Conteúdo de DNA nuclear em cultivares de morangueiro

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1 Conteúdo de DNA nuclear em cultivares de morangueiro Amanda G Guimarães 1, Valter C de Andrade Júnior 1, Leila A Salles Pio 2, Moacir Pasqual 2, Carlos E Pedrosa 1, Marcos Aurélio M Ferreira 1 1 UFVJM Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri/Departamento de Agronomia, Rodovia MGT 367 Km 583, nº 5000, Alto da Jacuba, CEP , Diamantina MG, Brasil. amandagguimaraes@yahoo.com.br, valterjr@ufvjm.edu.br, carlosenrrik@yahoo.com.br, marcaumife2010@hotmail.com. 2 UFLA Universidade Federal de Lavras/Departamento de Agricultura Campus Universitário, s/nº cep , cp 37, Lavras MG. leilapio.ufla@gmail.com, mpasqual@dag.ufla.br RESUMO A citometria de fluxo é uma técnica que utiliza propriedades ópticas de partículas (células, núcleos, organelas, etc.) que fluem em uma suspensão líquida dentro de um aparelho denominado citômetro de fluxo que possui, entre outras aplicações, a capacidade de estimar a quantidade de DNA de plantas. Dados deste tipo são importantes em trabalhos de melhoramento genético de várias espécies vegetais. O objetivo deste trabalho foi estimar a quantidade de DNA de oito cultivares de morangueiro, pela técnica de citometria de fluxo. Foram utilizadas plantas matrizes de morangueiro (Fragaria x ananassa Duch.), cultivares Camarosa, Campinas, Dover, Florida Festival, Oso Grande, Toyonoka, e de dias neutros: Aromas e Diamante. Amostras de folhas jovens de plantas aclimatizadas foram retiradas para a realização das análises. Foi utilizado como padrão interno de referência folhas jovens de ervilha Pisum sativum (2C=9,09 pg de DNA). As amostras foram trituradas em uma placa de Petri contendo 1 ml de tampão Marie gelado para a obtenção da suspensão nuclear (DOLEZEL, 1997), a qual foi corada com 25 µl de iodeto de propídeo (1 mg/ml). Os histogramas foram obtidos no citômetro FacsCalibur (Becton Dickinson) com o programa Cell Quest (Becton, Dickinson) e os coeficientes de variação (CV) serão analisados no software WinMDI 2.8 (2009). Para cada amostra foram analisados núcleos sendo, aquelas com coeficiente de variação (CV) maior que 3%, foram descartadas. O delineamento estatístico utilizado foi o inteiramente casualizado com oito cultivares, seis repetições, e os dados foram submetidos análise de variância pelo teste F e as medias comparadas pelo teste de tukey a 5% de probabilidade utilizando o programa SISVAR. A quantidade de DNA é diferente apenas para a cultivar Oso Grande comparadas com as demais cultivares. Essa cultivar apresenta menor quantidade de DNA (2,36 pg) que as demais. Palavras-chave: Citometria de fluxo, Ploidia, Melhoramento genético Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 1

2 ABSTRACT Nuclear DNA content in strawberry cultivars Flow cytometry is a technique that utilizes the optical properties of particles (cells, nucleus, organelles, etc.). Flowing in a liquid suspension within a device called flow cytometry which has, among other applications, the ability to estimate the amount DNA from plants. Data of this type are important in plant breeding of various plant species. The objective of this study was to estimate the amount of DNA of eight strawberry cultivars by flow cytometry. We used plants of strawberry (Fragaria x ananassa Duch.) Cultivars Camarosa, Campinas, Dover, Florida Festival, Oso Grande, Toyonoka, and day neutral: Aromas and Diamante. Samples of young leaves of acclimatized plants were removed for analyzes. Was used as internal reference standard young leaves of pea Pisum sativum (2C = 9.09 pg of DNA). Samples were crushed in a petri dish containing 1 ml of cold buffer Marie for obtaining nuclear suspension (DOLEZEL, 1997), which was stained with 25 ml of propidium iodide (1 mg / ml). The histograms were obtained in the FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson) with Cell Quest program (Becton Dickinson) and coefficients of variation (CV) will be analyzed in the software WinMDI 2.8 (2009). To each sample were analyzed with 10,000 cores, those with a coefficient of variation (CV) greater than 3% were discarded. The statistical design was completely randomized with eight cultivars, six replications and the data were submitted for analysis of variance F test and the averages compared by Tukey test at 5% probability using the program SISVAR. The amount of DNA is different only for the cultivar Oso Grande compared to other cultivars. This cultivar has a lower amount of DNA (2.36 pg) than the others. Keywords: Flow cytometry, Ploidy, breeding INTRODUÇÃO O morangueiro (Fragaria x ananassa Duch), cultivado nos dias atuais, foi originado pela hibridação natural das espécies silvestres F. virginiana e F. chiloensis, introduzidas na França nos anos de 1624 e 1714, respectivamente. Essa espécie é classificada botanicamente na divisão Magnoliophyta (Angiospermae), classe Magnoliopsida (Dicotiledoneae), subclasse Rosidae, ordem Rosales, família Rosaceae, gênero Fragaria (CRONQUIST,1988). O gênero Fragaria compreende dezessete espécies silvestres. A classificação das espécies é feita com base no nível de ploidia que são diplóides, tetraplóides hexaplóides e octoplóides, em que o número cromossômico básico é igual a sete (x = 7). A espécie cultivada F. x ananassa é octaplóide (2n = 8x = 56). BRIGHHURST (1990) sugeriu a fórmula genômica AAA A BBB B (2A2A 2B2B ) aos octaplóides F. x ananassa, F. chiloensis e F. virginiana, em função das Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 2

3 evidências citológicas e genéticas que sugerem que essas espécies sejam poliplóides dissômicos, com comportamento meiótico similar ao dos diplóides. A determinação do conteúdo de DNA nuclear em plantas tem sido reconhecida como um relevante parâmetro para caracterização genômica, podendo também auxiliar estudos evolutivos (KNIGHT & BEAULIEU, 2008), melhoramento genético (DOLEZEL, 1997), ecologia, sistemática e biologia molecular e celular (BENNET & LEITCH, 1995). Uma das formas de estimar o conteúdo de DNA de uma espécie é por meio da citometria de fluxo, que é uma técnica que envolve a análise das propriedades ópticas (dispersão da luz e fluorescência) de partículas que podem ser células, núcleos, cromossomos, dentre outras; que fluem numa suspensão líquida (DOLEZEL, 1997). Entre as finalidades nos estudos biológicos de plantas pode-se citar o conhecimento do controle e estabilidade do nível de ploidia, identificação de haploides e duplohaplóides em culturas de anteras e ovários, verificar novos níveis de ploidia em resultados de cruzamentos, detectar aneuplóides, identificar híbridos, polissomatia e o sexo de plantas dioicas, acompanhar o desenvolvimento da semente e identificar o produto da fusão de protoplastos (DOLEZEL, 1997). Este trabalho teve como objetivo estimar a quantidade de DNA nuclear em diferentes cultivares de morangueiro. MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi conduzido na Universidade Federal de Lavras, em Lavras, MG, no laboratório de cultura de tecidos vegetais e no Departamento de Agricultura. Foram utilizadas plantas matrizes de morangueiro (Fragaria x ananassa Duch.), provenientes da empresa Multiplanta Biotecnologia Vegetal, da cidade de Andradas/MG. As cultivares avaliadas são classificadas como espécies de dias curtos: Camarosa, Campinas, Dover, Florida Festival, Oso Grande, Toyonoka, e de dias neutros: Aromas e Diamante (FAEDI et al., 2009; CHANDLER et al., 2006; HOWARD & ALBREGTS, 1980) conforme a Tabela 1. As plantas matrizes de morango foram transplantadas em agosto de 2012 em vasos de 4 L com 100% de substrato Vida Verde Tropstrato hortaliças (casca de pinus compostada, turfa e carvão vegetal). A adubação foi realizada semanalmente com 10 ml em cada vaso, com os sais e vitaminas doo meio MS composição em (mg/l). A irrigação foi feita manualmente por regador diariamente de acordo com as necessidades da cultura. A coleta das folhas para a estimativa da quantidade de DNA foi obtida após 3 meses de aclimatização das mudas a partir de discos foliares, com 6 mm de diâmetro, retirados de folhas jovens totalmente expandidas. Foi utilizado como padrão interno de referência folhas jovens de ervilha Pisum sativum (2C=9,09 pg de DNA). As amostras foram trituradas em uma placa de Petri Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 3

4 contendo 1 ml de tampão Marie gelado para a obtenção da suspensão nuclear (DOLEZEL, 1997), a qual foi corada com 25 µl de iodeto de propídeo (1 mg/ml). Os histogramas foram obtidos no citômetro FacsCalibur (Becton Dickinson) com o programa Cell Quest (Becton, Dickinson) e os coeficientes de variação (CV) serão analisados no software WinMDI 2.8 (2009). Para cada amostra foram analisados núcleos sendo, aquelas com coeficiente de variação (CV) maior que 3%, foram descartadas. O delineamento estatístico utilizado foi o inteiramente casualizado com oito cultivares, seis repetições, e os dados foram submetidos análise de variância pelo teste F e as medias comparadas pelo teste de tukey a 5% de probabilidade utilizando o programa SISVAR (FERREIRA, 2003). RESULTADOS E DISCUSSÃO As cultivares de morango apresentaram conteúdo de DNA significativamente estatisticamente (Tabela 2). Na tabela 2, as médias dos coeficientes de variação (CV) obtidas foram baixas o que demonstra a qualidade dos resultados e a confiabilidade nas estimativas da quantidade de DNA, uma vez que valores de até 2% são considerados de alta qualidade (MARIE & BROW, 1993). A quantidade de DNA foi diferente apenas para a cultivar Oso Grande comparadas com as demais cultivares. Essa cultivar apresentou menor quantidade de DNA (2,36 pg) que as demais, isso pode ser devido a um menor tamanho dos cromossomos desta variedade, porém para se ter certeza é necessário fazer análises citogenéticas. Segundo SCHIFINO-WITTMANN (2001), informações sobre a quantidade de DNA nuclear das espécies auxiliam no manejo de grandes coleções de germoplasma e no controle dos níveis de ploidia em resultados de cruzamentos. Estudo futuros em caracterização do núcleo interfásico e às informações cariotípicas complementares a quantificação do DNA nuclear poderá ser um diferencial, pois pequenas diferenças na quantidade de DNA cultivares poderá torna-se possível a inferência sobre pequenos rearranjos cromossômicos que poderão não ter tamanha dimensão a ponto de influenciarem na estrutura física dos cromossomos. Na figura 1 é possível observar os histogramas de cada cultivar. O primeiro pico de cada histograma corresponde a quantidade de DNA de células da fase G1 da intéfase das cultivares de morangueiro e o segundo pico corresponde a células da fase G1 da intéfase do padrão de referência interno. Observando a média da quantidade de fluorescência de ambos os picos e comparando com o índice de DNA do padrão interno (9,09 pg de DNA) é possível obter a quantidade de DNA da amostra desejada, que neste caso é o morangueiro. Quanto menor a quantidade de DNA, mais a esquerda o Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 4

5 pico se formará. No caso da cultivar Oso Grande existe um deslocamento do pico, embora discreto, para a esquerda em relação a todas as outras cultivares (Figura 1). AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à FAPEMIG, CNPq e CAPES pela concessão de bolsas de estudos e recursos para o desenvolvimento do projeto, e a empresa Multiplanta Tecnologia Vegetal pela concessão das mudas das cultivares de morangueiro estudadas nesse trabalho.os morangos. REFERÊNCIAS BENNET, M. D.; LEITCH, I. J. Nuclear DNA amounts in angiosperms. Annals of Botany, London, v. 76, n. 2, p , Aug BRINGHURST, R,S, Cytogenetics and evolution in American. HortScience, v,25, n,8, p, , CHANDLER, C. K.; MERTELY, J. C.; PERES, N. Resistance of selected strawberry cultivars to anthracnose fruit rot and botrytis fruit rot. Acta Horticulturae, Amsterdam, v. 708, p , CRONQUIST, A, The evolution and classification of flowering plants, The New York Botanical Garden, DOLEZEL, J, Application of flow cytometry for the study of plants genomes, Journal of Applied Genetics, Olomouc, v, 38, n, 3, p, , FAEDI, W.; BARUZZI, G.; LOVATI, F.; SBRIGHI, P.; LUCCHI, P. Monografia di cultivar di fragola. Roma: Istituto Sperimentale per la Frutticoltura Roma, v.2, p. FERREIRA, D. F. Sistema Para Análise de Variância Para Dados Balanceados -SISVAR. Versão 4. 6 (build 61) Software. Lavras: Dex/UFLA, HOWARD, C.M.; ALBREGTS, E.E. 'Dover' Strawberry. HortScience, v.15, n.4, p.540, KNIGHT, C. A.; BEAULIEU, J. M. Genome Size through Phenotype Space. Annals of Botany, London, v. 101, n. 6, p , Apr MARIE, D.; BROWN, S. A cytometric exercice in plant DNA histograms, with 2C values for 70 species. Biology of the Cell, Paris, v. 78, n. 1-2, p , SCHIFINO-WITTMANN, M. T. Determinação da quantidade de DNA nuclear em plantas. Ciência Rural, Santa Maria, v. 31, n. 5, p , set Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 5

6 Tabela 1: Genitores, país de origem e ano de lançamento das cultivares de morango (Parents, country of origin and year of release of strawberry cultivars). UFLA, Lavras, Cultivar País de origem Genitores Ano Aromas USA-Califórnia Cal x Cal Campinas IAC- Brasil Donner x Tahoe Camarosa USA-Califórnia Douglas x Cal Diamante USA-Califórnia Cal x Cal Dover USA- Flórida Florida Belle x Fla Flórida USA- Flórida Rosa Linda x Oso Grande 1995 Festival Oso Grande USA-Califórnia Parker x Cal Toyonoka Japão Himiko x Harunoka 1983 Tabela 2. Médias da quantidade 2C de DNA obtida por citometria de fluxo e coeficiente de variação para as cultivares de morango. (Averages of the 2C amount of DNA obtained by flow cytometry and coefficient of variation for the strawberry cultivars). UFLA, Lavras, DNA (pg) 1 CV (%) Aromas 2.62 a 1,31 Camarosa 2.75 a 1,25 Campinas 2.81 a 1,21 Diamante 2.70 a 1,44 Dover 2.71 a 1,36 Festival 2.74 a 1,11 Oso Grande 2.36 b 1,55 Toyonoka 2.69 a 1,48 ¹ Médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente, pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade (Means followed by same letter do not differ statistically by Tukey test at 5% probability). Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 6

7 Figura 1. Histogramas de citometria de fluxo em núcleos de cultivares de morangueiro e padrão de referência interno (Ervillha -Pisum sativum) (Flow cytometry histograms of cores and strawberry cultivars internal reference standard (Ervillha-Pisum sativum). Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 7