AVALIAÇÃO CLÍNICA E MICROBIOLÓGICA DE INDIVÍDUOS TABAGISTAS E NÃO-TABAGISTAS COM PERIODONTITE CRÔNICA

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1 CENTRO DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO CURSO DE MESTRADO EM ODONTOLOGIA ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PERIODONTIA AVALIAÇÃO CLÍNICA E MICROBIOLÓGICA DE INDIVÍDUOS TABAGISTAS E NÃO-TABAGISTAS COM PERIODONTITE CRÔNICA SÉRGIO EDUARDO BRAGA DA CRUZ 1ª Orientadora: Prof.ª Dr.ª Magda Feres 2ª Orientadora: Prof.ª Dr.ª Luciene Figueiredo Guarulhos 2006

2 ii SÉRGIO EDUARDO BRAGA DA CRUZ AVALIAÇÃO CLÍNICA E MICROBIOLÓGICA DE INDIVÍDUOS TABAGISTAS E NÃO-TABAGISTAS COM PERIODONTITE CRÔNICA Dissertação apresentada à Universidade Guarulhos para obtenção do título de Mestre em Odontologia, Área de Concentração em Periodontia. 1ª Orientadora: Prof.ª Dr.ª Magda Feres 2ª Orientadora: Prof.ª Dr.ª Luciene Figueiredo Guarulhos 2006

3 iii Ficha Catalográfica Elaborada pela Biblioteca Central da Universidade Guarulhos C964a Cruz, Sérgio Eduardo Braga da Avaliação clínica e microbiológica de indivíduos tabagistas e não tabagistas com periodontite crônica./ Sérgio Eduardo Braga da Cruz Guarulhos, SP: Universidade Guarulhos, p.: il.; 30 cm 1 Orientador: Profª Dra. Magda Feres 2 Orientador: Profª Dra. Luciene C. de Figueiredo Dissertação (Mestrado) Universidade Guarulhos. 1. Periodontite. 2. Tabagismo 3. Microbiota subgengival CDD 21. ed.

4 iv Banca Examinadora Prof. Dr. Fancisco H. Nociti Jr. Prof.ª Dr.ª Magda Feres Prof.ª Dr.ª Poliana M. Duarte

5 v Dedico este trabalho aos meus pais Marilene L. Braga da Cruz e João Batista da Cruz que sempre se mostraram fortes em todos meus momentos de fraqueza e que desde a minha infância me deram apoio e amor incondicionais. Vocês serão sempre exemplos de vida, dignidade e honra! Às minhas irmãs Monalisa e Renata Karina que sempre foram excelentes conselheiras nos momentos de incertezas. Muito obrigado! Eu vos amo!

6 vi AGRADECIMENTOS (ESPECIAIS) A Deus pela vida e por ensinar, por meio de toda a Sua sabedoria, que aqui estamos para aprender e compartilhar e, também, que por mais difíceis e tortuosos que forem os caminhos, estes nos tornam mais fortes e nos trazem mais responsabilidades para evoluirmos! Agradeço-Te pela força que me dá a cada dia! À Prof.ª Dr.ª Magda Feres que, além da competente orientação, me transmitiu ensinamentos de valor inestimável. Exemplo de luta que se vence com competência, caráter e evidente amor à profissão! Meus sinceros agradecimentos pela confiança, incentivo e dedicação em me guiar durante esses dois anos no meu sonho de, futuramente, lecionar e pesquisar! Obrigado por ter sido minha orientadora! À Prof.ª Dr.ª Luciene C. Figueiredo, também, pela sua competente orientação, pelos ensinamentos e valores transmitidos que foram e serão de importância fundamental à minha formação profissional e pessoal. Ao Orientador da Vida, Prof. Dr. Jamil A. Shibli, pela amizade, pelo exemplo de força, dedicação, bom-humor e trabalho árduo que eu sempre admirei! À Prof.ª Dr.ª Poliana M. Duarte por ter tido paciência comigo, por ter acreditado em mim e, principalmente, pela amizade e carinho, e pela demonstração de que competência e alegria andam juntas para melhor realizar as tarefas. Ao Prof. Dr. José Augusto Rodrigues pela amizade e pelos ensinamentos fundamentais na área de informática e estatística. À Prof.ª Ms. Maria Letícia B. Pinheiro, da Faculdade de Odontologia do Planalto Central, pela indicação, pelo prazer em ensinar, pela bondade e carinho e pelo estímulo em alcançar os nossos objetivos, mesmo quando estes nos parecem distantes. Aos professores do Mestrado Acadêmico em Odontologia, Prof.ª Dr.ª Sheila C. Cortelli, Prof.ª Dr.ª Cristiane M. Amaral, Prof. Dr. Saulo Geraldeli, Prof. Dr. Marcelo W. Araujo e Prof. Dr. Sérgio Costa por todo o acompanhamento durante o mestrado, amizade e pelos ensinamentos não só na área da Odontologia e Ciência, mas, inclusive, pelos ensinamentos fundamentais à vida e ao meu desenvolvimento. Ao Prof. Ms. Nelson Bagnato, Prof. Ms. Silvio Zerbini, Prof. Ms. Luis Tognoli, Prof. Cel. Moraes, Prof. Ms. Neyl Tavares, Prof. Dr. Geza Nemeth e à Glória Guimarães pela confiança, competência, profissionalismo e por todo o incentivo que me deram durante e depois da minha graduação. A todos os professores, minha eterna gratidão, respeito e admiração! Espero sempre conseguir ser aluno de tudo que me transmitiram, para que, um dia, possa transmitir aos meus. Aos funcionários da Universidade Guarulhos e, principalmente do Mestrado, em especial à Fernanda, Cinthia, Nice, Adriana e ao Monge, que contribuíram, em muito, para os meus trabalhos durante este período.

7 vii Aos amigos e alunos de iniciação científica Fabiano Lee, Tânia e Jussara pela inestimável ajuda e por dividirem parte de seus momentos comigo. À Universidade Guarulhos por investir e acreditar na pesquisa e por oferecer o espaço físico para que pudesse ser realizado este trabalho. Aos voluntários pela compreensão da importância da pesquisa para a melhoria da Odontologia como Ciência e por, às vezes, sofrer pelo nosso (des)conhecimento científico atual para que outros, futuramente, possam ter o melhor. Aos meus amigos e colegas de trabalho, Mestres e futuros Mestres: Adriano Sapata, Flávia Matarazzo, Juliana Lucchesi, Kátia Pestana, Lauren Gursky, Maria Angélica, Sauro Grassi e Thales Colombo. Tenho a certeza de que esta amizade, mesmo que distante há de ser eterna. Foram por demais prazerosas, importantes e felizes a convivência, ajuda e troca de experiências com todos! Ao (futuro) Doutor Marcelo de Faveri, pela competência, esforço, acompanhamento e ajuda incomensuráveis para a realização deste trabalho além da enorme ajuda na estatística deste trabalho. À Bióloga Izilvânia Q. Barreto pelo trabalho, dedicação e ajuda indispensáveis na fase laboratorial deste trabalho. À Dr.ª Josely Moussallem e Dr. Frederico pela competência, ética, profissionalismo e auxílio em um importante passo para que eu não desistisse de mim. À minha família de São Paulo: Norival, Edna, Andréa, Débora e Pedrinho por terem sido tão especiais, amáveis e alegres durante toda a minha estadia nesta cidade. Eu tenho certeza que cresci muito convivendo com vocês! A todos os meus eternos amigos-irmãos de Brasília, Alexandre Learth, Claudia Melo, Ellen Batalhone, Flávia Komeno, Márcio Komeno, Marcos Junqueira, Melina Sales, Paulo Pastore, Rachel Campos, Thiago Santos, Yuri Mestnik e outros tantos amigos que sempre me incentivaram. Agradeço pelo carinho e amor distantes e por me fazer sentir querido a cada volta. À Ana Elisa pelo seu amor, bondade, cumplicidade, amizade e pelo prazer em compartilhar seus raros momentos livres comigo! Mesmo à distância, você é essencial para a minha felicidade! Às minhas irmãs pelo amor e que, em momento algum, me deixaram só, me aconselhando e incentivando nos momentos mais difíceis, mostrando que não só razão alimenta o ser humano; é preciso religiosidade, também. E aos meus pais que sempre me deram todo o apoio ao meu desenvolvimento. Pela dedicação, pelo amor, pela abdicação de necessidades próprias, lutas em prol do melhor para seus filhos (mesmo aquelas que eu não conheci ou não compreendi, por inocência de quando vocês me protegeram) e por todos os exemplos de valores morais dos quais serei eternamente grato! Sem vocês, eu não seria!

8 viii Se você abre uma porta, você pode ou não entrar em uma nova sala. Você pode não entrar e ficar observando a vida. Mas se você vence a dúvida, o temor, e entra, dá um grande passo: nesta sala vive-se! Mas, também, tem um preço... São inúmeras outras portas que você descobre. O grande segredo é saber quando e qual porta deve ser aberta. A vida não é rigorosa, ela propicia erros e acertos. Os erros podem ser transformados em acertos quando com eles se aprende. Não existe a segurança do acerto eterno. A vida é generosa, a cada sala que se vive, descobrem-se tantas outras portas. E a vida enriquece quem se arrisca a abrir novas portas. Ela privilegia quem descobre seus segredos e generosamente oferece afortunadas portas. Mas a vida também pode ser dura e severa. Se você não ultrapassar a porta, terá sempre a mesma porta pela frente. É a repetição perante a criação, é a monotonia monocromática perante a multiplicidade das cores, é a estagnação da vida... Para a vida, as portas não são obstáculos, mas diferentes passagens! Içami Tiba Daquilo que sabes conhecer e medir, é preciso que te despeças, pelo menos por um tempo. Somente depois de teres deixado a cidade, verás a que altura suas torres se elevam acima das casas. Friedrich Nietzsche O que é verdadeiramente imoral é ter desistido de si mesmo. Clarice Lispector

9 ix RESUMO O objetivo do presente estudo foi comparar a composição da microbiota subgengival e os parâmetros clínicos periodontais de indivíduos tabagistas e nãotabagistas com periodontite crônica. Foram selecionados 50 indivíduos, sendo 25 não-tabagistas (grupo NT) e 25 tabagistas (grupo T). Os indivíduos foram submetidos a exame clínico periodontal e microbiológico. Foram avaliados 6 sítios por dente para os parâmetros de índice de placa visível, índice de sangramento gengival, profundidade de sondagem (PS), nível clínico de inserção (NCI), sangramento à sondagem e supuração. De 6 a 12 amostras de biofilme subgengival foram coletadas por indivíduo, sendo 2 a 4 sítios dentro de cada uma das seguintes categorias de bolsa: rasas (PS < 3 mm); moderadas (PS de 4 a 6 mm) e profundas (PS > 7 mm). As amostras foram avaliadas para 38 espécies bacterianas utilizandose a técnica Checkerboard DNA-DNA hybridization. Não houve diferença significativa na média de PS e NCI entre os dois grupos. Os tabagistas apresentaram um menor percentual de sítios com sangramento gengival (T=9,54% + 15,31 e NT=39,44% + 25,13, p<0,001, Teste U de Mann-Whitney) e uma maior freqüência de sítios com NCI > 4 mm (T=60,9% e NT=50,4% - p<0,001, Teste Quiquadrado). Os indivíduos do grupo NT apresentaram valores superiores na média da contagem total de espécies bacterianas (3,2 x 10 7 ) comparados aos do grupo T (2,1 x 10 7 ). Diferenças estatísticas foram observadas (p<0,05, Teste U de Mann-Whitney) apenas para a contagem das espécies S. sanguinis, A. actinomycetemcomitans e L. buccalis, e, também, na média percentual de A. actinomycetemcomitans e L. buccalis, as quais se apresentaram diminuídas para o grupo T. As proporções dos complexos microbianos e a prevalência das espécies avaliadas foram semelhantes entre os grupos. Em conclusão, os resultados deste estudo demonstraram que não houve diferenças marcantes no perfil clínico-microbiológico entre indivíduos brasileiros tabagistas e não-tabagistas com periodontite crônica. Palavras-chaves: microbiota subgengival, doença periodontal, tabagismo.

10 x ABSTRACT The aim of the present study was to compare the composition of the subgingival microbiota and the periodontal clinical parameters of smokers and nonsmokers with chronic periodontitis. 50 subjects were enrolled in this study, 25 nonsmokers (NS group) and 25 smokers (S group). Subjects received clinical and microbiological examination. Six sites per tooth were examined for the parameters of visible plaque index, gingival bleeding index, probing depth (PD), clinical attachment level (CAL), bleeding on probing and suppuration. 6 to 12 subgingival biofilm samples were collected, per subject, from 2 to 4 sites in each of the following PD categories: shallow (PD < 3mm), moderate (PD between 4 to 6 mm) and deep (PD > 7 mm). The samples were evaluated for 38 bacterial species using the Checkerboard DNA-DNA hybridization technique. There were no differences in mean PD and CAL between the two groups. The smokers showed a lower percent of sites with gingival bleeding (S = 9.54% and NS = 39.44% , p<0.01, Mann Whitney U Test) and a higher frequency of sites with CAL > 4 mm (S = 60.9% and NS = 50.4%, p<0.001, Chi-square Test). The subjects of NS group showed higher mean total counts of the bacterial species (3.2 x 10 7 ) compared to S group (2.1 x 10 7 ). Significant statistical differences were observed (p<0.05, Mann Whitney U Test) only for the total counts of S. sanguinis, A. actinomycetemcomitans and L. buccalis and to the mean percent of A. actinomycetemcomitans and L. buccalis, which were reduced in the S group. The proportions of the bacterial complexes and the mean prevalence of the species evaluated were similar between the groups. In conclusion, the results of the present study showed that there were no marked differences for both clinical and microbiological profiles between non-smoking and smoking Brazilians subjects with chronic periodontitis. Key-words: subgingival microbiota, periodontal disease, tabagism/smoking.

11 xi LISTA DE TABELAS Tabela 1. Relação das cepas empregadas para a confecção das sondas de DNA separados por complexos bacterianos Tabela 2. Índice utilizado para a determinação dos níveis dos microorganismos nas amostras de biofilme subgengival Tabela 3. Média + DP dos parâmetros clínicos dos indivíduos do estudo em cada grupo Tabela 4. Freqüência da distribuição dos sítios examinados em indivíduos do grupo NT e T, de acordo com as mensurações das variáveis PS e NCI Tabela 5. Perfil do grupo T em relação ao consumo de tabaco Tabela 6. Distribuição da freqüência de sítios-teste para coleta microbiológica nos dois grupos de acordo com a categoria de PS... 28

12 xii LISTA DE FIGURAS Figura 1. Representação gráfica do Minislot (Immunetics, Cambridge, MA, EUA) e resumo da preparação e deposição das amostras de biofilme subgengival (técnica do Checkerboard DNA-DNA hybridization) Figura 2. Representação gráfica do Miniblotter (Immunetics, Cambridge, MA, EUA) e resumo das etapas de hibridização e detecção das espécies bacterianas presentes nas amostras de biofilme subgengival (técnica do Checkerboard DNA-DNA hybridization) Figura 3. Representação gráfica do padrão de hibridização entre as bactérias presentes nas amostras de biofilme e as sondas de DNA (técnica do Checkerboard DNA-DNA hybridization) Figura 4. Representação esquemática do padrão de hibridização entre as bactérias presentes nas amostras de biofilme e as sondas de DNA (técnica do Checkerboard DNA-DNA hybridization). Nesta figura estão apresentadas 40 bactérias, e as amostras de biofilme são de todos os dentes de um mesmo indivíduo Figura 5. Correlação entre a exposição ao tabaco (número de cigarros x tempo de hábito) e as variáveis clínicas de nível clínico de inserção, profundidade de sondagem e sangramento à sondagem. Correlação de Pearson (α=0,05) Figura 6. Gráfico de barras das médias de contagens (x desvio-padrão) de 38 espécies bacterianas presentes nas amostras de biofilme subgengival dos indivíduos não-tabagistas (grupo NT) e tabagistas (grupo T). Teste U de Mann-Whitney (*p<0,05). Os resultados foram ajustados para comparações múltiplas Figura 7. Gráfico de barras das médias percentuais (% + desvio-padrão) de 38 espécies bacterianas presentes nas amostras de biofilme subgengival dos indivíduos não-tabagistas (grupo NT) e tabagistas (grupo T). Teste U de Mann-Whitney (*p<0,05). Os resultados foram ajustados para comparações múltiplas Figura 8. Média das proporções dos complexos microbianos descritos por Socransky et al. (1998), presentes nas amostras de biofilme subgengival dos indivíduos não-tabagistas (grupo NT) e tabagistas (grupo T). Teste U de Mann-Whitney (*p<0,05). A área dos gráficos foram ajustadas para refletir a contagem total das espécies bacterianas em cada grupo Figura 9. Gráfico de área das médias percentuais (%) de 38 espécies bacterianas presentes nas amostras de biofilme subgengival dos indivíduos não-tabagistas (grupo NT) e tabagistas (grupo T) separados por categoria de profundidade de sondagem (Sítios rasos: < 3 mm; moderados: de 4 até 6 mm; profundos: > 7 mm). Teste U de Mann-Whitney (p>0,05). Os resultados foram ajustados para comparações múltiplas Figura 10. Gráficos de barras das médias das freqüências das 38 espécies bacterianas (% + desvio padrão) presentes nas amostras de biofilme subgengival nos dois grupos (NT Não-Tabagistas e T Tabagistas). Teste U de Mann-Whitney (p>0,05). Os resultados foram ajustados para comparações múltiplas... 34

13 xiii SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA Etiologia da doença periodontal Fumo de tabaco e periodontite crônica Tabagismo como fator de risco para a doença periodontal Alterações fisiológicas sistêmicas e locais associadas ao tabagismo Aspectos clínico-periodontais em indivíduos tabagistas Aspectos microbiológicos em indivíduos tabagistas PROPOSIÇÃO MATERIAL E MÉTODOS Seleção de indivíduos Critérios de inclusão Critérios de exclusão Delineamento experimental Avaliação clínico-periodontal Avaliação microbiológica Seleção dos sítios-teste para análise microbiológica Coleta de amostras de biofilme subgengival Cepas bacterianas e condições de crescimento Isolamento do DNA e preparo das sondas Checkerboard DNA-DNA hybridization Análise estatística RESULTADOS Resultados clínicos Resultados microbiológicos DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS... 51

14 1 1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA A periodontite é uma doença infecciosa e destrutiva dos tecidos de suporte que ancoram o dente aos ossos gnáticos (Palmer et al., 2000; Hujoel et al., 2003) e possui etiologia bacteriana específica (Socransky et al., 1998; AAP, 1999). A periodontite crônica caracteriza-se por uma progressão geralmente de lenta a moderada, indolor, com destruição tecidual compatível com os fatores locais presentes, e por uma maior prevalência em adultos (AAP, 1999). Alguns fatores podem cooperar para o aumento do risco e da severidade da doença periodontal. De acordo com Genco (1996), esses fatores de risco podem ser um aspecto característico de comportamento ou uma exposição ambiental. Há ainda, segundo o mesmo autor, fatores determinantes, os quais não podem ser modificados, tais como idade, gênero e perfil genético. Além de ser apontado como o principal fator de risco e passível de prevenção de inúmeras doenças (Bánóczy & Squier, 2004), o tabagismo tem sido apontado como o fator de risco de maior significância para a infecção periodontal (Bergström, 1989; Bergström & Preber, 1994; Genco, 1996; Kinane & Radvar, 1997; Tonetti, 1998; Rivera-Hidalgo, 2003; Bergström, 2003; Ylöstalo et al., 2004, Torrungruang et al., 2005). Os mecanismos pelos quais o tabagismo e a periodontite se associam ainda não estão completamente claros (Haffajee & Socransky, 2001a; Buduneli et al., 2005). Porém, acredita-se que a maior parte dos efeitos nocivos do cigarro de tabaco é causada por ação sistêmica e não apenas local (Palmer et al., 2000). A nicotina parece ter um efeito de supressão da reação vascular, possivelmente aumentando a vasoconstricção (Bergström et al., 1988; Palmer et al., 2000; Bergström & Boström, 2001). Apesar desta ser a substância mais pesquisada do tabaco, existem diversos outros componentes que são tóxicos ao organismo e às células, mas seus efeitos ainda não são totalmente conhecidos (Palmer et al., 2005). O fumo de tabaco pode promover alterações no ambiente periodontal (Holmes, 1990; Hanioka et al., 2000), no sistema imune específico e de defesa inespecífico que podem interferir na patogênese da doença periodontal (MacFarlane et al., 1992; Numabe et al., 1998; Pauleto et al., 2000; Giannopolou et al., 2003; Rawlinson et al., 2003; Graswinckel et al., 2004; Petropoulos et al., 2004; Charalabopoulos et al., 2005). Além disso, a proliferação de fibroblastos pode estar

15 2 inibida em tabagistas, o que poderia levar a um processo de cicatrização pouco eficiente (James et al., 1999; Checchi et al., 1999). Ainda não existe um consenso em relação à composição da microbiota oral de tabagistas comparada a de não-tabagistas. Enquanto alguns estudos não demonstraram diferenças microbianas significativas entre esses indivíduos (Preber et al., 1992; Boström et al., 2001; Persson et al., 2005), outros sugeriram que o tabaco poderia levar a uma alteração na microbiota bucal (Umeda et al., 1998; Mager et al., 2003), no biofilme supragengival (Kazor et al., 1999) ou no subgengival (Zambon et al., 1996; Umeda et al., 1998; Haffajee & Socransky, 2001b). Com relação aos aspectos clínicos, alguns autores observaram maiores médias de perda óssea, profundidade de sondagem e de inserção periodontais em tabagistas (Grossi et al., 1994; Grossi et al., 1995; Paidi et al., 1999; Haffajee & Socransky, 2001a), enquanto que outros estudos não observaram essas diferenças (Preber et al., 1980; Apatzidou et al., 2005). Além disso, foi relatado que os indivíduos tabagistas com periodontite respondem menos favoravelmente a tratamentos periodontais comparados aos não-tabagistas (MacFarlane et al., 1992; Preber et al., 1995; Kinane & Radvar, 1997; Palmer et al., 1999; Papantonopoulos, 1999, Labriola et al., 2005). Desta forma, o melhor entendimento da microbiota subgengival relacionada a indivíduos tabagistas com periodontite crônica pode levar à elaboração de terapias periodontais mais específicas Etiologia da doença periodontal O biofilme dental é o fator etiológico primário da periodontite (Löe et al., 1965; Socransky & Haffajee, 1994; Nunn, 2003; Ronderos & Ryder, 2004; Socransky & Haffajee, 2005). Existe uma variedade de microorganismos presentes na cavidade bucal, podendo chegar a até 750 espécies diferentes, incluindo filotipos (Kazor et al., 2003). Porém, apenas uma parte dessas espécies é considerada periodontopatogênica (van Winkelhoff et al., 1987; Loesche et al., 1990; Genco, 1996; Socransky et al., 1998; Nunn, 2003; Ronderos & Ryder, 2004). Utilizando técnicas de biologia molecular demonstrou-se que algumas destas espécies bacterianas se desenvolvem, com freqüência, conjuntamente no ambiente subgengival (Grossi et al., 1994; Socransky et al., 1998). Socransky et al.

16 3 (1998) analisaram as associações entre 40 espécies bacterianas presentes na microbiota subgengival de indivíduos com periodontite crônica e definiram cinco complexos bacterianos de acordo com as similaridades por pares e grupos de espécies. Esses complexos foram, assim, organizados em complexo vermelho: Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia (Bacteroides forsythus) e Treponema denticola; complexo laranja, que se mostrou fortemente associado ao complexo vermelho e foi dividido em dois grupos, sendo um central, fortemente relacionado, composto por 3 subespécies de Fusobacterium nucleatum, Fusobacterium periodonticum, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens e Micromonas micros (Peptostreptococcus micros); e outro grupo associado a este, formado pelas seguintes espécies: Eubacterium nodatum, Campylobacter rectus, Campylobacter showae, Campylobacter gracilis, Streptococcus constellatus; complexo verde, composto por Capnocytophaga sputigena, Capnocytophaga gingivalis, Campylobacter concisus, Capnocytophaga ochracea, Eikenella corrodens e Actinobacillus actinomycetemcomitans sorotipo a; complexo amarelo, formado por um grupo de estreptococos: Streptococcus mitis, Streptococcus sanguinis (S. sanguis), Streptococcus oralis; e o complexo roxo, que inclui Actinomyces odontolyticus e Veillonella parvula. As espécies Selenomonas noxia e Actinobacillus actinomycetemcomitans sorotipo b não se correlacionaram com nenhuma outra. As cepas que compõem o complexo vermelho foram fortemente associadas ao sangramento durante a sondagem e às bolsas mais profundas (Socransky et al., 1998). Posteriormente, algumas espécies de actinomicetos (Actinomyces gerencseriae, A. israelii, A. naeslundii 1 e A. naesundii 2) foram agrupadas no complexo azul (Socransky & Haffajee, 2002) Fumo de tabaco e periodontite crônica Tabagismo como fator de risco para a doença periodontal O fumo de tabaco é considerado um importante fator de risco para diversas patologias que acometem o ser humano, inclusive a doença periodontal (Summers & Oberman, 1968; Preber et al., 1980; Bergström & Eliasson, 1987a; Bergström & Preber, 1994; Numabe et al., 1998; Palmer et al., 2005; Susin et al., 2005). Inúmeros trabalhos corroboram uma associação positiva direta da periodontite e a quantidade de cigarros consumidos (Bergström & Eliasson, 1987b;

17 4 Bolin et al., 1993; Dini & Guimarães, 1995; Martinez-Canut et al., 1995; Bergström et al., 2000; Chen et al., 2001; Calsina et al., 2002; Susin et al., 2005; Heitz-Mayfield, 2005). Estudos de periodontite induzida por ligadura em animais sugeriram que a exposição diária à nicotina pode levar a uma redução do fluxo sanguíneo gengival e aumento da perda óssea na região interradicular, e essas associações parecem ser dose-dependente (Nociti et al., 2000; Nociti et al., 2001; Nakamura et al., 2005). Susin et al. (2005) avaliaram fatores comportamentais que poderiam influenciar diretamente nos parâmetros clínicos periodontais em uma população brasileira. No quesito tabagismo, observou-se que indivíduos considerados fumantes moderados ( maços/vida) e pesados (> 7300 maços/vida) possuíam uma maior prevalência (p<0,001) de sítios com profundidade de sondagem > 5 mm (73% e 88%, respectivamente) comparados aos que nunca fumaram (56%). Outros fatores tais como idade, gênero, cor da pele, razão sócio-econômica, diabetes e presença de biofilme interdental apresentaram, por meio de uma análise multi-variada, valores de razão de risco relativo (RRR) não maiores que 2,4, enquanto que indivíduos tabagistas pesados apresentaram um RRR de 6,8 para periodontite generalizada. Estudos longitudinais demonstram que indivíduos tabagistas possuem respostas clínica e microbiológica ao tratamento periodontal cirúrgico e não-cirúrgico aquém do esperado quando comparados a indivíduos não-tabagistas (Apatzidou et al., 2005; Darby et al., 2005). Estas respostas às terapias são tanto piores quanto maior é a exposição ao tabaco (Kaldahl et al., 1996; Grossi et al., 1997; Lieden et al., 1999). É possível, inclusive, observar a correlação entre tabagismo e resposta ao tratamento periodontal, quando se compara indivíduos tabagistas a ex-tabagistas. Alguns trabalhos corroboram a relação benéfica do ato de cessação do tabagismo à resposta terapêutica não-cirúrgica (Grossi et al., 1997; Lieden et al., 1999; Hilgers & Kinane, 2004; Bergström, 2004; Preshaw et al., 2005) Alterações fisiológicas sistêmicas e locais associadas ao tabagismo Diversos mecanismos são atribuídos aos efeitos deletérios do tabagismo na resposta do hospedeiro, apesar destes ainda não serem bem compreendidos. Dentre estes mecanismos podem-se citar alterações vasculares, no sistema de defesa inato e imunológico, no metabolismo celular e no potencial de oxirredução (Palmer et al., 2005; Nakamura et al., 2005).

18 5 As catecolaminas sistêmicas (adrenalina e noradrenalina) são responsáveis pela reação de vasoconstricção. A nicotina promove o estímulo da medula adrenal e de gânglios simpáticos, levando, desta forma, a liberação de catecolaminas. Além disso, diminui a síntese de óxido nítrico, reduzindo o relaxamento do endotélio arterial e, também, é capaz de ligar-se a receptores adrenérgicos, levando, assim, à vasoconstricção (Powell, 1998). Em uma investigação sobre a reação vascular em gengivite experimental, Bergström et al. (1988) avaliaram 16 indivíduos, 8 tabagistas (consumo de 10 a 20 cigarros/dia). Nesse trabalho foi realizada a contagem de vasos visíveis na margem gengival dos voluntários por meio de técnicas fotográficas estereomicroscópicas padronizadas. Os autores encontraram uma intensidade diminuída da reação vascular na ordem de 50% em indivíduos tabagistas comparados àqueles que não fumavam. A cessação do tabagismo pode levar ao aumento da circulação sangüínea no tecido gengival após o terceiro dia (42,9%) e no quinto dia, a um aumento significante do fluido crevicular gengival (FCG). Entretanto, é necessário um intervalo de duas semanas para que os níveis de FCG em ex-tabagistas possam ser comparáveis aos de não-tabagistas (Morozumi et al., 2004). Para o sistema imune específico e de defesa inespecífica, o fumo de tabaco é capaz de promover diversas alterações tais como: causar deficiência de adesão leucocitária e de fagocitose (MacFarlane et al., 1992), abaixar o nível de neutrófilos e de suas atividades na cavidade bucal (Pauleto et al., 2000; Numabe et al., 1998); alterar os níveis de interleucinas no fluido gengival (Petropoulos et al., 2004; Rawlinson et al., 2003; Giannopolou et al., 2003) e reduzir a resistência dos linfócitos a agentes oxidantes (Charalabopoulos et al., 2005). Pode ainda, manter níveis baixos de IgG e IgG2 no plasma de indivíduos com periodontite comparados aos não-tabagistas (Graswinckel et al., 2004) e diminuir os títulos de IgG sulcular para A. actinomycetemcomitans após terapia (Apatzidou et al., 2005). A diminuição do fluxo do fluido gengival também foi relatada (Holmes, 1990; Morozumi et al., 2004). O reparo tecidual em tabagistas pode estar alterado devido a uma deficiência no desenvolvimento e migração dos fibroblastos, o que pode acarretar em uma cicatrização pouco eficiente (James et al., 1999; Checchi et al., 1999). O sistema ativador de plasminogênio, importante na proteólise da matriz extracelular e na reparação e remodelação tecidual e reações inflamatórias locais, também, pode

19 6 estar alterado (Buduneli et al., 2005). Buduneli et al. (2005) apresentaram indícios de que um inibidor dos ativadores de plasminogênio (PAI), o PAI-2, em indivíduos tabagistas periodontalmente saudáveis, estava significativamente reduzido dentro de uma amostra de seis grupos distintos, que incluía indivíduos tabagistas com ou sem doença periodontal (gengivite e/ou periodontite) e indivíduos não-tabagistas com ou sem doença periodontal. Hanioka et al. (2000) ao comparar a tensão de oxigênio entre indivíduos com periodontite tabagistas ou não, encontraram valores menores da tensão de oxigênio em bolsas de tabagistas. A diferença chegou a médias acima de 10 mmhg. Essas alterações fisiológicas, promovidas pelo tabaco, podem levar a alterações nos aspectos clínicos e microbiológicos em indivíduos tabagistas Aspectos clínico-periodontais em indivíduos tabagistas Preber et al. (1980) observaram em um grupo de jovens soldados (média de idade de 21,9 anos) que os tabagistas possuíam um maior índice de placa e sangramento gengival quando comparados aos jovens que não fumavam. Porém, não houve diferença estatística entre a média de profundidade de sondagem (PS) de indivíduos tabagistas (2,66 mm) e não-tabagistas (2,55 mm). Bergström & Eliasson (1987b) examinaram 242 indivíduos, 76 tabagistas e 166 não-tabagistas. Nesta amostra, indivíduos tabagistas diferiram na média de PS de indivíduos não-tabagistas, 2,59 mm e 2,36 mm, respectivamente (p<0,05). Também, foi encontrada uma maior freqüência de sítios com PS > 4 mm nos tabagistas. Preber et al. (1992) avaliaram 32 pacientes (17 tabagistas e 15 nãotabagistas). Foi possível observar diferenças na média de PS entre esses dois grupos, sendo que os não-tabagistas apresentavam média de PS de 3,8 mm e tabagistas de 4,3 mm (p=0,04). Os autores mostraram também que indivíduos tabagistas possuíam maior número de sítios com PS > 4 mm (p=0,05). No que tange o aspecto clínico periodontal, Stoltenberg et al. (1993) apresentaram dados que demonstram que tabagistas com boa saúde médica possuem um menor número de dentes e maior média de profundidade de sondagem, sendo que 12,7% dos tabagistas possuíam pelo menos um sítio com profundidade de sondagem > 5,5 mm, contrapondo-se a 2,4% dos não-tabagistas.

20 7 Bergström et al. (2000), ao examinarem um grupo de 257 indivíduos (20% tabagistas, 23% ex-tabagistas, 52% não-tabagistas) em relação à exposição ao fumo (acima ou abaixo de 10 cigarros/dia) e à duração do hábito de fumar (mais ou menos de 15 anos de tabagismo), observaram uma forte associação entre estas variáveis e a doença periodontal. Indivíduos com história de maior exposição ao fumo possuíam uma maior freqüência de sítios afetados pela doença. Haffajee & Socransky (2001a), em um estudo com indivíduos com periodontite crônica em diversas faixas etárias, demonstraram uma maior perda de inserção em indivíduos tabagistas em relação a indivíduos ex-tabagistas e nãotabagistas. Indivíduos mais jovens (20-41 anos, média de 31,8 anos) tabagistas tiveram perda de inserção semelhante à de indivíduos acima de 49 anos (média de 59,4) que nunca fumaram. Apatzidou et al. (2005) selecionaram 40 indivíduos não tratados com periodontite crônica, sendo 25 tabagistas e 15 não-tabagistas. Nestes grupos não foram observadas diferenças entre os parâmetros clínicos. Ambos os indivíduos, tabagistas e não-tabagistas apresentaram média de PS de 4,4 mm e a média de NCI foi de 5,3 mm para tabagistas e de 4,9 mm para não-tabagistas (p>0,05). Em um estudo prospectivo de 10 anos descrito por Baljoon et al., em 2005, foram avaliados 24 indivíduos tabagistas, 24 ex-tabagistas e 43 nãotabagistas portadores de periodontite crônica. Observou-se perda óssea radiográfica estatisticamente significante nos indivíduos tabagistas comparados aos nãotabagistas. Após ajuste para idade, verificaram-se diferenças tanto nos valores de perda óssea vertical, quanto nos valores para profundidade de sondagem entre os dois grupos ao longo do período de 10 anos. Os valores médios de altura óssea foram representados em porcentagem proporcional à medida da raiz, sendo que os valores iniciais foram de 80,3%, 80,7% e 85,1% (tabagistas, ex-tabagistas e nãotabagistas, respectivamente) e após 10 anos: 78%, 80% e 84,2% (p<0,01). Para profundidade de sondagem os valores médios iniciais foram de 2,2 mm, 2,1 mm e 2,0 mm; e os finais de 2,9 mm, 2,2 mm e 2,2 mm (p<0,01). Com relação à exposição ao tabaco, não houve diferenças entre indivíduos ex-tabagistas e não-tabagistas; entretanto para indivíduos tabagistas leves (63,5 a 174,8 cigarros/ano) o risco relativo de perda óssea foi de 2,3 e para tabagistas pesados (350 a 602 cigarros/ano), 5,3 (p<0,05).

21 8 Persson et al. (2005) avaliaram 882 indivíduos divididos nas categorias: tabagistas, ex-tabagistas e não-tabagistas. Os autores demonstraram não haver diferenças na freqüência de sítios com PS > 5 mm e nível clínico de inserção (NCI) > 4 mm entre os grupos. A proporção de sítios com NCI > 4 mm foi significativamente maior nos tabagistas Aspectos microbiológicos em indivíduos tabagistas Em um estudo que utilizou método de cultura bacteriana, Preber et al. (1992) não encontraram diferenças na contagem e na prevalência de A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis e P. intermedia entre indivíduos acima de 32 anos tabagistas (n=83) e não-tabagistas (n=62), em coletas de biofilme subgengival de sítios > 6 mm. Foi considerado tabagista aquele que consumia 15 cigarros ou mais por dia. Stoltenberg et al. (1993), ao utilizarem técnica de imunofluorescência direta, também, não encontraram diferenças significantes ao testarem a prevalência de P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans, P. intermedia, E. corrodens e F. nucleatum entre tabagistas (126) e não-tabagistas (63). Como parte do Erie County Study, foi realizada uma pesquisa sobre a microbiota bucal em uma população de 1426 voluntários, dos quais 60,8 % eram tabagistas (Zambon et al., 1996). Nesse trabalho foi avaliado a relação entre o consumo de cigarro e a prevalência de oito espécies bacterianas periodontopatogênicas. Foram coletadas 12 amostras de biofilme subgengival por indivíduo, sendo 6 do arco superior e 6 do arco inferior. As amostras foram coletadas com cones de papel estéreis de sítios mésio-vestibulares e foi feito um pool para cada arco, totalizando 2 amostras por indivíduo. Para a análise microbiológica foi utilizada a técnica de imunofluorescência. Nesse estudo transversal foi observado que os indivíduos tabagistas possuem um risco aumentado para a presença de A. actinomycetemcomitans e T. forsythia (3,11 e 2,32, respectivamente). Umeda et al. (1998) também avaliaram amostras de um pool de biofilme subgengival das quatro bolsas mais profundas de voluntários tabagistas (21), nãotabagistas (145) e ex-tabagistas (33). Nesse estudo foi possível demonstrar que havia um risco maior de indivíduos tabagistas em apresentar T. denticola (4,61), em relação aos não-tabagistas. Kazor et al. (1999) examinaram 55 indivíduos tabagistas, 38 ex-tabagistas e 79 que nunca fumaram. Foram coletadas de duas a quatro amostras de biofilme

22 9 interproximal dos primeiros molares de cada indivíduo, totalizando 670 amostras. Estas amostras foram analisadas para a reação de hidrólise de substrato sintético de tripsina, benzoil-dl-arginina naftilamida (BANA), teste diagnóstico que detecta T. forsythia, T. denticola e/ou P. gingivalis. A maioria (81%) do total de resultados negativos para o teste BANA se deu em indivíduos que nunca fumaram. 75% dos sítios sem sangramento em tabagistas apresentaram-se positivos para o teste. Nesse trabalho, os sítios de indivíduos tabagistas possuíam uma chance quatro vezes maior em apresentar-se BANA positivos do que em sítios daqueles que nunca fumaram. Considerando-se apenas os sítios que não sangraram, esta relação foi 11 vezes maior. Em artigo apresentado em 2001, Boström et al. investigaram a presença de P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola, P. intermedia, P. nigrescens, A. actinomycetemcomitans, F. nucleatum, M. micros, C. rectus, E. corrodens, S. noxia, S. intermedius no biofilme subgengival de 33 indivíduos tabagistas e 31 nãotabagistas. Os pesquisadores utilizaram cones de papel para a coleta, e para a análise microbiológica foi utilizado o método do Checkerboard DNA-DNA hybridization. Foram coletadas 4 amostras de sítios com profundidade de sondagem > 5 mm em cada indivíduo, totalizando 256 amostras. Foi avaliada a prevalência dessas espécies por indivíduo e a relação entre as espécies bacterianas e a condição de tabagismo (tabagista ou não). Nesse estudo, não foram observadas diferenças na microbiota de tabagistas e não-tabagistas, com exceção na prevalência de indivíduos com bolsas profundas (> 6 mm) no que diz respeito à presença de T. forsythia (88,9% e 37,5%, respectivamente). Entretanto, os autores questionam o achado devido à quantidade pequena de indivíduos comparados e com estas características (18 tabagistas e 8 não-tabagistas). Haffajee & Socransky (2001b) utilizaram a técnica do Checkerboard DNA- DNA hybridization para avaliar a microbiota subgengival em indivíduos tabagistas (50), ex-tabagistas (98) e não-tabagistas (124). Os pesquisadores não encontraram diferenças estatisticamente significativas no biofilme subgengival dos 3 grupos de voluntários em bolsas maiores ou iguais a 4 mm no que se refere à contagem, proporção e prevalência das 29 espécies bacterianas avaliadas. Porém, foi observada uma maior prevalência de microorganismos do complexo vermelho (T. forsythia, P. gingivalis e T. denticola) e de algumas espécies do complexo laranja (P.

23 10 intermedia, M. micros, P. nigrescens, E. nodatum, F. nucleatum ss. vincentii) nos sítios menores de 4 mm em indivíduos tabagistas. Em um estudo sobre o impacto do cigarro nos parâmetros clínicos e microbiológicos de indivíduos tabagistas não-tratados, Apatzidou et al. (2005) avaliaram, por meio de PCR, a presença ou ausência de alguns periodontopatógenos no biofilme subgengival do sítio mais profundo de cada quadrante em 40 indivíduos. Os autores observaram diferenças limitadas no que tange a prevalência de indivíduos portadores de P. gingivalis, T. forsythia, A. actinomycetemcomitans, P. intermedia e T. denticola. A exceção de P. gingivalis, os outros microorganismos apareceram com menor freqüência em indivíduos tabagistas. Após analisar, por meio de cultura, a presença de periodontopatógenos nos quatro sítios mais profundos de cada indivíduo (um em cada quadrante), van der Velden et al. (2003), também, não observaram diferenças na prevalência de A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythia, F. nucleatum e M. micros entre 30 tabagistas e 29 não-tabagistas (média de idade 41,5 anos). Os indivíduos não-tabagistas, após se submeterem a tratamento periodontal cirúrgico e não-cirúrgico, tiveram uma redução na prevalência dos periodontopatógenos até dois anos após o tratamento. Os indivíduos tabagistas, todavia, mostraram redução apenas em P. gingivalis no mesmo período de avaliação. Outros autores também observaram uma deficiência na resposta microbiológica de indivíduos tabagistas após diferentes formas de terapia periodontal (Grossi et al., 1997). Apesar da microbiota de indivíduos tabagistas ter sido investigada por alguns autores, muitos dos resultados desses estudos ainda são controversos (Palmer et al., 2005). Essas diferenças podem ser devido às técnicas de diagnóstico microbiológico empregadas. O método do Checkerboard DNA-DNA hybridization (Socransky et al., 1994), utilizado no presente estudo, permite uma avaliação sistemática da microbiota bucal por meio da detecção e quantificação de um grande número de amostras e de espécies bacterianas, viabilizando a realização de estudos ecológicos e terapêuticos de infecções mistas, como a periodontite crônica. É também importante destacar que estudos recentes sugerem possíveis diferenças na microbiota bucal entre diferentes regiões geográficas (Colombo et al., 2002; Lopez et al., 2004; Haffajee et al., 2004; Natto et al., 2005). Utilizando a técnica do Checkerboard DNA-DNA hybridization, Haffajee et al. (2004) compararam

24 11 a composição da microbiota subgengival de indivíduos com periodontite crônica de quatro países, Brasil, EUA, Suécia e Chile. Diferenças importantes foram observadas nas proporções de diversas cepas testadas, principalmente dos patógenos do complexo vermelho. Os indivíduos suecos mostraram as menores proporções de P. gingivalis e T. denticola (1,6% e 0,7%, respectivamente); enquanto que os chilenos mostraram as maiores proporções de P. gingivalis (11,7%) e os brasileiros de T. denticola (6,7%). Essas possíveis diferenças microbiológicas entre as regiões geográficas têm efeito clínico direto. Uma vez que o tratamento de uma infecção deve ser direcionado para os agentes etiológicos, o diagnóstico exato de cada condição clínica periodontal, incluindo os diferentes grupos de risco, realizado em cada país, será fundamental para a aplicação de terapias periodontais mais específicas.

25 12 2. PROPOSIÇÃO Comparar a composição da microbiota subgengival e os parâmetros clínicos periodontais de indivíduos tabagistas e não-tabagistas com periodontite crônica.

26 13 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1. Seleção de indivíduos Cinqüenta indivíduos portadores de periodontite crônica, sendo 25 tabagistas (grupo T) e 25 não-tabagistas (grupo NT), que compareceram à Clínica Odontológica da Universidade Guarulhos foram incluídos no estudo. A seleção foi realizada por dois mestrandos em periodontia, sob supervisão dos professores da disciplina. Todos os participantes foram informados dos objetivos do estudo, de seus riscos e benefícios, incluindo os tipos de medições clínicas e coletas. Os indivíduos que concordaram em participar do estudo assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (anexo A), responderam a um questionário de saúde/anamnese (anexo B), foram submetidos a exame periodontal completo (anexo C) e receberam terapia periodontal gratuita, estando de acordo com as diretrizes e normas do Conselho Nacional de Saúde (Resolução nº. 196/96). O projeto foi submetido à apreciação e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em seres humanos da Universidade Guarulhos Critérios de inclusão Foram incluídos indivíduos acima de 30 anos, com 15 dentes naturais ou mais, tendo no mínimo seis dentes com pelo menos um sítio interproximal com profundidade de sondagem > 5 mm e nível clínico de inserção entre 5 e 10 mm. Os sítios não poderiam ser contíguos e, preferencialmente, distribuídos em sextantes distintos. Ponto de corte para tabagistas e não-tabagistas Foram considerados tabagistas aqueles que declararam o uso diário de 10 ou mais cigarros de tabaco industrializados por pelo menos 5 anos (Kerdvongbundit & Wikesjö, 2000). Foram considerados não-tabagistas aqueles que declararam nunca ter tido o hábito de fumar Critérios de exclusão Foram excluídos do estudo indivíduos que tivessem recebido tratamento periodontal anterior ou feito uso de antibióticos ou anti-sépticos de forma periódica nos últimos seis meses anteriores à seleção. Também foram excluídos gestantes,

27 14 indivíduos que fizessem uso de medicamentos capazes de alterar a patogênese da doença periodontal ou que necessitassem de antibioticoterapia profilática para procedimentos odontológicos Delineamento experimental Os voluntários foram avaliados, inicialmente, por meio de anamnese e exame clínico periodontal e, em seguida, submeteram-se à coleta microbiológica dos sítios selecionados (ver: Seleção dos sítios-teste para análise microbiológica) Avaliação clínico-periodontal As mensurações clínicas foram realizadas em 6 sítios para cada dente (excluindo-se terceiros molares): mésio-vestibular (MV), vestibular (V), distovestibular (DV), mésio-lingual (ML), lingual (L), disto-lingual (DL). Os seguintes parâmetros foram avaliados: Índice de Placa Visível (0/1) IPV: ausência (0) ou presença (1) de biofilme supragengival visível (Ainamo & Bay, 1975), logo após leve secagem com jato de ar; Índice de Sangramento Gengival (0/1) ISG: ausência (0) ou presença (1) de sangramento na gengiva marginal após percorrer a sonda periodontal ao longo do sulco gengival (Ainamo & Bay, 1975); Nível Clínico de Inserção (mm) NCI: mensuração da distância entre o limite amelo-cementáriperiodontal; até a porção mais apical sondável do sulco/bolsa Profundidade de Sondagem (mm) PS: mensuração da distância entre a margem gengival livre até a porção mais apical sondável do sulco/bolsa periodontal; Sangramento à Sondagem (0/1) SS: ausência (0) ou presença (1) de sangramento até 20 segundos após sondagem; Supuração à Sondagem (0/1) - SUP: ausência (0) ou presença (1) de supuração até 20 segundos após sondagem.

28 15 Para todas as medidas deste estudo foram utilizadas sondas periodontais milimetradas, previamente esterilizadas, do tipo UNC PC-BR 15 (Hu-Friedy, Rio de Janeiro, RJ, Brasil). Três examinadores foram treinados e calibrados com o objetivo de conseguir a máxima reprodutibilidade nas medições realizadas por cada um deles e entre eles. A metodologia utilizada para a calibração foi preconizada por Araujo et al. (2003), que avaliaram o erro padrão da medida (e.p.m.) e o erro médio percentual (e.m.p.) para os parâmetros clínicos periodontais contínuos (PS e NCI). Os valores do e.p.m. e o e.m.p. intra-examinadores variaram, respectivamente, de 0,09 a 0,21 e de 1,46% a 5,79% para a PS; de 0,10 a 0,12 e de 2,0% a 3,8% para o NCI. Em relação ao erro inter-examinador, os valores de e.p.m. e e.m.p. indicaram uma reprodutibilidade aceitável para os parâmetros de pesquisa clínica periodontal (e.p.m. para PS e NCI, respectivamente, 0,13 e 0,11; e para e.m.p., 4,83% e 3,16%). Para as variáveis categóricas (IPV e ISG), considerando a presença ou ausência do parâmetro clínico, foi realizada a média do nível de concordância para cada examinador e entre eles. Ambos os examinadores apresentaram uma concordância intra- e inter-examinador superior a 92% (teste Kappa) Avaliação microbiológica Seleção dos sítios-teste para análise microbiológica Foram coletadas amostras de biofilme subgengival de 6 a 12 sítios interproximais por indivíduo, nas seguintes categorias de PS (2 a 4 sítios por categoria): sítios rasos (PS< 3 mm), moderados (PS de 4 a 6 mm) e profundos (PS > 7 mm). Sempre que possível foram incluídos sítios de todos os hemi-arcos, com exceção dos terceiros molares. Sítios próximos ou em dentes com próteses maladaptadas, lesão de cárie extensa e/ou lesão endo-periodontal foram excluídos Coleta de amostras de biofilme subgengival Após a remoção de cálculo e biofilme supragengivais, as coletas de amostras de biofilme subgengival foram realizadas com curetas Gracey do tipo minifive (HuFriedy), posicionadas na porção mais apical dos sítios e em um único golpe de raspagem no sentido ápico-coronal. As amostras foram imediatamente depositadas em tubos plásticos individuais (1,5 ml) contendo 150 μl de solução TE

29 16 (ph 7,6), e a estas foi acrescentado 100 μl de NaOH a 0,5 M para que o DNA bacteriano permanecesse viável por longos períodos de tempo. Esses tubos de plástico foram, então, devidamente identificados com o código do indivíduo, data e sítio, e, por fim, armazenados sob refrigeração a -20ºC até serem analisados por meio da técnica do Checkerboard DNA-DNA hybridization para as 38 cepas bacterianas descritas na Tabela 1, no laboratório de microbiologia da Universidade Guarulhos Cepas bacterianas e condições de crescimento A lista das 38 cepas bacterianas utilizadas neste estudo para o preparo das sondas de DNA está apresentada na Tabela 1. Todas as cepas foram adquiridas liofilizadas da ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD, EUA) ou do Forsyth Institute (Boston, MA, EUA). O conteúdo liofilizado foi reidratado em caldo para crescimento de Mycoplasma (Difco Laboratories, Detroit, MI, EUA) e cultivado em ágar-triptose de soja contendo 5% de sangue de ovelha desfibrinado (BBL, Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville, MD, EUA) a 35 o C sob condição de anaerobiose (80% N 2, 10% CO 2, 10% H 2 ). Algumas bactérias foram cultivadas em meios de cultura enriquecidos de forma a suprir suas necessidades nutricionais. T. forsythia, por exemplo, foi cultivada em ágar-triptose de soja com 5% de sangue de ovelha desfibrinado e 10 µg/ml de ácido N-acetil murâmico (NAM) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA); enquanto P. gingivalis cresceu em um meio similar, suplementado com 5% de sangue de ovelha desfibrinado, 0,3 µg/ml de menadiona (Sigma) e 5 µg/ml de hemina (Sigma). T. denticola e T. socranskii foram cultivados em caldo para crescimento de Mycoplasma (Difco) suplementado com 1 mg/ml de glicose, 400 µg/ml de niacinamida, 150 µg/ml espermina tetraidroclorídrica, 20 µg/ml de isobutirato de sódio, 1 mg/ml de L-cisteína, 5 µg/ml de tiamina pirofosfato e 0,5% de soro bovino.

30 17 Tabela 1. Relação das cepas empregadas para a confecção das sondas de DNA separados por complexos bacterianos (Socransky et al., 1998; Socransky & Haffajee, 2002). Espécies Cepas Espécies Cepas Complexo Azul Complexo Laranja (cont.) Actinomyces gerencseriae a Fusobacterium nucleatum ss. nucleatum a Actinomyces israelii a Fusobacterium nucleatum ss polymorphum a Actinomyces naeslundii I a Fusobacterium nucleatum ss vincentii a Complexo Roxo Fusobacterium periodonticum a Actinomyces odontolyticus a Micromonas micros a Veillonella parvula a Prevotella intermedia a Complexo Amarelo Prevotella nigrescens a Streptococcus gordonii a Streptococcus constellatus a Streptococcus intermedius a Complexo Vermelho Streptococcus mitis a Tannerella forsythia a Streptococcus oralis a Porphyromonas gingivalis a Streptococcus sanguinis a Treponema denticola B1 b Complexo Verde Outras Espécies Actinobacillus a Eubacterium saburreum a actinomycetemcomitans a e b a Gemella morbillorum a Capnocytophaga gingivalis a Leptotrichia buccalis a Capnocytophaga ochracea a Prevotella melaninogenica a Capnocytophaga sputigena a Propionibacterium acnes I e II a a Eikenella corrodens a Selenomonas noxia a Complexo Laranja Streptococcus anginosus a Campylobacter gracilis a Treponema socranskii S1 b Campylobacter rectus a Campylobacter showae a Eubacterium nodatum a a ATCC (American Type Culture Collection) b Forsyth Institute.

31 Isolamento do DNA e preparo das sondas As cepas bacterianas foram anaerobiamente cultivadas na superfície de ágar-sangue contido em placas de Petri, com exceção das 2 espécies de espiroquetas, que foram cultivadas em caldo de cultura, por 3 a 7 dias. As colônias foram raspadas e depositadas em tubos plásticos para microcentrífuga de 1,5 ml contendo 1 ml de solução TE (10 mm Tris-HCl, 0,1 mm EDTA, ph 7,6). As células foram lavadas 2 vezes por centrifugação na solução-tampão de TE a rpm por 10 minutos. Em seguida, as células das cepas Gram-negativas foram novamente suspensas e lisadas com SDS (dodecilsulfato de sódio, C 12 H 25 NaO 4 S) a 10% e proteinase K em uma concentração de 20 mg/ml (Sigma). As cepas Gram-positivas foram lisadas em 150 µl de uma mistura enzimática contendo 15 mg/ml de lisozima (Sigma) e 5 mg/ml de acromopeptidase (Sigma) em solução tampão de TE (ph 8,0). O DNA foi isolado e purificado como descrito por Smith et al. (1989). As sondas multi-genômicas (whole-genomic) foram preparadas para cada uma das 38 espécies pela marcação de 1 µg do DNA bacteriano com digoxigenina, por meio do random primer digoxigenin labeling kit (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN, EUA), de acordo com o método descrito por Feinberg & Vogelstein (1983). As espécies bacterianas avaliadas foram selecionadas segundo suas associações com diferentes tipos de doenças ou saúde periodontal (Socransky & Haffajee, 1994; Socransky & Haffajee, 2005) Checkerboard DNA-DNA hybridization Hibridização DNA-DNA As suspensões contidas nos tubos plásticos foram fervidas em banhomaria por 10 minutos e, em seguida, neutralizadas pela adição de 0,8 ml de acetato de amônia a 5 M. Cada suspensão de biofilme dental contendo o DNA livre foi depositada em uma das canaletas do Minislot (Immunetics, Cambridge, MA, EUA - Figura 1) ficando, assim, concentrada em uma membrana de nylon (15 x 15 cm) com carga positiva (Boehringer Mannheim). As duas últimas das 30 canaletas do Minislot (Immunetics) foram ocupadas por controles contendo uma mistura do DNA das espécies de microorganismos investigadas pelas sondas, nas concentrações correspondentes a 10 5 e 10 6 células, ou seja, 1 ng e 10 ng de DNA de cada espécie, respectivamente (Socransky et al., 1994; Haffajee et al., 1997a, b). A membrana foi

32 19 então removida do Minislot (Immunetics) e o DNA nela concentrado fixado por meio de aquecimento em forno a 120ºC por 20 minutos. A membrana foi pré-hibridizada a 42º C, por 1 hora, em uma solução contendo 50% de formamida, 1% de caseína (Sigma), 5 x solução salina citratada - SSC (1 x SSC = 150mM NaCl, 15mM de citrato de sódio, ph 7,0), 25 mm de fosfato de sódio (ph 6,5) e 0,5 mg/ml de RNA de levedura (Boehringer Mannheim). Figura 1. Representação gráfica do Minislot (Immunetics, Cambridge, MA, EUA) e resumo da preparação e deposição das amostras de biofilme subgengival (técnica Checkerboard DNA-DNA hybridization). Em seguida, a membrana foi posicionada no Miniblotter (Immunetics, Figura 2) com as linhas de DNA perpendiculares às canaletas do aparato. Em cada canaleta do Miniblotter (Immunetics) adicionou-se uma sonda de DNA (diluída a aproximadamente 20ng/ml) em 130 μl de uma solução de hibridização composta de 45% de formamida, 5 X SSC, 20 mm de fosfato de sódio (ph 6,5), 0,2 mg/ml de RNA

33 20 de levedura (Boehringer Mannheim), 10% de sulfato de dextrano e 1% de caseína (Sigma). A hibridização ocorreu dentro de um período mínimo de 20 horas, a 42º C. Figura 2. Representação gráfica do Miniblotter (Immunetics, Cambridge, MA, EUA) e resumo das etapas de hibridização e detecção das espécies bacterianas presentes nas amostras de biofilme subgengival (técnica Checkerboard DNA-DNA hybridization). Detecção das espécies Após o período de hibridização, a membrana foi removida do Miniblotter (Immunetics), lavada por 40 minutos a 65ºC numa solução adstringente composta de 1% de SDS, 1 mm de EDTA e 20mM de Na 2 HPO 4, a fim de remover as sondas que não hibridizaram completamente. Em seguida, a membrana foi imersa por 1 hora em uma solução contendo 1% de ácido maleico (C 4 H 4 O 4 ), 3 M de NaCl, 0,2 M de NaOH, 0,3% de Tween 20, 0,5% de caseína, ph 8,0, e, logo após, por 30 minutos, na mesma solução contendo o anticorpo anti-digoxigenina conjugado à fosfatase alcalina em uma concentração de 1: A membrana depois foi lavada 2 vezes,

34 21 por 20 minutos, em uma solução de 0,1 M de ácido maleico, 3 M de NaCl, 0,2 M de NaOH, 0,3% de Tween 20, ph 8,0, e 1 vez, por 5 minutos, em uma solução de 0,1 M de Tris HCl, 0,1 M de NaCl, 50 mm de MgCl 2, ph 9,5. O passo seguinte foi a incubação da membrana por 45 minutos a 37 o C em uma solução detectora à base de fosfatase alcalina, CDP-Star TM Detection Reagent (Amersham Biosciences UK Limited, Buckinghamshire, Inglaterra, RU). Em seguida, a membrana foi colocada em um cassete, Chassi Radiográfico 30x40 cm (Konex, Ind. Bras., SP, Brasil), sob um filme radiográfico de marca Kodak X-Omat K, 18x24 cm (Kodak Brasileira Com. e Ind. Ltda., São José dos Campos, SP, BR) por 40 minutos. O filme, posteriormente, foi revelado (Figuras 3 e 4) manualmente pelo método convencional temperatura-tempo, de acordo com orientações do fabricante. As soluções utilizadas foram da marca Kodak, mantidas à temperatura de 20ºC. Figura 3. Representação gráfica do padrão de hibridização entre as bactérias presentes nas amostras de biofilme e as sondas de DNA (técnica Checkerboard DNA-DNA hybridization).

35 22 Figura 4. Representação esquemática do padrão de hibridização entre as bactérias presentes nas amostras de biofilme e as sondas de DNA (técnica Checkerboard DNA-DNA hybridization). Nesta figura estão apresentadas 40 bactérias, e as amostras de biofilme são de todos os dentes de um mesmo indivíduo. A leitura dos filmes radiográficos foi realizada por um único examinador treinado, calibrado e cego. A leitura foi realizada no mínimo duas vezes, em dias diferentes, para conferência de resultados. Cada sinal produzido por uma determinada sonda na amostra de biofilme foi comparado em intensidade ao sinal produzido pela mesma sonda nos dois controles contendo 10 5 e 10 6 bactérias. Desta forma, o número 0 foi registrado quando não houve detecção do sinal; 1 - equivaleu a um sinal menos intenso que o controle de 10 5 células; 2 - equivaleu a aproximadamente 10 5 células; 3 - entre 10 5 e 10 6 células; 4 - aproximadamente 10 6 células e, finalmente, 5 determinado como mais de 10 6 células (Tabela 2). Esses registros foram então utilizados para determinar os níveis das diferentes espécies investigadas nos sítios de indivíduos do estudo.