987, usado como monoterapia ou terapia combinada, e indicado como uso para prevenção de transmissão vertical nas primeiras seis semanas de vida. Os efeitos adversos incluem anemia, neutropenia, náusea, cefaléia, miopatia, pigmentação de unhas, neuropatia. A resistência associada a zidovudina pode ser conseqüência de mutações de análogos de timidina (TAMs), as quais podem se acumular com o tempo, principalmente com uso da medicação em pacientes em falha terapêutica. 1.2-Abacavir (ABC): é um análogo sintético da guanosina, consiste em um fraco inibidor da DNA polimerase, tendo pouca toxicidade mitocondrial, seu uso está indicado a partir dos três meses de idade. Seu mecanismo de ação consiste na inibição da atividade da transcriptase reversa, gerando a terminação da cadeia de DNA viral, interrompendo o ciclo de replicação viral. Efeitos adversos incluem reações de hipersensibilidade e náuseas, febre, cefaléia, diarréia, rash, fadiga, sintomas respiratórios principalmente nas primeiras seis semanas de uso. A presença de febre, dor abdominal e rash nas primeiras duas semanas do uso levam a necessidade de descontinuação da droga. A diminuição da sensibilidade dessa droga e a resistência são relacionadas às mutações K65R, L74V, Y115F e M184V no gene da transcriptase reversa. 1.3-Lamivudina (3TC): é um análogo da citosina, sofre fosforilação e o metabólito ativo vai competir com a 2 -desoxicitidina 5 -trifosfato pela ligação ao DNA do HIV, e pela ausência do grupo hidroxila na posição 3 a cadeia de DNA não é alongada e não há replicação viral. Os efeitos adversos incluem

27 Introdução 26 náuseas, diarréia, fadiga, dor de cabeça, neutropenia. A mutação de resistência à lamivudina é a M184V do gene da transcriptase reversa. 1.4-Estavudina (d4t): é um análogo da timidina, atua da mesma forma que zidovudina, mas produz mais citotoxicidade. Inibe a atuação da transcriptase reversa por competição pelo substrato natural trifosfato timidina e conduz a terminação da cadeia de DNA. Efeitos adversos incluem neuropatia periférica, pancreatite, lipodistrofia, hepatite, distúrbios gastrointestinais, cefaléia, rash. Associado a didanosina pode causar lipodistrofia, acidose láctica e pancreatite. Seu uso está sendo descontinuado em crianças. 1.5-Didanosina (ddi): é um análogo de adenosina, vai levar a terminação da cadeia de DNA. Pode estar associada a toxicidade mitocondrial. Efeitos adversos incluem neuropatia periférica, pancreatite, náusea, diarréia. Associado a estavudina pode causar lipodistrofia e pancreatite. 1.6-Tenofovir (TDF): é um derivado da 5 monofosfato de adenosina, inibe a atividade da transcriptase reversa por competir com substrato natural desoxiadenosina 5-trifosfato e, constituir um terminador de cadeia, conduz a terminação da cadeia de DNA. Seu uso indicado em adolescentes com mais de 40 Kg. Efeitos adversos incluem cefaléia, vômitos, náuseas, desmineralização óssea, disfunção tubular renal. É verificada resistência à medicação com presença da mutação K65R. Há boa atividade na presença da mutação Q151M. 2-Inibidores da Transcriptase Reversa Não-Análogos de Nucleosídeos (ITRNN): 2.1-Nevirapina (NVP): uso indicado em crianças para profilaxia de transmissão vertical em mães que não trataram na gestação, associado a zidovudina e para tratamento. É um indutor da enzima hepática CYP3A, liga-se diretamente a transcriptase reversa do HIV, e bloqueia as atividades RNA-dependentes e

28 Introdução 27 DNA-dependentes da DNA polimerase. A nevirapina não atua na transcriptase reversa do HIV-2. Efeitos adversos incluem rash cutâneo, hepatite, síndrome de Steven-Johnson. As mutações na K103N, V106A/M, Y181C, Y188L, G190A/S no gene da transcriptase reversa estão associadas à resistência à nevirapina: 2.2-Efavirenz (EFV): uso em crianças maiores de três anos. Efeitos adversos incluem alterações de humor e sonhos vividos nas primeiras semanas de tratamento, tontura, dificuldade de concentração, hipercolesterolemia, rash. Não deve ser usado em gestantes por risco de defeitos no tubo neural do feto. A mutação de resistência mais comum a essa droga é K103N. 3-INIBIDORES DE PROTEASE: P3A4. Todos os medicamentos dessa classe atuam com inibição do citocromo 3.1-Lopinavir/ritonavir (LPV/r): inibidor de protease preferencial para crianças a partir de 14 dias de vida quando há indicação desse medicamento. Efeitos adversos incluem diarréia, vômitos, cefaléia, náuseas. A principal mutação de resistência é V82A, mas a V32I, e I47A, também estão relacionadas. Essa droga requer combinação de seis ou mais resistências para diminuir sua eficácia. Mutações foram documentadas nas posições 10, 20, 24, 33, 46, 50 (I50V), 53, 54, 63, 71, 73, 76, 84 e 90. Quando as mutações V32I e I47A são encontradas em conjunto com mutações na posição 46, estão associadas com alto nível de resistência do lopinavir/ritonavir. 3.2-Fosamprenavir (FPV): é uma pré-droga do amprenavir, que é inibidor competitivo da protease, impede a progressão da gag do vírus e das poliproteínas precursoras gag-pol. Possui alta barreira genética, ou seja, é necessário um acúmulo de mutações para conduzir a resistência e, baixo nível de resistência cruzada com outros inibidores de protease/ritonavir. Seu uso

29 Introdução 28 leva a uma elevação do colesterol total e triglicérides, superior a observada com o uso de outros inibidores de protease. Está indicado para crianças acima de seis anos de idade sendo alternativa ao uso de lopinavir/ritonavir em intolerância a essa medicação ou resistência. Efeitos adversos: rash cutâneo, parestesia perioral, náusea e diarreia. As principais mutações de resistência ao fosamprenavir são I50V e, menos comumente, I84V. 3.3-Tipranavir (TPV): é inibidor de protease de segunda geração, não peptídico, que inibe especificamente o processamento viral das poliproteínas gag e gag-pol e com isso, bloqueia a formação de vírions maduros. É considerado para uso restrito em resgate terapêutico, para pacientes entre dois e 18 anos incompletos. Efeitos adversos à medicação são vômitos, febre, tosse e diarréia. A mutação mais associada à resistência é I50V. 3.4-Darunavir (DRV): é inibidor da protease não peptídico usado associado à baixa dose de ritonavir para efeito reforçador, apresenta alta barreira genética e é ativo contra HIV multirresistente. Atua inibindo a clivagem das poliproteínas gag-pol do vírus HIV-1, impedindo a formação dos vírus maduros. Também de uso restrito para resgate em pacientes com falha virológica a partir de seis anos. Efeitos adversos incluem rash, náusea, diarréia, cefaléia. A mutação mais associada à resistência é I50V, mas isolada não confere resistência, sendo necessárias duas ou mais mutações. Outras mutações associadas à resistência são: V11I, I54L, G73S, L89V, V32I, L33F, I47V, I54M, L76V, I84V. 3.5-Indinavir (IDV): uso em adolescentes de acordo com o desenvolvimento puberal. Inibe a protease do HIV-1 e HIV-2, é inibidor competitivo da enzima, impedindo a clivagem da poliproteína precursora viral que ocorre durante a maturação da partícula viral recém-formada. As partículas virais imaturas formadas não são infectantes e não estabelecem novos ciclos infecciosos. Efeitos adversos incluem náuseas, dor abdominal, cefaléia, tonturas, hiperbilirrubinemia, e como reações graves, pode causar nefrite e nefrolitíase e exacerbar doença hepática. As principais mutações de resistência ao indinavir selecionados durante a terapia são M46L, V82A e I84V.

30 Introdução Ritonavir: em crianças uso indicado apenas em associação a outros inibidores de protease. Efeitos adversos incluem parestesia perioral, náusea, diarréia, rash. É geralmente usado em doses baixas com outros Inibidores de protease para inibir a citocromo P3 A4, e elevar a biodisponibilidade dos outros IP. 3.7-Nelfinavir: liga-se ao sítio ativo da protease do HIV e evita a quebra das poliproteínas virais, resultando em partículas virais imaturas. Efeitos adversos incluem diarréia (frequente), dor abdominal, síndrome lipodistrófica (pouco frequente), hiperglicemia. Em geral, não é recomendado como terapia inicial pela baixa eficácia em relação aos outros inibidores de protease. A principal mutação de resistência ao nelfinavir é D30N, a mutação L90M também está relacionada, menos comumente. 3.8-Saquinavir: fixa-se ao sítio ativo de ligação das proteases do HIV-1 e HIV-2, funcionando como inibidor seletivo e reversível, impedindo a formação de partículas do vírus. Efeitos adversos incluem diarréia, desconforto abdominal e náuseas, erupções na pele, prurido, cefaléia, vômitos, ulceração da mucosa da boca, fadiga, astenia. As mutações L90M e G48V, estão associadas a resistência a medicação. Não há estudos suficientes que liberem o uso em menores que 16 anos. 4-INIBIDORES DE FUSÃO 4.1-Enfurvitida (T-20): inibidor do rearranjo estrutural da gp41 do vírus, ligandose a essa proteína viral impedindo a fusão entre a membrana celular da célula alvo e o envelope viral, bloqueando a entrada do vírus na célula alvo. Seu uso está indicado em crianças de seis anos a 16 anos. Efeitos adversos incluem reações nos locais de aplicação.

31 Introdução 30 5-INIBIDORES DA INTEGRASE 5.1-Raltegravir (RAL): uso acima de 16 anos. Inibe a atividade catalítica da integrase, enzima produzida pelo HIV necessária para replicação viral. Não é capaz de inibir a citocromo P450. Impede a integração do genoma do HIV no genoma da célula hospedeira. Assim, o vírus não consegue se reproduzir e se replicar. Efeitos adversos incluem tonturas, náuseas, insônia, rash, pancreatite, elevação de enzimas hepáticas e elevação de triglicérides. As vantagens dos esquemas são que no uso de ITRNN o risco de lipodistrofia e de dislipidemia é inferior e, no uso de IP/r há um menor risco de desenvolvimento de resistência devido à barreira genética dessa medicação. A escolha do esquema de tratamento antirretroviral deve ser baseada no resultado do teste de resistência às drogas, que é preconizado para todas as crianças virgens de tratamento. As crianças em uso de dois ITRN que apresentem falha terapêutica devem realizar o teste de resistência às drogas para avaliar a nova terapia antirretroviral a ser instituída. Depois de introduzida a terapêutica mais indicada, dois tipos de resposta terapêutica podem ser observadas: sucesso terapêutico, caracterizado pela máxima supressão viral sustentada, determinada pela carga viral indetectável mantida ao longo do tempo associada à preservação da competência imunológica ou recuperação da mesma, e ausência de sintomas associados ao HIV e; falha terapêutica caracterizada pelo rebote na replicação viral após resposta virológica completa (retorno de carga viral acima de 400 cópias de RNA/mL após período de carga indetectável), por má adesão ao tratamento, associada ou não a falha imunológica (queda de cinco pontos percentuais dos níveis de CD4 ou não aumento de CD4 em 50 células/mm³ no primeiro ano de tratamento) e clínica (deterioração neurológica progressiva, deficiência de crescimento e ocorrência de infecções recorrentes e graves ou doenças associadas a aids após seis meses de tratamento antirretroviral) (BRASIL, 2009).

32 Introdução 31 No entanto, mesmo com o uso regular das medicações pode ocorrer falha terapêutica por problemas de absorção, interações medicamentosas e resistência às drogas. Com o aumento da sobrevida de crianças e adolescentes com HIV, constata-se o aumento da resistência aos tratamentos antirretrovirais, o que tem se tornado uma preocupação. A resistência viral pode ser detectada por testes genotípicos ou fenotípicos. A genotipagem detecta presença de mutações genéticas relacionadas à redução da suscetibilidade as terapias existentes. Já a fenotipagem refere-se à redução da atividade antirretroviral da droga in vitro, mostrando não inibição da replicação viral na presença da droga. Devido a alta replicação do HIV, diariamente são geradas mutações no genoma do vírus. Esses vírus mutantes competem com os selvagens para infectar as células CD4. Na presença de tratamentos inefetivos, os vírus mutantes têm mais chance de infectar as células, uma vez que os vírus sensíveis serão eliminados e os mutantes selecionados, ocorrendo propagação da mutação de resistência (BRASIL, 2009). Existem mutações associadas à resistência que podem ser classificadas em primárias, e secundárias ou acessórias, as primárias são mutações capazes de reduzir sozinha a suscetibilidade de uma droga específica, já a mutação acessória reduz a suscetibilidade da droga quando combinada com a mutação principal, onde a capacidade de replicação do vírus (fitness) aumenta. Além disso, polimorfismos que ocorrem naturalmente entre diferentes subtipos de HIV-1 demonstram enorme importância na terapêutica, uma vez que podem influenciar na resistência a drogas. Os polimorfismos L89M que são observados em subtipos C, F, G e que podem também conduzir a mutações M89I/V, e um polimorfismo V82I no subtipo G é de importância aparente no surgimento de resistência I82 M/T/S após falha terapêutica (DUMANS et al., 2004). A mutação de resistência L90M é comum no subtipo B do Brasil, mas raro no subtipo F (CALAZANS et al., 2005). Polimorfismos na posição 36 na protease podem desempenhar um papel complementar na determinação do aparecimento de mutações de resistência entre os vírus específicos de subtipos diferentes (LISOVSKY et al., 2010).

33 Introdução 32 Estudo realizado em um grupo pediátrico composto por 45 crianças observou que pacientes com infecção comprovada pelo vírus HIV, virgens de tratamento, apresentaram mutações de resistência acessórias ou secundárias (ALMEIDA et al., 2009). Aquelas já em tratamento apresentaram mutações V106 na TR, que associadas e correlacionadas com outras mutações diminuíram a resposta a ETR, mas não aos Inibidores da Transcriptase Reversa Não-Nucleósido (ITRNNs) (VINGERHOETS et al., 2007). Mutações de resistência viral normalmente afetam o fitness viral, ou seja, a capacidade do vírus se reproduzir, mas na presença das drogas antirretrovirais, os vírus com melhores fitness são os mutantes. Quando se suspende a medicação de um indivíduo com falha terapêutica e vírus resistente, os vírus sensíveis reaparecem após oito a doze semanas, mostrando que em condições naturais, os vírus selvagens têm maior fitness que os mutantes (Diaz, 2006). A resistência primária, resistência presente antes do tratamento, pode ocorrer pela transmissão de variantes resistentes e as mutações de resistência podem persistir por longos períodos mesmo sem tratamento. A resistência secundária ocorre por má adesão ao tratamento ou exposição prolongada a antirretrovirais, que pode levar ao acúmulo de mutações de resistência, sendo a principal causa de falha terapêutica em crianças e adolescentes (BRASIL, 2009). A manutenção de um esquema antirretroviral por longos períodos de tempo em pacientes estáveis, mas com carga viral detectável, pode levar ao acúmulo de mutações de resistência, que pode piorar a resposta do indivíduo para combater o vírus com as drogas utilizadas e pode levar a um aumento de resistência cruzada entre drogas. As mutações adicionais, que são selecionadas, vão recuperar o fitness viral levando a um aumento gradativo da carga viral em níveis próximos ou até superiores ao encontrado no início do tratamento desses pacientes, selecionando vírus multirresistentes com poucas possibilidades de resgate terapêutico, e por esse motivo, nos indivíduos com chance de resgate terapêutico, a troca deve ser efetuada assim que possível. Diante desta problemática no Brasil, o Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais do Ministério da Saúde criou, em 2001, a Rede Nacional de

34 Introdução 33 Laboratórios de Genotipagem (RENAGENO) constituída por 23 laboratórios distribuídos pelo território nacional, os quais realizam o teste de genotipagem, que pesquisa mutações em códons específicos associados à resistência aos antirretrovirais. Assim, a partir de 2001 a rede de laboratórios que realiza exames para o acompanhamento da infecção pelo HIV passou a ser constituída pelas Redes Nacionais de Laboratórios para a Contagem de Linfócitos T CD4+/CD8+, a qual avalia o estado imunológico dos indivíduos infectados; de Carga Viral, que realiza a quantificação plasmática do RNA do HIV-1 (carga viral); e de Genotipagem. Esses parâmetros são utilizados no prognóstico dos indivíduos infectados, monitoramento da resposta a terapia antirretroviral (TARV), avaliação da progressão da doença para aids, e a resistência aos ARV durante a falha terapêutica, utilizada para orientar a terapia de resgate. (BRASIL, 2008). A genotipagem é um teste que detecta a resistência genotípica, ou seja, as mutações do HIV, visando avaliar a melhor alternativa de tratamento ou uma reorientação do tratamento de pacientes em falha terapêutica para indicar um tratamento de resgate. Através do teste realizado pela rede nacional de genotipagem (RENAGENO) é possível determinar a prevalência de mutações e sua relação com o estadiamento clínico, exposição prévia aos medicamentos e aos esquemas utilizados no momento do exame. O teste de genotipagem deve ser avaliado em conjunto com os dados clínicos e com a história de uso de antirretrovirais, pois após um período de suspensão das medicações, as mutações podem desaparecer e por esse motivo a amostra de sangue deve ser colhida na vigência do esquema terapêutico que se deseja avaliar. Em pacientes que apresentem resistência a múltiplos antirretrovirais, deve ser mantido a melhor combinação possível, já que as variantes do HIV sobre pressão das drogas antirretrovirais tem menor poder de replicação que as variantes virais selvagens, virgens de tratamento. A RENAGENO indica realização do teste para todas as crianças e adolescentes com falha terapêutica virológica, com carga viral acima de 1000 cópias/ml, em uso de terapia antirretroviral regular há pelo menos seis meses antes do exame e para início de terapia antirretroviral (BRASIL, 2009).

35 Introdução 34 O acesso gratuito aos antirretrovirais ARV, garantido a todas as pessoas que vivem com HIV no Brasil e com indicação da terapia, desde 1996 pela Lei 9.313, melhorou significantemente os indicadores de morbidade, mortalidade e qualidade de vida dos pacientes, pela supressão da replicação viral, levando a recuperação ou preservação da função imune e, consequente redução da frequência de infecções e neoplasias oportunistas. No entanto, contribuiu para o desenvolvimento do perfil crônico-degenerativo assumido pela doença e para o aparecimento de variantes virais resistentes ao tratamento. (BRASIL, 2008). Assim torna-se claro que o principal obstáculo em crianças para alcançar a supressão sustentada é a falha na adesão ao esquema de tratamento antirretroviral por erros na administração, esquecimento das doses, suspensões temporárias do tratamento, falta da medicação, toxicidade das drogas e efeitos adversos, uso prévio de antirretrovirais e resistência, presença de comorbidades que impeçam o uso de algum esquema de tratamento, por exemplo, a tuberculose. Com isso, dificulta a abordagem para tratamento dessas crianças, e como agir em casos de presença de mutações de resistência. Existem vários estudos a respeito da influência de mutações de resistência e polimorfismos virais no tratamento da infecção pelo HIV. Contudo, embora tenham sido demonstradas taxas elevadas de resistência aos antirretrovirais (ARV) em crianças que não respondem à terapia (BRINDEIRO et al., 2002), a maioria destes estudos é conduzida em adultos e pouco se sabe sobre esta questão em pacientes pediátricos. Neste cenário, a finalidade deste estudo foi avaliar o perfil de mutações e resistência nas regiões codificadoras da transcriptase reversa e protease do HIV-1 em crianças com infecção pelo HIV.

36 Objetivos 35 Objetivos

37 Objetivos 36 Avaliar o perfil de mutações e resistência aos inibidores de protease e transcriptase reversa em pacientes pediátricos infectados pelo HIV-1 atendidos no Ambulatório de Imunologia Pediátrica da Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP. Inferir sobre o significado da presença das mutações e a terapêutica utilizada pelo paciente. Correlacionar estes dados com parâmetros laboratoriais e clínicos.

38 Casuística e Métodos 37 Casuística e Métodos

39 Casuística e Métodos 38 Foram incluídos neste estudo dezenove crianças com infecção pelo HIV confirmada por testes sorológicos e moleculares, atendidas no Ambulatório de Imunologia Pediátrica da Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP. O número de crianças incluídas no estudo representa a população pediátrica com falha terapêutica atendida e acompanhada no referido ambulatório, e crianças que realizaram genotipagem para início de tratamento e seguimento nesse serviço. A amostra utilizada para execução deste trabalho foi o material excedente da coleta de sangue realizada por ocasião da realização do exame de carga viral, teste de rotina para acompanhamento da infecção pelo HIV, o qual foi armazenado no Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro de Botucatu, Faculdade de Medicina, UNESP. De forma que, todos os pacientes incluídos neste estudo apresentavam solicitação médica para execução do teste de carga viral para o HIV. O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP. MÉTODOLOGIA Todos os procedimentos laboratoriais foram realizados pelo Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro de Botucatu, Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP, ponto executor da RENAGENO. RNA viral extraído do plasma foi utilizado para genotipagem do HIV-1 utilizando o kit comecial Trugene HIV-1 Genotyping Kit (Siemens Healthcare Diagnóstics, Inc. Tarrytown, NY, USA), segundo as especificações do fabricante. Utilizou-se o software OpenGene DNA Sequencing System (Siemens Healthcare Diagnóstics, Inc. Tarrytown, NY, USA), na aquisição e análise das sequências, segundo instruções do fabricante. As sequências obtidas foram analisadas utilizando o Trugene HIV-1 Genotyping, versão 17.0 (Siemens Healthcare Diagnóstics, Inc. Tarrytown, NY,

40 Casuística e Métodos 39 USA), que analisa as diferenças nas sequências de aminoácidos entre o vírus circulante no paciente e o padrão HXB2, internacionalmente aceito como subtipo selvagem do HIV. O relatório resultante desta análise origina dados das regiões do gene pol, PR e TR, sobre mutações principais e acessórias na região da PR, relacionadas ao IP, e mutações de resistência da TR, relacionadas aos ITRNs e ITRNNs. Além disso, os dados relacionados à resistência aos ARVs destas classes são divididos em resistência, possível resistência e sensível. Parâmetros laboratoriais como carga viral, contagem de linfócitos T CD4; clínicos e epidemiológicos foram coletados dos prontuários médicos dos pacientes. O perfil de mutações e resistência foi avaliado em crianças comparativamente ao descrito na literatura e, a um grupo de pacientes adultos já bem caracterizado da mesma região do estudo de Munhoz e colaboradores (2011).

41 Resultados e Discussão 40 Resultados e Discussão

42 Resultados e Discussão 41 No presente estudo quinze (78,95%) pacientes constituíam caso aids de acordo com o critério CDC adaptado, Ministério da Saúde (BRASIL, 2004), apresentando imunodeficiência, e/ou diagnóstico de doença, sinais ou sintomas indicativos de aids e, quatro pacientes (21,05%) eram assintomáticos ao diagnóstico, o qual foi realizado devido ao conhecimento de que a mãe era portadora do vírus. As crianças classificadas como caso aids foram aquelas que apresentaram o maior tempo para o diagnóstico, o que se relaciona, possivelmente, ao diagnóstico tardio da mãe, falha no pré-natal, o que já foi descrito em alguns estudos brasileiros que avaliaram crianças HIV positivas (SILVA, et al., 2010). Neste contexto, o aprimoramento das ferramentas diagnósticas para a criança e clínicas, tanto para a mãe infectada quanto para a criança, representa um papel primordial na modificação deste panorama. Hoje já é bem documentado que a profilaxia precoce da gestante minimiza o risco de transmissão vertical e, quando ocorre transmissão o tratamento precoce da criança minimiza as complicações da infecção pelo HIV (YOSHIMOTO et al, 2005). No âmbito laboratorial, a disponibilização do exame de carga viral plasmática para diagnóstico da criança e, a utilização do teste de resistência às drogas para direcionar a melhor terapêutica quando indicada contribuíram para diagnóstico e tratamento precoce com intenção de minimizar as complicações oriundas da doença. Das crianças avaliadas por este estudo, 57,90% eram do sexo masculino e 42,10% feminino (Tabela 4). Estudos realizados com crianças têm sido controversos no que se relaciona ao sexo. Um estudo realizado em Kentalan, Malásia, que avaliou crianças infectadas pelo HIV em falha terapêutica demonstrou um equilíbrio na frequência em relação ao sexo (MOHAMAD et al, 2012). Por outro lado, na Tailândia um estudo que avaliou mutações de resistência em crianças infectadas demonstrou um predomínio da população masculina (SUNGKANUPARPH et al, 2010). No Brasil, muitos estudos realizados em crianças portadoras de HIV não têm dividido a amostra em relação ao sexo (MACHADO et al., 2005; ALMEIDA, et al., 2009), de forma que a predominância da infecção pelo HIV em relação ao sexo da criança ainda não é bem estabelecida.

43 Resultados e Discussão 42 Tabela 4: Características demográficas e clínicas dos pacientes infectados pelo HIV incluídos no estudo (n=19). Características (N = 19) Idade, mediana 12 anos e 10 meses (IQR) (8 anos e 9 meses 15 anos e 1 mês) Sexo, Masculino [N (%)] 11 (57,90) Tempo de diagnóstico*, mediana 11 anos e 5 meses (IQR) (6 anos e 1 mês 13 anos e 9 meses) Classificação Clínica* [N (%)] Critério CDC (1992) N 2 (10,53) B1 5 (26,31) B2 4 (21,05) B3 2 (10,53) C2 3 (15,79) C3 3 (15,79) Tratamento Antirretroviral* [N (%)] 2 ITRN + 1 ITRNN 03 (15,79) 2 ITRN + 1 IP 13 (68,42) Não Tratado (Naive) 03 (15,79) HIV: Vírus da Imunodeficiência Humana; IQR: Intervalo interquartil; N: número absoluto; ITRN: Inibidor de Transcriptase Reversa Análogo Nucleosídeo; ITRNN: Inibidor de Transcriptase Reversa Não Análogo Nucleosídeo; IP: Inibidor de Protease; CDC: Centro de Controle e Prevenção de Doenças; N: assintomático B1: sinais e/ou sintomas moderados com contagem linfócitos TCD4 entre 500 células/mm3 e 1500 células/mm3 ou mais de acordo com idade; B2: sinais e/ou sintomas moderados com contagem de linfócitos T CD4 entre 200 células/mm3 e 1499 células/mm3 de acordo com idade; C1: sinais e/ou sintomas graves com contagem de linfócitos T CD4 500 células/mm3 e 1500 células/mm3 ou mais de acordo com idade; C2: sinais e/ou sintomas graves com contagem de linfócitos T CD4 entre 200 células/mm3 e 1499 células/mm3 de acordo com idade; C3: sinais e/ou sintomas graves com contagem de linfócitos T CD4 entre 200 células/mm3 e 750 células/mm3 de acordo com idade. *Informação obtida no prontuário médico dos pacientes.

44 Resultados e Discussão 43 Quanto às características virológicas dos pacientes deste estudo 15 (78, 95%) crianças apresentavam vírus HIV do subtipo B e, 04 (21,05%) do subtipo não B (Tabela 5). Estes resultados são concordantes com estudos anteriores realizados no Brasil, nos quais o subtipo B é o prevalente entre crianças infectadas pelo HIV (BRINDEIRO et al., 2002; MACHADO et al., 2004; PEDROSO et al., 2007; ALMEIDA et al., 2009; FERREIRA et al., 2010; MUNHOZ et al., 2011), seguidos do F e mosaicos BF, estes últimos em expansão no Brasil (BRINDEIRO et al., 2002; ALMEIDA et al., 2009; DE OLIVEIRA et al., 2009; MUNHOZ et al., 2011). No presente estudo, dos quatro vírus classificados como não B, três eram mosaicos BF, resultado também similar aos obtidos nos estudos citados. Dos dezenove pacientes incluídos no estudo, todos (100%) eram casos de transmissão vertical, dezesseis (84,21%) estavam em uso de medicamentos antirretrovirais no momento da coleta da genotipagem, e três (15,79%) realizaram o exame pré-tratamento. Dos pacientes avaliados neste estudo dez (52,63%) estavam em seguimento a, em média, 11 anos e, portanto, não estava disponível o teste de resistência às drogas (genotipagem) por ocasião do início de tratamento. Os esquemas com três drogas antirretrovirais usados pelos pacientes do estudo foram os seguintes: d4t, 3TC, LPV/r (37,50%), AZT, 3TC e LPV/r (25,00%), d4t, ddi e EFZ (6,25%), d4t, ddi e LPV/r (6,25%), AZT, ddi e LPV/r (6,25%), d4t, 3TC e EFZ (6,25%), AZT, ddi e EFZ (6,25%), 3TC, TFV e LPV/r (6,25%) (Figura 3).

45 Resultados e Discussão 44 Tabela 5: Características virológicas dos pacientes infectados pelo HIV incluídos no estudo (n=19). Características (N = 19) Subtipo do HIV* [N (%)] B 1 15 (78,95) Não B 2 04 (21,05) Nível de Linfócitos T CD4* [N (%)] Inferior a 250 células/mm 3 Entre 250 e 500 células/mm 3 Entre 500 e 1500 células/mm 3 Superior a 1500 células/mm 3 05 (26,32) 03 (15,79) 10 (52,63) 01 (05,26) Carga Viral do HIV* [N (%)] Inferior a cópias de RNA/mL Entre e cópias de RNA/mL Entre e cópias de RNA/mL Superior a cópias de RNA/mL 04 (21,05) 08 (42,11) 03 (15,79) 04 (21,05) HIV: Vírus da Imunodeficiência Humana; N: número absoluto; *Informação obtida no prontuário médico dos pacientes; 1 Subtipagem segundo a região genômica da protease e transcriptase reversa; 2 F ou Recombinante BF segundo a região genômica da protease e transcriptase reversa.

46 d4t, 3TC, LPV/r AZT, 3TC, LPV/r d4t, ddi, LPV/r d4t, ddi, EFZ AZT, ddi, LPV/r d4t, 3TC, EFZ AZT, ddi, EFZ 3TC, TFV, LPV/r Porcentagem % Resultados e Discussão Esquema de medicações Figura 3: Percentual de pacientes utilizando cada um dos esquemas terapêuticos Com relação à utilização de cada droga individualmente a tabela 6 mostra a porcentagem de pacientes utilizando cada medicamento. Tabela 6: Percentual de pacientes que usam determinado medicamento dividido por classes (n=16). Classe Medicação em uso n Frequência (%) IP LPV/r 13 81,25 3TC 11 68,75 AZT 6 37,50 ITRN d4t 9 56,25 ddi 4 25,00 TDF 1 6,25 ITRNN EFZ 3 18,75 n: número de pacientes do estudo em uso das medicações; IP: Inibidor de Protease; ITRN: Inibidor de Transcriptase Reversa Análogo Nucleosídeo; ITRNN: Inibidor de Transcriptase Reversa Não Análogo Nucleosídeo. Entre os pacientes avaliados, onze já usaram esquemas com as três classes de drogas utilizadas para tratamento das crianças, ITRN, ITRNN e IP, antes de realizar a genotipagem, e dentre esses pacientes, nove usaram esquema duplo no início do tratamento, por ser o tratamento preconizado na