Ocorrência de Aggregatibacter actinomycetemcomitans no biofilme subgengival de crianças com idade de 6 a 12 anos

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1 Artigo Inédito Ocorrência de Aggregatibacter actinomycetemcomitans no biofilme subgengival de crianças com idade de 6 a 12 anos Elerson Gaetti-Jardim JR*, Samira Âmbar Lins**, Silvia Linard Marcelino***, Flávia Sukekava***, Marcelle Marie Buso Ramos**** Palavras-chave gengivite. Bactérias. Crianças. Prevenção. Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Resumo O presente estudo avaliou as condições gengivais, sócio-econômicas e a ocorrência de A. actinomycetemcomitans em 233 crianças com idade entre 6 e 12 anos, em Araçatuba-São Paulo. Na avaliação clínica periodontal foram utilizados os índices de placa e de sangramento a sondagem. A coleta dos espécimes clínicos de biofilme subgengival foi realizada com cones de papel absorvente, que foram introduzidos no interior dos sulcos gengivais sadios ou inflamados, durante 1 minuto, e transferidos para tubos contendo 3ml de VMGA III e para criotubos com 300µl de água ultrapura. As amostras foram cultivadas em ágar TSBV, em anaerobiose, a 37 o C, por 3 dias. A presença desse microrganismo também foi avaliada através de PCR com iniciadores específicos. As condições sócio-econômicas da população estudada foram avaliadas por meio de questionário específico. A maioria das crianças estudadas apresentou gengivite. Verificou-se que a baixa renda familiar e o número de crianças na família estão estatisticamente associados com a gengivite nessas crianças, sendo que a ocorrência de A. actinomycetemcomitans não mostrou correlação com as condições gengivais ou sócio-econômicas da população alvo. * Professor Livre-Docente da Disciplina de Microbiologia e Imunologia da FO Araçatuba-UNESP. ** Mestranda do Curso de Pós-graduação em Estomatologia da FOA-UNESP. Professora da Disciplina de Microbiologia da FOSFS-FUNEC. *** Mestranda do Curso de Pós-graduação em Periodontia da FOUSP. **** Aluna de iniciação científica da FOA-UNESP. Rev. Dental Press Periodontia Implantol., Maringá, v. 2, n. 1, p , jan./fev./mar

2 Ocorrência de Aggregatibacter actinomycetemcomitans no biofilme subgengival de crianças com idade de 6 a 12 anos Introdução As doenças periodontais são amplamente distribuídas na população, representando as principais causas da perda precoce de elementos dentários em adultos, acometendo todas as classes sociais, grupos étnicos, sem distinção de localização geográfica, e se agravam com a idade, sendo que suas primeiras manifestações, por vezes, ocorrem na infância. Nessa fase, as periodontopatias geralmente se manifestam no periodonto de revestimento, raramente produzindo perdas significativas de inserção conjuntiva, atingindo a maioria das crianças antes dos 10 anos de idade 5. Essas patologias estão associadas ao biofilme microbiano, o qual é constituído por membros da microbiota endógena da cavidade bucal, sendo que os danos clinicamente detectáveis das periodontopatias são o resultado da agressão microbiana, direta ou indireta, e de fenômenos inflamatórios e imunologicamente mediados 8. A composição do biofilme microbiano é complexa e diferentes espécies microbianas desempenham um importante papel no desenvolvimento e progressão das periodontopatias, em particular os bastonetes anaeróbios e microaerófilos Gram-negativos, como Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum e Aggregatibacter actinomycetemcomitans, relacionados a outros microrganismos Gram-positivos e negativos 8,16. A distribuição de alguns desses periodontopatógenos ainda possui marcada influência étnico-racial, como A. actinomycetemcomitans, freqüentemente associado com a periodontite agressiva 10. Embora a literatura mostre que a colonização da cavidade bucal por esses cocobacilos pode ocorrer precocemente 15,19, poucas são as informações disponíveis sobre a ocorrência dos principais periodontopatógenos em crianças brasileiras com diferentes condições de saúde gengival e sócioeconômicas, na faixa de 6 a 12 anos. Nessa fase da vida, os contatos externos, particularmente no ambiente escolar, tornam as condições muito favoráveis à transmissão desses patógenos. Assim, o presente estudo teve como objetivo avaliar as condições gengivais de crianças na faixa etária de 6 a 12 anos; verificar a presença dos principais periodontopatógenos na microbiota subgengival das mesmas; bem como correlacionar a presença desses microrganismos e os parâmetros clínicos periodontais. MATERIAL E MÉTODOS Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba-UNESP (Processo FOA ). Grupo amostral Neste estudo, transversal e duplo cego, foram selecionadas aleatoriamente 233 crianças de ambos os gêneros (127 meninos, 54,51%; 106 meninas, 45,49%), sem distinção de raça e nível sócio-econômico, matriculadas em duas escolas municipais da cidade de Araçatuba ou atendidas nas clínicas da Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba-UNESP, entre 2004 e 2006, na faixa etária entre 6 e 12 anos. 38 Rev. Dental Press Periodontia Implantol., Maringá, v. 2, n. 1, p , jan./fev./mar. 2008

3 Elerson Gaetti-Jardim Júnior, Samira Âmbar Lins, Silvia Linard Marcelino, Flávia Sukekava, Marcelle Marie Buso Ramos Os objetivos e a metodologia da pesquisa foram explicados aos pais ou responsáveis, e um roteiro de informações lhes foi entregue, obtendo-se, nesse momento, a assinatura do termo de consentimento informado. As condições sócio-econômicas foram obtidas através de questionário elaborado por assistente social, abordando a renda familiar, número de pessoas que coabitavam no mesmo lar, número de crianças presentes, profissão e grau de instrução dos pais, a postura dos mesmos em relação à saúde bucal dos filhos ou enteados, bem como as práticas e hábitos de higiene bucal, como o uso de creme dental, fio dental e a freqüência com que a higiene era realizada. Foi considerado como critério de exclusão crianças que tivessem utilizado antibiótico em um período inferior a 3 meses antes da coleta da amostras 22 e aquelas com necessidades especiais. Exame clínico A avaliação clínica periodontal das crianças foi realizada por uma periodontista e uma odontopediatra. Para avaliação periodontal foram considerados os parâmetros clínicos de sondagem (bolsas supra e subgengivais), os índices de placa visível e sangramento à sondagem 1, além dos índices subgengivais propostos por Ramfjord 25, sangramento à sondagem (SS), profundidade clínica à sondagem (PS) e nível clínico de inserção (NIC), os quais foram determinados em seis locais para cada elemento dentário (mesiovestibular, vestibular, distovestibular, mesiolingual, lingual e distolingual). As condições de inflamação gengival foram categorizadas como descrito por Costa et al 4. Coleta dos espécimes clínicos de biofilme microbiano A coleta foi realizada com auxílio de cones de papel absorvente esterilizados, que eram introduzidos no interior de sulcos gengivais que apresentavam sinais de inflamação ou sadios, onde permaneciam por aproximadamente 1 minuto 9, sendo, em seguida, transferidos para microtubos contendo água ultrapura Milli Q, para a extração de DNA, e frascos contendo 3mL de meio de transporte VMGA III 18, para o cultivo microbiano. Isolamento bacteriano Todos os espécimes coletados foram transportados para o laboratório e processados dentro de um intervalo máximo de quatro horas. No laboratório, para o isolamento bacteriano, os espécimes transportados eram diluídos em VMGA I e alíquotas de 0,1mL eram plaqueadas em ágar TSBV 28, que era incubado em condições de anaerobiose (90% N % CO 2 ), por 3 dias. A seguir, as colônias características desse microaerófilo eram cultivadas, para obtenção de cultura pura e identificação dos isolados. A identificação microbiana foi realizada através da fermentação de carboidratos, prova da catalase, características morfocelulares, morfocoloniais e, quando necessária, amplificação do DNA através de PCR, empregando-se iniciadores específicos. Rev. Dental Press Periodontia Implantol., Maringá, v. 2, n. 1, p , jan./fev./mar

4 Ocorrência de Aggregatibacter actinomycetemcomitans no biofilme subgengival de crianças com idade de 6 a 12 anos Extração do DNA bacteriano e detecção de microrganismos periodontais por PCR Os DNAs das amostras clínicas foram extraídos pelo kit comercial QIAamp DNA Mini Kit (QIagen, Hilden, Alemanha). Cada amostra foi processada segundo recomendação dos fabricantes. A concentração do DNA bacteriano foi determinada em espectrofotômetro (Beckman, Modelo DU-640), com leitura da absorvância (A 260 nm ). A presença de Aggregatibacter actinomycetemcomitans também foi avaliada pela amplificação do DNA por PCR, utilizando-se iniciadores específicos para cada espécie 2. Os iniciadores utilizados apresentavam a seguinte seqüência de bases: P1 5 -CTA GGT ATT GCG AAA CAA TTT G-3, P2 5 -CCT GAA ATT AAG CTG GT AAT C-3. A amplificação do DNA foi realizada em volumes de 25µl contendo 2,5µl de 10 X tampão PCR, 1,25µl de MgCl 2 (50mM), 2,0µl de dntp (10mM), 0,25µl de Taq DNA polimerase (0,5U), 1,0µl de cada iniciador (0,4µM), 7µl de água ultrapura Milli-Q esterilizada e 10µl de DNA (ng). A amplificação foi realizada em aparelho de PCR (Perkin Elmer, GeneAmp PCR System 2400) programado para: 1 ciclo de desnaturação a 94 o C (5 min.); 35 ciclos de 94 o C (1 minuto.), 60 o C (1 minuto), 72 o C (1 minuto) e 1 ciclo de extensão do DNA a 72 o C (5 minutos). Em todas as reações foram utilizadas DNA da cepa de referência JP2 como controle positivo das reações de amplificação e o marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder (Gene Ruler TM ). Os produtos da amplificação pelo PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1%, 80 V por 2 horas, sendo corados com brometo de etídio (0,5µg/ml) e fotografados sobre transiluminador com luz UV com câmara Kodak (Eletrophoresis Documentation and Analyses System 120). Como controle positivo das reações de amplificação foi utilizado DNA extraído de cepas de referência das espécies bacterianas estudadas. ANÁLISE ESTATÍSTICA As amostras permitiram, através de estatísticas pontuais e intervalos de confiança, caracterizar as crianças segundo os parâmetros clínicos e microbiológicos. Prevalência e análise de risco foram realizadas utilizando-se as estatísticas de Cochran e Mantel-Haenszel (cálculo de odds ratio) para variáveis dicotômicas, ou teste de Qui-quadrado de Pearson para análise de proporções quando as variáveis possuem três ou mais categorias. As inter-relações entre os diferentes parâmetros analisados foram avaliadas por regressão logística multivariada. Os níveis de significância adotados nos testes foram sempre iguais a 5%. RESULTADOS Como apresentado na tabela 1, verificase que a gengivite leve predominou entre as crianças estudadas, enquanto a ocorrência de gengivite grave foi modesta. A ocorrência de perda óssea não foi detectada em nenhuma das crianças examinadas, tampouco se observaram diferenças clínicas ou microbiológicas referentes ao gênero (p = 0,681) ou idade 40 Rev. Dental Press Periodontia Implantol., Maringá, v. 2, n. 1, p , jan./fev./mar. 2008

5 Elerson Gaetti-Jardim Júnior, Samira Âmbar Lins, Silvia Linard Marcelino, Flávia Sukekava, Marcelle Marie Buso Ramos Tabela 1 - Diferentes condições gengivais em crianças com idade entre 6 e 12 anos (n=233). Condição gengival n (%) Gengiva saudável 31 (13,31) Gengivite leve 74 (31,76) Gengivite moderada 95 (40,77) Gengivite severa 33 (14,16) das crianças (p=0,2671). As informações fornecidas nos questionários aplicados, referentes aos hábitos de higiene bucal, não foram compatíveis com as condições de higiene efetivamente detectadas nas crianças. A tabela 2 demonstra a distribuição de crianças e condições gengivais de acordo com a renda familiar, evidenciando que houve correlação estatisticamente significativa entre gravidade de gengivite e crianças cujas famílias apresentavam renda inferior ou igual a dois salários mínimos (p= 0,0027). Tabela 2 - Diferentes condições gengivais em crianças com idade entre 6 e 12 anos (n=233). n (%) RF < _ 2 SM 1 RF > 2 SM 2 Condição gengival N=87 N=146 Gengiva saudável 7 (8,05) 24 (16,44) Gengivite leve 24 (27,59) 50 (34,25) Gengivite moderada 35 (40,23) 60 (41,1) Gengivite severa 21 (24,14) 12 (8,22) 1 Renda familiar menor ou igual a dois salários mínimos. 2 Renda familiar maior do que dois salários mínimos. Rev. Dental Press Periodontia Implantol., Maringá, v. 2, n. 1, p , jan./fev./mar

6 Ocorrência de Aggregatibacter actinomycetemcomitans no biofilme subgengival de crianças com idade de 6 a 12 anos Tabela 3 - Ocorrência de Aggregatibacter actinomycetemcomitans em crianças com idade entre 6 e 12 anos (n=233) apresentando diferentes condições gengivais, independentemente de suas condições sócioeconômicas. Condição gengival (n) Prevalência de Aa 1 n (%) Cultura/PCR Gengiva saudável 1 (3,23) / 8 (25,81) Gengivite leve 4 (5,41) / 17 (22,97) Gengivite moderada 3 (3,16) / 23 (24,21) Gengivite severa 7 (21,21) / 12 (36,36) 1 Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Os resultados obtidos evidenciam correlação significativa entre a ocorrência de gengivite grave e o número de crianças sob responsabilidade da mesma mãe ou cuidadora principal (p=0,0041). Pelos resultados expressos na tabela 3, verifica-se que a detecção de A. actnomycetemcomitans aumentou em função da severidade da condição gengival, mas sem significância estatística. Contudo, significância estatística pode ser observada quando se comparam os resultados obtidos através de cultura e de PCR. Os resultados do presente estudo mostram que a ocorrência desse microrganismo tampouco foi afetada pela condição sócio-econômica da criança e sua família (p=0,0781). DISCUSSÃO As doenças periodontais representam a interação entre uma microbiota complexa, na qual alguns microrganismos possuem a capacidade de lesar o hospedeiro, diretamente ou através de reações inflamatórias, bem como hospedeiros suscetíveis e condições ambientais favoráveis 6,8. Desde que a maioria dessas patologias se inicia precocemente na infância, onde, por vezes, não são diagnosticadas, é necessário que os aspectos clássicos da periodontite também sejam enfatizados para pacientes jovens, como forma de prevenir os danos aos tecidos periodontais. Os resultados evidenciaram que a ocorrência de gengivite se deu em 86,7% das crianças, se aproximando dos resultados encontrados por Martins et al. 17, Coutinho e Tostes 5, Feldens et al. 7 e Xavier et al. 30, sendo que esses últimos autores estudaram os aspectos clínicos e microbiológicos de crianças dessa mesma área geográfica e condição sócio-econômica. Entre os diferentes níveis de gengivite, a gengivite moderada teve uma maior prevalência (40,77% das crianças), seguida pela gengivite leve (31,76%) e severa (14,16%), sendo que apenas 13,3% das crianças não apresentaram evidências clínicas de gengivite. Esses resultados discordam dos encontrados por Zebulum e Cunha 31, que encontraram gengivite em apenas 30,32% da amostra, e Pannain 23 que verificou que 80,60% das crianças apresentavam gengiva completamente saudável. Segundo Tamura et al. 29, o risco de desenvolvimento de doença periodontal está relacio- 42 Rev. Dental Press Periodontia Implantol., Maringá, v. 2, n. 1, p , jan./fev./mar. 2008

7 Elerson Gaetti-Jardim Júnior, Samira Âmbar Lins, Silvia Linard Marcelino, Flávia Sukekava, Marcelle Marie Buso Ramos nado, dentre outros fatores, à colonização precoce da cavidade bucal por periodontopatógenos. Entretanto, os resultados mostraram que não existem diferenças significativas entre as condições gengivais das crianças, aspectos raciais ou o fator gênero. Essa ausência de associação entre a ocorrência de A. actinomycetemcomitans e a severidade de gengivite em crianças e adolescentes também foi observada por Paolantonio et al. 24 e Gafan et al. 11. A ausência de significância para o fator gênero, possivelmente está associada à idade das crianças. Talvez em função desse fator, desde que a maioria das crianças apresentou entre 6 e 10 anos, as diferenças hormonais, conhecidas entre os gêneros, não tenham produzido alterações significativas na microbiota estudada (p = 0,681). Embora outros estudos enfatizem a distribuição diferenciada de A. actinomycetemcomitans em determinados grupos étnicos 12,13,14, os resultados do presente estudo não sustentam essa posição, entretanto, não se pode deixar de se abordar a intensa miscigenação da população brasileira, que cria condições nas quais uma família aparentemente negra possui grande parte de sua ascendência européia, ou o inverso, e o próprio preconceito racial, que faz com que muitos se autodeclarem brancos. Embora Morinushi et al. 19 tenham evidenciado que a ocorrência de níveis detectáveis de A. actinomycetemcomitans está ligada à inflamação gengival, os resultados do presente estudo não suportam esse ponto de vista, para a população estudada, concordando com Okada et al. 22, onde A. actinomycetemcomitans foi detectado em 4,8% das crianças saudáveis, 6,8% das portadoras de gengivite e 20% das portadoras de periodontite, sendo que nesse último caso provavelmente estaríamos diante de pacientes com periodontite agressiva, onde a participação desse microaerófilo é conhecida 20,26. Contudo, a simples presença de periodontopatógenos nos sítios periodontais, normalmente, não leva a um processo inflamatório no periodonto 21, com a perda de inserção conjuntiva e a desorganização desses tecidos. Outros fatores, como predisposição genética, imunossupressão, falta de higiene, consumo de tabaco, desnutrição severa e ausência de espécies bacterianas benéficas, são importantes para aumentar o risco de desenvolvimento das periodontopatias marginais 26. Como apresentado na tabela 3, a prevalência de A. actinomycetemcomitans foi relativamente baixa, como também observado por Okada et al. 22, Paolantonio et al. 24 e Sakai et al. 27, não tendo sido observada nenhuma correlação entre a prevalência de A. actinomycetemcomitans e os parâmetros clínicos e sócioeconômicos analisados. Nesse sentido, A. actinomycetemcomitans estaria mais associado à periodontite propriamente dita, em particular nas suas manifestações mais agressivas 3,10, não sendo freqüentemente isolado de gengivites 21, particularmente nessa faixa etária. Assim, as condições sociais e econômicas em que vivem as crianças da população alvo são mais propícias para o desenvolvimento de gengivite do que a ocorrência de A. actinomycetemcomitans, o que sugere a necessidade de se Rev. Dental Press Periodontia Implantol., Maringá, v. 2, n. 1, p , jan./fev./mar

8 Ocorrência de Aggregatibacter actinomycetemcomitans no biofilme subgengival de crianças com idade de 6 a 12 anos valorizar os aspectos educativos dos programas preventivos para redução da ocorrência e severidade dessas condições clínicas. CONCLUSÕES Com os resultados observados no presente estudo pode-se concluir que: 1) Na faixa etária estudada, 86,69% das crianças apresentavam gengivite, com predomínio de gengivite moderada. 2) A baixa renda familiar e o número de filhos ou dependentes foram os principais fatores associados com a gravidade da gengivite em crianças. 3) A freqüência de isolamento de A. actinomycetemcomitans foi baixa em todas as condições clínicas estudadas e não foi estatisticamente associada ao desenvolvimento da gengivite. Occurrence of Aggregatibacter actinomycetemcomitans in subgengival biofilm of children aged 6-12 years old ABSTRACT The present study evaluated gingival, socioeconomic conditions and the occurrence of Aggregatibacter actinomycetemcomitans in 233 children from 6 to 12 years-old in Araçatuba-São Paulo. In the periodontal evaluation the plaque index and bleeding on probing index were used. Subgingival biofilm samples were taken through sterile paper points, which were transfered to VMGA III or to criotubes with 300µl of ultrapure water. Microbial isolation was carried out using TSBV agar and the occurrence of A. actinomycetemcomitans was also determined by mean of PCR using specific primer pairs. The socio-economic conditions were evaluated by specific questionaire. The vast majority of studied children exihibited gingivitis and it was statistically correlated low income, family s children number and the gingival status of the patients. The occurence of A. actinomycetemcomitans did not show any correlation between gingival or socio-economic conditions and target population. KEY WORDS: Gingivitis, bacteria. Children. Prevention. Aggregatibacter actinomycetemcomitans. 44 Rev. Dental Press Periodontia Implantol., Maringá, v. 2, n. 1, p , jan./fev./mar. 2008

9 Elerson Gaetti-Jardim Júnior, Samira Âmbar Lins, Silvia Linard Marcelino, Flávia Sukekava, Marcelle Marie Buso Ramos Referências 1. AINAMO, J.; BAY, I. Problems and proposals for recording gingivitis and plaque. Int. Dent. J., London, v, v. 25, no. 4, p , AVILA-CAMPOS, M. J.; VELASQUEZ-MELENDEZ, G. Prevalence of putative periodontopathogens from periodontal patients and healthy subjects in São Paulo, SP, Brazil. Rev. Inst. Med. Trop. S. Paulo. São Paulo, v. 44, p. 1-5, CORTELLI, J. R.; CORTELLI, S. C.; JORDAN, S.; HARASZTHY, V. I.; ZAMBON, J. J. Prevalence of periodontal pathogens in Brazilians with aggressive or chronic periodontitis. J. Clin. Periodontol., Copenhagen, v. 32, p , COSTA, B.; LIMA, J. E. O.; GOMIDE, M. R.; ROSA, O. P. S. Clinical and microbiological evaluation of the periodontal status of children with unilateral complete cleft lip and palate. Cleft Palate Craniofac. J., Lewiston, v. 40, p , COUTINHO, T. C.; TOSTES, M. A. Prevalência de gengivite em crianças. Rev. Gaucha Odontol., Porto Alegre, n. 45, v. 3, p , DELANEY, J. E.; KORNMAN, K. S. Microbiology of subgingival plaque from children with localized prepubertal periodontitis. Oral Microbiol. Immunol., Copenhagen, v. 2, no. 2, p , FELDENS, E.G.; KRAMER, P. F.; FELDENS, C. A.; FERREIRA, S. H. Distribution of plaque and gingivitis and associated factors in 3- to 5-year-old Brazilian children. J. Dent. Child., Fulton, v. 73, no.1, p. 4-10, FENG, Z.; WEINBERG, A. Role of bacteria in health and disease of periodontal tissues. Periodontol. 2000, Copenhagen, v. 40, no. 1, p , GAETTI-JARDIM JR, E.; ZELANTE, F.; AVILA-CAMPOS, M. J. Oral species of fusobacterium from human and environmental samples. J. Dent., Copenhagen, v. 24, p , GAETTI-JARDIM JR., E.; BOSCO, J. M. D.; LOPES, A. M.; LANDUCCI, L. F.; GAETTI-JARDIM, E. C.; CARNEIRO, S. R. S. Occurrence of Actinobacillus actinomycetemcomitans in patients with chronic periodontitis, aggressive periodontitis, healthy subjects, and children with gingivitis in two cities of the State of São Paulo, Brazil. J. Appl. Oral Sci., Bauru, v. 14, p , GAFAN, G. P.; LUCAS, V. S.; ROBERTS, G. J.; PETRIE, A.; WILSON, M.; SPRATT, D. A. Prevalence of periodontal pathogens in dental plaque of children. J. Clin. Microbiol., Washington, D. C., v. 42, no. 9, p , HAFFAJEE, A. D.; BOGREN, A.; HASTURK, H.; FERES, M.; LOPEZ, N. J.; SOCRANSKY, S. S. Subgingival microbiota of chronic periodontitis subjects from different geographic locations. J. Clin. Periodontol., Copenhagen, v. 31, p , HAUBEK, D.; DIRIENZO, J. M.; TINOCO, E. M.; CORTELLI, J. R.; LALLY, E. T.; DAVIS, E.; ZAMBON, J. J. Evidence for the role of highly leukotoxic Actinobacillus actinomycetemcomitans in the pathogenesis of localized juvenile and other forms of earlyonset periodontitis. J. Periodontol., Chicago, v. 71, p , HAUBEK, D.; ISMAILI, Z.; POULSEN, S.; ENNIBI, O-K.; BENZARTI, N.; BAELUM, V. Association between sharing of toothbrushes, eating and drinking habits and the presence of Actinobacillus actinomycetemcomitans in Moroccan adolescents. Oral Microbiol. Immunol., Copenhagen, v. 20, p , LAMELL, C. W.; GRIFFEN, A. L.; McCLELLAN, D. L.; LEYS, E. J. Acquisition and colonization stability of Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis in children. J. Clin. Microbiol., Washington, D. C., v. 38, p , LEDDER, R. G.; GILBERT, P.; HUWS, S. A.; AARONS, L.; ASHLEY, M. P.; HULL, P. S., MCBAIN, A. Molecular analysis of the subgingival microbiota in health and disease. Appl. Environ. Microbiol., Washington, D. C., v. 73, p , MARTINS, A. M. A. O.; VIGGIANO, R. D.; HALLA, D. Gengivite em crianças. Rev. Gacúcha Odontol., Porto Alegre, v. 36, n. 2, p , MÖLLER, A. J. Microbiol examination of root canals and periapical tissues of human teeth: methodological studies. Odontol. Tidskr., Göteborg, v. 74, p , Supplement. Rev. Dental Press Periodontia Implantol., Maringá, v. 2, n. 1, p , jan./fev./mar

10 Ocorrência de Aggregatibacter actinomycetemcomitans no biofilme subgengival de crianças com idade de 6 a 12 anos 19. MORINUSHI, T.; LOPATIN, D. E.; VAN POPERIN, N.; UEDA Y. The relationship between gingivitis and colonization by Porphyromonas gingivalis and Actinobacillus actinomycetemcomitans in children. J. Periodontol., Chicago, v. 71, no. 3, p , MULLALLY, B. H.; DACE, B.; SHELBOURNE, C. E.; WOLFF, L. F.; COULTER, W.A. Prevalence of periodontal pathogens in localized and generalized forms of early-onset periodontitis. J. Periodont. Res. Copenhagen, v. 35, p , MÜLLER, H. P.; HEINECKE, A.; FUHRMANN, A.; EGER, T.; ZÖLLER, L. Intraoral distribution of Actinobacillus actinomycetemcomitans in young adults with minimal periodontal disease. J. Periodont. Res., Copenhagen, v. 36, p , OKADA, M.; FUMIKO, H.; NAGASAKA, N. Detection of Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis in dental plaque samples from children 2 to 12 years of age. J. Clin. Periodontol., Copenhagen, v. 27, p , PANNAIN, L. C. Exames clínicos gengivais em escolares de 7 a 13 anos de idade. Rev. Assoc. Paul. Cir. Dent., São Paulo, v. 13, n. 5, p , PAOLANTONIO, M.; BONAVENTURA, G.; PLACIDO, G.; TUMINI, V.; CATAMO, G.; DONATO, A.; PICCOLOMINI, R. Prevalence of Actinobacillus actinomycetemcomitans and clinical conditions in children and adolescents from rural and urban areas of central Italy. J. Clin. Periodontol., Copenhagen, v.27, p , RAMFJORD, S. P. Indices for prevalence and incidence of peridodontal disease. J. Periodontol., Chicago, v. 30, p , RAMS, T. E.; LISTGARTEN, M. A.; SLOTS, J. Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis subgingival presence species-specific serum immunoglobulin G antibody levels and periodontitis disease recurrence. J. Periodont. Res., Copenhagen, v. 41, p , SAKAI, V. T.; CAMPOS, M. R.; MACHADO, M. A. A. M.; LAURIS, J. R. P.; GREENE, A. S.; SANTOS, C.F. Prevalence of four putative periodontopathic bacteria in saliva of a group of Brazilian children with mixed dentition: 1-year longitudinal study. Int. J. Paediatr. Dent., Oxford, v. 17, p , SLOTS, J. Selective medium for isolation of Actinobacillus actinomycetemcomitans. J. Clin. Microbiol., Washington, D. C., v. 15, p , TAMURA, K.; NAKANO, K.; HAYASHIBARA, T.; NOMURA, R.; FUJITA, K.; SHINTANI, S.; OOSHIMA, T. Distribution of 10 periodontal bacteria in saliva samples from Japanese children and their mothers. Arch. Oral Biol., Oxford, v. 51, p , XAVIER, A. S. S.; CAYETANO, M. H.; GAETTI-JARDIM JR., E.; BENFATTI, S.V.; BAUSELLS, J. Condições gengivais de crianças com idade entre 6 e 12 anos: aspectos clínicos e microbiológicos. Pesq. Bras. Odontoped. Clin. Integr., João Pessoa, v. 7, n.1, p , ZEBULUM, S.; CUNHA, J. J. Prevalência da gengivite na criança. Rev. Brás. Odonto., Rio de Janeiro, v. 42, n. 5, p , Endereço para correspondência Elerson Gaetti-Jardim Júnior Rua Jose Bonifácio, 1193 CEP: Araçatuba/SP egaettij@foa.unesp.br 46 Rev. Dental Press Periodontia Implantol., Maringá, v. 2, n. 1, p , jan./fev./mar. 2008