INTRODUÇÃO. R. Periodontia - Março Volume 19 - Número 01. Especialista em Periodontia, Departamento de Periodontia UNITAU

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1 R. Periodontia - Março Volume 19 - Número 01 O IMPACTO DO HÁBITO DE FUMAR SOBRE A CONDIÇÃO CLÍNICA PERIODONTAL E A PREVALÊNCIA DE PATÓGENOS PERIODONTAIS The impact of the habit of smoking on the periodontal clinical status and the prevalence of periodontopathogens Mariana Terreri 1, Sheila Cavalca Cortelli 2, Davi Romeiro Aquino 3, Gilson Cesar Nobre Franco 4, Jonas de Carvalho Filho 5, Juliana Guimarães Santos 5, José Roberto Cortelli 6 RESUMO O objetivo do presente estudo foi avaliar a influência do hábito de fumar sobre a característica clínica periodontal e prevalência de periodontopatógenos em indivíduos adultos. Para esta finalidade, 79 indivíduos (31 fumantes e 48 não fumantes) foram incluídos neste estudo transversal. Parâmetros clínicos periodontais tais como: Profundidade de Sondagem (PS), Nível clínico de Inserção (NCI), Índice de Placa (IP) e Índice gengival (IG) foram mensurados em todos os dentes. Amostras microbianas de mucosa jugal, dorso de língua e sulco gengival foram obtidas e analisadas por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Os indivíduos fumantes apresentaram valores de PS e NCI estatisticamente superiores (p < 0,05) aos não fumantes. C. rectus apresentou maior (p<0,05) prevalência nos indivíduos não fumantes em comparação aos fumantes. Maior prevalência de P. gingivalis e P. intermedia nas amostras de sulco gengival gengival e A. actinomycetemcomitans nas amostras de mucosa jugal foi observada nos indivíduos fumantes (p < 0,05). Conclui-se que o hábito de fumar esteve relacionado a uma pior condição periodontal e maior prevalência de importantes periodontopatógenos, tais como P. gingivalis, P. intermedia e A. actinomycetemcomitans. UNITERMOS: Periodontite, Bactérias, Reação em Cadeia da Polimerase, Tabagismo. R Periodontia 2009; 19: Especialista em Periodontia, Departamento de Periodontia UNITAU 2 Professora do Departamento de Periodontia UNITAU 3 Doutorando em Periodontia, Departamento de Periodontia UNITAU 4 Professor do Departamento de Biologia Odontológica UNITAU 5 Assistente de Pesquisa, Departamento de Biologia Odontológica UNITAU 6 Professor do Departamento de Periodontia UNITAU Recebimento: 26/09/08 - Correção: 12/12/08 - Aceite: 16/02/09 INTRODUÇÃO A doença periodontal é uma patologia que acomete os tecidos de proteção e sustentação dos dentes, caracterizando-se por inflamação gengival, perda de inserção conjuntiva, formação de bolsa periodontal e reabsorção óssea alveolar. A manifestação, gravidade e progressão desta patologia são determinadas por diversos fatores, tais como: condições sociais, fatores sistêmicos e genéticos, composição microbiana e fatores de risco atuantes (NUNN, 2003). Atualmente, cerca de 600 espécies bacterianas podem ser detectadas em amostras de cavidade bucal humana. Normalmente, 30 a 40 gêneros bacterianos podem ser isolados de uma única amostra subgengival (PASTER et al., 2006; SOCRANSKY, HAFFAJEE, 2002; KAZOR et al., 2003). Dentre os diversos patógenos relacionados com a doença periodontal, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella forsythia e Campylobacter rectus podem ser encontrados em indivíduos portadores de diferentes tipos e gravidades de doença periodontal (TANAKA et al., 2002; CORTELLI et al., 2005; BODET et al., 2007). Van Winkelhoff et al. (2001) propuseram uma 76

2 análise comparativa da microbiota subgengival após terapia periodontal entre pacientes fumantes e não fumantes e concluíram que o hábito de fumar pode ser um importante fator na determinação da microbiota subgengival. Em outro estudo, Eggert et al. (2001) sugeriram que em fumantes, mesmo as bolsas rasas (< 5 mm de PS), este hábito já favorece uma maior prevalência de A. actinomycetemcomitans, P.gingivalis e P. intermedia. Porém, neste mesmo ano, Boström et al. (2001) não encontraram diferenças significativas entre a microbiota de fumantes e não fumantes diagnosticados com periodontite avançada. Posteriormente, em 2005, Apatzidou et al. avaliaram o impacto do hábito de fumar na prevalência de patógenos periodontais. Foram examinados 40 indivíduos com periodontite crônica de moderada a avançada, antes e após (6 meses) o tratamento periodontal. Foram coletadas amostras subgengivais e processadas por PCR para P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans, P. intermedia, T. denticola e T. forsythensis. Não foram observadas diferenças estatisticamente significantes na prevalência dos patógenos periodontias entre os indivíduos fumantes e não fumantes nos períodos avaliados. Novamente em 50 indivíduos com periodontite crônica, Gomes et al. (2006) relacionaram os perfis periodontais clínico e microbiano com o hábito de fumar. As amostras subgengivais coletadas foram processadas por PCR em tempo real para P. gingivalis, M. micros, D. pneumosintes e A.actinomycetemcomitans. Os resultados mostraram prevalência similar de P. gingivalis entre os grupos. M. micros e D. pneumosintes apresentaram maiores prevalências nos indivíduos fumantes. Em 2007, Könönen et al. observaram maior prevalência de P. intermedia e T. denticola e menor prevalência de A. actinomycetemcomitans nos indivíduos fumantes em comparação aos nunca fumantes. Pela divergência dos dados aqui apresentados, o hábito de fumar representa um fator de risco para a doença periodontal, todavia cabe ainda elucidar seu real papel na influência da colonização bacteriana e sua possível associação com o desfecho doença. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a influência do hábito de fumar sobre a característica clínica periodontal e prevalência de patógenos periodontais em indivíduos adultos residentes no Vale do Paraíba, São Paulo. MATERIAL E MÉTODO População do estudo: Os participantes avaliados neste estudo foram selecionados a partir de 645 indivíduos que buscaram atendimento clínico nas clínicas de graduação e pós-graduação em odontologia da Unitau, no período compreendido entre agosto de 2004 e julho de O protocolo do presente estudo foi avaliado e aprovado pelo Comitê de Ética em pesquisa da Universidade de Taubaté Unitau (CEP 362/03). Foram excluídos indivíduos submetidos à terapia periodontal 12 meses antecedentes ao início do estudo, aqueles submetidos à antibioticoterapia 6 meses ao início do estudo além dos indivíduos com necessidade de profilaxia antibiótica para a realização de exame clínico periodontal. Determinação da condição periodontal: Exame clínico periodontal foi realizado com espelho plano nº 05, pinça clínica, explorador e sonda periodontal milimetrada tipo Hu Friedy PCP11.5B, por um único examinador previamente treinado e posteriormente calibrado. Para o exame clínico periodontal, foram observados, em 6 pontos por dente (Fetner, 1994), para todos os dentes presentes, excetuando-se os terceiros molares, os valores de Profundidade de Sondagem - PS, Nível Clínico de Inserção - NCI, Índice de Placa IP (Ainamo e Bay, 1975) e Índice Gengival IG (Ainamo e Bay, 1975). Obtenção das amostras microbianas: Foram realizadas coletas bacterianas extrassulculares com swab tamponado de algodão previamente umedecido com solução de Ringer esfregando nas regiões de mucosa jugal do lado esquerdo e dorso da língua. Cada swab foi colocado em um microtubo contendo 1,5 ml de solução de Ringer e mantido a -20 C até seu processamento. Amostras bacterianas intrassulculares, foram coletadas com cone de papel autoclavado nº 30 (Dentsply) dos cinco sítios que apresentassem as maiores profundidades de sondagem de dentes não contíguos em hemi-arcos opostos. Cada dente selecionado para a coleta foi isolado com roletes de gaze estéril e o biofilme dental supragengival removido com algodão estéril. O cone de papel foi inserido na porção mais apical do sulco gengival/bolsa periodontal sendo mantido ai por 60 segundos. Os cinco cones de cada indivíduo foram então colocados em um único microtubo contendo 1,5 ml de solução de Ringer e mantidos a -20 C até seu processamento. Extração do DNA e PCR: Os microtubos foram homogeneizados em agitador mecânico (Vortex, Phoenix, AP56) e centrifugados por 3 minutos (12000 rpm). Após remoção do sobrenadante, 200µL de matriz comercial de extração e purificação de DNA 77

3 Quadro 1 DESCRIÇÃO DOS PRIMERS UTILIZADOS NO PRESENTE ESTUDO Bactéria Primer A. actinomycetemcomitans 5 AAACCCATCTCTGAGTTCTTCTTC3 5 ATGCCAACTTGACGTTAAAT3 P. intermedia 5 TTTGTTGGGGAGTAAAGCGGG3 5 TCAACATCTCTGTATCCTGCGT3 P. gingivalis 5 AGGCAGCTTGCCATACTGCG3 5 ACTGTTAGCAACTACCGATGT3 T. forshytia 5 GCGTATGTAACCTGCCCGCA3 5 TGCTTCAGTGTCAGTTATACCT3 C. rectus 5 TTTCGGAGCGTAAACTCCTTTTC3 5 TTTCTGCAAGCAGACACTCTT3 (Instagene, Bio-Rad ) foram adicionados ao pellet formado. Após homogeneização por 10 segundos, o material foi mantido em banho-maria por 30 minutos a 56 o C. O material foi então novamente homogeneizado por 30 segundos e mantido por mais 8 minutos em banho-maria a 100ºC. A conclusão do processo de extração e purificação deu-se pela homogeneização por 30 segundos e centrifugação por 3 minutos. A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada em termociclador tipo Mastercycler Gradient (Eppendorf ) na seguinte condição: Um ciclo inicial a 95ºC/5 min., 35 ciclos 95ºC/30 seg., 55ºC/30 seg., 72ºC/1 min., e um ciclo final de 72ºC/5 min. Com a finalidade de verificar o sucesso do processo de extração de DNA, todas as amostras envolvidas no presente estudo foram processadas inicialmente utilizando primer específico para o gene da actina humana. As amostras negativas para o gene da actina humana foram novamente submetidas ao processo de extração e posterior amplificação. A partir de DNA extraído de todas as amostras, a presença de A. actinomycetemcomitans, P. intermedia, P. gingivalis, T. forsythia e C. rectus foi avaliada empregando primers específicos (Quadro 1). Para a análise dos produtos amplificados pela PCR foi empregada eletroforese conduzida a 5V/cm 2 em solução tamponada (TAE) por uma hora empregando-se gel de agarose a 1,5% corados com Brometo de Etídio. A visualização foi realizada em câmara de irradiação ultravioleta (UV). Marcador de peso molecular (Ladder 100 Invitrogen ), bem como, controles positivos e negativos foi empregado em todos os geis, os quais foram fotografados e comparados com os produtos amplificados a partir de cepas padrão, cedidos pelo Instituto Fiocruz, RJ. Análise estatística: Análise estatística específica foi conduzida com o auxílio dos softwares Bio Estat 5.0 e SPSS11.0, sempre adotando significância estatística de 95%. Após o estabelecimento das características de distribuição amostral, optou-se pela aplicação do teste estatístico Qui-quadrado para a comparação das frequências dos patógenos periodontais nos grupos avaliados. A avaliação dos parâmetros clínicos periodontais foi conduzida através dos testes Análise de Variância (ANOVA) e t de Student. RESULTADOS Foram incluídos no presente estudo 79 indivíduos, sendo 19 homens e 60 mulheres, 31 fumantes e 48 não-fumantes (Tabela 1). A avaliação comparativa dos parâmetros clínicos periodontais, mostrou que os indivíduos fumantes apresentaram valores de PS e NCI estatisticamente superiores (p<0,05) aos não fumantes (Tabela 2). Tabela 1 DISTRIBUIÇÃO DA POPULAÇÃO ESTUDADA DE ACORDO COM O GÊNERO E HÁBITO DE FUMAR MasculinoN FemininoN TotalNIdade (Média ± DP) FUMANTE ,77±6,82 NÃO FUMANTE ,19±3,09 TOTAL 1931,00±5, ,79±5, ,77±5,54 N número de indivíduos; DP desvio padrão. 78

4 Tabela 2 VALORES MÉDIOS DE PROFUNDIDADE DE SONDAGEM (PS), NÍVEL CLÍNICO DE INSERÇÃO (NCI), ÍNDICE DE PLACA (IP) E ÍNDICE GENGIVAL (IG) FUMANTE NÃO-FUMANTE TOTAL DE ACORDO COM O HÁBITO DE FUMAR DOS INDIVÍDUOS INCLUÍDOS NO ESTUDO PS Média ± DP 2,95±0,82 2,55±0,93 2,67±0,85 NCI Média ± DP 2,87±1,36 2,52±1,25 2,65±1,29 IP Média ± DP 0,61±0,31 0,68±0,22 0,62±0,27 ISG Média ± DP 0,47±0,32 0,52±0,26 0,46±0,25 DP Desvio padrão. * - Diferença estatisticamente significativa (p<0,05), teste ANOVA e t Student. Foi proposta uma avaliação comparativa da prevalência dos patógenos periodontais, nas amostras de sulco gengival/ bolsa periodontal, dorso de língua e mucosa jugal, entre os indivíduos fumantes e não fumantes (Figura 1). Independente do local de coleta, C. rectus apresentouse mais (p<0,05) prevalente nos indivíduos não fumantes quando comparado aos fumantes. Para P. gingivalis e P. intermedia, nas amostras provenientes do sulco gengival/ bolsa periodontal, os indivíduos fumantes apresentaram prevalências estatisticamente superiores (p < 0,05). A avaliação de A. actinomycetemcomitans também se mostrou mais (p < 0,05) prevalente nas amostras de mucosa jugal e sulco gengival/bolsa periodontal dos fumantes. Finalmente, para T.forsythia, com exceção das amostras de dorso de língua, onde foi observada maior (p < 0,05) prevalência para os indivíduos não fumantes, não foi observada diferença estatisticamente significativa entre os indivíduos fumantes e não fumantes para as amostras sulco gengival/bolsa periodontal e mucosa jugal (Figura 1). Foi proposta ainda a avaliação do Odds Ratio dos indivíduos fumantes em comparação aos não fumantes para as bactérias testadas (Tabela 3). Os indivíduos fumantes apresentaram 1,8316 vezes mais chance de apresentar P. gingivalis e 1,6217 de apresentar P. intermedia em comparação aos não fumantes. DISCUSSÃO A identificação de fatores de risco para doença periodontal tem sido objetivo de inúmeras investigações ao redor do mundo. Talvez, o fator de risco mais estudado e relacionado com as patologias periodontais seja o hábito de fumar. Os efeitos do fumo têm sido estudados extensivamente durante anos e sugerem, de maneira geral, uma interferência negativa acentuada nos parâmetros clínicos periodontais (TONETTI, 1998). Geralmente, ao se avaliar fatores de risco, indivíduos fumantes estão associados com um aumento de 2 a 7 vezes no risco de ter periodontite e/ou perda do tecido periodontal quando comparados com controles não fumantes (GELSKEY et al., 1998). Porém, a interferência do hábito de fumar sobre a prevalência de importantes patógenos periodotais como A. actinomycetemcomitans, P. intermedia, P. gingivalis, T. forsythia e C. rectus ainda não está totalmente definida na literatura. Sobretudo, quando se avalia essa interferência em diferentes regiões da cavidade bucal, como sulco gengival/ bolsa periodontal, mucosa jugal e dorso da língua. Dessa forma, esse estudo do tipo transversal objetivou caracterizar o impacto do hábito de fumar sobre a ocorrência desses patógenos periodontais em diferentes habitats na cavidade bucal, relacionando esta ocorrência com parâmetros clínicos periodontais, podendo assim fornecer achados importantes para a melhor compreensão do relacionamento entre fumo, periodontopatógenos e parâmetros clínicos periodontais. Quando da avaliação dos parâmetros clínicos periodontais, na população estudada, observou-se médias estatisticamente superiores (p < 0,05) de PS e NCI para os indivíduos fumantes em comparações aos não fumantes (Tabela 2). Esse impacto sobre os parâmetros clínicos observados no presente estudo estão de acordo com os resultados de diversos pesquisadores (Preber e Bergströn, 1986; Albandar et al., 2000; Chen et al. 2001; Haffajee e Socransky, 2001; Boström et al., 2001; van Winkelhoff et al., 2001; Al-Wahadni e Linden, 2003). Chen et al. (2001), demonstraram que o hábito de fumar esteve associado com um maior aumento na profundidade de sondagem e perda de inserção e que a interrupção desse hábito pode estar relacionado com a melhora da saúde periodontal. Evolução clínica esta também observada por Torrungruang et al (2005). Além do relacionamento do hábito de fumar com os parâmetros clínicos periodontais, alguns autores também o 79

5 R. Periodontia - 19(1):76-83 Figura 1 Prevalência dos patógenos periodontais nas amostras de sulco gengival/bolsa periodontal, dorso de língua e mucosa jugal para os indivíduos fumantes e não-fumantes; * - Diferença estatisticamente significativa p <0,05, teste Qui-quadrado. relacionam com a velocidade de progressão da patologia. A maioria desses autores admite que a progressão da doença periodontal aconteça de forma mais rápida e intensa em indivíduos fumantes (Ojima et al. 2006, Kibavashi et al. 2007, Do et al ) Contrariamente aos resultados observados para PS e NCI, no presente estudo, os índices de placa e gengival não se apresentaram superiores para os indivíduos fumantes. Autores como Bergström et al. (2000) e Van DER WEIJDEN et al. (2001) demonstraram resultados similares. Porém, Jansson e Lavstedt (2002) em um estudo que avaliou 507 indivíduos dentados entre os anos de 1970 e 1990, encontraram maiores valores médios de índice de placa em indivíduos fumantes quando comparados aos não fumantes. Além do índice de placa, Muller et al. (2002) e Al-Wahadni e Linden (2003), também observaram que o sangramento à sondagem e a presença de cálculo foram mais acentuadas em indivíduos fumantes. As prevalências de A. actinomycetemcomitans, P. intermedia, P. gingivalis, T. forsythia e C. rectus foram estabelecidas e comparadas entre os indivíduos fumantes e não fumantes. Reconhecidos como impor tantes patógenos periodontais, A. actinomycetemcomitans, P. intermedia e P. gingivalis apresentaram-se mais prevalentes no sulco gengival/bolsa periodontal de indivíduos fumantes quando comparados a indivíduos não fumantes (Figura 1). Esses resultados são similares aos observados por Van Winkelhoff et al. (2001), onde observaram que o hábito de fumar promove um habitat favorável para a colonização de A. actinomycetemcomitans, P. intermedia e P. gingivalis. Boström et al. (2001) também detectaram que fumantes abrigam maiores níveis de certos patógenos periodontais como A. actinomycetemcomitans e P. gingivalis. Para Gomes 80 periomarço pmd 80 4/9/2009, 5:20 PM

6 Tabela 3 DISTRIBUIÇÃO DO ODDS RATIO DOS INDIVÍDUOS FUMANTES EM COMPARAÇÃO AOS NÃO FUMANTES PARA OS PATÓGENOS PESQUISADOS NO PRESENTE ESTUDO Bactéria Odds Ratio p valor IC C. rectus 0,0957 0,0854 0,01/0,83 P. gingivalis 1,8316 0,0489 1,94/4,49 A. actinomycetemcomitans 2,3154 0,3051 0,66/8,05 P. intermedia 1,6217 0, ,99/3,96 T. forsythia 0,7018 0,6853 0,24/1,97 IC Intervalo de confiança et al. (2006), o hábito de fumar apresenta um impacto determinante tanto sobre a condição periodontal, bem como no perfil microbiológico. No entanto, alguns autores ainda discutem o efeito do fumo sobre a constituição da microbiota periodontal. Para Haffajee e Socransky (2001) e Gajardo et al. (2005), fumantes apresentam apenas pequenos efeitos na microbiota subgengival, e que esses efeitos não são da mesma intensidade daqueles produzidos nos parâmetros clínicos tais como profundidade de sondagem e principalmente sobre o nível clínico de inserção. De maneira geral, os achados apontam para o hábito defumar como um dos mais importantes e característicos fatores de risco para doença periodontal. Seu exato efeito sobre a microbiota periodontopatogênica ainda merece novas avaliações, porém, parece estabelecer um habitat favorável para o desenvolvimento desses patógenos. Estes dados foram confirmados no presente estudo, ou seja, tanto os parâmetros clínicos PS e NCI (Tabela 2), quanto à prevalência de A. actinomycetemcomitans, P. intermedia e P. gingivalis (Figura 1) foram negativamente influenciadas pelo hábito de fumar. Adicionalmente, foi possível identificar um Odds Ratio que caracterizou aumento da chance de detecção de P. intermedia e P. gingivalis em indivíduos fumantes (Tabela 3). Dessa forma, a pesquisa dessas bactérias em indivíduos fumantes antes do desfecho doença, pode ser importante sob o aspecto preventivo, pois se o indivíduo possui o hábito de fumar e é positivo para A. actinomycetemcomitans, P. intermedia e/ou P. gingivalis, ele pode apresentar uma maior chance de desenvolver níveis elevados de PS e NCI, logo, apresentar quadros estabelecidos de doença periodontal. CONCLUSÃO No presente estudo, indivíduos fumantes apresentaram maiores valores de profundidade de sondagem e nível clínico de inserção, além de estarem relacionados com maiores prevalências de A. actinomycetemcomitans, P. intermedia e P. gingivalis no sulco gengival/bolsa periodontal. ABSTRACT The aim of the present study was to evaluate the influence of the habit of smoking on the clinical periodontal status and prevalence of periodontopathogens in adults. 79 individuals (31 smoking and 48 non-smoking) were included in this transversal study. Periodontal assessments included probing depth (PD), clinical attachment level (CAL), gingival index (GI) and plaque index (PI). Microbial samples of cheek mucosa, dorsum of tongue and gingival sulcus were collected and evaluate by PCR technique. PD and CAL values were higher on the smoking individuals compared to non-smoking individuals (p<0.05). The microbial analysis indicated the C. rectus was more prevalent on the non-smoking individuals in all sites collected while P. gingivalis and P. intermedia (gingival sulcus) and A. actinomycetemcomitans (cheek mucosa) were more prevalent on the smoking individuals (p < 0.05). The results suggest that the habit of smoking was related to the worst periodontal clinical status and presence of key periodontopathogens including P. gingivalis, P. intermedia and A. actinomycetemcomitans. UNITERMS: Periodontitis, Bacteria, Polymerase Chain Reaction, Smoking. 81

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