Biossíntese e Genética de Imunoglobulinas - BCR / Acs / Anticorpos Monoclonais
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- Lídia Andrade
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1 Biossíntese e Genética de Imunoglobulinas - BCR / Acs / Anticorpos Monoclonais Prof. Helio José Montassier hjmonta@hotmail.com 1
2 Imunoglobulinas / Anticorpos e TCR Moléculas Receptoras p/ o reconhecimento de Antígenos Ligação (Ag-Ac) - Específica Marcadores Celulares BCR-Ig / Acs TCR Linf. B Linf. T 2
3 Sumário sobre a estrutura básica dos Acs 3
4 RNAm RNAm BIOSSÍNTESE, GLICOSILAÇÃO E JUNÇÃO DAS MOLÉCULAS DE Ig SÍNTESE Ribossomos RER N-glicosilação das cadeias pesadas Proteínas chaperones JUNÇÃO - RE Pontes dissulfeto Liberação das chaperonas Complexo de Golgi Modificação dos carboidratos Transporte dos Acs para a membrana em vesículas Ancorados na membrana 4 Secretados por exocitose
5 Parátopo / Sítio Combinatório dos Acs - CDRs das Regiões VH e VL conferem especificidade ao para os BCRs e/ou Acs combinarem-se com os Epítopos 5
6 Bases da Especificidade do Sítio Combinatório dos Acs para interação e reconhecimento de Ags Nos domínios variáveis de cadeia leve (VL) e pesada (VH) existem 3 regiões hipervariáveis (HV), que formam as regiões determinantes de complementariedade (CDRs) e são apresentados na superfície do parátopo ou sítio combinatório de uma molécula de anticorpo. Estas CDRs formam a superfície de ligação para o epítopo do antígeno. As CDRs são ladeadas por seqüências de aminoácidos mais conservados, chamadas de regiões Framework (FRs), responsáveis pela estabilidade estrutural do domínio de ligação do antígeno. CDRs CDRs
7 As CDRs das Regiões VH e VL contêm aminoácidos cujas cadeias laterais estabelecem as ligações (Pontes de H, forças eletrostáticas, interações hidrofóbicas e Forças de Van der Waals) com os grupos químicos que compõem os epítopos dos antígenos, conferindo especificidade para os BCRs e/ou Acs combinarem-se com os Epítopos dos Antígenos
8 CDRs / HVs Quando se comparam as sequências de aminoácidos dos domínios VH e VL de Acs com diferentes especificidades para diferentes Ags:- 1.-) Existem determinadas áreas de hipervariabilidade (HVs / CDRs) nos domínios variáveis das cadeias H e L das Igs (VH e VL). 2.-) Existem Regiões mais conservadas em moldura (Frameworks-FRs) ladeando as regiões hipervariáveis (HVs / CDRs) 8
9 RESUMINDO:- Região ou domínio variável (VH e VL) determina a especificidade do anticorpo, pois é responsável pela ligação com o epítopo do Antígeno e contém regiões de complementariedade da diversidade (CDRs) ou de hipervariabilidades (HVs). Há 3 CDRs em cada um dos domínios variáveis (VH e VL). 9
10 RESUMINDO:- Bases da Especificidade do Sítio Combinatório dos Anticorpos A superfície do sítio combinatório do Ac, especialmente ao nível das CDRs de VH e de VL são as partes mais importantes para conferir especificidade na interação específica com cada epítopo de um Ag 1. A forma e as cargas elétricas das CDRs de VH e de VL que constituem o sítio combinatório de um dado Ac determinam qual o epítopo que será ligado pelo mesmo. 2. A forma e as cargas elétricas, ou o inverso a ausência delas indicando hidrofobicidade, dependem das sequências de Aminoácidos que compõem cada CDR
11 Fluxo Normal da Informação Gênica em Células Eucariotas (DNA) 11
12 Fluxo da Informação Gênica em Células Eucariotas Síntese Proteica no R.E.R. pelo RNAm e RNAt 12
13 13
14 Como é possível então serem produzidos todas essas diferentes especificidades de anticorpos /BCR se existem no máximo 1000 genes de Igs??? 14
15 15
16 Organização e Estrutura dos genes/igs/bcrs/acs Cadeias leves L Cadeias pesadas H Genes:- L Região variável V Região constante C as regiões V e C das cadeias L e H são codificadas por genes diferentes V ; J ; C H V H ;D H ; V ; J ; C J H ; C H C - IgA C - IgM C - IgG C - IgD C - IgE 16
17 Organização dos loci gênicos das Igs em Humanos 17
18 Bases Genéticas da Diversidade dos Anticorpos Regiões variáveis (V) e constantes (C) coexistem nas cadeias leves (L) e pesadas (H) de uma mesma molécula de Ig / Anticorpo / BCR e são codificadas por diferentes regiões gênicas dos genes de Igs. Genes das cadeias pesadas (H) de Igs estão localizados em cromossomos diferentes daqueles onde estão localizados os genes codificadores das cadeias leves (L). Ocorrem rearranjos (recombinações somáticas) para reunir as regiões gênicas codificadoras (exons) dos genes das regões V e C das cadeias H e L das Imunoglobulinas / Anticorpos / BCR. As cadeias polipeptídicas H e L das Imunoglobulinas / Anticorpos / BCR devem ser sintetizadas, nos ribossomos dos linfócitos B separadamente e depois agrupadas por pontes dissulfeto. 18
19 Organização dos genes de imunoglobulinas na linhagem germinativa e diversidade dos sítios combinatórios dos anticorpos 1- Múltiplos genes: V, D, J e C para cadeia H e genes V, J e C para cadeia L 2- Diversidade combinatória aleatória dos genes V, D, J e C para cadeia H e genes V, J e C para cadeia L 3- Diversidade juncional dos genes V, D, J e C para cadeia H e genes V, J e C para cadeia L: gera códons diferentes 4 Combinação de cadeias peptídicas recém-sintetizadas leves (L) e pesadas (H) das Igs 5- Mutação somática: ocorre no momento da duplicação do DNA em algumas bases de regiões hipervariáveis (CDRs) dos genes V das cadeias H e L. de linfócitos B adultos e de memória. 19
20 Cada Célula B produz somente uma especificidade para o BCR e para o Ac 20
21 Teoria da seleção clonal Linfócitos B c/ BCRs de Diferentes Especificidades Ag Linf. B BCR Cada linfócito B possui um único tipo de receptor (BCR) com uma especificidade única. A interação BCR Ag leva à ativação dos linfócitos B. As células B filhas possuem a mesma especificidade, quanto ao BCR ou aos Acs produzidos que a célula B mãe. 21
22 Recombinação V(D)J Gene Cadeia H Recombinação ao acaso Rearranjos de DNA tornam os exons dos genes V, D e J contíguos no gene de cadeia H Quebra na dupla hélice do DNA Adição ou remoção de nucleotídeos 22
23 Resumo Organização dos Genes de Imunoglobulinas 23
24 Relação entre Principais Genes Codificadores de cadeias H e L de Imunoglobulinas e as Regiões dessas Cadeias Polipeptídicas 24
25 Recombinação Somática e expressão dos genes das cadeias L e H das Igs 25
26 Estágios na Maturação de Linfócitos B e as Alterações nos Genes de Igs 26
27 Diversidade do repertório de anticorpos 27
28 28
29 29
30
31 Troca de classes de Igs / Acs Switch ou troca de classes Linfs. B de mesma especificidade são capazes de gerar imunoglobulinas de classes diferentes de acordo com o estímulo antigênico o mecanismo envolvido é o splicing, através do qual são selecionados os diferentes segmentos de cadeia pesada constante (C, C, etc.) que determina os isotipos ou classes de Ig resposta primária predomínio de IgM (C ) resposta secundária predomínio de IgG (C ), ou de IgA (Cα), ou de IgE (C ) 31
32 Fig. - Troca de classes (isótipos) de Igs depende de recombinação entre sinais específicos. 32
33 Fig Isotype switching is preceded by transcriptional activation of C H genes. Resting naive B cells transcribe the m and d loci at a low rate, giving rise to surface IgM and IgD. Bacterial lipopolysaccharide (LPS), which can activate B cells independently of antigen (see Section 8-10), induces IgM secretion. In the presence of IL-4, however, Cg1 and Ce are transcribed at a low rate, presaging switches to IgG1 and IgE production. The transcripts originate 5 of the region to which switching occurs, and do not code for protein. Similarly, TGF-b gives rise to Cg2b and Ca transcripts, and drives switching to IgG2b and IgA. It is not known what determines which of the two transcriptionally activated CH gene segments undergoes switching. Arrows indicate transcription. 33
34 Anticorpos monoclonais (mab) Conceito Características Produção Aplicações 34
35 Principais Características e Diferenças entre Anticorpos Policlonais e Monoclonais 35
36 I. Acs Policlonais Mistura de anticorpos com diferentes especificidades e afinidades para os epítopos que compõem um dado antígeno Gerados em qualquer animal, após contato com antígeno. 36
37 Na resposta immune humoral adaptativa, somente as células B que reconhecem os epítopos de um antígeno são selecionadas para participar da R.I.H. Proliferação de célula com receptores para o epitopos Mistura de Células B com diferentes especificidades Um antígeno com dois epitopos (azul e vermelho) Seleção clonal durante a R.I. = soro policlonal com mistura de Acs 37
38 II. Anticorpo monoclonal (mab) Produzidos a partir de um clone único de célula B, possuindo a mesma especificidade e afinidade para um determinado epítopo de um Antígeno. mab = Monoclonal Antibody 38
39 Resposta Imune Humoral - É Policlonal Antígeno Imunização Resposta Imune Humoral anticorpos epítopos Uma mistura de anticorpos Anticorpos Policlonais 39
40 40
41 Acs Policlonais Se for possível isolar uma única célula B produtora de Ac de 1 especificidade Separação de Acs c/ 1 especificidade B B B B B B B B Cultivo de Cels. B prod. Acs 1 especificidade 41 Acs Monoclonais c/ 1 especificidade
42 Célula B secreta Acs c/ 1 espec. Mieloma Crescem indefinidamente em cultura FUSÃO Hibridomas Seleção de Clones Híbridos produzindo Acs c/ 1 espec. Sobrevivem e produzem anticorpos Separação de Acs c/ 1 especificidade 42 Acs Monoclonais c/ 1 especificidade
43 RESUMINDO:- ANTICORPOS MONOCLONAIS São anticorpos com elevada especificidade e obtidos por uma técnica que é capaz de fundir (hibridizar) linfócitos B ativados apresentando uma única especificidade de reconhecimento de um epítopo de um determinado Ag (células de vida curta in vitro) com células de mieloma (células de vida longa e contínua in vitro), de modo que as células híbridas podem ser mantidas em cultura celular e produzir continuadamente Acs monoclonais (mab) com especificidade para um único epítopo do Ag usado na ativação (imunização) dos linfócitos B. Acs que são produzidos a partir de um único clone de células B são denominados de Acs monoclonais (Mab). 43
44 Técnica de Preparo de Acs Monoclonais 44
45 em células do sangue (Linfócitos) 45
46 46
47 Aplicações dos Acs Monoclonais Outras Aplicações 47
48 FIM 48
Biossíntese e Genética de Imunoglobulinas - BCR / Acs / Anticorpos Monoclonais
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