TÍTULO: ANALISE DO ESTADO OXIDATIVO DE GLÂNDULAS PARÓTIDAS DE RATOS TRATADOS COM CLORIDRATO SIBUTRAMINA

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1 TÍTULO: ANALISE DO ESTADO OXIDATIVO DE GLÂNDULAS PARÓTIDAS DE RATOS TRATADOS COM CLORIDRATO SIBUTRAMINA CATEGORIA: CONCLUÍDO ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE SUBÁREA: Biomedicina INSTITUIÇÃO(ÕES): UNIVERSIDADE PAULISTA - UNIP AUTOR(ES): HENRIQUE ARNALDO DE OLIVEIRA ORIENTADOR(ES): ANTONIO HERNANDES CHAVES NETO COLABORADOR(ES): ANA CLAUDIA DE MELO STEVANATO NAKAMUNE, DAMARIS RAISSA DOS SANTOS, MARCO AURÉLIO GOMES, NATHÁLIA DE OLIVEIRA VISQUETTE

2 CATEGORIA CONCLUÍDO 1. RESUMO O cloridrato sibutramina (SIBU) é um fármaco antiobesidade. Disgeusia e xerostomia são os efeitos colaterais mais frequentes. Resultados demonstraram que a SIBU reduz o peso das glândulas parótidas (PA) e a atividade da alfa-amilase. O desequilíbrio do sistema de defesa antioxidante é associado com a patofisiologia de determinadas disfunções das glândulas salivares. O objetivo deste trabalho foi investigar os possíveis efeitos da SIBU no estado oxidativo e nas defesas antioxidantes enzimáticas e não-enzimáticas das glândulas PA. O trabalho foi autorizado pela CEUA da FOA UNESP (Protocolo n ). Ratos machos Wistar ( g) foram divididos em três grupos (n=8) e tratados por gavagem durante 28 dias consecutivos com 6 e 10 mg/kg de massa corpórea (m.c.) de SIBU, SIBU6 e SIBU10, respectivamente, enquanto o grupo Controle (CON) recebeu apenas o veículo. Ao final do tratamento, os ratos foram pesados, eutanasiados e as glândulas PA foram removidas, pesadas e armazenadas a -80 C. Nos homogenatos teciduais das glândulas PA foram analisadas a defesa antioxidante não-enzimática total pelo poder antioxidante por redução férrica total (FRAP), glutationa reduzida (GSH) e ácido úrico (AU) enquanto que as defesas enzimáticas foram avaliadas pelas atividades das enzimas, superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx). A análise do conteúdo das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARs) foi utilizado como marcador de danos lipídicos. Os dados foram submetidos à análise estatística ANOVA, seguida pelo teste de Tukey. Palavras-chaves: Estresse Oxidativo, Peroxidação de lipídeo, Glândula Parótida. 2. INTRODUÇÃO A obesidade é resultado da associação de diversos fatores como má alimentação, falta de atividade física e fatores psicossomais (Mancini & Halpern, 2006). Por ser uma doença metabólica, está ligada diretamente a redução da expectativa de vida, sendo um agente fundamental para o desenvolvimento de hipertensão, dislipidemia, diabetes do tipo 2, doenças cardiovasculares, apnéia obstrutiva e câncer (Heal et al., 2009; Jackson et al., 1997; Li & Cheung, 2011; Moore et al., 2005; Rajala & Scherer, 2003). 1

3 O tratamento farmacológico da obesidade é indicado para indivíduos com índice de massa corpórea maior que 27 kg/m2 e com a presença de doenças associadas ao excesso de peso (Mancini & Halpern, 2006). O cloridrato de sibutramina (SIBU) é uma droga administrada oralmente para o tratamento da obesidade a longo prazo. Ela é uma β-fenetilamina (Padwal & Majumdar, 2007) que, quando administrado em doses de 5-15 mg/dia e em conjunto com mudanças no estilo de vida, pode induzir uma significante perda de peso corpóreo de 5-10% na maioria dos pacientes obesos (Padwal & Majumdar, 2007; Schwartz et al., 2000). A habilidade da SIBU em reduzir o peso corpóreo pode ser explicada por várias razões: a) o efeito mais bem descrito é a inibição seletiva da recaptação présináptica dos neurotransmissores monoaminérgico serotonina (5-hidroxitriptamina; 5- HT), noradrenalina e, em menor grau, dopamina, ao nível de SNC, acentuando a ação supressora de apetite destes neurotransmissores (Williams, 2010); b) aumenta neuropeptídios anorexígenos e reduz a liberação de neuropeptídeos orexígenos no núcleo arqueado; c) estimula a termogênese através da ativação de receptores adrenérgicos β3 no tecido adiposo branco (Bray & Greenway, 1999) e marrom (Connoley et al., 1999). Os efeitos colaterais da SIBU são associados com a sua estimulação noradrenérgica dos circuitos hipotalâmicos de apetite e com as suas propriedades inerentes simpaticomiméticos. Os mais comuns são dores de cabeça, insônia, astenia, obstipação, amnésia, aumento da pressão arterial sistólica e/ou diastólica e frequência cardíaca (Bray et al., 1999a; Schwartz et al., 2000; Fu et al., 2010; Williams, 2010; Siebenhofer et al., 2016). Os organismos vivos possuem um amplo sistema de defesa antioxidante, que incluem componentes enzimáticos, como a superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), tioredoxina redutase e não enzimáticos, como as vitaminas (A, E C), carotenoides, proteínas, lipídeos, glutationa reduzida (GSH), albumina, entre outros (Halliwell, 2007). As enzimas estão diretamente envolvidas na neutralização dos radicais livres, e o sistema antioxidante enzimático está predominantemente presente no meio intracelular (Vasconcelos et al., 2006; Valko et al., 2007). A SIBU também tem demonstrado provocar distúrbios relacionados ao estado oxidativo corpóreo. O estresse oxidativo em glândulas PA de ratos com diabetes induzido por estreptozotocina foi caracterizado pelo aumento da atividade da SOD e GPx e um 2

4 aumento concomitante do dano celular, evidenciado pelo aumento da concentração de TBARs (Deconte et al., 2011). Em contrapartida, Campos et al. (2005) demonstraram que as glândulas PA são mais vulneráveis ao estresse oxidativo gerado pelo consumo de etanol, como observado pelo aumento de TBARs e da atividade de SOD e GPx. 3. OBJETIVOS O propósito deste trabalho foi investigar os possíveis efeitos da SIBU no estado oxidativo e nas defesas antioxidantes enzimáticas, determinada pela atividade das enzimas SOD, CAT e GPx e, não-enzimáticas avaliadas pelas concentrações de FRAP, GSH e AU. A análise de TBARs foi utilizada como marcador de dano oxidativo lipídico das glândulas PA. 4. METODOLOGIA 4.1. Manejo e tratamento dos animais Foram utilizados ratos machos Wistar (Rattus novergicus albinus) de semanas ( g) de idade, provenientes do Biotério Central da Faculdade de Odontologia de Araçatuba FOA/UNESP. Os animais foram mantidos em gaiolas (quatro/gaiola), no Biotério do Departamento de Ciências Básicas, com temperatura de 21 ± 3 ºC, ciclo de claro/escuro de 12 horas e umidade relativa do ar entre 60 ± 5%. Água e ração comercial padrão (Labina Purina, Brasil) foram disponibilizadas à vontade, durante todo o período e também durante a adaptação ao biotério (10 dias). O tratamento foi realizado de acordo com o protocolo adaptado proposto por (Bellentani et al., 2011; Francia-Farje et al., 2010). Os animais foram tratados com 6 e 10 mg/kg/dia de SIBU (SIBU6 e SIBU10), diluída em dimetilsufóxido (DMSO) e solução salina (60 mg SIBU/ 1 ml DMSO/ 2 ml solução salina) através de gavagem (via oral) por 28 dias consecutivos. Cada grupo tratado com 8 animais. Os respectivos controles (CON) (n = 8) receberam somente o veículo (1 ml DMSO/ 2 ml solução salina) à uma dose de 0,17 ml DMSO/kg Consumo alimentar e peso corpóreo O consumo alimentar foi acompanhado e calculado a cada 2 dias durante todo o período experimental, no mesmo horário, sendo representado pela diferença, em gramas, entre o alimento oferecido e o residual. O rejeito sujo foi considerado o alimento que não foi ingerido na área interna do comedouro, e o 3

5 rejeito limpo, o alimento que não foi ingerido e permaneceu na área externa (Vadivel & Pugalenthi, 2010). A pesagem dos ratos foi realizada nos mesmos momentos em que foi determinado o consumo alimentar Eutanásia e obtenção das amostras Os animais foram eutanasiados através da exsanguinação por punção cardíaca com o animal sob efeitos de anestesia geral (cetamina 100 mg/kg de peso corpóreo e xilazina 10 mg/kg de peso corpóreo, intraperitoneal) de acordo com as Diretrizes da Prática de Eutanásia (Brasília/2015) do CONCEA. Após a eutanásia dos animais, as glândulas PA foram imediatamente removidas, limpas de tecido aderente, pesadas e fracionadas em tubos cônicos de 0,5 ml. Na sequência foram congeladas em nitrogênio líquido, e em seguida conservadas em freezer a -80 C até o momento das análises. O sangue obtido na exsanguinação foi transferido para tubo heparinizado, centrifugado (1000 x g, 15 min, 4 C em centrifuga 5810Rrotor S-4-104, Eppendorf, USA) para obtenção do plasma, que foi armazenado em freezer -80 C Preparação do homogenato das glândulas parótidas As glândulas salivares foram homogeneizadas a 10% em tampão fosfato 50 mmol/l ph 7,4 e o homogenato centrifugado a 4000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi utilizado em todos os ensaios bioquímicos deste trabalho Determinação do conteúdo tecidual de TBARs Alíquotas de 200 μl do homogenato foram adicionadas a 400 ul de solução de ácido tiobarbitúrico (0,67%) em meio fortemente ácido (ácido tricloroacético a 15% e ácido clorídrico 0,25 mol/l) e então incubadas a 90 C durante 45 minutos (Bird & Draper, 1984). As amostras foram centrifugadas durante 5 minutos a x g, e 300 μl e pipetadas para a leitura de ELISA dos valores de absorbância a 532 nm (corrigidos pelos valores de absorbância a 600 nm). Foi calculado nmol de aldeído formado por mg de proteína (Bose et al., 1989) utilizando-se para o cálculo um coeficiente de extinção molar de 1,55 x 105 M-1 cm Capacidade antioxidante total plasmática A capacidade antioxidante total plasmática foi determinada pelo poder antioxidante por redução férrica total ou ferric reducing antioxidante power (FRAP) através do método descrito por Benzie & Strain (1996). A absorbância foi estimada a 595 nm e os resultados expressos em mmol/l, utilizando uma curva padrão de sulfato ferroso. 4

6 4.7. Determinação dos níveis de GSH Para determinar a GSH foi empregado o método enzimático de Tietze, modificado por Akerboom e Sies (1981). O ensaio enzimático de 2 minutos foi realizado em tampão fosfato de potássio 100 mmol/l, EDTA 1 mmol/l, ph 7,0, contendo 0,2 mmol/l de fosfato de dinucleótido de nicotinamida e adenina (NADPH) e 0,1 mmol/l de ácido 5,5-ditio-bis-2-nitrobenzoico (DTNB). Como iniciador da reação utilizamos glutationa redutase a 0,25 U/mL. As quantificações dos níveis de GSH foi baseada na curva padrão de GSH realizada no momento da leitura Determinação da concentração da AU A concentração tecidual de AU foi avaliado utilizando kit comercial da marca Labtest, baseado no método enzimático de Trinder (Trivedi et al., 1978) Avaliação da atividade da SOD A atividade da SOD foi determinada colorimetricamente pelo grau de inibição da auto-oxidação de 0,2 mmol/l de pirugalol em 50 mmol/l de tampão Tris-HCL, ph 8,2, equilibrado com o ar contendo 1mmol/L de EDTA. A taxa de auto-oxidação foi monitorada a 420 nm (Marklund & Marklund, 1974; Das & Mukherjee, 2010). A inibição da auto-oxidação foi iniciada pela adição do homogenato da glândula parótida. Os resultados foram expressos como % de inibição normalizada pela concentração de proteína total Avaliação da atividade da CAT A atividade da CAT foi determinada seguindo o método de (Aebi, 1984) o qual se baseia no acompanhamento da decomposição do H 2 O 2 por 3 minutos a 240 nm espectrofotometricamente (ε240 = 43,6 mm-1 cm-1). O meio de reação foi composto de tampão fosfato 50 mmol/l ph 7,2 e amostra. A reação foi iniciada através da adição de 10 mmol/l de H 2 O 2. Os valores foram expressos como nmol H 2 O 2 consumido/minuto/mg de proteína total Avaliação da atividade da GPx As glândulas salivares foram homogeneizadas a 10% em tampão fosfato 50 mmol/l ph 7,4 e o homogenato centrifugado a 4000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi utilizado no ensaio. A atividade da GPx foi determinada pelo método de Wendel [1981] e Flohé & Günzler, [1984] que utilizam o peróxido de diterc-butila como substrato da reação, ocorrendo oxidação da GSH pela GPx gerando GSSG, que é convertido em GSH pela glutationa redutase (GR), 5

7 M a s s a c o rp ó re a fin a l (g ra m a s ) consumindo nessa reação uma molécula de NADPH, a qual pode ser acompanhada em espectrofotômetro a 340 nm. O meio de reação foi composto de tampão fosfato 50 mmol/l ph 7,0, EDTA 1,0 mmol/l, GR 0,1 U/mL, GSH 1 mmol/l e NADPH 0,2 mmoll. A reação foi iniciada com a adição de peróxido de di-tercbutila 0,5 mmol/l e acompanhada durante 5 minutos (ε340 = 6,22 x 103 mm-1 cm- 1). 5. DESENVOLVIMENTO O protocolo experimental foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais CEUA da FOA/UNESP (Processo FOA n ). Os dados foram expressos como média ± desvio padrão da média e submetidos às análises estatísticas utilizando a análise de variância (ANOVA) de uma via, seguido pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. O nível de significância foi estabelecido em 5% (p < 0,05). 6. RESULTADOS Os grupos SIBU6 e SIBU10 apresentaram massa corpórea 8,6 (p < 0,05) e 9,6% (p < 0,05) inferiores ao grupo CON que recebeu solução salina (1 ml DMSO/ 2 ml solução salina), respectivamente, após 28 dias de tratamento (Figura 1) C o n tr o le S IB U 6 S IB U 1 0 Figura 1. Efeito da SIBU na m.c final de ratos machos Wistar após 28 dias de tratamento com SIBU a 6 mg/kg m.c. (SIBU6) e 10 mg/kg m.c. (SIBU10). O grupo CON recebeu somente o veículo (1 ml DMSO/2 ml solução salina). Os dados foram expressos como média ± desvio padrão da média e submetidos as análises estatísticas utilizando a análise de variância (ANOVA) de uma via, seguido pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. O nível de significância foi estabelecido em 5% (p < 0,05): p < 0,05. 6

8 Os ratos dos grupos SIBU6 e SIBU10 perderam m.c. na primeira semana de administração da SIBU, entretanto a partir do 8º dia de tratamento os animais retornaram a ter ganho de m.c., porém a proporção deste ganho de massa corpórea manteve inferior ao grupo CON durante todo o período e tratamento (Figura 2). Figura 2. Efeito da SIBU na variação da m.c. de ratos machos Wistar após 28 dias de tratamento com SIBU a 6 mg/kg m.c. (SIBU6) e 10 mg/kg m.c. (SIBU10). O grupo CON recebeu somente o veículo (1 ml DMSO/2 ml solução salina). Os dados foram expressos como média ± desvio padrão da média e submetidos às análises estatísticas utilizando a análise de variância (ANOVA) de uma via, seguido pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. O nível de significância foi estabelecido em 5% (p < 0,05): versus CON. A ingestão de ração foi menor nos ratos tratados com SIBU durante todo o período experimental, embora esta redução da ingesta foi mais acentuada e estatisticamente significante nas duas primeiras semanas de tratamento (Figura 3). Figura 3. Efeito da SIBU na ingestão de ração de ratos machos Wistar após 28 dias de tratamento com SIBU a 6 mg/kg m.c. (SIBU6) e 10 mg/kg m.c. (SIBU10). O grupo CON recebeu somente o veículo (1 ml DMSO/2 ml solução salina). Os dados foram expressos como média ± desvio padrão da média e submetidos as análises estatísticas utilizando a análise de variância (ANOVA) de uma via, seguido pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. O nível de significância foi estabelecido em 5% (p < 0,05): versus CON. Ambos os grupos aumentaram o dano oxidativo lipídico como observado pelas concentrações de TBARs (SIBU6, 50%, p < 0,01; SIBU10, 75%, p < 0,001) em relação ao grupo CON (Figura 4). 7

9 F R A P (m m o l F e + 2 /m g d e p r o te ín a to ta l) C o n c e n tr a ç ã o d e G S H (n m o l/g d e p ro te ín a to ta l) N ív e is d e A U (m g /g d e p ro te ín a to ta l) C o n c e n tr a ç ã o d e T B A R S (n m o l/m g d e p ro te ín a to ta l) Figura 4. Efeito da SIBU na concentração de TBARs nas glândulas PA de ratos machos Wistar após 28 dias de tratamento com SIBU a 6 mg/kg m.c. (SIBU6) e 10 mg/kg m.c. (SIBU10). O grupo CON recebeu somente o veículo (1 ml DMSO/2 ml solução salina). Os dados foram expressos como média ± desvio padrão da média e submetidos às análises estatísticas utilizando a análise de variância (ANOVA) de uma via, seguido pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. O nível de significância foi estabelecido em 5% (p < 0,05): p < 0,01, p < 0,001. Em contrapartida, ambas as doses de SIBU apresentaram decaimento na capacidade antioxidante não-enzimática: FRAP (SIBU6, 25%, p < 0,05; SIBU10, 25%, p < 0,05) (Figura 5A), GSH (SIBU6, 54%, p < 0,05; SIBU10, 86%, p < 0,01) (Figura 5B) e AU (SIBU6, 16%, p < 0,05; SIBU10, 17%, p < 0,05) (Figura 5C) comparados ao grupo CON. A B C Figura 5. Efeito da SIBU na atividade de capacidade antioxidante não-enzimática (A) FRAP; (B) GSH; (C) AU FRAP nas glândulas PA de ratos machos Wistar após 28 dias de tratamento com SIBU a 6 mg/kg m.c. (SIBU6) e 10 mg/kg m.c. (SIBU10). O grupo CON recebeu somente o veículo (1 ml DMSO/2 ml solução salina). Os dados foram expressos como média ± desvio padrão da média e submetidos as análises estatísticas utilizando a análise de variância (ANOVA) de uma via, seguido pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. O nível de significância foi estabelecido em 5% (p < 0,05): p < 0,05, p < 0,01, p < 0,001. Além do mais, o tratamento crônico com ambas doses de SIBU, reduziram significantemente a capacidade antioxidante enzimática como observado na atividade da SOD (SIBU6, 35%, p < 0,05; SIBU10, 45%, p < 0,01) (Figura 6A), CAT (SIBU6, 25%, p < 0,01; SIBU10, 24%, p < 0,05) (Figura 6B) e GPx (SIBU6, 25%, p < 0,05; SIBU10, 31%, p < 0,01) (Figura 6C) quando contraposto ao grupo CON. 8

10 A tiv id a d e d a S O D % d e in ib iç ã o / m g d e p ro te ín a to ta l A tiv id a d e d a C A T (n m o l H 2 O 2 /m g d e p r o te ín a to ta l) A tiv id a d e d a G P x (n m o l/m in /g d e p ro te ín a to ta l) A B C Figura 6: Efeito da SIBU na atividade da SOD (A), CAT (B) e GPx (C) nas glândulas PA de ratos machos Wistar após 28 dias de tratamento com SIBU a 6 mg/kg m.c. (SIBU6) e 10 mg/kg m.c. (SIBU10). O grupo CON recebeu somente o veículo (1 ml DMSO/2 ml solução salina). Os dados foram expressos como média ± desvio padrão da média e submetidos as análises estatísticas utilizando a análise de variância (ANOVA) de uma via, seguido pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. O nível de significância foi estabelecido em 5% (p < 0,05): p < 0,05, p < 0,01, p < 0, CONSIDERAÇÕES FINAIS O desequilíbrio do sistema de defesa antioxidante diante de diferentes tipos de estresse é associado ao mecanismo patofisiológico das disfunções das glândulas salivares. Semelhante ao observado no modelo de diabetes induzido por estreptozotocina (Ibuki et al., 2010; Deconte et al., 2011; Zalewska et al., 2015) constatamos o aumento do dano oxidativo lipídico e a redução do estado antioxidante total e dos níveis de AU no homogenato das glândulas PA. Em contrapartida, diferente do modelo de diabetes experimental, os tratamentos com SIBU reduziram as atividades das enzimas antioxidantes SOD, CAT e GPX (Ibuki et al., 2010; Deconte et al., 2011; Zalewska et al., 2015). Logo, pode-se deduzir que as mudanças no estado oxidativo nas glândulas dependem do tipo e intensidade do agente estressante. Por sua vez, a perda de peso induzida por SIBU em ratos machos e fêmeas da linhagem Wistar foi associada com redução do estresse oxidativo em regiões do cérebro, como observado por meio da diminuição de TBARs e ao aumento dos níveis de GSH (Guzmán et al., 2012). Os resultados apontam que os efeitos biológicos da SIBU são dependentes das características de cada tecido. Dessa forma, concluímos que a disfunção da glândula PA induzido pelo tratamento crônico com SIBU está relacionado, pelo menos em parte, com a redução das defesas antioxidantes enzimáticas e não-enzimáticas. 9

11 8. FONTES CONSULTADAS 1. Aebi H, et al. Methods Enzymol. 1984;105: Aebi H, et al. Methods Enzymol. 1984;105: Benzie IF & Strain JJ. Anal Biochem Jul; 15;239(1): Bird RP & Draper HH. Methods Enzymol. 1984;105: Bose R, Sutherland GR, Pinsky C. Neurochem Res Mar;14(3): Bray GA & Greenway FL. Endocr Rev Dec; 20: Campos SC et al. Arch Oral Biol Jul;50(7): Connoley IP, et al. Br J Pharmacol Mar; 126: Deconte SR, et al. Arch Oral Biol Aug; 56: Flohé L, Günzler WA Methods Enzymol 105: Guzmán DC, et al. Basic Clin Pharmacol Toxicol May; 110: Guzmán DC, et al. Horm Metab Res May; 41: Halliwell B. Biochem Soc Trans Nov; 35: Heal DJ, et al. Br J Clin Pharmacol Dec; 68: Ibuki, F. K.; et al. Cell Biochem Funct Jackson HC, et al. Br J Pharmacol Aug; 121: Mancini MC & Halpern A. Arq Bras Endocrinol Metabol 2006; 50: Marklund S & Marklund L. Eur J Biochem Sep 16;47(3): Padwal RS & Majumdar SR. Lancet Jan; 369: Rajala MW & Scherer PE. Endocrinology Sep; 144: Schwartz MW, et al Nature 404: Trivedi RC, et al. Clin Chem Nov;24(11): Valko M, et al. Int J Biochem Cell Biol. 2007; 39 (1): Vasconcelos et al. Quim. Nova v.30, n.5, p Wendel A Methods Enzymol 77: Williams G. BMJ 2010 Feb; 340:c Zalewska A, et al. Arch Oral Biol Sep;60(9):