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1 i UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO FACULDADE DE MEDICINA Alterações do gene BCL2 em subgrupos de linfoma difuso de células grandes B definidos pela expressão imunohistoquímica e pelo perfil imunogenético Claudio Gustavo Stefanoff 2006

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3 ii Claudio Gustavo Stefanoff Alterações do gene BCL2 em subgrupos de linfoma difuso de células grandes B definidos pela expressão imunohistoquímica e pelo perfil imunogenético Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências. Orientadores: Nelson Spector Ilana Zalcberg Renault Rio de Janeiro, 2006

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5 iv A minha família, a natural e a adquirida, por não cobrar nada de mim. A meus amigos, pela ausência aflitiva destes meses.

6 v AGRADECIMENTOS A Ilana Zalcberg, pelos cuidados, pela medida sem medidas... A Nelson Spector, pelo privilégio de desenvolver meu projeto sob sua orientação. Ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio de Janeiro, pela oportunidade para desenvolver este projeto. Ao diretor do CEMO, Luis Fernando Bouzas, pelo nosso trabalho cotidiano A Rocio Hassan, amiga, companheira e confidente, pelo estímulo contínuo em todos estes anos de estrada juntos. A Vanesa, Ana Carolina, Lyanna, Deisy, Priscila, Telma, Esteban, Marina, Fernanda, Maria, Rodrigo e Ana Paula, amigos e colegas do Laboratório de Biologia Molecular do CEMO, pelas horas (e altas horas) partilhadas. A Virginia Pires, pela eterna paciência desde sempre. A Denize Azambuja do Serviço de Patologia do INCA, pela coragem de encarar novos desafios. A Fernando Soares do Serviço de Patologia do Hospital A.C. Camargo (São Paulo) pela sua contribuição com este trabalho e pelas suas valiosas sugestões. A Victor Piana de Andrade pela disponibilidade constante. A José Ivanildo Neves e Carlos Ferreira do Nascimento, do Serviço de Patologia do Hospital A.C. Camargo, pela experiente colaboração e ajuda. A Kátia e Rosane, da Administração do CEMO-INCA, pela espontaneidade cotidiana e pela disposição, sempre, de ajudar. A Héctor Seuánez e à equipe da Divisão de Genética da Coordenação de Pesquisa - INCA (Miguel, Cibelle, Prof. Orílio, Cláudio, Aline, Lia, Lívia e tantos outros), pela oportunidade de desenvolver parte deste trabalho.

7 vi A Teresa Gouda da Secretaria da Pós-Graduação em Clínica Médica (UFRJ), pelo compromisso com todos nós... sem perder o bom humor. A Christa Bonhoff do Rotary Club, pelo auxilio, em oportunidades e recursos e pela sua sensibilidade. A Irene Biasoli, pelas sugestões. A Joana Ferreira Lima, da Unidade Clínica do CEMO-INCA, pelo trabalho em colaboração. À Associação Pro-Vita, pelo amparo permanente em todos estes anos. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apóio financeiro.

8 vii RESUMO STEFANOFF, Claudio Gustavo. Alterações do gene BCL2 em subgrupos de linfoma difuso de células grandes B definidos pela expressão imunohistoquímica e pelo perfil imunogenético. Rio de Janeiro, Tese (Doutorado em Clínica Médica) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, O linfoma difuso de células grandes B (LDCGB) é um grupo heterogêneo de neoplasias no que diz respeito às características clínicas, morfológicas e às alterações moleculares subjacentes. O objetivo deste trabalho foi a caracterização imuno-histoquímica (IHQ) e molecular de LDCGB primários diagnosticados e tratados em uma única instituição, visando o estudo da incidência de alterações genéticas associadas ao gene BCL2 em subgrupos classificados de acordo com a origem celular. Foram estudados 117 casos de LDCGB provenientes do Instituto Nacional de Câncer, Rio de Janeiro. A expressão de CD10, BCL6, BCL2, MUM1/IRF4 e CD138, foi avaliada por IHQ em lâminas de tissue microarray. A presença de variação intraclonal (VI) foi avaliada através da análise do padrão de hipermutação somática ongoing do gene IGH. Alterações do gene BCL2 foram estudadas por hibridização in situ flourescente (FISH) e por métodos baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR). O grupo incluiu 57 homens e 60 mulheres, com idade mediana de 56 anos (16-90 anos) e classificados majoritariamente no grupo IPI de baixo risco (71%). De acordo com o algoritmo de três marcadores IHQ, 38% dos LDCGB foram classificados como tipo centro germinal (CG) e 62% como tipo não-cg. Não foram encontradas diferenças nas principais características clínico-laboratorias entre estes pacientes. Todos os LDCGB estudados exibiram mutações no gene IGH indicando origem em células B CG ou pós-cg, sendo que a VI foi demonstrada em 3/6 dos LDCGB CG e em apenas 2/9 casos não-cg. A t(14;18) foi detectada em casos nodais (15%) e associada a casos CG (p<0,001). Sinais extras do BCL2 foram detectados em 23 casos (26,5%), associados a LDCGB não-cg (p=0,005): 18 casos (18%) com cromossomos 18 adicionais, 5 casos (6%) com amplificação 18q21 e 2 casos com ambas alterações (2%). Cromossomos 18 adicionais foram mais freqüentes em casos não-cg MUM1+ (p=0,02). Apenas casos não-cg exibiram amplificação 18q21 (9%, p=0,04). Os métodos de PCR para detecção da t(14;18) foram concordantes com os métodos de FISH (87%). A expressão IHQ de BCL2 foi demonstrada em 50% dos casos, porém sem diferenças entre os casos CG e não-cg. Os casos BCL2+ incluíram 10 casos com a t(14;18), 5 casos com amplificação 18q21 e 9 casos com cromossomos 18 adicionais. No entanto não foi observada uma associação significativa entre a expressão protéica e estas alterações, indicando que outros mecanismos podem ser os responsáveis pela desregulação da expressão de BCL2 nos LDCGB.

9 viii ABSTRACT STEFANOFF, Claudio Gustavo. Alterações do gene BCL2 em subgrupos de linfoma difuso de células grandes B definidos pela expressão imunohistoquímica e pelo perfil imunogenético. Rio de Janeiro, Tese (Doutorado em Clínica Médica) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Diffuse large B cell lymphomas (DLBCL) are a heterogeneous group of neoplasms with heterogeneous immunophenotype, genetic abnormalities and clinical features. The aim of the current study was the immunohistochemical (IHC) and molecular characterization of primary DLBCLs diagnosed and treated in a single institution, regarding to BCL2 genetic abnormalities incidence in subsets of DLBCL classified according to cellular origin. Tissue microarray was constructed for paraffin blocks of 117 DLBCL obtained from the Instituto Nacional de Câncer, Rio de Janeiro. IHC analyses were performed using CD10, BCL6, BCL2, MUM1/IRF4 and CD138 antibodies. For evaluation of intraclonal heterogeneity (IH), the presence of ongoing somatic hypermutation in IGH gene rearrangements was examined in 15 cases. BCL2 genetic abnormalities were studied by interphase fluorescence in situ hybridization (FISH) and by polymerase chain reaction (PCR) methods. The patients consisted of 57 men and 60 women with a median age of 56 years (range, years), most classified in the low-risk IPI group (71%). When using the IHC three-marker algorithm, 38% cases show a germinal center (GC) phenotype and 62% were considered non-gcb. There was no significant difference in the clinical characteristics between the GC and the non-gc groups of patients. All cases examined demonstrated mutated IGH gene (homology <98%), indicating that most cases of DLBCL derive from GC or post-gc B cells. IH was demonstrated in 3/6 GC DLBCL cases, but in only 2/9 non-gc DLBCL. The t(14;18) was detected exclusively in nodal cases (15%), and was more commonly associated with the GC phenotype (p<0.001). Exclusively extra BCL2 gene signals were observed in 23 patients (26.5%), and occurred mostly in the non-gc subgroup (p=0.005): 16 cases with additional chromosomes 18 (18%), 5 with 18q21 amplification (6%), and two cases with both alterations (2%). Additional chromosomes 18 were more frequently in MUM1-positive non-gc cases (p=0.02). Only DLBCL with non-gc phenotype exhibited 18q21 amplification (p=0.04). The PCR-based methods for the t(14;18) detection shown high concordance with FISH (87%). BCL2 protein expression was observed in 50% of cases, but was not significantly different in the GC and non-gc subgroups. The cases with BCL2 expression included 10 t(14;18)- positive cases, 5 cases showing 18q21 amplification and in 9 cases with additional chromosome 18. BCL2 expression was not exclusively confined to cases with BCL2 abnormalities, indicating alternative mechanisms of BCL2 up-regulation in DLBCL.

10 ix LISTA DE FIGURAS Pág. Figura 2.1 Figura 2.2 Representação esquemática do rearranjo do gene da cadeia pesada da imunoglobulina Processos moleculares responsáveis pela modificação dos genes das imunoglobulinas no centro germinativo Figura 2.3 Principais eventos da diferenciação B no centro germinativo Figura 2.4 Compartimentos fisiológicos na diferenciação das células B maduras definidos pela mutação dos genes de imunoglobulinas Figura 4.1 Construção de TMA Figura 4.2 Algoritmo utilizado na definição de LDCGB com perfil imunohistoquímico CG e não-cg Figura 4.3 Estratégia utilizada na amplificação de rearranjos clonais do gene IGH Figura 4.4 Amplificação e tipificação da t(14;18)(q21;q32) por PCR 53 Figura 4.5 Figura 4.6 Figura 4.7 Figura 5.1 Figura 5.2 Figura 5.3 Figura 5.4 Figura 5.5 Clonagem e sequenciamento de genes VH para o estudo da hipermutação somática ongoing em LDCGB Localização das sondas utilizadas na detecção das alterações no gene BCL2 por FISH Critérios de análise de acordo com os possíveis padrões de hibridização utilizando as sondas LSI IGH, LSI BCL2 e CEP18 Expressão de marcadores imunohistoquímicos em LDCGB utilizando TMA Subgrupos de LDCGB agrupados hierarquicamente pelas semelhanças na expressão dos marcadores imunohistoquímicos e pelas alterações no gene BCL2 detectadas por FISH Curvas de sensibilidade dos métodos de PCR nested e single para a detecção da t(14;18) nos pontos de quebra mbr e mcr Detecção de equivalentes moleculares da t(14;18)(q32;q21) por métodos de PCR de única etapa nos pontos de quebra conhecidos no gene BCL2 Detecção da t(14;18)(q32;q21) e sinais extras do gene BCL2 por FISH em casos de LDCGB fixados e impregnados em parafina Figura 5.6 Rearranjos clonais IGH amplificados pelo método VHlider/JH Figura 5.7 Identificação de insertos de interesse em DNA plasmidial 85 Figura 5.8 Freqüências mutacionais observadas em LDCGB 87 Figura 5.9 Figura 5.10 Distribuição de mutações somáticas nas diferentes regiões analisadas dos genes VH em LDCGB Distribuição de mutações somáticas na região variável do gene IGH em LDCGBs CG e não-cg 89 90

11 x LISTA DE TABELAS Pág. Tabela 2.1 Expressão de proteínas individuais no prognóstico dos LDCGB 23 Tabela 2.2 Principais alterações genéticas associadas à patogênese dos LDCGB 25 Tabela 2.3 Tabela 4.1 Principais estudos sobre o valor prognóstico do perfil IHQ CG em LDCGB Características dos anticorpos utilizados e detalhes dos processos imunohistoquímicos Tabela 4.2 Condições gerais das reações de PCR e iniciadores complementares 54 empregados na amplificação de genes constitutivos e de rearranjos clonais do gene IGH Tabela 4.3 Iniciadores utilizados na detecção por PCR da t(14;18) Tabela 4.4 Tabela 5.1 Tabela 5.2 Condições gerais das reações de PCR empregadas na amplificação de equivalentes moleculares da t(14;18) Principais características clínicas e laboratoriais dos pacientes em relação à expressão dos marcadores imunohistoquímicos e à classificação nos subtipos CG e não-cg Perfis imunohistoquímicos definidos pela expressão dos marcadores de diferenciação B CD10, BCL6 e MUM1 em 114 casos de LDCGB Tabela 5.3 Comparação dos resultados da avaliação da t(14;18) por PCR e FISH Tabela 5.4 Tabela 5.5 Perfil imunohistoquímico dos LDCGB com alterações no gene BCL2 detectadas por FISH Expressão imunohistoquímica de BCL2 em relação às alterações do gene BCL2 detectadas por FISH em LDCGB Tabela 5.6 Resultados da análise de variação intraclonal nos genes VH em 15 casos de LDCGB classificados de acordo à expressão de marcadores IHQ Tabela 5.7 Correlação do perfil imunogenético com as alterações no gene BCL2 detectadas por FISH em casos de LDCGB classificados pela expressão de marcadores IHQ Tabela A1 Correlação das principais características clínicas dos pacientes t(14;18) positivos e negativos Tabela A2 Tabela A3 Correlação das principais características clínicas dos pacientes com e sem cromossomos 18 adicionais Correlação das principais características clínicas dos pacientes com e sem amplificação gênica 18q

12 xi LISTA DE SIGLAS aa AID CBA cdna CDR CG CGH CHOP COP CP DH DNA dntps FIP FISH FOXP1 FR HIV HS I ICE IF Ig IGH INCA JH kb LDCGB LDH LH LNH MO NF-κB OF WHO pb PCR RNA RT-PCR SP V(D)J VH VI Aminoácidos Activation-induced cytidine deaminase Células B ativadas DNA complementar Região determinante da complementariedade antigênica Centro germinativo Do inglês Comparative Genomic Hibridization Combinação de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina e prednisona Combinação de ciclofosfamida, vincristina e prednisona Combinação de ciclofosfamida e prednisona Segmento gênico D da região variável do gene IGH Ácido desoxirribonucleico Deoxiribonucleosídeos trifosfatos Tecido fixado e impregnado em parafina Hibridização in situ fluorescente do inglês Forkhead Box Protein P1 Região framework Vírus da imunodeficiência humana Hipermutação somática Identidade Ifosfamida, Carboplatina e Etoposide Seqüência com pauta aberta de leitura Imunoglobulina Gene da cadeia pesada das imunoglobulinas Instituto Nacional de Câncer Segmento gênico J da região variável do gene IGH Kilobase Linfoma difuso de células grandes B Desidrogenasse láctica Linfoma de Hodgkin Linfoma não Hodgkin Medula óssea Do inglês Nuclear Factor-kappa B Seqüência com perda de pauta de leitura Do inglês World Health Organization Pares de bases Reação em cadeia da polimerase Ácido ribonucleico Reação em cadeia da polimerase após retrotranscrição Sangue periférico Região juncional do rearranjo da região variável das Ig Segmento gênico V da região variável do gene IGH Variação intraclonal

13 xii SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 15 Pag. 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 A diversidade e a heterogeneidade dos LDCGB na era da classificação WHO Subgrupos de LDCGB definidos pela expressão gênica Definição de perfis de expressão protéica por imunohistoquímica (IHQ) em 26 LDCGB: a transferência do conhecimento da expressão gênica à pratica clínica 2.4 Perfil imunogenético dos LDCGB Ontogenia de células B e principais mecanismos fisiológicos envolvidos na 28 diversidade do reconhecimento antigênico Padrões de hipermutação somática em LDCGB A t(14;18) e outras alterações do gene BCL2 em LDCGB 36 3 OBJETIVOS 39 4 MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Pacientes e amostras estudadas Registro das características clínico-laboratoriais Construção do TMA Expressão de marcadores imuno-histoquímicos Avaliação preliminar Imunohistoquímica Critérios de análise Manipulação e processamento de amostras cirúrgicas Extração de DNA de alto peso molecular Extração de DNA com o reagente DNAzol Extração de DNA com fenol-clorofórmio Extração de RNA e síntese de DNA complementar (cdna) Avaliação qualitativa e quantitativa dos ácidos nucléicos Métodos baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR) Considerações metodológicas Amplificação de genes constitutivos Amplificação de rearranjos clonais do gene IGH Amplificação de equivalentes moleculares da t(14;18)(q32;q21) Eletroforese, preparação de géis e fotodocumentação Clonagem e seqüenciamento Isolamento de produtos de PCR Subclonagem em plasmídeos Método de isolamento de DNA plasmidial por minipreparação e lise alcalina 60

14 xiii Identificação de clones Seqüênciamento Análise de seqüências VH Hibridização in situ fluorescente (FISH) Racional do método Procedimento Critérios de análise Análise Estatística 66 5 RESULTADOS Características clinico-demográficas do grupo de pacientes estudados Resultados imunohistoquímicos e classificação em CG e não-cg Análise da expressão dos marcadores imuno-histoquímicos e as principais 74 características clínicas 5.4 Alterações genéticas do gene BCL2 em LDCGB Detecção e tipificação de pontos de quebra da t(14;18) por PCR Incidência de alterações no gene BCL2 em LDCGB detectadas por FISH Detecção da t(14;18) Detecção de sinais extras do gene BCL Detecção de sinais extras do gene IGH Expressão protéica de BCL2 em LDCGB com alterações no gene BCL Analise de HS de genes VH em LDCGB Padrões de HS e utilização de genes IGH Análise da variação intraclonal (HS ongoing) 86 6 DISCUSSÃO Principais características clínico-demográficas do grupo de pacientes Categorização de LDCGB em subgrupos CG e não-cg pela expressão de 94 marcadores imunohitoquímicos 6.3 A análise do perfil imunogenético identifica dois subgrupos de LDCGB Distribuição de alterações do gene BCL2 em subgrupos de LDCGB Incidência da t(14;18) em LDCGB Tipificação dos pontos de quebra da t(14;18) Detecção de sinais extras do gene BCL2 em LDCGB Possível significado de sinais extras IGH em LDCGB detectadas por FISH Expressão da proteína BCL2 em LDCGB e sua relação com as alterações genéticas CONCLUSÕES REFERENCIAS BIBLIGRÁFICAS 120

15 xiv 9 ANEXOS Anexo I: Ficha de coleta de dados clínicos Anexo II: Correlação das principais características clínicas em relação às alterações do gene BCL2 (Tabelas A1-3) Anexo III: Alinhamentos das seqüências de genes IGH em LDCGB 148

16 15 1. INTRODUÇÃO Apesar do progresso na identificação, diagnóstico e prognóstico dos linfomas não- Hodgkin (LNH) (Harris et al., 1994), alguns subtipos têm sido mal caracterizados e classificados em grupos heterogêneos. Este é o caso do linfoma difuso de células grandes B (LDCGB), o tipo mais freqüentes de LNH (30-40%) no adulto. A diversidade na apresentação clínica, nos aspectos morfológicos e nas alterações moleculares sugere que o LDCGB representa um grupo heterogêneo de neoplasias, mais que uma entidade única (Gatteer e Warnke, 2001). Os regimes terapêuticos baseados em antraciclinicos são eficazes em apenas 40-50% dos pacientes com LDCGB (Coiffier, 2005). Por esta razão torna-se um desafio identificar, ao diagnóstico, pacientes que poderiam beneficiar-se de terapias mais agressivas ou experimentais. Atualmente, o prognóstico dos pacientes com LDCGB é estimado usandose os parâmetros do International Prognostic Index (IPI) (The International Non- Hodgkin s Lymphoma Prognostic Factors Project, 1993). No entanto acredita-se que estes parâmetros clínicos representem a expressão de diversos fatores biológicos e genéticos, subjacentes. Nos últimos anos, os estudos de expressão gênica (DNA microarrays) têm revolucionado o nosso entendimento dos LDCGB. Alizadedeh et al. (2000), e posteriormente outros autores (Rosenwald et al., 2002; Wright et al., 2003), demonstraram que os LDCGB podem ser categorizados em pelo menos dois grupos: um grupo de tumores com melhor prognóstico, presumivelmente derivados de células do centro germinativo (LDCGB-CG), e um outro grupo com pior prognóstico, que inclui linfomas derivados de células B ativadas pós-centro germinativas (LDCGB-CBA). A distinção baseada na origem celular dos LDCGB foi confirmada pela demonstração de heterogeneidade intraclonal nos LDCGB-CG e ausência desta nos LDCGB-CBA. A heterogeneidade intraclonal reflete o fenômeno de hipermutação somática (HS) ongoing no gene IGH rearranjado, o que apóia a idéia de que o evento de transformação inicial

17 16 dos linfomas CG ocorreria no microambiente centro-germinal e dos LDCGB-CBA em células B pós-cg (Lossos et al., 2000b). Diante do alto custo destas novas tecnologias e da dificuldade da sua aplicação na rotina clínica, as atuais pesquisas têm-se esforçado por desenvolver métodos mais simples para subclassificar os LDCGB nos grupos moleculares e clínicos (King et al., 2000; Barrans et al., 2002a; Colomo et al., 2003; Linderoth et al., 2003). Recentemente, Hans et al. (2004) demonstraram que a expressão imunohistoquímica de CD10, BCL6 e MUM1/IRF4 pode ser combinada para diferenciar os LDCGB em subtipos CG e não-cg e predizer uma sobrevida similar à obtida pelos estudos de cdna microarrays. Trabalhos posteriores confirmaram estas observações (Zinzani et al., 2005; Berglund et al., 2005), demonstrando que a caracterização do perfil imunohistoquímico dos LDCGB representa uma abordagem eficiente e altamente confiável na pratica clínica. No entanto, praticamente não existem trabalhos na literatura que correlacionem a expressão combinada destes três marcadores ao perfil imunogenético dos LDCGB. A superexpressão da proteína antiapoptótica BCL2, encontrada em 45 a 60% dos LDCGB, tem sido indicada em vários estudos como um marcador biológico com significado prognóstico, mas com resultados controversos entre as diferentes séries publicadas (Tang et al., 1994; Piris et al., 1994; Gascoyne et al., 1997; Barrans et al., 2002a; Colomo et al., 2003). A t(14;18)(q32;q21), que representa um evento precoce na patogênese do linfoma folicular e acredita-se ser responsável pela superexpressão da proteína BCL2 (Tsujimoto et al., 1986), também é detectada em 10 a 30% dos LDCGB. Alguns estudos, que analisaram a freqüência desta alteração em LDCGBs caracterizados pela expressão dos marcadores imunohistoquímicos CD10 e BCL6 (Mccluggage et al., 2002; Barrans et al., 2003a; Xu et al., 2005) ou por estudos de expressão gênica (Huang et al., 2002; Iqbal et al., 2004; Poulsen et al., 2005) concluíram que a t(14;18) pode ser responsável pela superexpressão de BCL2 em alguns LDCGBs derivados de células B do CG. A amplificação gênica do BCL2, um outro mecanismo pelo qual a expressão de BCL2 poderia estar desregulada, tem sido descrita em mais de 30% dos LDCGB (Monni et al.,

18 ; Rao et al., 1998) e recentemente associada aos LDCGB-CBA (Beà et al., 2004; Kusumoto et al., 2005; Iqbal et al., 2006). Estas observações suportam a importância da detecção da t(14;18) e outras alterações no gene BCL2 nos LDCGB visando à distinção de subgrupos com valor prognóstico, porém estudos adicionais são necessários para determinar a freqüência e o impacto destas anormalidades nos subgrupos CG e não-cg caracterizados através da expressão de marcadores imunohistoquímicos. O objetivo do presente estudo foi a caracterização imunohistoquímica-molecular de uma série de LDCGB primários. Para isto foi: a) determinado o perfil de expressão imunohistoquímica característico dos subgrupos CG e não-cg utilizando a tecnologia de tissue microarray (TMA); b) analisado o padrão de hipermutação somática dos genes IGH (perfil imunogenético) em casos selecionados e c) estudada a freqüência de alterações do gene BCL2 por hibridização in situ flourescente (FISH) e por métodos baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR).

19 18 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 A diversidade e a heterogeneidade dos LDCGB na era da classificação WHO O linfoma difuso de células grandes B (LDCGB) é o tipo de linfoma não Hodgkin (LNH) mais comum no adulto. Mais de novos casos são diagnosticados a cada ano, o que representa aproximadamente 30-40% dos LNH nos paises ocidentais (Gatteer e Warnke, 2001; Milito et al., 2002). Embora considerados como uma entidade clínicopatológica única, acredita-se que o LDCGB represente um grupo heterogêneo de neoplasias devido à acentuada diversidade de suas características clínicas, morfológicas e moleculares. Esta heterogeneidade biológica e clínica foi reconhecida pela classificação da WHO (World Health Organization), hoje aceita como o novo padrão de classificação das neoplasias hematológicas (Gatteer e Warnke, 2001). Os fatores clínicos com valor prognóstico incluídos no IPI (International Prognostic Index) têm sido utilizados na estratificação de pacientes com LDCGB por mais de uma década (The International Non-Hodgkin s Lymphoma Prognostic Factors Project, 1993). O IPI ajustado à idade em estudos com terapias em altas doses e transplante de precursores hematopoiéticos, e o IPI modificado de acordo com o estagiamento para pacientes com doença limitada, também têm sido amplamente utilizados (Sweetenham, 2005). Embora o IPI tenha valor para a estratificação de pacientes em diversos estudos clínicos, há uma marcada variabilidade no desfecho de pacientes pertencentes ao mesmo grupo de risco. A limitação dos parâmetros clínicos para predizer a resposta às terapias específicas reflete em parte a heterogeneidade biológica inerente aos LDCGB, e indica a necessidade de identificação de fatores de risco mais precisos, baseados nas características biológicas de cada tumor e cada paciente. No intuito de elucidar estes fatores, a maioria dos estudos têm abordado a heterogeneidade dos LDCGB focalizando-se no valor prognóstico de características morfológicas, na expressão de numerosas proteínas individuais e em alterações moleculares freqüentemente associadas à patogênese destes linfomas

20 19 (Engelhard et al., 1997; Diebold et al., 2002; Kramer et al., 1996; Vitolo et al., 1998; Harada et al., 1999; Uherova et al., 2001). Apenas três entidades de LDCGB com características morfológicas, imunofenotípicas, citogenéticas e clínicas particulares foram reconhecidas e classificadas separadamente pela classificação WHO: linfoma primário de mediastino, linfoma intravascular e linfoma primário com derrame em cavidades (Carbone e Gaidano, 1997; Kanda et al., 1999; Pileri et al., 2003; Savage et al., 2006). Os LDCGB centroblástico, imunoblástico, anaplásico e B rico em células T são reconhecidos como variantes morfológicas porem sem o status de entidades clinico-patológicas diferentes (Gatteer e Warnke, 2001). Contudo, o significado destes subtipos morfológicos na sobrevida de pacientes com LDGCB permanece controverso, principalmente pela falta de reprodutibilidade dos critérios histopatológicos de análise (Engelhard et al., 1997; Diebold et al., 2002; Colomo et al., 2003; Azambuja et al., 2006). O possível valor prognóstico das variantes morfológicas dos LDCGB tem sido abordado previamente em vários estudos (Baars et al., 1999; Engelhard et al., 1997; Diebold et al., 2002). Foi observado que pacientes com LDCGB imunoblástico (ou alternativamente tumores com >50% de imunoblastos) apresentam sobrevida menor quando comparados àqueles com variantes centroblásticas (Engelhard et al., 1997; Diebold et al., 2002; De Paepe et al., 2005). Estas e outras evidências sugerem que os LDCGB definidos pela classificação REAL/OMS, incluem diversos tumores originados da transformação maligna de células B em diferentes estágios da diferenciação (Küppers et al., 1999). Um grande número de marcadores imunofenotípicos relacionados à diferenciação celular, proliferação, evasão da apoptose, capacidade de invasão e de angiogênese têm sido identificados e propostos como potenciais fatores prognóstico nos LDCGB, mas com resultados controversos entre os diferentes estudos (Tabela 2.1). As discrepâncias em relação ao genuíno valor complementar destes biomarcadores, para predizer a

21 20 sobrevida dos pacientes com LDCGB tem impossibilitado a sua incorporação à pratica clínica (Lossos e Morgensztern, 2006). Estudos citogenéticos e moleculares em DLBCL primários demonstraram a presença de translocações cromossômicas recorrentes envolvendo os genes BCL2, BCL6 e CMYC (Bastard et al., 1994; Kramer et al., 1998; Vitolo et al., 1998; Akasaka et al., 2000a). Na grande maioria dos casos trata-se de translocações recíprocas com o gene da cadeia pesada da imunoglobulina (IGH) no cromossomo 14q32 (Willis e Dyer, 2000). O significado prognóstico destas alterações em pacientes com LDCGB é ainda incerto. No que diz respeito à presença de rearranjos no BCL2 (18q21) vários estudos não acharam correlação com o desfecho clínico (Gascoyne et al., 1997; Kramer et al., 1998), ao passo que outros descreveram um impacto adverso na sobrevida (Yunis et al., 1989; Jacobson et al., 1993; Barrans et al., 2002a). Esta incongruência entre as diferentes séries também é observada quando analisado o papel de translocações e mutações na região 5 do gene BCL6 (3q27) no prognóstico dos LDCGB (Offit et al., 1994; Barrans et al., 2002b; Bastard et al., 1994; Kramer et al., 1998; Jerkeman et al., 2002). Por sua vez, translocações envolvendo o gene CMYC não parecem influenciar na sobrevida como demonstrado nas séries de LDCGB estudadas (Ladanyi et al., 1991; Kramer et al., 1998; Akasaka et al., 2000a). Os mecanismos moleculares subjacentes à patogênese dos LDCGB ainda não foram completamente elucidados, mas a grande maioria destes tumores exibe alterações em genes implicados na reparação do DNA, ciclo celular ou apoptose (ATM, ARF, TP53, P16 INK4, etc.). Outras alterações foram descritas em LDCGB, como amplificações gênicas (REL, C-MYC e BCL2), deleções e ganhos cromossômicos, envolvendo genes cujo verdadeiro papel, em muitos casos, ainda não foi identificado (Houldsworth et al., 1996; Monni et al., 1997; Rao et al., 1998; Berglund et al., 2002; Beà et al., 2004). Foi demonstrado em alguns estudos que várias destas alterações têm implicações prognósticas (Rao et al., 1998; Moller et al., 2000; Grønbæk et al., 2002; Leroy et al.,

22 ), mas a sua aplicação na pratica clínica é limitada e o seu verdadeiro poder para predizer o prognóstico em LDCGB é ainda incerto. Estas e outras alterações genéticas freqüentemente descritas nos LDCGB estão listadas na tabela Subgrupos de LDCGB definidos pela expressão gênica O recente desenvolvimento da tecnologia de DNA microarrays tem permitido analisar, em grande escala, as alterações na expressão gênica associadas a processos fisiológicos e patológicos (Brown e Botstein, 1999; Staud e Brown, 2000; Dybkaer et al., 2004). Vários grupos, reconhecendo este potencial, exploraram a utilização da expressão gênica no diagnóstico, classificação e definição de fatores prognósticos em vários tipos de linfomas (Davis e Staudt, 2002; Husson et al., 2002; Rosenwald et al., 2003; Basso et al., 2004; Schmechel et al., 2004; Hummel et al., 2006). Vários trabalhos têm associado certos perfis de expressão gênica tumoral com o desfecho clínico ou com a resposta terapêutica de pacientes com LDCGB. Essencialmente, estes estudos seguiram duas estratégias: análises não supervisionadas, onde os dados foram estudados sem o auxilio de informações externas (tais com dados clínicos, tempo de sobrevida, etc.) e análises supervisionadas cujo principal objetivo foi identificar genes com expressão alterada em relação a variáveis predeterminadas. O primeiro trabalho de expressão gênica em linfomas foi a partir de amostras de LDCGB utilizando uma plataforma de cdna microarray, conhecida como LymphoChip, construída especificamente para monitorar a expressão gênica em neoplasias linfóides (Alizadeh et al., 2000). Os autores, em um estudo não supervisionado, identificaram dois subgrupos de LDCGB exibindo dois diferentes perfis de expressão gênica: linfomas com alta expressão de genes característicos das células B do centro germinativo (CG) e outros exibindo expressão de um grupo de genes superexpressos em linfócitos B de memória ativados in vitro por agentes mitógenos (CBA). Neste estudo pioneiro, foi demonstrado também que a sobrevida global dos pacientes com LDCGB-CG foi significativamente maior quando comparada à dos pacientes com LDCGB-CBA, achado significativo ainda

23 22 considerando os pacientes nos grupos definido pelo IPI. Estes resultados iniciais foram confirmados em estudos posteriores, nos quais, além dos tipos LDCGB-CG e CBA foram identificados linfomas com expressão gênica e desfecho clínico intermediários, nomeados como LDCGB tipo III ou não classificáveis (Rosenwald et al., 2002; Wright et al., 2003). Apesar da correlação significativa entre sobrevida global dos pacientes com LDCGB com os grupos de origem celular definidos pela expressão gênica, ainda observa-se uma substancial heterogeneidade no desfecho clínico dos pacientes do grupo CG com melhor prognóstico (~60% de sobrevida em cinco anos) assim como dentro do grupo CBA (30% de sobrevida em cinco anos). Em um estudo supervisionado, utilizando uma plataforma de oligonucleotídeos correspondentes a genes (Affymetrix GeneChip ), Shipp et al. (2002) analisaram 58 casos de LDCGB selecionados de acordo à resposta a tratamento com CHOP (curados versus sem resposta ou refratários). Os autores geraram um modelo baseado na expressão diferencial de 13 genes capaz de identificar, independentemente do IPI, duas categorias de pacientes com taxas de sobrevida de 70% e 12% em cinco anos, e predisser a chance de cura ou morte pela doença. Estes resultados não se correlacionaram com os subgrupos definidos pela origem celular como descrito por Alizadeh et al., sugerindo que outros fatores poderiam estar determinando a resposta terapêutica dos LDCGB. Estudos recentes em uma série independente de 176 LDCGB nodais assinalaram a existência de outros padrões de expressão gênica relacionados ao micro-ambiente tumoral e à resposta inflamatória do hospedeiro (Monti et al., 2005). Embora os grupos de pacientes definidos por estes perfis não tenham mostrado diferenças na sobrevida global em cinco anos, os autores identificaram potenciais mecanismos patogênicos assim como eventuais alvos terapêuticos em subgrupos particulares de LDCGB.

24 Tabela 2.1: Expressão de proteínas individuais no prognóstico dos LDCGB Expressão de proteínas Características Impacto no prognóstico Principais estudos de referência Ciclo celular p53 Fator de transcrição multifuncional Não Zhang et al., 1999; Kramer et al., 1996; Sohn et al, 2003;Barrans et al., 2003b; Maartense et al., 2004 Adverso Ichikawa et al., 1997; Leroy et al., 2002; Paik et al. 2005; Visco et al., 2006 p27 KIP1 Quinase dependente de ciclinas Adverso Saez et al., 1999 Não Seki et al., 2003 Ciclina B1 Ciclina Adverso Oberman et al., 2005 Ciclinas D (D2 e D3) Ciclina Adverso Filipits et al., 2002; Hans et al., 2004; Hans et al., 2005 Ciclina E Ciclina Adverso Tzankov et al., 2006 Ki67 Antígeno nuclear de proliferação Adverso Miller et al., 1994; Grogan et al., 1988 Não Zhang et al., 1999; Seki et al., 2003; Colomo et al., 2003; Jerkeman et al., 2004 Diferenciação B BCL6 Repressor transcricional Favorável Zhang et al., 1999; Lossos et al., 2001; Berglund et al., 2005 Não Chang et al, 2004; Muris et al., 2006 CD10 Endopeptidase de membrana Favorável Ohshima et al., 2001; Hans et al., 2004; Biasoli et al., 2005; Berglund et al., 2006 Não Lossos et al., 2001; Colomo et al, 2003; Fabiani et al., 2004 Adverso Uherova et al, 2001; Xu et al., 2001 HGAL Proteína transdutora de sinais 2 Favorável Natkunam et al., 2005 CD23 Molécula reguladora de células B Favorável Linderoth et al., 2003 CD40 Receptor da família do TNFR Favorável Linderoth et al., 2003 CD5 Glicoproteína de membrana Adverso Yamaguchi et al., 2002; Linderoth et al., 2003 CD21 Receptor de membrana Adverso Otsuka et al., 2004 MUM1/IRF4 Fator de transcrição Não Colomo et al., 2003; Berglund et al., 2005 Adverso Hans et al., 2004; Sáez et al., 2004; Chang et al, 2004 FOXP1 Fator de transcrição Não Hans et al., 2004 Adverso Barrans et al., 2004; Banaham et al., 2005 PKCβ Quinase Adverso Hans et al., 2005

25 24 Tabela 2.1: Expressão de proteínas individuais no prognóstico dos LDCGB (continuação) Expressão de proteínas Características Impacto no prognóstico Referências Apoptose BCL2 Proteína antiapoptótica Não Piris et al., 1994; Tang et al., 1994; Wilson et al.,1997 Favorável 1 Hill et al., 1996; Hermine et al., 1996; Kramer et al., 1998 Adverso Gascoyne et al., 1997; Barrans et al., 2002a; Colomo et al., 2003; Sohn et al., 2003; Mounier et al., 2003; Hans et al., 2004; De Paepe et al., 2005 CD95/FAS Receptor de membrana Favorável Eser et al., 2006; Kojima et al., 2006 Caspase 3/8 Enzima proteolítica Favorável Donoghue et al., 1999 ; Muris et al., 2005 Caspase 9 Enzima proteolítica Adverso Muris et al., 2005 Survivina Inibidor da apoptose Adverso Adida et al., 2000; Watanuki-Miyauchi et al., 2005 Adesão s-icam1 Receptor de membrana Adverso 3 Lei e Johnson, 2000; Terol et al., 2003 s-cd44 Glicoproteína de membrana Adverso 3 Ristamaki et al., 1997 Angiogênese Endostatina Fator peptídico anti-angiogenico Adverso 3 Bono et al., 2003 VEGF Fator peptídico pró-angiogênico Adverso 3 Salven et al., 2000 MMPs Endopeptidases Adverso Sakata et al., 2004 HGF Proteína tipo plasminogênio Adverso Kawano et al., 2004 Outras moléculas IL-10 Citocina imunoreguladora Adverso 3 Lech-Maranda et al., 2004 nm23-h1 Fator supressor de metástase Adverso 3 Niitsu et al., 2004 MHC Complexo de histocompatibilidade Favorável Miller et al., 1988; Muris et al., 2004; Rimsza et al., 2004 LDCGB, linfoma difuso de células grandes B; do inglês: HGAL, human germinal center associated lymphoma; TNFR, tumor necrosis factor-receptor; MUM1/IRF4, multiple myeloma 1/interferon regulatory factor 4 ;VEGF, vascular endothelial growth factor; MMP, matrix metalloproteinase; HGF, hepatocyte growth factor; FOXP1, forkhead box protein 1; PKCβ, protein kinase C-beta; IL-10, interleucina 10; MHC, major histocompatibility complex 1 Estudos mostrando associação inversa entre a expressão de BCL2 com a sobrevida livre de doença, mas não com a sobrevida global 2 O gene HGAL, recentemente caracterizado, de função certa desconhecida, é induzível pela IL-4 (Lossos et al., 2003) 3 Fração solúvel da molécula ou produto de degradação detectadas em soro

26 25 Tabela 2.2: Principais alterações genéticas associadas à patogênese dos LDCGB Gene (localização) Mecanismo de desregulação Freqüência Impacto no prognóstico Principais estudos BCL2 (18q21) t(14;18)(q32;q21) 10-30% Não Gascoyne et al., 1997; Kramer et al., 1998 Amplificação ganho cromossômico 11-24% Adverso Monni et al, 1997; Rao et al., 1998; Bèa et al., 2004 BCL6 (3q27) t(3;...) % Controverso Offit et al., 1994; Ichinohasama et al., 1998; Hosokawa et al., 2000; Akasaka et al., 2000b Deleção Desconhecido Nakamura et al., 1999, 2000 HS fisiológica/ 50-70% Controverso Pasqualucci et al., 1998; aberrante 4 Pasqualucci et al., 2001 CMYC (8q24) t(8;...) 1 15% Não Ladanyi et al., 1991; Vitolo et al., 1998; Kramer et al., 1998; Akasaka et al., 2000a Amplificação 16% Adverso Rao et al., 1998 HS aberrante 4 32% Desconhecido Pasqualucci et al., 2001 FAS/CD95 (10q24) TP53 (17p) Mutação 2 20% Desconhecido Muschen et al., 2000 Wohlfart et al., 2004 HS fisiológica/ 6-10% Desconhecido Pasqualucci et al., 2001 aberrante 4 Scholl et al., 2006 Mutação, deleção 18-30% Adverso 3 Schouten et al., 1990; Ichikawa et al., 1997; Leroy et al., 2002; Kerbauy et al., 2004; Beà et al., 2004 REL (2p13) Amplificação ganho cromossômico 15-25% Controverso Houldsworth et al., 1996; Rao et al., 1998; Beà et al., 2004; Houldsworth et al., 2004 PIM1 (6p21.2) PAX5 (9p13) RhoH/TTF (4p13) BLIMP1 (6q21-q22.1) ATM (11q23) HS aberrante 4 43% Desconhecido Pasqualucci et al., 2001 HS aberrante 4 57% Desconhecido Pasqualucci et al., 2001 HS aberrante 4 46% Desconhecido Pasqualucci et al., 2001 Mutação, deleção 24% 5 Desconhecido Pasqualucci et al., 2006; Tam et al., 2006 Mutação 13-24% Desconhecido Zhu et al., 2000; Grønbæk et al., 2002 HS, hipermutação somática; LDCGB, linfoma difuso de células grandes B 1 Na maioria dos casos o parceiro destas translocações é o cromossomo 14q32. 2 Mutações no exon 9 do CD95 (domínio de morte extracelular) têm sido mais freqüentemente observadas em LDCGB extranodais, ao passo que mutações na região 5 do gene, incluindo várias seqüências reguladoras parecem ser mais comuns nos casos nodais (Scholl et al., 2006) 3 Não foi demonstrado em outras séries (Kramer et al., 1998; Sohn et al., 2003; Maartense et al., 2004) 4 Nas regiões reguladoras 5 5 Alterações detectadas apenas em LDCGB com expressão de células B ativadas

27 Definição de perfis de expressão protéica por imunohistoquímica (IHQ) em LDCGB: a transferência do conhecimento da expressão gênica à pratica clínica As técnicas baseadas na análise de expressão gênica em grande escala contribuíram enormemente para o entendimento da biologia das neoplasias linfóides e principalmente para o refinamento na discriminação dos grupos prognósticos de LDCGB identificados pelo IPI. No entanto, a utilidade clínica desta abordagem é limitada fundamentalmente pela necessidade de tecidos criopreservados (ou grandes quantidades de RNA), laboriosidade e elevados custos. A tradução do conhecimento gerado pelos estudos de cdna microarray dos LDCGB em plataformas aplicáveis à rotina clínica tem se tornado um grande desafio, especialmente no que diz respeito à validação da expressão ao nível do RNA mensageiro (RNAm) com a expressão protéica detectada por imunohistoquímica (IHQ) em tecidos fixados e impregnados em parafina (Shipp et al., 2002; Lossos et al., 2004a; Sáez et al., 2004; Hans et al., 2004). Neste ponto, enormes avanços ocorreram nos últimos anos, principalmente pela incorporação da tecnologia do TMA (tissue microarray), que têm permitido analisar simultaneamente a expressão IHQ de até 500 fragmentos (cores) de tumores fixados e impregnados em parafina (Kononen et al., 1998; Bubendorf et al., 2001; Packeisen et al., 2002; Hedvat et al., 2002; Zu et al., 2005). Numerosos estudos têm demonstrado uma excelente correlação entre os resultados de expressão IHQ em lâminas de TMA e seções de tumores FIP convencionais em linfomas e outros tumores (Camp et al., 2000; Natkunam et al., 2001; Zettl et al., 2003; Leversha et al., 2003; Griffin et al., 2003). Deste modo o TMA constitui uma poderosa ferramenta para a análise da expressão de proteínas relacionadas à diferenciação celular B, assim como a de outros biomarcadores com potencial impacto na sobrevida de pacientes com LDCGB. No intuito de definir perfis de expressão protéica, associados a grupos de riscos, vários estudos focalizaram-se na análise e validação clínica de marcadores imunohistoquímicos

28 27 em LDCGB, embora com resultados discordantes (Barrans et al., 2002a; Colomo et al., 2003; Sáez et al., 2004). Hans et al. (2004) demonstraram que a expressão imunohistoquímica de CD10, BCL6 e MUM1/IRF4 pode ser combinada para diferenciar dois grupos de pacientes, com melhor e pior sobrevida global em cinco anos: 73% no grupo de pacientes com perfil IHQ CG e 34% no grupo não-cg. Estas taxas de sobrevida foram altamente concordantes com as obtidas pela definição da expressão gênica nos grupos de LDCGB CG e CBA, respectivamente. Este estudo demonstrou também, que a expressão individual de CD10 e BCL6 esteve associada com uma maior sobrevida global, ao passo que a expressão individual de MUM1, BCL2 e Ciclina D2 foram fatores adversos. O perfil não-cg e IPI de alto risco demonstraram ser fatores preditivos independentes da sobrevida global. Tabela 2.3: Principais estudos sobre o valor prognóstico do perfil IHQ CG em LDCGB Referência N de pacientes Freqüência de casos CG (%) Sobrevida global em 5 anos (%, p) Sobrevida livre de doença em 5 anos (%, p) Barrans et al., 2002a % (<0,001) NR Colomo et al, /26 2 NS NR Chang et al., % (0.008) NR Hans et al., % (<0,001) 63% (0,007) Paik et al., NS NS De Paepe et al., NS NS Zinzani et al., % (<0,001) 6 86% (0,001) 6 Visco et al., % (0,006) 57% (0,01) Muris et al., % (0,004) NR Berglund et al., % (<0,0001) 68% (0,002) Lin et al., % (0,003) NR LDCGB, linfoma difuso de células grandes B; NR, não reportado; NS, não significativo; CG, centro germinativo. Os resultados foram considerados com valor significativo quando p<0,05. Todas as séries incluíram casos nodais, com exceção dos estudos de Colomo et al. (39% de casos extranodais) e Paik et al. (59% casos extranodais) 1 Definidos pela co-expressão de CD10 e BCL6 2 Os autores distinguem LDCGB CG CD10+ (21%) e CD10- (26%) 3 Expressão de pelo menos um marcador próprio do CG, CD10 ou BCL6 ( Padrão A no trabalho original). 4 Definidos de acordo com o modelo de três marcadores IHQ, proposto por Hans e col. (2004) 5 Definidos pela expressão conjunta de CD10 e BCL6 ou alternativamente BCL6 e MUM1, sem expressão de BCL2. Os autores distinguem estes padrões de expressão (nomeado Grupo 1 no trabalho original) como de células B entrando ou deixando o CG, respectivamente. 6 Nesta série a sobrevida global e a sobreviva livre de doença foi calculada em 3 anos de acompanhamento

29 28 Desde então, séries independentes de LDCGB foram analisadas de acordo com esta estratégia e, com algumas exceções, os estudos com maior número de pacientes mostram resultados inconstantes no que diz respeito ao poder de diferenciar grupos prognósticos (Tabela 2.3). Constata-se, que apesar de todos os esforços ainda não existe um modelo de expressão IHQ definitivo capaz de discriminar a heterogeneidade observada nos LDCGBs. 2.4 Perfil imunogenético dos LDCGB Uma forma de entender e abordar as neoplasias de células B é determinar o estagio onde cessou a diferenciação da célula precursora (Zalcberg e Hassan, 2004). A grande maioria dos linfomas B maduros tem sua origem em células do CG, indicando que os fenômenos e mecanismos próprios deste compartimento envolvem alto risco linfomatogênico (Küppers et al., 1999). Particularmente, nas neoplasias linfóides originadas pela transformação de células B, sustenta-se a visão de que os processos moleculares envolvidos na diversificação dos genes de imunoglobulinas (recombinação somática VDJ, revisão de receptor, hipermutação somática e mudança de isotipos) comportariam um risco de erro e produção de alterações genéticas (Vaandrager et al., 2000; Willis e Dyer, 2000; Pasqualucci et al., 2001; Küppers e Dalla-Favera, 2001; Ferguson et al., 2002) Ontogenia de células B e principais mecanismos fisiológicos envolvidos na diversidade do reconhecimento antigênico As células B normais diferenciam-se através de um processo programado no qual um progenitor indiferenciado passa por um número de estágios que culminam na produção de uma célula B de memória ou de uma célula plasmática produtora de anticorpos (Alt et al., 1987). Os diferentes estágios de maturação podem ser caracterizados com base na expressão diferencial de moléculas de superfície e dos processos gênicos operantes nos genes das imunoglobulinas.

30 29 A recombinação V(D)J é propriedade exclusiva das células linfóides, constituindo uma estratégia única, responsável pela imensa diversidade molecular do sistema imune. As cadeias pesadas (H) e as cadeias leves (kappa ou lambda) das imunoglobulinas são codificadas pelos genes IGH, IGK e IGL, respectivamente. Cada um destes genes possui uma região variável e uma região constante. Na região variável, cada gene contém um repertório disponível de segmentos gênicos V (variável), J (juncional) e D (diversidade), nos quais na configuração germinal, encontram-se separados fisicamente em longos trechos de DNA (Tonegawa, 1983). O processo de maturação dos genes das imunoglobulinas começa com a recombinação somática V(D)J na medula óssea num processo antígeno independente (Figura 2.1). Figura 2.1: Representação esquemática do rearranjo do gene da cadeia pesada da imunoglobulina Nas etapas precoces da diferenciação dos linfócitos B, ocorre um processo de recombinação somática originando segmentos V(D)J contínuos. Primeiramente acontece a recombinação entre os segmentos D e J, e posteriormente o rearranjo V com DJ. A seqüência codificada pela região C incorpora-se às moléculas de Igs no momento da transcrição do RNA mensageiro (RNAm). Deste processo de rearranjo gênico resulta a expressão das Igs. As linhas de pontos representam o corte e a união dos segmentos gênicos durante o processo. V, segmentos variáveis; D, segmentos de diversidade; J, segmentos de união (joining); C, segmentos constantes.

31 30 Existem aproximadamente 51 segmentos VH, 27 segmentos DH e seis segmentos JH funcionais (Ravetch et al., 1981; Cook e Tomlinson, 1995; Matsuda et al., 1996; Corbett et al., 1997). Os segmentos gênicos VH possuem um exon líder curto, na posição 5, seguido por um exon codificante, de aproximadamente 300 pb. Este último é organizado em 3 regiões framework (FR1-3) com seqüências relativamente bem conservadas e 3 regiões determinantes da complementariedade antigênica (CDR1-3). A região CDR3 do gene IGH é criada pela junção VDJ e é gerada pela combinação ao acaso dos segmentos gênicos VH, DH e JH, pela excisão exonucleolítica e pela adição de nucleotídeos extras (nomeados N ) (Sanz, 1991) (Figura 4.3). Durante a fase antígeno-dependente nos órgãos linfóides secundários, o repertório de Ig, gerado pela recombinação V(D)J nas etapas precoces da ontogenia B (repertório imune primário), é diversificado pela indução de HS na região variável dos genes Ig, ao passo que a região constante é freqüentemente mudada pelo processo conhecido como mudança de isotipo ou switch (Manis et al., 2002; Jacobs e Bross, 2001) (Figura 2.2). Dos mecanismos moleculares típicos dos genes das imunoglobulinas no centro germinativo (CG), compete aos objetivos deste trabalho uma breve revisão de conceitos fundamentais sobre o processo de HS. A HS é um processo único das células B de vertebrados, pelo qual são introduzidas mutações pontuais (mas também deleções e inserções) especificamente nos genes que codificam a porção variável das cadeias leves e pesadas das Igs, com uma taxa de adição de ~10-3 bases por geração (aproximadamente um milhão de vezes maior que a taxa mutacional no genoma em geral) (Neuberger et al., 1998). Neste contexto, as células centro-germinativas estimuladas por antígenos são submetidas a vários ciclos de hipermutação somática. Após a seleção positiva das células produtoras de anticorpos de alta afinidade, aquelas células que perdem a afinidade pelo antígeno ou falham na produção de anticorpos funcionais, são induzidas à execução do programa de apoptose (Figura 1.3) (Tonegawa, 1983; Klein et al., 1998).

32 31 Figura 2.2: Processos moleculares responsáveis pela modificação dos genes das imunoglobulinas no centro germinativo. A, a edição da Ig é um processo pelo qual uma cadeia polipeptídica de um anticorpo expresso no linfócito B, usualmente a cadeia leve, é substituída por outra. B, o switch isotípico resulta na substituição de imunoglobulinas de superfície originais com regiões constantes por moléculas de anticorpos com a mesma especificidade antigênica, mas com funções efetoras (IgA, IgG ou IgE) distintas da original. C, o processo de hipermutação somática introduz mutações pontuais e ocasionalmente deleções e duplicações numa taxa elevada, especialmente nos genes VH e VL. CH e CL, segmentos gênicos codificantes para as regiões constantes da cadeia pesada e leve da Ig, respectivamente. Figura modificada de Küppers et al., O modelo mais aceito de HS sustenta que este processo ocorre a nível genômico e apresenta as seguintes características: 1) dependência da estimulação antigênica; 2) dependência de seqüências em cis específicas; 3) associação com a transcrição ou reparação ligada à transcrição; 4) limitação à região variável, em um segmento de ~1.5 Kb, em posição 3 com relação às seqüências promotoras; 5) substituição de aminoácidos (mutações R) ou silenciosas (mutações S); 6) introdução de mutações com alvo preferencial em motivos moleculares específicos ( hotspots ) definidos pelas seqüências RGYW/ WRCY (R = A, G ou T; Y = C ou T; W = A ou T); 7) mutações pontuais, mas também deleções e inserções; 8) preferência de transições sobre transversões (Peters e Storb, 1996; Klein et al., 1998; Storb et al., 1998; Jacobs e Bross, 2001).

33 Figura 2.3: Principais eventos da diferenciação B no centro germinativo 32

34 Padrões de hipermutação somática em LDCGB Pelas características moleculares inerentes ao processo de recombinação, cada célula B gera somente um rearranjo V(D)J funcional por cadeia pesada e leve, codificando um anticorpo único e distinto. Como o processo de transformação maligna é originado a partir de uma simples célula, que adquire vantagens seletivas sobre as células normais, todas as células derivadas do clone maligno compartilham o mesmo rearranjo V(D)J (marcador clonal) (Küppers et al., 1999). A análise de seqüências da região variável dos genes Ig, utilizados pelas várias populações B normais, tem suportado o conceito de origem celular deduzido pelos dados imunohistoquímicos e por estudos experimentais em animais. Especialmente no estudo das neoplasias B, a análise de mutações representa uma poderosa ferramenta que permite elucidar o estágio de diferenciação no qual o processo de transformação maligna aconteceu assim como identificar a contraparte normal das células neoplásicas (Stevenson et al., 2001) (Figura 2.4). Como já foi mencionado, as mutações acumulam-se nos genes V-Ig, particularmente no CG, durante a diversificação do reconhecimento antigênico. Como conseqüência disto, as células B pré-cg e os diferentes linfomas que se originam delas apresentam seus genes V não mutados (células B virgens circulantes e a grande maioria das células da região do manto), ao passo que as células B experimentadas que participaram da reação centrogerminal carregam estes genes mutados (Jacob et al., 1991; Kuppers et al., 1993; Pascual et al., 1994; Hummel et al., 1994). Inúmeros trabalhos sobre o perfil imunogenético dos linfomas foliculares, tipicamente originados a partir de células B CG, revelaram que em todos os casos as células neoplásicas carregam genes V-Ig mutados e especialmente exibem seqüências com diversidade intraclonal, evidência da HS ongoing constitutiva (Bahler e Levy, 1992; Zelenetz et al., 1992). Isto sugere, que os mecanismos responsáveis pela incorporação de mutações nos genes Ig permanecem

35 34 ativos nestes tumores após a transformação neoplásica (Ottensmeier et al., 1998; Zhu et al., 2002). Nesta mesma linha de evidência, o estudo da região variável dos genes Ig em LDCGB tem demonstrado, também, que praticamente todos os casos exibem seus genes mutados e muitos deles apresentam heterogeneidade intraclonal (Küppers et al., 1997; Taniguchi et al., 1998; Ottensmeier et al., 1998; Lossos et al., 2000a). Recentemente, Lossos et al. (2000b) demonstraram que os subgrupos moleculares e prognósticos de LDCGB definidos de acordo com os perfis de expressão gênica podem também ser diferenciados em relação ao perfil imunogenético. Os autores demonstraram evidências de variabilidade intraclonal (HS ongoing) em todos os casos classificados como CG, mas apenas em 2 dos 7 LDCGB com características de células B ativadas. Estes achados suportam a idéia de que o evento de transformação inicial que origina os LDCGB-CG ocorreria no microambiente CG e que estas células manteriam intacta a sua habilidade de mutar seus genes Igs. Por outro lado, os LDCGB-CBA seriam derivados de células B pós- CG, nas quais a maquinaria da HS está inativa, ou eventualmente, de células B CG onde o evento de transformação altera o padrão de expressão gênica e o processo de HS é interrompido (Pasqualucci et al., 2004).

36 35 Figura 2.4: Compartimentos fisiológicos na diferenciação das células B maduras definidos pela mutação dos genes de imunoglobulinas As células B virgens pré-foliculares apresentam os genes de Ig rearranjados mas não mutados. Os linfócitos que colonizam os órgãos linfáticos secundários e entram na área centrofolicular são submetidos a intensa seleção antigênica. No compartimento centrofolicular os genes das Igs sofrem hipermutação somática (as mutações originadas pela HS são representadas, nesta figura, como barras verticais na região VDJ das células CG e pós-cg), switch isotípico e, eventualmente, edição dos segmentos gênicos. A HS ongoing é um fenômeno que origina heterogeneidade intraclonal no processo de seleção antigênica. Células estimuladas IgM+ formam a zona marginal (novas evidências indicam que nestas células a HS também se encontra ativa). O compartimento pósfolicular inclui células B de memória e células plasmáticas. Estas células pós-cg sobreviventes exibem os genes Ig mutados mas não experimentam HS ongoing, a menos que reingressem ao CG.

37 A t(14;18) e outras alterações do gene BCL2 em LDCGB A identificação e caracterização de translocações cromossômicas recorrentes tem contribuído com a classificação de vários tipos de linfomas. Do mesmo modo foi possível elucidar alguns dos mecanismos responsáveis pela transformação neoplásica, visto que a grande maioria destas translocações tipicamente acarreta a desregulação de proteínas envolvidas no controle de processos críticos tais como apoptose, proliferação e diferenciação (Falini e Mason, 2002). O exemplo mais evidente é a t(14;18)(q32;q32), associada freqüentemente aos linfomas foliculares (LF), nos quais representa um evento precoce na linfomatogênese (Yunis et al., 1982; Cleary et al., 1985; Weiss et al., 1987). Como conseqüência desta translocação, o locus BCL2 no cromossomo 18q21 é justaposto a seqüências ativadoras da transcrição no gene da cadeia pesada da imunoglobulina (IGH, 14q32), levando a uma superexpressão da proteína antiapoptótica BCL2 (Tsujimoto et al., 1986). O rearranjo BCL2/JH também é detectado em 10 a 30% dos LDCGB, porém o papel exato na patogênese e a relação com a superexpressão da proteína BCL2 nestes linfomas é ainda uma questão em aberto (Lipford et al., 1987; Aisenberg et al., 1998; Yunis et al., 1989; Offit et al., 1989). Provavelmente a t(14;18) acontece como conseqüência de um erro pouco freqüente durante o rearranjo do gene IGH na maturação normal dos linfócitos B. No entanto, algumas evidências sugerem que esta anormalidade não é suficiente para a transformação maligna, uma vez que células portadoras da translocação foram detectadas em linfonodos benignos e em linfócitos circulantes de indivíduos sadios (Limpens et al., 1995; Schmitt et al., 2004). De acordo com um modelo patogênico aceito, o encontro de células B portadoras da t(14;18) com antígenos apropriados no contexto das células dendríticas e linfócitos T, na região paracortial em tecidos linfóides secundários, seria crucial para iniciar uma fase de alta proliferação no CG. A superexpressão aberrante de BCL2 protegeria estas células e sua progênie da iminente eliminação por apoptose. Repetidos ciclos de expansão clonal dirigida por antígenos apropriados poderia aumentar a chance de adquirir alterações genéticas adicionais (Ngan et al., 1988; Mcdonnell et al., 1989; Meijerink, 1997). Acredita-se que alterações genéticas secundárias levariam ao desenvolvimento de LF ou LDCGB. Em 20 a 30% dos

38 37 casos de LF, alterações adicionais ainda não conhecidas completamente, levariam à transformação a LDCGB (Bastion et al., 1997; Lossos e Levy, 2003). Recentemente, estudos independentes analisaram a t(14;18) em séries de LDCGBs, caracterizados pela expressão dos marcadores imunohistoquímicos CD10 e BCL6 (Mccluggage et al., 2002; Barrans et al., 2003a; Xu et al., 2005) ou pelos estudos de cdna microarrays (Huang et al., 2002; Iqbal et al., 2004; Poulsen et al., 2005). Estes estudos concluíram que os linfomas com a translocação representam um subgrupo dentro dos LDCGB derivados de células B do CG, sugerindo um possível papel na patogênese deste grupo de linfomas, assim como nos linfomas foliculares. A superexpressão de BCL2 em LDCGB ocorre em 24 a 66% dos casos, muito mais freqüente que esperado pela freqüência da t(14;18) (Piris et al., 1994; Tang et al., 1994; Hill et al., 1996; Hermine et al., 1996; Wilson et al,1997; Gascoyne et al., 1997; Kramer et al., 1998). Nos últimos anos este marcador recebeu especial atenção desde que vários estudos sugeriram uma estreita associação entre a expressão da proteína com um pior prognóstico em pacientes com LDGCB (Barrans et al., 2002a; Colomo et al., 2003; Sohn et al., 2003; Mounier et al., 2003) (Tabela 2.1). Em ausência da t(14;18), outras alterações genéticas do gene BCL2, como amplificação gênicas da banda 18q21 e ganho de cromossomos 18, poderiam explicar a superexpressão protéica de BCL2 em LDCGB, como foi evidenciado anteriormente por estudos de hibridização genômica (Monni et al. 1997; Rao et al., 1998; Beà et al., 2004) (Tabela 2.2). Recentemente Iqbal et al. (2006), em uma série de 240 pacientes previamente caracterizados pela tecnologia de cdna microarray, demonstraram que a expressão de BCL2 foi associada à t(14;18), detectada por FISH nos LDCGB tipo CG, porem sem impacto no prognóstico. No entanto, no subgrupo ABC, a expressão de BCL2 teve um efeito adverso na sobrevida destes pacientes. Além disto, os autores propõem que a amplificação do gene BCL2 poderia representar um mecanismo alternativo responsável pela superexpresssão de BCL2 neste subgrupo de linfomas.

39 38 Até agora, um único estudo analisou a freqüência das anormalidades genéticas do BCL2 em subgrupos de LDCGB definidos pelo perfil imunohistoquímico (Kusumoto et al., 2005). Neste estudo, com um número reduzido de casos (um total de 25 casos nodais primários), sinais extras de hibridização (compatível com amplificação 18q21 e/ou cromossomos 18 adicionais) foram observados exclusivamente em LDCGBs classificados como não-cg (segundo os critérios de Hans et al.). A proteína BCL2 foi superexpressa em praticamente todos os casos com estas alterações.

40 39 3. OBJETIVOS O principal objetivo deste trabalho foi a caracterização imuno-histoquímica e molecular de uma série de LDCGB primários, visando o estudo da freqüência de alterações genéticas associadas ao gene BCL2 em subgrupos de linfomas classificados de acordo com a origem celular. Para isto foram perseguidos os seguintes objetivos específicos: Diferenciar os subgrupos de LDCGB CG e não-cg pela expressão dos marcadores imunohistoquímicos CD10, BCL6, MUM1/IRF4 e CD138 utilizando a tecnologia de Tissue Microarray (TMA). Investigar o perfil imunogenético dos subgrupos de LDCGB CG e não-cg, através da análise de variabilidade intraclonal no gene rearranjado da cadeia pesada da imunoglobulina (IGH). Desenvolver métodos baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR) visando a detecção de equivalentes moleculares da t(14;18) e a tipificação dos pontos de quebra no gene BCL2 em amostras de LDCGB. Determinar a freqüência da t(14;18) e de outras alterações associadas ao gene BCL2 nos subgrupos de LDCGB CG e não-cg através da análise por hibridização in situ fluorescente (FISH) em material fixado e impregnado em parafina de lâminas de TMA. Analisar a expressão protéica por imunohistoquímica da proteína antiapoptótica BCL2 na série de LDCGB estudada e a sua relação com as anormalidades genéticas do gene BCL2. Correlacionar os achados imunohistoquímicos e moleculares com as principais características clínico-laboratoriais ao diagnóstico destes pacientes.

41 40 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Pacientes e amostras estudadas Foram estudados 117 pacientes com diagnóstico de linfoma difuso de grandes células B de novo (LDGCB), referidos à Divisão de Patologia (DIPAT) do Instituto Nacional de Câncer (INCA), Rio de Janeiro, Brasil, entre janeiro de 2002 e dezembro de O diagnóstico de LDCGB foi realizado de acordo com os critérios morfológicos e imunohistoquímicos da classificação da WHO (Gatteer e Warnke, 2001). Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do INCA (Projetos institucionais 101/04 e 003/06). Foram estudadas amostras de pacientes com diagnóstico confirmado de LDGCB (após a revisão morfológica e análise imunohistoquímica), não associados ao vírus da imunodeficiência humana (HIV) e com disponibilidade de material histológico (tumores fixados e impregnados em parafina) para a construção do tissue microarray (TMA). Este grupo corresponde a aproximadamente 80% dos casos registrados no INCA no período de estudo. Foram excluídos pacientes com história de linfoma indolente prévio e/ou evidência histológica de padrão folicular e com tumores de localização gastro-intestinal. Foram excluídos, também, casos de LDCGB primário de sistema nervoso central e subtipos específicos como LDCGB primário de mediastino, intravascular, primário de efusão pleural e associado a piotorax (Gatteer e Warnke, 2001). Em 33 dos 117 pacientes com LDCGB foram analisadas também amostras de tecido tumoral a fresco (32 linfonodos e massas extranodais, um aspirado de medula óssea e 3 amostras de sangue periférico). Estas amostras foram analisadas por PCR para a presença da t(14;18) e para a amplificação de rearranjos clonais do gene IGH. Durante a padronização e validação dos métodos moleculares de detecção da t(14;18) por PCR foram analisadas 75 amostras a fresco correspondentes a 43 pacientes com linfoma folicular (LF) e 11 pacientes com LDCGB secundários a LF (LDCGB-LF). Como controle de tecido linfóide não neoplásico foram incluídas 32 amostras a fresco de

42 41 linfonodos de pacientes HIV negativos, exibindo hiperplasia reativa benigna referidos ao Laboratório de Biologia Molecular do Centro de Transplante de Medula Óssea (CEMO- INCA) para investigação de clonalidade B e T. Como controle de tecido normal nos estudos moleculares foram estudadas amostras de sangue periférico e medula óssea, provenientes de 23 doadores sadios. 4.2 Registro das características clínico-laboratoriais Os dados clínico-laboratoriais do diagnóstico e acompanhamento dos pacientes foram obtidos dos registros hospitalares do arquivo médico do INCA. Foram registrados os seguintes dados: sexo e idade, estádio de Ann Arbor (estádios I, II, III ou IV), presença ou ausência de sintomas B (sudorese profusa, perda de peso superior a 10% do peso corporal, ou febre, definida como temperatura axilar maior que 38ºC), PS (performance status, valores de 0 a 4 de acordo com a escala do Eastern Cooperative Oncology Group ) (Oken et al., 1982), dosagem sérica de LDH (desidrogenase lática, normal ou elevada, de acordo com a referencia laboratorial do INCA) e a presença de acometimento extranodal (MO, trato gastro-intestinal, fígado, pulmões e ossos; o número de áreas extranodais foi registrado como 0, 1 ou > 1). O status do paciente na data da última visita ou a data do óbito foram também coletados (Vide Ficha de coleta de dados clínicos, Anexo I, pág. 143). Idade menor ou igual a 60 anos, doença localizada (estágios Ann Arbor I ou II), número de áreas extraganglionares 1, PS ambulatorial ( 1) e níveis séricos de LDH normais (<480 U/l) foram considerados fatores de bom prognóstico. Por sua vez, foram considerados fatores de mau prognóstico: idade > 60 anos, doença avançada (estágios Ann Arbor III ou IV), PS 2, número de áreas extraganglionares > 1 e LDH aumentada. De acordo com o número de fatores de mau prognóstico presentes os pacientes foram classificados em dois grupos: de baixo risco (presença de até dois fatores de mau prognóstico, incluindo os subgrupos de baixo risco e risco baixo - intermediário definidos no IPI) e de alto risco (presença de até dois fatores de mau prognóstico, incluindo os

43 42 subgrupos de alto risco e risco alto intermediário) (The International Non-Hodgkin s Lymphoma Prognostic Factors Project, 1993). Linfomas com comprometimento nodal predominante, com acometimento esplênico e aqueles com doença extensa em sítios nodais e extranodais, foram considerados linfomas primários nodais. Lesões na área do anel de Waldeyer também foram consideradas nodais. Finalmente, doença extranodal exclusiva ou com mínimo envolvimento nodal foram consideradas primárias extranodais (Krol et al., 2003; Moller et al., 2004). 4.3 Construção do TMA A revisão morfológica de todos os casos foi realizada, através da análise de preparações histológicas convencionais coradas com Hematoxilina-Eosina (HE), pela patologista Denize Azambuja do DIPAT-INCA. Foram identificadas e demarcadas áreas tumorais representativas de pelo menos um bloco original de cada caso de LDCGB incluído neste estudo, assim como de tumores selecionados como controles positivos internos para as reações imunohistoquímicas e os estudos de FISH: linfomas folicular, de Burkitt, de células do manto, de grandes células anaplásico T/NK CD30+, plasmocitoma e hiperplasia folicular reativa. O bloco de TMA foi construído em colaboração com o Serviço de Anatomia Patológica do Hospital do Câncer A.C. Camargo de São Paulo, sob a supervisão do patologista Fernando A. Soares. Cilindros de tecido (cores) dos blocos de parafina originais (doadores) foram retirados com agulhas especiais de 1 mm de diâmetro e inseridos, de forma ordenada, em um bloco receptor de resina sintética (Histosec, Merck), utilizando um equipamento manual ou arrayer (Beecher Instrumedics, Microarray Technology), como previamente descrito (Hedvat et al., 2002; Zu et al., 2005) (Figura 4.1).

44 43 Cortes de 4 µm foram realizados a partir do bloco TMA, recolhidos com o auxílio de filme aderente comercial (Instrumedics) e montados sobre lâminas comerciais com adesivo (Starfrost, Instrumedics) e/ou carregadas positivamente (Superfrost Plus, Erviegas). O tecido foi fixado através da exposição das lâminas à luz ultra-violeta por 15 minutos e o adesivo plástico removido com solvente não clorinado (TPC, Instrumedics). As laminas foram apropriadamente identificadas e armazenadas a -20 C. Figura 4.1: Construção de TMA Para a construção do tissue microarrays foi utilizando um equipamento manual ou arrayer (A). Cilindros de 1 mm de tecidos representativos de LDCGB e controles foram inseridos, de forma ordenada, em um bloco receptor (B). Seções correspondentes a diferentes níveis foram coradas com HE (C) e avaliadas ao microscópio óptico comum.

45 Expressão de marcadores imuno-histoquímicos Avaliação preliminar Visando avaliar a representatividade de tecido tumoral nos diferentes níveis do bloco TMA, seções seriadas correspondentes a sete níveis de profundidade (níveis 1, 10, 20, 40, 60, 80 e 100) foram coradas com HE e analisadas ao microscópio ótico comum por dois observadores. Assim, foram selecionadas lâminas do bloco TMA representativas de dois diferentes níveis e submetidas a reações de imunohistoquímica com anticorpos monoclonais anti-cd20, CD10, BCL6, MUM1, CD138 e BCL2. Como controles positivos das reações foram utilizados diferentes tecidos de imunoreatividade conhecida processados simultaneamente, assim como os respectivos controles internos de TMA Imunohistoquímica Os cortes foram pré-aquecidos a 56ºC pelo menos 12 horas, desparafinizados em xilol e hidratados em soluções decrescentes de álcool. De acordo com o anticorpo monoclonal de interesse, as lâminas foram submetidas a métodos de recuperação antigênica que diferiram tanto nos procedimentos (banho termostático, panela de pressão ou forno microondas) como nas soluções tampão utilizadas (Tris-EDTA ph 9.0; EDTA ph 8.0 ou citrato ph 6.0). Informações sobre os anticorpos utilizados e detalhes dos processos gerais das reações imunohistoquímicas são descritas na tabela 4.1. A atividade endógena da peroxidase foi inibida com solução de peróxido de hidrogênio 3% (Merck) em tampão TBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. As proteínas foram bloqueadas com reagente comercial específico após 20 minutos de tratamento a temperatura ambiente (Protein Block Serum free, DakoCytomation). Em seguida, as lâminas foram cobertas com o anticorpo primário previamente diluído em BSA 1% (albumina sérica bovina, Merck) e incubadas por duas horas a temperatura

46 45 ambiente. A detecção da reação foi feita com o sistema comercial estreptoavidinabiotina-peroxidase de acordo com as especificações do fabricante (LSAB ou StrepABC Duet, DakoCytomation), utilizando o substrato cromogênico DAB (diaminobenzidina, DakoCytomation). Por fim, os cortes foram contra-corados com hematoxilina de Harris, desidratados e acondicionados para a sua análise Critérios de análise Todas as amostras foram avaliadas através de estimativa visual ou da contagem não automatizada de células tumorais positivas nos casos limítrofes, considerando-se um mínimo de 200 células preservadas em cada core para a avaliação. Para os anticorpos relacionados à diferenciação linfóide foram computadas as análises independentes de dois patologistas. Foi escolhido um valor >30% de imunoreatividade nas células neoplásicas para definir positividade nas marcações de CD10, BCL6, MUM1/IRF4 e CD138. Para a expressão de BCL2 foram considerados alternativamente dois valores de pontos de corte: mais de 30% ou mais de 50% das células neoplásicas positivas. Para a definição dos perfis de diferenciação linfóide centro germinativo (CG) e não-cg, utilizou-se o algoritmo descrito por Hans et al. (2004) (Figura 4.2). Em resumo, foram considerados com padrão de expressão imuno-histoquímica tipo CG, casos com expressão de CD10 (independente da positividade para BCL6 e MUM1). Foram também considerados tipo CG os casos CD10/MUM1 negativos, mas positivos para BCL6. Foram classificados como tipo não-cg LDCGB com CD10 negativo e MUM1 positivo (independente da expressão para BCL6). De acordo com o algoritmo empregado, casos negativos para estes três anticorpos foram classificados também como não-cg.

47 46 Tabela 4.1: Características dos anticorpos utilizados e detalhes dos processos imunohistoquímicos Anticorpo Clone 1 Fornecedor Diluição de uso Recuperação antigênica 2 Método de visualização Reatividade CD20 L26 DakoCytomation 1:1000 Citrato de sódio 10mM, ph 6.0 Forno micro-ondas LSAB Membrana plasmática CD10 56C6 Novocastra 1:100 Citrato de sódio 10mM, ph 6.0 Panela de pressão LSAB Membrana plasmática MUM1 MUM1p DakoCytomation 1:100 Citrato de sódio 10mM, ph 6.0 Panela de pressão LSAB Núcleo e citoplasma BCL6 P1F6 Novocastra 1:20 Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM, ph 9.0 Banho termostático StrepABC Duet Núcleo BCL2 124 DakoCytomation 1:50 Citrato de sódio 10mM, ph 6.0 Panela de pressão LSAB Citoplasma CD138 MI15 DakoCytomation 1:200 Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM, ph 9.0 Banho termostático LSAB Membrana plasmática 1 Anticorpos monoclonais derivados de camundongo. 2 A recuperação antigênica foi realizada alternativamente em panela de pressão durante 3 minutos após primeira pressão e 20 minutos adicionais a temperatura ambiente; em banho termostático a 96 C por 40 min ou em forno micro-ondas com 2 ciclos de potencia máxima (950W), de 12 min cada.

48 Figura 4.2: Algoritmo utilizado na definição de LDCGB com perfil imunohistoquímico CG e não-cg. 4.5 Manipulação e processamento de amostras cirúrgicas Nos estudos moleculares foi utilizado DNA ou RNA de diversas fontes, a saber: (1) biópsias cirúrgicas, que consistiram de tecidos frescos ou congelados a -80ºC, (2) células mononucleares isoladas de amostras de SP e MO (idealmente 5-10 ml) pelo método de separação por centrifugação em gradiente de Ficoll e (3) linhagens celulares. Para a separação de células mononucleares, por centrifugação em gradiente de densidade, as amostras de SP e MO foram colocadas sobre um volume igual de Ficoll- Histopaque 1077 (Amersham). Após centrifugação (400 x g, 30 minutos), o anel de células mononucleares da interface foi isolado e lavado duas vezes com PBS (solução tamponada de fosfatos, ph 7,2).

49 48 As amostras de tecido sólido proveniente de biópsias cirúrgicas foram transportadas em meio RPMI-1640 (Sigma) com 10% de soro fetal bovino (SFB, Invitrogem). O tecido linfóide foi dissociado em placas de Petri com o auxílio de bisturis, e os fragmentos foram submetidos a procedimentos de extração de ácidos nucléicos. Visando determinar a fração neoplásica em cada amostra estudada, foram realizadas preparações citológicas a partir do tecido tumoral (citospins ou imprints) e coradas segundo o método de May- Grümwald-Giemsa. As linhagens celulares REH, Karpas-422 e DHL-16 (DSMZ, Alemanha) foram utilizadas no percurso deste trabalho com diferentes objetivos: como controles positivos e negativos para as diferentes reações de PCR e para a realização de diluições para aferir a sensibilidade dos métodos moleculares empregados. As células foram cultivadas em suspensão a uma concentração de 1 x 10 6 cel/ml em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de SFB, penicilina (Sigma, 100 IU/ml) e estreptomicina (Sigma, 50 µg/ml), em uma atmosfera de 5% de CO 2 a 37ºC. 4.6 Extração de DNA de alto peso molecular Para a extração de DNA de alto peso molecular foram utilizados vários métodos, de acordo com as características das amostras Extração de DNA com o reagente DNAzol : Alíquotas de suspensões de células mononucleares de SP, MO ou células em cultura (1-3 x 10 7 células) foram ressuspendidas em 1 ml do reagente DNAzol (Invitrogen). O DNA foi precipitado com etanol absoluto (Merck), lavado duas vezes com etanol 95%, solubilizado em volumes variáveis de NaOH 8 mm e neutralizado com HEPES 0,1 M Extração de DNA com fenol-clorofórmio: Para amostras de tumores a fresco, o tecido foi ressuspendido em volumes variáveis de tampão de digestão (10 mm EDTA; ph

50 49 8,0; 10 mm Tris-HCl, ph 8,0; 10 mm NaCl), submetido a lise com 0,1 % de SDS (Dodecil sulfato de sódio, Sigma) e digerido com 200 µg/ml de proteinase K (Invitrogen), por 12 horas a 65 C. A suspensão obtida foi submetida à extração orgânica utilizando fenolclorofórmio de acordo com métodos padrões (Sambrook et al., 1989). O DNA foi precipitado pela adição de 1:10 volumes de acetato de sódio 3M (ph 5,2) e 2 volumes de etanol absoluto gelado, lavado em etanol 70%, secado e ressuspendido em TE (10 mm Tris-HCl e 1mM EDTA) à concentração aproximada de 0,5 µg/µl. 4.7 Extração de RNA e síntese de DNA complementar (cdna) O RNA das amostras a fresco foi extraído a partir de lisados celulares obtidos com o reagente comercial TRIzol (Invitrogen). Após a adição de 0,2 ml de clorofórmio (Merck) cada amostra foi centrifugada ( x g, 10 minutos, a 4ºC) e a fase aquosa resultante foi utilizada para precipitar o RNA após a adição de 0,5 ml de isopropanol (Merk) e centrifugação a x g por 10 minutos, a 4ºC. O pellet contendo o RNA foi lavado com etanol 75% e solubilizado em H 2 O-DEPC. Após avaliação quali-quantitativa, o RNA foi utilizado de imediato ou armazenado a 80ºC. Precauções sistemáticas foram tomadas para evitar a contaminação e degradação do RNA: todos os procedimentos foram realizados em recintos exclusivos, com materiais descartáveis livre de RNAses e soluções preparadas com água tratada com DEPC (H 2 O-DEPC, Di-etil-pirocarbonato), sobre superfícies limpas e descontaminadas com reagentes especiais (RNAseAway, Invitrogen ). A retrotranscrição do RNA para obtenção da fita complementar (cdna) foi realizada a partir de 2µg do RNA total, utilizando 5µM de iniciadores hexâmeros randômicos (Invitrogen), 10U/µL de enzima transcriptase reversa (Superscript TM, Invitrogen) e 1U/µL do inibidor de RNAse (RNAguard Invitrogen), seguindo protocolos previamente estabelecidos.

51 Avaliação qualitativa e quantitativa dos ácidos nucléicos A integridade do DNA e RNA foi avaliada por eletroforese em geis de agarose 0,8% com tampão TAE ou fosfato 0,1 M, respectivamente e corados com brometo de etídeo (Gibco). O DNA de alto peso molecular foi considerado íntegro quando foi visualizada uma banda de tamanho igual ou maior ao genoma do fago λ, utilizado como controle (aproximadamente 48 Kb). O RNA foi considerado de qualidade ótima quando as duas populações majoritárias de RNA ribossomal (28S) e (18S) se encontraram visíveis. A quantificação dos ácidos nucléicos foi realizada em um espectrofotômetro GeneQuant II (Pharmacia Biotech), por meio de leituras no comprimento de onda de 260 nm. (Sambrook et al., 1989). A pureza das amostras foi estimada em relação à DO na faixa de 280 nm (proteínas) e valores 260/280 entre 1,8 e 2,0 foram considerados com grau de pureza satisfatório. 4.9 Métodos baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR) Considerações metodológicas Durante este trabalho, vários estudos baseados nos métodos de amplificação por PCR a partir de DNA ou cdna foram desenvolvidos. As reações foram desenhadas para volumes finais de 50 µl, utilizando tampão de PCR (50 mm KCl, 10 mm Tris HCl, ph 8,3, Invitrogen) e MgCl 2 ou MgSO 4 (1,5 a 2,5 mm), uma mistura de datp, dttp, dctp e dgtp (dntps, 0,2 mm cada um deles, Pharmacia); oligonucletídeos iniciadores ou primers (0,2 a 1 µm) e água deionizada estéril para completar o volume da reação. Em todos os casos foi incorporado, por reação, 0,2 a 1 µg de DNA ou cdna como substrato e 1 a 2 U da enzima Taq DNA polimerase Platinun ou High Fidelity (Invitrogen). As reações de PCR foram realizadas em termocicladores PTC-100 TM (Flexigene, Techne) e incluíram em todos os casos controles positivos, negativos e controles de reação (sem DNA). Cada reação foi repetida, no mínimo, duas vezes. Medidas sistemáticas foram seguidas para evitar amplificações espúrias e contaminação cruzada entre amostras.

52 Amplificação de genes constitutivos Com o objetivo de determinar a amplificabilidade do DNA, avaliar a eficiência da transcrição reversa (cdna) e testar a presença de inibidores da PCR, foram realizadas reações individuais de PCR utilizando iniciadores específicos para os genes constitutivos gliceraldehído-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH) e β2-microglobulina (β2m). As condições e a aplicação de cada método são descritas na tabela 4.2. Os resultados foram avaliados em géis de agarose 2% Amplificação de rearranjos clonais do gene IGH Neste trabalho, a amplificação dos rearranjos da região variável do locus IGH teve como propósito o estudo dos padrões de hipermutação somática no segmento VH. Para isto, foram utilizados: a) iniciadores consenso, complementares às seqüências conservadas das regiões framework FR1 e JH (PCR FR1/JH, em amplificações a partir de DNA genômico) e, b) iniciadores complementares à região líder das 7 famílias de genes VH com um iniciador anti-sentido complementar à região JH (PCR VH líder/jh, em amplificações a partir de DNA genômico ou cdna) (Tabela 4.1 e Figura 4.3)(Hassan, 2005). Nestes casos foi utilizada a enzima Taq DNA polimerase High Fidelity com atividade de correção de erros (proofreading). Os resultados destas PCRs foram interpretados invariavelmente após eletroforese em géis de poliacrilamida 8%, corados com prata Amplificação de equivalentes moleculares da t(14;18)(q32;q21) Foram desenvolvidos diferentes métodos de PCR para a detecção e tipificação dos pontos de quebra da t(14;18)(q32;q21) em LDCGB. Na fase de padronização e validação destes métodos foram estudadas linhagens celulares portadoras da translocação e tumores a fresco de LF e LDCGB-LF, além de amostras não neoplásicas (tecidos reativos e normais). Finalmente, todos os 33 casos de LDCGB com material a fresco colhido durante o período de estudo, foram avaliados por estes métodos.

53 52 Uma primeira estratégia foi a detecção de equivalentes moleculares da translocação nos principais pontos de quebra mbr e mcr, a diferentes níveis de sensibilidade tanto em linfomas B como em tecidos não neoplásicos. Para isto foram desenvolvidos métodos de PCR em ninho (ou nested) e subseqüentemente, reações de amplificação de etapa única utilizando os mesmos iniciadores complementares externos (Gribben et al., 1991) (Tabelas 4.3 e 4.4, Figura 4.4). A sensibilidade destes métodos foi avaliada em experimentos testando diluições seriadas de DNA de células das linhagens Karpas-422 e DHL-16 em DNA de placenta. Visando a detecção de pontos de quebra fora dos principais mbr e mcr, foi desenvolvido um método de PCR de etapa única para a amplificação da t(14;18) em uma região intermediaria recentemente caracterizada por Albinger-Hegyi et al. (2002) denominada icr (do inglês intermediate cluster region) (Tabelas 4.3 e 4.4, Figura 4.4 C). Foram desenvolvidos também métodos de PCR multiplex de etapa única utilizando iniciadores complementares e condições de acordo com as sugestões do Consorcio Europeu BIOMED-2 para a detecção da t(14;18) (BIOMED-2 Concerted Action BMH4- CT ) (van Dongen et al., 2003). Esta estratégia baseia-se em três diferentes reações de PCR por amostra, incluindo uma mistura de iniciadores específicos para amplificar a maior parte dos pontos de quebra no gene BCL2 (18q21), em conjunção com um único primer consenso para os segmentos J do gene IGH (14q32) (Figura 4.4 D).Visando uma melhor caracterização destes pontos de quebra nas series de linfomas B analisados, o método original foi modificado e estabelecida uma nova estratégia de 4 reações de PCR individuais para cada amostra (Tabelas 4.3 e 4.4, Figura 4.4 E). Todas as reações de PCR desenvolvidas neste trabalho para a amplificação de equivalentes moleculares da t(14;18) a partir de DNA de alto peso molecular, foram desenhadas baseadas nas considerações da seção Os produtos de PCR foram avaliados em géis de agarose 2%.

54 53 Figura 4.3: Estratégia utilizada na amplificação de rearranjos clonais do gene IGH A: estrutura do rearranjo VDJ do gene IGH; B e C: localização dos iniciadores complementares das PCR FR1/JH e VH líder/jh, respectivamente. CDR: regiões determinantes de complementariedade; FR, regiões framework Figura 4.4: Amplificação e tipificação da t(14;18)(q21;q32) por PCR A: regiões cromossômicas envolvidas na t(14;18)(q21;q32): extremo 3 não codificante do exon III e região 3 do gene BCL2 e segmentos J do gene IGH. O cluster mbr (de ~150 pb) localiza-se no extremo 3 do exon III e ~30 kb downstream deste localiza-se o mcr (de ~500 pb). Outros pontos de quebra, caracterizados recentemente, localizam-se a 4 kb downstream do mbr (subcluster 3 mbr) e a 10 kb upstream do mcr (subcluster icr ou 5 mcr). A figura ilustra as posições relativas dos iniciadores complementares utilizados em cada uma das estratégias de amplificação: PCR nested para os dois principais pontos de quebra, mbr e mcr (B); PCR de única etapa (single) para a região icr caracterizada por Albinger-Hegyi et al. (2002) (C); PCR multiplex de única etapa de acordo com as condições do Consorcio Europeu BIOMED-2 (D) e finalmente o esquema proposto neste trabalho para a amplificação e tipificação da t(14;18) em LDCGB (D). As posições relativas dos iniciadores são indicadas na tabela 4.3.

55 54 Tabela 4.2: Condições gerais das reações de PCR e iniciadores complementares empregados na amplificação de genes constitutivos e de rearranjos clonais do gene IGH Iniciador Seqüência (5 3 ) Concentração de MgCl 2 TA Tamanho esperado Aplicação β2ms β2mas ACCCCCACTGAAAAAGATGA ATCTTCAAACCTCCATGATG 2,0 mm 58 C 800 pb Avaliação de amplificabilidade de DNA genómico GAPDHS GAPDHAS CATCTC TGCCCCCTCTGCTG CCCTCCGACGCCTGCTTCAC 1,5 mm 60 C 454 pb Avaliação de transcrição reversa. FR1c LJH VLJH AGGTGCAGCTGSWGSAGTCDGG TGAGGAGACGGTGACC GTGACCAGGGTNCCTTGG CCCCAG 1,5 mm 54 C pb Amplificação de rearranjos clonais do gene IGH VHL1/7 CTCACCATGGACTGGACCTGGAG VHL2 ATGGACACACTTTGCTMCACRCTC VHL3 VHL4 VHL5 CCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGG ACATGAAACAYCTGTGGTTCTTCC ATGGGGTCAACCGCCATCCTYG 2,0 mm 60 C pb Amplificação de rearranjos clonais do gene IGH VHL6 ATGTCTGTCTCCTTCCTCATCTTC JHc ACCTGAGGAGACGGTGACCAGGGT Todas as reações de PCR foram desenhadas baseadas nas considerações metodológicas generais da seção Os rearranjos clonais do gene IGH foram amplificados em duas etapas com o método FR1/JH (utilizando o mesmo iniciador sense FR1c) e/ou em etapa única através de sete reações individuais com o método VH lider/jh. Em estes casos foi utilizado MgSO 4 de acordo com as especificações para a enzima Taq DNA polimerase High Fidelity TA: temperatura de annealing; M: A/C; R: A/G; Y: C/T; N: qualquer um dos quatro nucleotídeos.

56 55 Tabela 4.3: Iniciadores utilizados na detecção por PCR da t(14;18) Iniciador Seqüência (5 3 ) Posição relativa Referência MBR1 CAGCCTTGAAACATTGATGG (-3599) Gribben et al., 1991 MBR2 ACTCTGTGGCATTATTGCATTATAT (-3575) van Dongen et al., 2003 MBR3 GACCAGCAGATTCAAATCTATGG (-3072) van Dongen et al., 2003 MBR4 TCTATGGTGGTTTGACCTTTAG (-3056) Poteat e Sklar, MBR1 GCACCTGCTGGATACAACACTG (+549) van Dongen et al., MBR2 GGTGACAGAGCAAAACATGAACA (+1362) van Dongen et al., MBR3 GTAATGACTGGGGAGCAAATCTT (+1619) van Dongen et al., MBR4 ATCGGTTGGCGTGGTTTAGAGA (+2550) van Dongen et al., MCR CCTTCTGAAAGAAACGAAAGCA (+15681) van Dongen et al., 2003 ICR TCGTTCTCAGTAAGTGAGAGTGC (+15953) Albinger-Hegyi et al., 2002 MCR1 CGTGCTGGTACCACTCCTG (+25553) Gribben et al., 1991 MCR2 GGACCTTCCTTGGTGTGTTG (+25605) Gribben et al., 1991 MCR3 TAGAGCAAGCGCCCAATAAATA (+25887) van Dongen et al., 2003 MCR4 TGAATGCCATCTCAAATCCAA (+26333) van Dongen et al., 2003 JH1 ACCTGAGGAGACGGTGACC Consenso Gribben et al., 1991 JH2 ACCAGGGTCCCTTGGCCCCA Consenso Gribben et al., 1991 JH3 CTTACCTGAGGAGACGGTGACC Consenso van Dongen et al., 2003 Os primers sense foram nomeados de acordo com a sua posição relativa na seqüência do gene BCL2 e, as suas posições relativas foram indicadas de acordo ao nucleotídeo upstream (-) ou downstream (+) ao extremo 3 do exon III do BCL2 (números de aceso ao NBCI, AF325194S1 e AC021299).

57 56 Tabela 4.4: Condições gerais das reações de PCR empregadas na amplificação de equivalentes moleculares da t(14;18) Método de PCR PCR mcr e mbr nested 2 PCR mcr e mbr single-round PCR icr single-round PCR mbr BIOMED-2 (multiplex) PCR 3 mbr BIOMED-2 (multiplex) PCR mcr BIOMED-2 (multiplex) 3 PCR 5 mcr BIOMED-2 3 Combinação de iniciadores complementares MBR1 ou MCR1 JH1 MBR4 ou MCR2 JH2 MBR1 ou MCR1 JH1 ICR JH1 MBR2/3 JH3 4 3 MBR1/2/3/4 JH3 4 MCR3/4 JH3 4 5 MCR JH3 4 Concentração de MgCl 2 Perfil térmico 1 2,5 mm 25 ciclos: 94 C 1 min, 55 C (mbr)/58 C (mcr) 1 min, 72 C 1 min 1,5 mm 35 ciclos: 94 C 1 min, 58 C, 72 C 1 min 1,5 mm 35 ciclos: 94 C 1 min, 56 C 45 sec, 72 C 45 sec 2,5 mm 35 ciclos: 94 C 2 min, 58 C 1 min, 72 C 2 min 2,0 mm 35 ciclos: 94 C 30 sec, 60 C 1 min, 72 C 1 min 1 Em todos os perfis térmicos foram incluídas uma etapa prévia de 5 minutos a 95 C para a ativação da enzima Taq Platinum e uma etapa de extensão adicional de 10 minutos a 72 C e esfriamento rápido a 10 C. 2 Cinco microlitros da primera etapa foram re-amplificados em uma segunda etapa empregando iniciadores mais internos (MBR4 ou MCR2 e JH2). 3 O método multiplex original proposto por van Donguen et al. (2003) foi dividido em duas diferentes reações: uma reação multiplex incluindo iniciadores para a região mcr e uma outra com iniciadores sense para a amplificação da região 5 mcr (monoplex) 4 Os iniciadores sense BIOMED-2 foram também testados em combinação com o antisense JH1 com resultados equivalentes.

58 4.10 Eletroforese, preparação de géis e fotodocumentação Para eletroforeses de DNA e produtos de PCR, os géis foram preparados com tampão TAE [Tris-acetato 0,04M e EDTA 0,001M (Sigma), ph 8.0] com concentrações variáveis de agarose (0,8-2,5%). Em todos os casos foi adicionado 0,5 µg/ml de brometo de etídeo (Invitrogen) durante a preparação do gel. Para eletroforeses de RNA, os géis de agarose de 1% foram preparados com tampão fosfato 0,1M. As eletroforeses foram realizadas a 5V/cm, utilizando cubas de tipo Horizon 11,14 e Horizon 58 com fonte de corrente contínua Life Tech Model 250 (Gibco, Life Technologies Inc.). Os resultados foram visualizados com a ajuda de um transiluminador UV de onda curta (TFX-20M, Vilber Lourmat). Os géis de poliacrilamida não-desnaturante foram preparados à concentração de 8% de acrilamida-bisacrilamida (29:1) em tampão TAE. A eletroforese foi realizada a 170 V por aproximadamente 3 horas, em um dispositivo de eletroforese vertical, modelo V16 com fonte de corrente contínua. Para visualização dos produtos de PCR foi utilizada a técnica de coloração com nitrato de prata. Brevemente, os géis foram fixados em metanol 10%/ácido acético glacial 0,5% (Merck), corados com N0 3 Ag 0,7% (Vetec) e revelados em solução de NaOH 30%/formaldeído 0,3% (Merck). A fotodocumentação foi realizada com o dispositivo fotográfico ULTRALUM/Polaroid GelCam com filtro E-49 (Polaróide) e filmes polaróides branco e preto do tipo 554 x 5 (Sigma) ou com o sistema EDAS 290 (Kodak) acoplado a uma câmera digital DC 290 Zoom (Kodak).

59 Clonagem e seqüenciamento Isolamento de produtos de PCR Os produtos de PCR destinados a análises de seqüências foram purificados a partir de géis de agarose 2%. O DNA foi purificado utilizando colunas comerciais GFX TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Biosciences) segundo as instruções dos fabricantes. Os eluatos contendo o DNA purificado foram avaliados quantitativamente por eletroforese em géis de agarose 1% com brometo de etídeo. Como padrão, foi utilizado o marcador de massa Low mass ladder (Invitrogen) (Figura 4.5) Subclonagem em plasmídeos Foi utilizado o sistema comercial Zero-Blunt PCR Cloning Kit (Invitrogen), que fornece o plasmídeo pcr -Blunt (3.5 kb) linearizado para permitir a clonagem de fragmentos de extremidades cegas e a ligação pela ação da enzima T4 Ligase. A ligação dos fragmentos foi realizada em tampão de ligação misturando 5 µl do produto de PCR purificado, 25 ng do vector pcr e 4U da T4 DNA Ligase, seguido por incubação a 16 C por 60 minutos. Logo após, a transformação foi realizada misturando 5 µl da reação de ligação a uma alíquota de células E. coli TOP10 (Invitrogen) competentes, seguido por incubação a 42ºC, por 40 segundos. Continuando, foi adicionado 250 µl do meio enriquecido S.O.C. e cada tubo foi incubado sob agitação constante (200 rpm), por uma hora a 37ºC (Figura 4.5). As células foram plaqueadas em placas de Petri de 10 cm de diâmetro, contendo ml de meio de cultura LB-agar com Kanamicina (50 µg/ml) ou Ampicilina (100 µg/ml) e X-gal (40 µg/ml). Em cada experimento foi realizado um controle de transformação, utilizando 10 pg de DNA do vector puc18 ou puc19 (Invitrogen). As placas foram incubadas a 37ºC, por horas. Dez a 20 colônias individuais foram selecionadas e inoculadas em 1 ml de meio LB líquido com antibiótico, em placa de cultura de 96 poços, que foi incubada a 37ºC, sob agitação orbital constante (320 rpm), por horas.

60 Figura 4.5: Clonagem e sequenciamento de genes VH para o estudo da hipermutação somática ongoing em LDCGB. 59

61 Método de isolamento de DNA plasmidial por minipreparação e lise alcalina As microplacas contendo 1 ml de subcultura líquida de bactérias transformadas, por poço, foram centrifugadas. Após descartar o sobrenadante, foi adicionado a cada poço 240 µl de solução P1/GET (50 mm glicose, 10 mm EDTA e 25 mm Tris-HCl), seguido de agitação por 2 minutos. As placas foram centrifugadas por 10 minutos e o sobrenadante foi descartado. O conteúdo da placa foi digerido com RNAse A (10 mg/ml). Adicionou-se então a cada poço 80 µl da Solução P2 (0,2 N NaOH e 1% SDS) e foi incubado por 10 minutos a temperatura ambiente, após o qual adicionou-se 80 µl da Solução P3 (5 M acetato e 3 M potássio). A placa foi incubada em estufa a 90ºC, por 30 minutos, esfriada em gelo e centrifugada por 10 minutos. O volume do sobrenadante foi filtrado através de uma placa Millipore MV22, mediante centrifugação. O DNA plasmidial foi precipitado pela adição de 100 µl de Isopropanol (Merck) e centrifugação por 45 minutos. Após descartar o sobrenadante, 200 µl de etanol 70% (Merck) gelado foi adicionado, seguido de centrifugação por 5 minutos. A placa foi deixada secar a temperatura ambiente por 60 min e o DNA foi ressolubilizado em 40 µl de água bidestilada estéril. Após isto, as placas foram armazenadas a 20º C Identificação de clones No intuito de identificar os clones portadores do inserto de interesse, foi realizada uma digestão de 2 µl do DNA plasmidial com 10 U da enzima de restrição EcoRI em tampão de digestão apropriado, a 37ºC por 2 horas. O produto da digestão foi analisado em gel de agarose 1% com brometo de etídeo, após eletroforese. Os clones carregando o inserto do tamanho esperado foram selecionados e estocados a 20ºC até o seqüenciamento Seqüênciamento O seqüenciamento foi realizado pelo método cíclico DYEnamic TM ET Dye Terminator Cycle Sequencing kit (Amersham), com química baseada na marcação dos terminadores

62 61 (ddntps) com corantes fluorescentes (dye terminator labelling). As reações foram realizadas em um volume final de 10 µl, em placas de 96 poços. A uma quantidade adequada de DNA subclonado em plasmídeos ( ng) foram adicionados os iniciadores universais M13F e M13R (0,2 µm) e 4 µl da mistura comercial pre-feita. A reação de seqüenciamento consistiu de 30 ciclos de 95ºC por 20 segundos, 50ºC por 15 segundo e 60ºC por 1 minuto. A precipitação foi realizada pela adição de 2,5 volumes de etanol absoluto e de centrifugação à máxima velocidade por 30 minutos, o sobrenadante foi removido e a placa foi deixada secar. O DNA plasmidial foi ressuspendido em 10 µl de tampão de seqüenciamento [EDTA 10 mm (ph 8,0)/formamida 70%]. A eletroforese foi realizada em um seqüenciador automático capilar MegaBace TM 1000 Sequence System (Amersham) de corrente contínua de 30V por 3 horas. A coleta de dados foi realizada com o programa Sequence DNA Analysis System Análise de seqüências VH As seqüências de cada clone foram analisadas utilizando o algoritmo Blast (IgBlast; e comparadas com seqüências germline compiladas no banco de dados V-BASE (MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK). Para a análise de seqüências foi utilizado o programa MacVector (Accelrys). A delimitação das regiões CDR e FR foi realizada seguindo a nomenclatura de Kabat et al. (1991), e os segmentos gênicos D foram identificados segundo os critérios de Corbett et al. (1997). A funcionalidade potencial dos rearranjos VDJ foi definida após a análise das seqüências. Foram definidos como rearranjos produtivos aqueles cujas seqüências não apresentaram códons de parada nem defeitos no códon de iniciação e/ou elementos regulatórios, assim como uma junção com moldura de leitura aberta (in frame). Foram definidos como rearranjos não produtivos aqueles cujas seqüências apresentaram junções sem moldura de leitura aberta (out frame) e/ou mutações gerando códons de parada e/ou alterações na pauta de leitura.

63 62 A análise de mutações foi realizada desde o início da região FR1 (em seqüências obtidas a partir de amplificações com os iniciadores VH líder/jh), ou desde o nucleotídeo seguinte ao extremo 3 do iniciador FR1 (no caso de amplificação FR1/JH), até o último códon identificável da região FR3. A freqüência de mutação foi calculada como proporção entre o número de mutações e o número de nucleotídeos seqüenciados por segmento VH por cem nucleotídeos. A variação intraclonal foi analisada apenas em rearranjos produtivos e foi definida como a presença de clones que, compartilhando a mesma região CDR3, variaram em uma ou mais mutações verificadas em pelo menos dois clones. Foram consideradas mutações não confirmadas aquelas substituições observadas em apenas um dos clones VH do mesmo paciente e mutações confirmadas aquelas observadas mais de uma vez em diferentes clones moleculares do mesmo paciente. Apenas mutações confirmadas foram consideradas como uma evidência de variação intraclonal Hibridização in situ fluorescente (FISH) Racional do método O método de hibridização in situ fluorescente (FISH) foi utilizado para detectar a t(14;18) e determinar alterações no número de cópias do gene BCL2 no grupo de LDCGB analisado. Para isto foi utilizada uma combinação das sondas comerciais LSI IGH SpectrumGreen TM /LSI BCL2 SpectrumOrange TM e CEP18 (D18Z1) alpha satellite SpectrumAqua probe (Vysis). As sonda LSI IGH SpectrumGreen TM (de ~1.5 Mb) e LSI BCL2 SpectrumOrange TM (de ~750 kb) cobrem praticamente todo o locus IGH e BCL2, respectivamente, já a sonda CEP 18 SpectrumAqua TM é do tipo centromérica específica para o cromossomo 18 (Figura 4.6). A técnica foi padronizada utilizando preparações citológicas da linhagem Karpas-422, positiva para a t(14;18), como também imprints de tecidos a fresco e cortes parafinados obtidos a partir de 5 casos de LF com a translocação detectada por PCR. Preparações

64 63 provenientes de 6 LN com hiperplasia reativa (4 imprints de material a fresco e 2 cortes parafinados) foram analisadas com este método visando determinar o ponto de corte (cut-off) para o diagnóstico desta alteração cromossômica. Figura 4.6: Localização das sondas utilizadas na detecção das alterações no gene BCL2 por FISH. Foi utilizada uma combinação das sondas comerciais LSI IGH SpectrumGreen TM /LSI BCL2 SpectrumOrange TM e CEP18 (D18Z1) alpha satellite SpectrumAqua TM (Vysis). As sonda LSI IGH (~1.5 Mb) e LSI BCL2 (~750 kb) cobrem praticamente todo o locus IGH e BCL2, respectivamente. A sonda centromérica CEP 18 foi utilizada para verificar aneuploidia do cromossomo Procedimento As preparações citológicas foram pré-tratadas por 60 minutos em tampão 2xSSC (0.3 M NaCl e 0.03 M citrato de sódio, ph 7,2) e digeridas com RNAse A (100 µg/ml) e pepsina (0,1% em HCl 0,01 N) a 37ºC por 1 hora e 10 minutos, respectivamente. Após lavagem com PBS, as preparações foram pós-fixadas em paraformaldehído 4%/PBS por 10 minutos e desidratadas com diluições crescentes de álcool. Cortes parafinados de 4 µm provenientes de blocos convencionais (controles negativos e positivos) e de TMA foram desparafinados em xileno, lavados em etanol e pré-tratados

65 64 em tampão de ácido cítrico 10 mm a 80 C por 60 minutos (Chin et al., 2003). Os tecidos foram digeridos em pepsina 0,3%/HCl 0,2 N a 37 C por 10 minutos, lavados em 2xSSC e pós-fixados em paraformaldehído 4%/PBS. Após estes tratamentos, as preparações citológicas e as lâminas com tecidos fixados e impregnados em parafina, foram submetidas à desnaturação em formamida 70% (Sigma)/2xSSC por 5-10 minutos a 73ºC, seguido de desidratação em álcool gelado. A mistura de sondas (1:10 em tampão de desnaturação, Vysis), previamente desnaturadas (73ºC 5 minutos, 45ºC 30 minutos), foi acrescentada às preparações e deixada hibridizar por horas a 37ºC em um hibridizador automático (Hybrite, Vysis). Após a hibridização, as lâminas com tecidos FIP foram lavadas em NP-40 0,3% (Sigma)/0,4xSSC a 73 C e em NP-40 0,1%/2xSSC à temperatura ambiente. As preparações citológicas foram lavadas com formamida 50%/2xSSC a 43ºC e com Triton X-100 0,001% (Sigma)/PBS à temperatura ambiente. As preparações foram secadas a temperatura ambiente ao abrigo da luz e os núcleos corados com 4,6-diamidino-2- phenylindole (DAPI, 125 ng/ml em solução Anti-Fade, Vysis) Critérios de análise A análise da hibiridização foi realizada em um microscópio de epifluorescência Olympus X-60, com uma câmera CCD monocromática (Photometrics) associada a um computador Apple G-300 com programa QUIPS (Vysis). Foram definidas como normais células exibindo dois sinais vermelhas (BCL2), dois sinais verdes (IGH) e dois sinais acqua (centrômero do cromossomo 18). A t(14;18) foi considerada positiva quando pelo menos dois sinais de hibridização foram co-localizados. A presença de sinais vermelhos adicionais foi interpretada em relação às marcações da sonda CEP18, a fim de diferenciar a amplificação do gene BCL2 de aneuploidia (Figura 4.7).

66 Figura 4.7 Critérios de análise de acordo com os possíveis padrões de hibridização utilizando as sondas LSI IGH, LSI BCL2 e CEP18 65

67 Análise Estatística As bases de dados foram criadas nos programas Excel (Microsoft) e SPSS versão Os testes estatísticos foram realizados usando o programa SPSS para Windows versão (SPSS Inc, EUA). As variáveis categóricas foram descritas utilizando proporções, e as contínuas através da mediana. O teste de Fisher (two-sided) foi utilizado para avaliar a associação entre as variáveis categóricas (sexo, IPI, PS, estádio, LDH, CG, não-cg, etc).

68 67 5. RESULTADOS 5.1 Características clinico-demográficas do grupo de pacientes estudados O grupo de 117 LDCGB estudado incluiu 60 mulheres e 57 homens, com uma mediana de idade de 56 anos (16-90 anos). As principais características clínicas e laboratoriais destes pacientes são listadas na tabela 5.1. Em 46 pacientes (40%) foi observada doença avançada (estágio III/IV), incluindo 7/94 casos (7%) com infiltração de medula óssea. Dos pacientes com dados disponíveis, 39% (44/114) foram considerados não ambulatoriais (PS 2), 56% (63/113) apresentaram níveis aumentados de LDH e 44% (50/114) exibiram massa tumoral 10 cm (bulky). A distribuição de acordo com o IPI foi: baixo risco, 41 pacientes (36%); baixo-intermediário, 40 pacientes (35%); altointermediário, 22 pacientes (19%) e alto risco, 11 pacientes (10%). No grupo total, 14,5% dos casos (17/117) foi considerado predominantemente extranodal (estágios IE ou IIE) e 85,5% (100/117) com apresentação nodal (16 casos com localização na área do anel de Waldeyer)(Tabela 5.1). Os locais de apresentação primária extranodal foram: osso (n=4), pele e partes moles (n=4), mama (n=3), parótida (n=2), palato (n=1), seios paranasais (n=1), órbita (n=1) e massa epidural (n=1). Os pacientes submetidos a regimes curativos (n=101) receberam esquemas quimioterápicos baseado na antraciclina, predominantemente ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina e prednisona (CHOP, n=96) ou equivalente (ICE, n=5). Destes, 58 pacientes receberam somente quimioterapia, 41 pacientes foram tratados com combinação de quimioterapia e radioterapia e dois com quimioterapia e Rituximab. Um total de 88 pacientes completou a primeira linha de tratamento. Cinco pacientes receberam terapia de suporte/paliativa (radioterapia, COP, CP ou outros) e 11 pacientes progrediram antes de receber tratamento.

69 Tabela 5.1: Principais características clínicas e laboratoriais dos pacientes em relação à expressão dos marcadores imunohistoquímicos e à classificação nos subtipos CG e não-cg. Características Total CD10+ BCL6+ MUM1+ BCL2+ 1 Perfil CG 2 Perfil não-cg 2 p 3 Total de pacientes (38%) 71 (62%) Idade 0,29 0,16 0,24 0, anos 72 (61,5%) 17 (24%) 20 (29%) 31 (43%) 27 (39%) 22 (31%) 48 (69%) 0,11 > 60 anos 45 (38.5%) 15 (33%) 19 (43%) 14 (31%) 31 (69%) 21 (48%) 23 (52%) Mediana (intervalo, anos) 56 (16-90) 60 (17-87) 55 (16-90) Sexo 0,41 1,00 0,06 0,85 M 60 (51%) 19 (32%) 19 (35%) 18 (30%) 31 (52%) 24 (41%) 34 (59%) 0,44 F 57 (49%) 13 (23%) 20 (35%) 27 (47%) 27 (49%) 19 (34%) 37 (66%) Estágio (Ann Arbor) 0,67 1,00 0,24 1,00 I/II (doença localizada) 69 (60%) 18 (26%) 24 (36%) 29 (42%) 34 (49%) 23 (34%) 44 (66%) 0,32 III/IV (doença avançada) 46 (40%) 14 (31%) 15 (34%) 14 (30%) 22 (51%) 20 (44%) 25 (56%) ND Nível sérico de LDH 0,21 0,84 1,00 0,035 Normal 50 (44%) 11 (22%) 16 (33%) 19 (38%) 19 (38%) 17 (35%) 31 (65%) 0,69 Aumentada 63 (56%) 21 (34%) 22 (36%) 23 (36%) 36 (60%) 25 (40%) 37 (60%) ND Sintomas B 0,28 0,68 0,69 0,85 Presentes 52 (48%) 17 (33%) 16 (31%) 18 (35%) 26 (51%) 19 (37%) 32 (63%) 0,84 Ausentes 56 (52%) 13 (23%) 20 (37%) 22 (39%) 26 (48%) 22 (40%) 33 (60%) ND PS 0,009 1,00 0,07 0,44 < 2 (ambulatorial) 70 (61%) 13 (19%) 24 (35%) 31 (44%) 32 (47%) 21 (31%) 47 (69%) 0,045 2 (não ambulatorial) 44 (39%) 19 (43%) 15 (37%) 12 (27%) 24 (56%) 22 (51%) 21 (49%) ND 3 - -

70 69 Tabela 5.1: Principais características clínicas e laboratoriais dos pacientes em relação à expressão dos marcadores imunohistoquímicos e à classificação nos subtipos CG e não-cg (continuação) Características Total CD10+ BCL6+ MUM1+ BCL2+ 1 Perfil CG 2 Perfil não-cg 2 p 3 IPI 4 0,11 0,19 0,08 0, (71%) 19 (24%) 30 (39%) 35 (43%) 36 (46%) 28 (36%) 50 (64%) 0, (29%) 13 (39%) 8 (24% ) 8 (24%) 20 (61%) 14 (42%) 19 (58%) ND Acometimento primário 0,23 0,57 0,43 0,29 Nodal 100 (85,5%) 30 (30%) 35 (36%) 37 (37%) 52 (53%) 40 (40%) 59 (60%) 0,16 Extranodal 17 (14,5%) 2 (12,5%) 4 (27%) 8 (47%) 6 (37,5%) 3 (20%) 12 (80%) N de sítios extranodais 0,22 1,00 0,56 0,45 < 2 64 (56%) 21 (33%) 22 (35%) 22 (34%) 34 (54%) 25 (40%) 37 (60%) 0, (44%) 11 (22%) 17 (35%) 21 (41%) 22 (45%) 18 (36%) 32 (64%) ND Envolvimento de MO 1,00 1,00 0,09 0,43 Sim 7 (7%) 2 (29%) 2 (29%) 0 5 (71%) 4 (57%) 3 (43%) 0,42 Não 90 (93%) 23 (26%) 31 (36%) 33 (37%) 42 (48%) 31 (36%) 56 (64%) ND Tamanho do tumor 10 cm 0,034 0,32 0,56 1,00 Sim 50 (44%) 19 (38%) 20 (40%) 17 (34%) 25 (50%) 22 (44%) 28 (56%) 0,24 Não 64 (56%) 12 (19) 18 (30%) 26 (41%) 30 (49%) 20 (33%) 41 (67%) ND Foram considerados os valores de corte para a expressão de BCL2 (>30% e >50%) sem diferenças nos resultados. 2 Considerados 114 pacientes, em três casos a falta de imunoreatividade de CD10 e/ou BCL6 impossibilitou a classificação CG e não-cg. 3 entre tipos CG e não CG pelo teste de Fisher (two-sided), valores de probabilidade (p) foram considerados como estatisticamente significativos quando <0,05. 4 Valores IPI 0-2: riscos baixo, baixo-intermediário; valores IPI 3-4: riscos alto-intermediário, alto ND: não disponível; LDH: desidrogenase lática (considerados valores < 480 U/l como normais); PS: Performance status (Eastern Cooperative Oncology Group); IPI: International Prognosis Index.

71 5.2 Resultados imunohistoquímicos e classificação em CG e não-cg A expressão dos marcadores relacionados à diferenciação B (CD10, BCL6, MUM1 e CD138) e à onco-proteína BCL2 foi avaliada por imunohistoquímica em lâminas de TMA, incluindo todos os casos. Os marcadores CD10 e BCL6 não puderam ser avaliados em 5 casos (um caso por ausência de imunoreatividade de CD10 e 4 casos por profusa marcação inespecífica do anticorpo anti-bcl6). A expressão de BCL2 foi avaliada com sucesso em todos os casos, exceto em 3 tumores. No grupo total, a expressão de CD10 foi observada em 28% dos casos (32/116), BCL6 em 34,5% (39/113), e MUM1 em 38,5% (45/117) (Figura B, C e D). Por sua vez, BCL2 foi expresso em 51% (58/114) e 50% (57/114) dos casos, quando considerados >30% e >50% de células neoplásicas positivas, respectivamente (Figura E). A expressão de CD138 não foi registrada em nenhum dos tumores analisados, apesar da intensa positividade observada em eventualmente em células plasmáticas, utilizadas como controle interno da reação (Figura F). O algoritmo de Hans et al. (2004), para a classificação dos subtipos CG e não-cg, pôde ser aplicado com sucesso em 114 casos. Desta forma, na série estudada, 38% dos LDCGB (43/114) foram classificados como tipo CG e 62% dos casos (71/114) como tipo não-cg (Tabela 5.2). Foram classificados como CG: 15 casos (35%) que expressaram apenas CD10, 11 casos (26%) CD10 negativo e BCL6 positivo em ausência de positividade para MUM1 e 17 casos (39%) que exibiram co-expressão de CD10 e BCL6. A expressão de MUM1 neste grupo foi observada em 6 casos CD10 positivos (14%) (Tabela 5.2). Por sua vez, no grupo não-cg foram incluídos 38 tumores CD10 negativo com expressão de MUM1 somente (27/71, 38%) ou co-expressando MUM1 e BCL6 (11/71, 15,5%). Foram classificados também como LDCGB não-cg, 33 casos (46,5%) sem expressão imunohistoquímica para estes marcadores (Tabela 5.2), porém com imunoreatividade para CD20.

72 Figura 5.1: Expressão de marcadores imunohistoquímicos em LDCGB utilizando TMA O painéis mostram imagens representativas de células tumorais imunoreativas para os marcadores CD20, CD10, BCL6, MUM1/IRF4 e BCL2. A expressão de CD138 não foi registrada em nenhum dos tumores analisados, apesar da intensa positividade observada em eventuais células plasmáticas, utilizadas como controle interno da reação (setas). Visualização da reação imunohistoquímica pelo método estreptoavidina-biotina-peroxidase/dab e contra-coloração com hematoxilina de Harris. Aumento 100X 71

73 Figura 5.2: Subgrupos de LDCGB agrupados hierarquicamente pelas semelhanças na expressão dos marcadores imunohistoquímicos e pelas alterações no gene BCL2 detectadas por FISH. Foram considerados 114 casos com expressão imunohistoquímica disponível para a classificação de acordo com modelo de três marcadores proposto por Hans e col. (2004). Para cada marcador imunohistoquímico: em vermelho casos positivos (>30% em células neoplásicas) e em verde casos negativos; em branco os casos sem avaliação imunohistoquímica por impossibilidade técnica. Em A, os casos CG (n=43) e não- CG (n=71) foram agrupados de acordo às suas semelhanças na expressão dos marcadores associados a cada um dos subgrupos: CD10/BCL6 no grupo CG e MUM1/BCL2 no grupo não-cg. Em B, LDCGB exibindo as mesmas alterações no gene BCL2 foram agrupados considerando a expressão protéica de BCL2. As barras laranjas identificam casos com a t(14;18); as barras azuis identificam casos com cromossomos 18 adicionais e a barra rosa casos com amplificação 18q21. As barras pretas inferiores indicam casos sem hibridização na análise por FISH (n=27).

74 A expressão de BCL2 não foi diferente quando analisada separadamente nos casos CG (23/42, 55%) e não-cg (35/70, 50%). Não foi observada nenhuma associação entre a expressão imunohistoquímica de BCL2 e os marcadores CD10 e BCL6 no grupo total de pacientes, nem quando analisados separadamente em linfomas CG e não-cg. Em contrapartida, a expressão de BCL2 foi associada com a expressão de MUM1/IRF4 tanto no grupo total (p=0,036) como nos casos com perfil não-cg (p=0,03). Uma análise particular deste ultimo grupo, revelou ainda que a expressão de BCL2 (independentemente dos valores de corte) esteve associada mais freqüentemente (p=0,015) aos LDCGB MUM1 positivos (71%) quando comparada aos casos MUM1 negativos (29%) (Figura 5.2-A). Tabela 5.2: Perfis imunohistoquímicos definidos pela expressão dos marcadores de diferenciação B CD10, BCL6 e MUM1 em 114 casos de LDCGB 1 Perfil imuno-histoquímico Casos Grupo CG CD10+/ BCL6-/ MUM1± 15 (35%, 4 MUM1+) CD10+/ BCL6+/ MUM1± 17 (39%, 2 MUM1+) CD10-/ BCL6+/ MUM1-11 (26%) Subtotal 38% (43/114) Grupo não-cg CD10-/ BCL6+/ MUM1+ 11 (15,5%) CD10-/ BCL6-/ MUM1+ 27 (38%) CD10-/ BCL6-/ MUM1-33 (46,5%) 2 Subtotal 62% (71/114) CG, centro germinativo. 1 Em três casos artefatos técnicos impossibilitaram a avaliação da expressão de CD10 ou BCL6. 2 Os casos negativos para estes marcadores exibiram forte expressão de CD20.

75 Análise da expressão dos marcadores imuno-histoquímicos e as principais características clínicas Quando analisada as principais características clínicas em relação à expressão dos marcadores imuno-histoquímicos BCL6 e MUM1 não foram encontradas diferenças significativas. A expressão de CD10 foi mais comum em casos nodais (30%) que em linfomas com apresentação predominantemente extranodal (12,5%), porém sem diferença significativa. Na série estudada a expressão deste marcador foi associada a pacientes com PS 2 (p=0,009) e apresentando tumores volumosos (p=0,034). Não foram encontradas diferenças nas principais características clínico-laboratorias entre os pacientes dos grupos CG e não-cg, exceto que valores de PS categorizados como ambulatorial (PS ECOG <2) foram associados a tumores com perfil não-cg (p=0,045) (Tabela 5.1). A expressão de BCL2 foi associada a pacientes com idades acima de 60 anos (p= 0,002) e a níveis séricos elevados de LDH (p= 0,035) (Tabela 5.1). Quando os pacientes foram estratificados em CG e não-cg, a expressão de BCL2 não foi correlacionada a nenhuma característica clínica no grupo CG, mas foi significativamente associada à idade (p=0,01) e a níveis elevados de LDH (p=0,027) nos pacientes não-cg. 5.4 Alterações genéticas do gene BCL2 em LDCGB Detecção e tipificação de pontos de quebra da t(14;18) por PCR Do grupo total de LDCGB incluído neste estudo, 33 casos com material tumoral a fresco foram avaliados por PCR para a detecção da t(14;18). Diferentes métodos foram desenvolvidos e validados a partir de um grupo de amostras de linfomas foliculares, linfonodos reativos e tecido normal (Stefanoff et al., 2006). Visando identificar equivalentes moleculares da t(14;18) a diferentes níveis de sensibilidade, foram

76 75 padronizadas duas abordagens para a amplificação dos principais pontos de quebra no gene BCL2: amplificação por PCR em duas etapas (PCR nested) e em etapa única (PCR single). A sensibilidade destes métodos foi avaliada através da amplificação de diluições seriadas de DNA de linhagens celulares ou amostras de LF portadores da t(14;18) em DNA normal. Para os principais pontos de quebra mbr e mcr, os métodos nested atingiram uma sensibilidade de 10-6 e 10-4, respectivamente. Como esperado, os métodos de PCR single para estes pontos de quebra foram menos sensíveis (10-3 para mbr e 10-1 para mcr), porém mais específicos (Figura 5.3 e Tabela 5.3). No grupo de LDCGB avaliado por PCR foram detectados equivalentes moleculares da t(14;18) em 12 casos (36%) pelos métodos nested, todos eles no ponto de quebra mbr do gene BCL2. Quando aplicados os protocolos de PCR single, apenas cinco destes casos foram positivos para a translocação no mbr (15%) (Figura 5.4). Estes resultados foram concordantes entre os diferentes métodos de etapa única empregados (Tabela 5.3). A avaliação morfológica de preparações citológicas nos casos com resultados discordantes entre os métodos nested e single, revelou que a fração neoplásica da amostra sempre foi superior a 30% (Tabela 5.3). Finalmente, todas as amostras de LDCGB foram submetidas a protocolos de amplificação utilizando iniciadores complementares específicos aos pontos de quebra alternativos no gene BCL2: 3 mbr e 5 mcr/icr. A sensibilidade destes métodos de PCR single foi entre 10-2 e A t(14;18) foi detectada em dois casos adicionais de LDCGB negativos para os outros pontos de quebra. Ao todo 7 de 33 (21%) casos de LDCGB foram positivos para a t(14;18), quando considerados os resultados dos métodos de PCR single (Figura 5.4 e Tabela 5.3).

77 Freqüência de alterações no gene BCL2 em LDCGB detectadas por FISH Após uma avaliação preliminar das lâminas de TMA submetidas aos protocolos de FISH, foram excluídos das análises 28 casos, nos quais no foi observada hibridização das sondas LSI BCL2, LSI IGH e CEP18. Adicionalmente, foram também excluídos dois casos analisáveis por FISH, porém sem imunoreatividade dos marcadores chaves para a classificação CG e não-cg. As alterações do gene BCL2 detectadas por FISH foram analisadas no contexto da diferenciação dos subgrupos CG e não-cg (em 86 casos) e correlacionadas com a expressão imunohistoquímica de BCL2 (em 87 casos) Detecção da t(14;18) A t(14;18) foi detectada por FISH em 13 de 87 tumores fixados e impregnados em parafina incluídos no TMA (15%): 7 casos com translocação detectada também pela estratégia de amplificação por PCR de etapa única, um caso negativo por PCR e cinco casos apenas avaliados por FISH (Figura 5.4-A). A t(14;18) não foi detectada em nenhum LDCGB com a translocação detectada apenas pelos métodos de PCR nested (n=7), sendo estes casos classificados como negativos (Tabela 5.4). Além do padrão de hibridização típico esperado para esta translocação, múltiplas fusões BCL2/IGH ( 3) foram registradas em 4 dos 13 casos positivos (31%) (Figura 5.4-B). A t(14;18) foi detectada em casos exclusivamente nodais e foi mais freqüentemente associada (p <0.001) com LDCGB CG: 11 dos 33 casos (33%) do grupo CG em contraste com 2 de 54 casos (4%) não-cg. A expressão de CD10 foi mais comum nos casos t(14;18) positivos que nos casos t(14;18) negativos (78% vs. 21%; p <0,001), porém não foram observadas diferenças em relação à expressão de BCL6 ou à coexpressão de ambos marcadores (p=0,75 e p=0,69; respectivamente) entre estes dois grupos. MUM1 foi expresso em um único caso t(14;18) positivo, classificado como não- CG (Tabela 5.4).

78 77 Quando analisadas as principais características clínicas ao diagnóstico do grupo estudado por FISH, a t(14;18) foi mais comumente detectada em pacientes com risco intermediário-alto e alto (p=0,04) de acordo com o IPI e apresentando PS 2 (p=0,05), assim como níveis aumentados de LDH (p=0,11), estágios III/IV (p=0,21) e tumores volumosos (p=0,21). No grupo CG considerado particularmente foi observada esta mesma tendência, porem sem diferenças significativas (Tabela A1 do Anexo II, pág. 145) Detecção de sinais extras do gene BCL2 A utilização conjunta das sondas LSI BCL2, LSI IGH e CEP18 permitiu nos casos estudados, além de detectar sinais de fusão correspondentes ao padrão de hibridização esperado para a t(14;18), avaliar sinais extras do gene BCL2 no contexto da marcação da sonda centromérica do cromossomo 18, diferenciando assim casos com amplificação gênica da banda 18q21 daqueles com aneuploidia do cromossomo 18 (cromossomos adicionais). Sinais extras do BCL2 (amplificação 18q21 e cromossomos 18 adicionais) não envolvidos na t(14;18) foram detectados em 27 dos 89 casos (30%) avaliados. Vinte casos (22%) apresentaram um ou mais cromossomos 18 adicionais, 5 casos (6%) amplificação gênica 18q21 e em 2 casos foram registrados ambas alterações (2%). Nenhum dos LDCGB portadores da t(14;18) apresentou amplificação gênica 18q21, mas em 4 casos (4,5%) foram registrados cromossomos 18 adicionais. Na figura 5.5 (painéis C-F) são apresentadas imagens de FISH representativas destas alterações. Estas alterações foram mais freqüentes em tumores nodais. Dos LDCGB com apresentação predominantemente extranodal 1 caso apresentou amplificação do gene BCL2 (duas cópias extras) e em 3 casos foram observados cromossomos 18 adicionais. Na série estudada apenas pacientes com perfil imunohistoquímico não-cg exibiram amplificação gênica 18q21 (7 de 54, 13%, p=0,04). Cromossomos 18 adicionais foram mais freqüentemente encontrados no grupo não-cg (16 de 54 casos; 30%) que no grupo

79 78 CG (6 de 33 casos, 18%) porém sem diferença significativa (p=0,31). Dos 7 LDCGB CG com cromossomos 18 adicionais, três casos apresentaram também a t(14;18) (Tabela 5.4). Figura 5.3: Curvas de sensibilidade dos métodos de PCR nested e single para a detecção da t(14;18) nos pontos de quebra mbr e mcr. Diluições seriadas de DNA das linhagens Karpas-422 mbr+ (A) e DHL-16 mcr+ (B) em DNA normal foram avaliadas com os respectivos métodos nested (Géis superiores) e single (Géis inferiores). Géis de agarose 2% corados com brometo de etídeo. Figura 5.4: Detecção de equivalentes moleculares da t(14;18)(q32;q21) por métodos de PCR de única etapa nos pontos de quebra conhecidos no gene BCL2 Foram identificados equivalentes moleculares por métodos de PCR de única etapa nos pontos de quebra mbr (A), 3 mbr (B) e 5 mcr (C). As setas indicam os tamanhos em pares de bases (pb) dos produtos amplificados nas respectivas reações de PCR com DNA da linhagem Karpas-422 ou de casos de LF t(14;18) positivos para os pontos de quebra 3 mbr e 5 mcr. Não foram detectados casos com t(14;18) no ponto de quebra mcr. Géis de agarose 2% corados com brometo de etídeo.

80 79 Tabela 5.3: Comparação dos resultados da avaliação da t(14;18) por PCR e FISH Caso N Fração tumoral 1 nested (10-6 ) t(14;18) detectada por PCR mbr single 1 (10-3 ) single 2 (10-3 ) 3 mbr single (10-2 ) 5 mcr 2 single (10-3 ) t(14;18) detectada por FISH % % % % NA % % NA % % % % NA % % NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA + mbr, major breakpoint region; mcr, minor cluster region; nested, reações de PCR em duas etapas; single, reações de PCR de única etapa; single 1, método desenvolvido com os mesmos iniciadores externos utilizados no respectivo método nested; single 2, método de PCR multiplex de acordo com o BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT ; NA, não avaliado. A sensibilidade de cada método é indicada entre parêntesis. 1 Por avaliação morfológica de preparações citológicas (imprints) de tumores a fresco (Método May-Grümwald- Giemsa) 2 Resultados equivalentes com o método icr/jh desenvolvido de acordo com iniciadores e condições em Albinger-Hegyi et al. (2002) 3 Avaliada em tumores fixados e impregnados em parafina do TMA.

81 80 Tabela 5.4: Perfil imunohistoquímico dos LDCGB com alterações no gene BCL2 detectadas por FISH Casos CD10 BCL6 MUM1 Perfil BCL2 t(14;18) (n=13) CG CG CG CG CG ,2,3 + CG ,2,3 + + CG CG ,2,3 + + CG CG CG 077 1,2,3 + não-cg não-cg + Cromossomos 18 adicionais (n= 16) CG CG CG não-cg não-cg não-cg não-cg não-cg não-cg não-cg não-cg não-cg não-cg não-cg não-cg não-cg NA Amplificação 18q21 (n=7) não-cg não-cg não-cg não-cg não-cg não-cg não-cg Considerados positivos casos com >30% de células neoplásicas imunoreativas. CG, centro germinativo. NA, não avaliável. 1 Com múltiplas ( 3) fusões BCL2/IGH 2 Com cromossomos 18 adicionais 3 Com sinais IGH extras

82 81 Figura 5.5: Detecção da t(14;18)(q32;q21) e sinais extras do gene BCL2 por FISH em casos de LDCGB fixados e impregnados em parafina. Foram observados padrões clássicos de hibridização (A) e múltiplas sinais de fusão (B) correspondentes à t(14;18) em núcleos em interfase (setas amarelas). Sinais extras da sonda vermelha (LSI BCL2 ) foram analisadas no contexto dos sinais da sonda azul centromérica (CEP18 ) para diferenciar amplificação gênica 18q21 (C e D, setas vermelhas) de cromossomos 18 adicionais (E e F, setas azuis). Sinais extras da sonda LSI IGH não envolvidos na t(14;18) (setas verdes) foram observados em casos sem outra alteração aparente (G) ou em associação com cromossomos 18 adicionais (aneuploidia, F). O padrão de hibridização esperado em células normais é mostrado no painel H.

83 82 Nenhuma associação foi encontrada entre sinais extras do gene BCL2 e a expressão dos marcadores imunohistoquímicos utilizados na classificação CG e não-cg, exceto que cromossomos 18 adicionais foram mais freqüentemente (p=0,02) observados em casos MUM1 positivos (31%) que em casos MUM1 negativos (9%) do grupo total de pacientes analisados. Não foram observadas diferenças entre as características clínicas do grupo total de pacientes ou do subgrupo não-cg quando analisadas em relação à amplificação 18q21 ou a cromossomos 18 adicionais (Tabelas A2 e A3 do Anexo II, Páginas 146 e 147, respectivamente) Detecção de sinais extras do gene IGH Foram detectados 29 casos (30% do grupo analisado) com sinais extras do gene IGH (14q32) não envolvidos na t(14;18). Cinco dos 24 casos com apenas um sinal 14q32 extra, apresentaram também a t(14;18) (Tabela 5.4). Um ou mais sinais extras foram registrados em 5 casos sem alterações evidentes do gene BCL2 (Figura 5.5 G). Sinais extras IGH foram encontrados mais freqüentemente associados (p=0,001) ao grupo de LDCGB com cromossomos 18 adicionais (14 de 22 casos, 64%) que ao grupo de casos sem esta alteração (15 de 52 casos, 22%) (Figura 5.5 F). Não foram observadas diferenças na distribuição destes padrões de hibridização entre os grupos de LCDGB CG (12/33, 36%) e não-cg (17/54, 31%) nem na expressão dos marcadores imunohistoquímicos CD10, BCL6 e MUM Expressão protéica de BCL2 em LDCGB com alterações no gene BCL2 Dos LDCGB que foram avaliados por FISH, 55% expressaram a oncoproteína BCL2 (48/87) e incluíram 10 casos com t(14;18) e 14 casos com sinais extras do gene BCL2 (50%, p=0,049). Em 24 casos com expressão de BCL2 não foram detectadas alterações genéticas deste gene com os métodos utilizados.

84 83 No grupo CG, BCL2 foi positivo em 8 dos 11 casos com translocação e em 11 dos 22 casos sem a alteração (73% e 50%, respectivamente; p=0,28). Os dois casos não-cg com t(14;18) também expressaram BCL2. A expressão de BCL2 foi detectada em 5 de 7 casos (72%) com amplificação gênica e em 9 de 15 casos (60%) com apenas cromossomos 18 adicionais (p=0,78 e p=0,45, respectivamente) (Tabela 5.5). Tabela 5.5 : Expressão imunohistoquímica de BCL2 em relação às alterações do gene BCL2 detectadas por FISH em LDCGB Expressão de BCL2 por IHQ BCL2+ (n=48) BCL2 (n=39) p Alterações no BCL2 1 Sim (n=35) 24 (50%) 11 (28%) 0,05 Não (n= 52) 24 (50%) 28 (72%) t(14;18) Sim (n=13) 2 10 (21%) 3 (8%) 0,13 Não (n= 74) 38 (79%) 36 (92%) Cromossomos 18 adicionais 3 Sim (n=15) 9 (19%) 6 (15%) 0,78 Não (n= 72) 39 (81%) 33 (85%) Amplificação gênica 18q21 Sim (n=7) 4 5 (10%) 2 (5%) 0,45 Não (n= 80) 43 (90%) 37 (95%) Considerados positivos casos com >30% de células neoplásicas imunoreativas. CG, centro germinativo. NA, não avaliável; IHQ, imunohistoquímica 1 Casos com pelo menos uma alteração no gene BCL2 detectada por FISH: t(14;18), amplificação 18q21 ou cromossomos 18 adicionais 2 Considerados 4 casos apresentando também cromossomos 18 adicionais. 3 Considerados casos apresentando apenas esta alteração. 4 Incluindo dois casos com um cromossomo 18 adicional (apenas um deles foi positivo para a expressão de BCL2).

85 Analise de HS de genes VH em LDCGB No intuito de caracterizar o perfil imunogenético dos LDCGBs, amostras de DNA de alto peso molecular de 33 casos foram submetidas a protocolos de amplificação de rearranjos do gene IGH. Em 27 casos (82%) foi possível amplificar um rearranjo clonal pelos métodos FR1/JH e/ou VHlider/JH. Foram purificados e subclonados em plasmídeos 22 destes rearranjos (Figura 5.6). Após digestão do DNA plasmidial com a enzima de digestão EcoRI, a presença de insertos foi confirmada em todos os casos (Figura 5.7). Em média, 15 subclones por caso (8-21) foram seqüenciados e analisados. Em 18 casos de LDCGB foram obtidos clones moleculares com idênticas seqüências no CDR3, o que confirmou o rearranjo IGH clonal. Em 3 destes casos os rearranjos VDJ foram considerados não produtivos por apresentarem seqüências com códons de parada, e foram excluídos da análise de variação intraclonal. Figura 5.6: Rearranjos clonais IGH amplificados pelo método VHlider/JH. Gel de agarose 2% com brometo de etídeo. M, marcador de peso molecular 100 pb

86 85 Figura 5.7: Identificação de insertos de interesse em DNA plasmidial. Gel de agarose 1% com brometo de etídeo. Em cada caso foi aplicado 2 µl de DNA plasmidial (sem e com digestão EcoRI). Os insertos (indicados pela seta) foram identificados na faixa do tamanho esperado ( pb). M: Marcador de peso molecular 1 Kb Padrões de HS e utilização de genes IGH A presença ou ausência de HS foi definida com base na identidade (I) da seqüência analisada com o gene germline VH utilizado no rearranjo clonal (I < 98%). Todos os LDCGB estudados foram nodais e exibiram os genes VH mutados com uma taxa média de mutação de 7,8% (2,1-14,2%). Nas seqüências dos genes VH analisados, foram confirmadas 346 mutações pontuais, das quais 204 foram transições (59%) e 142 transversões (41%). De acordo com critérios estabelecidos (Vanhentenrijk et al., 2004), 6 casos foram categorizados como levemente mutados (I entre 95% e 98%, 40%) e 9 casos como fortemente mutados (I<95%, 60%). Os alinhamentos das seqüências clonais VDJ de cada um destes casos são apresentados no Anexo III (Pág. 148). A comparação das seqüências dos segmentos VH rearranjados dos LDCGB com a dos alelos nativos (germline) permitiu determinar a utilização dos genes VH. Em praticamente todos os rearranjos dos LDCGB CG foram encontrados genes da família

87 86 VH3, exceto por um caso derivado da utilização de um gene VH5. Já nos LDCGB não-cg foram observados rearranjos clonais derivados de genes VH3 (n=5) e VH4 (n=4) (Tabela 5.6). Os rearranjos envolvendo segmentos gênicos da família VH4 foram caracterizados por uma freqüência baixa de mutações (média de 5,56%), sendo 80% deles classificados como levemente mutados (2,1-4,5%). Já os rearranjos que utilizaram genes da família VH3 mostraram maiores freqüências mutacionais (média de 8,8%), com 78% dos casos classificados como fortemente mutados (8,2 14,2%) (p=0,09) (Tabela 5.6). O pequeno número de casos avaliados neste estudo não permitiu analisar a utilização preferencial de genes VH nos dois subgrupos de LDCGB. Os segmentos gênicos DH e JH envolvidos em cada rearranjo analisado são listados na tabela 5.8. Quando considerados os subgrupos definidos pela expressão IHQ, a freqüência de mutação foi de 9,5% (2,4 13,7, mediana 10,25) e 6,7% (2,1-14,2, mediana 4,5) nos subgrupos CG e não-cg, respectivamente (Figura 5.8). Dos casos categorizados como fortemente mutados, 5 pertenceram ao grupo CG, porém as maiores freqüências de HS foram encontradas em dois LDCGB com perfil não-cg (14% no caso 107 e 14,2% no caso 108). Como esperado, as mutações somáticas foram substancialmente mais freqüentes nas regiões CDR que nas regiões FR. A freqüência média de mutações nas regiões CDR1 e CDR2 foram superiores nos casos CG (25,5% e 15,7%, respectivamente) quando comparadas com os LDCGB não-cg (13,3% e 9,2%, respectivamente) (Figura 5.9 e Figura 5.10) Análise da variação intraclonal (HS ongoing) Evidências de variação intraclonal foram observadas em cinco dos casos analisados (33%). Destes, 3 corresponderam ao subgrupo CG (50%, com 6 a 9 mutações somáticas não compartilhadas pelos clones moleculares relacionados) e 2 ao subgrupo não-cg (22%, com 1 e 4 mutações não compartilhadas). O número de HS ongoing foi expressivamente maior nos LDCGB do subgrupo CG (22 mutações em 66 clones

88 87 analisados) que no não-cg (5 em 114 clones analisados), sendo a média da freqüência de variação intraclonal de 0,24% e 0,05%, respectivamente (Tabela 5.6). Exemplos de alinhamentos de LDCGB que exibiram alta taxa de variação intraclonal podem ser observados no Anexo III (casos 001, 064 e 088). Todos os LDCGB CG nos quais não foi detectada variação intraclonal co-expressaram CD10 e BCL6 (Tabela 5.6) e em um deles foi detectada a t(14;18) por FISH. Por sua vez, os LDCGB não-cg com HS ongoing incluíram 1 caso com expressão de BCL6 e MUM1/IRF4 (com variação intraclonal definida pela presença de uma mutação não compartilhada por um único clone) e um outro caso negativo para todos os marcadores IHQ (com variação intraclonal em 3 diferentes subclones) (Tabela 5.6). Na tabela 5.7 são apresentadas as alterações no gene BCL2 detectadas por FISH em relação aos perfis imunohistoquímico e imunogenético dos 15 casos de LDCGB submetidos à análise de genes VH Freqüência de HS (%) Mm 10,25 Mn 4, CG não-cg LDCGB definidos pela expressão IHQ Figura 5.8: Freqüências mutacionais observadas em LDCGB Gráfico tipo Box and Whisker, onde as divisórias das caixas representam as medianas (Mn) e as linhas verticais a faixa de distribuição dos valores.

89 Tabela 5.6: Resultados da análise de variação intraclonal nos genes VH em 15 casos de LDCGB classificados de acordo à expressão de marcadores IHQ # Expressão de marcadores CD10 BCL6 MUM1 Perfil IHQ Utilização de segmentos gênicos VH DH JH Freqüência de HS (%) 1 N bases seqüenciadas e analisadas 2 Clones tumorais 3 / clones analisados Mutações não compartilhadas N de clones moleculares com VI 4 Freqüência de VI (%) CG b 2, / , CG b 10, / CG b 8, / CG a 13, / , CG a / , CG b 11, / não-cg b 3, / , não-cg b 8, / não-cg b 4, / não-cg c 4, / não-cg b 6, / não-cg a 3, / não-cg c 14, / , não-cg c 2, / não-cg / IHQ, imunohistoquímico; CG, centro germinal; VI, variação intraclonal (ongoing mutation), genes VH: variáveis; DH, diversidade; JH, junção; HS, hipermutação somática 1 Calculada como: número total de mutações x 100/número de nucleotídeos VH analisados 2 Compreende a região delimitada desde o início da região FR1 até o último códon identificável da região FR3. 3 Clones moleculares exibindo idêntica seqüência na região CDR3. 4 Definida como a presença de clones que, compartilhando a mesma região CDR3, variam em uma ou mais mutações verificadas em pelo menos dois clones. 5 Calculada como: número de mutações não compartilhadas x 100/número de nucleotídeos VH analisados x subclones analisados. Com uma mutação não compartilhada por um único clone

90 Tabela 5.7: Correlação do perfil imunogenético com as alterações no gene BCL2 detectadas por FISH em casos de LDCGB classificados pela expressão de marcadores IHQ. Caso Perfil IHQ Variação intraclonal t(14;18) Cromossomos 18 adicionais Amplificação 18q21 Expressão de BCL2 001 CG sim não não não CG não não não não 073 CG não sim sim não 088 CG sim sim sim não CG sim sim não não CG não não não não 112 não-cg sim não não sim não-cg não não não não 076 não-cg não não não sim não-cg não não não não não-cg não sim sim não não-cg não não não não 108 não-cg sim não não não não-cg não não sim sim não-cg não não não não CG, centro germinativo; IHQ, imunohistoquímico. Perfil imunogenético definido pela análise de genes VH 30 Mutações somáticas (%) ,3 25,5 13,3 casos CG caos não-cg 15,7 9,2 8,7 6 4,4 3,6 0 FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 Regiões VH analisadas Figura 5.9: Distribuição de mutações somáticas nas diferentes regiões analisadas dos genes VH em LDCGB CDR, regiões determinantes de complementaridade; FR, regiões frame; CG, centro germinativo. Os valores indicam as freqüências médias de mutações observadas em cada região (calculadas em relação ao comprimento da região analisada nos casos CG e não-cg)

91 90 Figura 5.10: Distribuição de mutações somáticas na região variável do gene IGH em LDCGBs CG e não-cg Na figura está representada a região analisada para a determinação de freqüência de hipermutação somática e variação intraclonal em rearranjos do gene da cadeia pesada da Ig, a saber: FR1, CDR1, FR2, CDR2 e FR3. As mutações foram indicadas com barras verticais na posição relativa ao inicio primeiro nucleotídeo do gene VH. Foram representadas todas as mutações encontradas em cada caso, inclusive mutações não compartilhadas por diferentes subclones naqueles LDCGB com variação intraclonal. Os 15 LDCGB estudados foram agrupados de acordo com o perfil imunohistoquímico em CG (n=6) e não-cg (n=9) e identificados de acordo com a nomenclatura utilizada na tabela 5.7. Com asteriscos foram indicados os casos onde foi demonstrada variação intraclonal (HS ongoing). CDR, regiões determinantes de complementaridade; FR, regiões frame ; CG, centro germinativo