Crescimento in vitro de Schomburgkia gloriosa Lindl. em meio de cultivo simplificados

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1 Volumen 30, Nº 2. Páginas IDESIA (Chile) Mayo-Agosto, 2012 Crescimento in vitro de Schomburgkia gloriosa Lindl. em meio de cultivo simplificados In vitro growth of Schomburgkia gloriosa Lindl. using simplified culture media Laiz Fernanda Dezan 1, Fernanda Canassa 1, Thiago de Souza-Leal 1, José Alberto Diogo 2, Raquel Massaro 3, Germana Marcelino Cordeiro 4, Cristiano Pedroso-de-Moraes 5* RESUMO Uma das formas de aumentar a produção de mudas com qualidade genética e conservar espécies de orquídeas ameaçadas de extinção tem sido a propagação in vitro. Diferentes formulações de meios de cultura têm sido desenvolvidas na tentativa de se obter meios eficazes e de protocolo simplificado, a fim de se produzir plantas com qualidade e custo reduzido. Considerando a importância da conservação de espécies de orquídeas e a obtenção de plantas com qualidade e menor custo, este trabalho teve como objetivo realizar a propagação in vitro de Schomburgkia gloriosa utilizando os meios de cultura simplificados. Para tal, foi realizado um experimento em delineamento inteiramente casualizado no qual sementes foram inoculadas em meio MS com metade da concentração de macro-nutrientes e outros dois meios à base dos fertilizantes Hyponex e Kristalon laranja. Após 180 dias de experimento, verificou-se que o meio de cultura que proporcionou maior eficiência no desenvolvimento in vitro de sementes foi o MS, composto por metade da concentração de macronutrientes, pois apresentou os maiores valores médios para as variáveis: altura da planta, peso da matéria fresca e comprimento da maior raiz e folha. Além deste meio de cultura ser mais eficiente, sua utilização reduz custos, o que pode viabilizar tanto a produção de mudas com finalidade comercial quanto ecológica. Palavras-chave: orquídea, ornamental, propagação, agronegócio. ABSTRACT One of the ways to increase the production of plants with good genetic quality and conserve orchid species in danger of extinction has been the in vivo propagation. Different culture media have been developed to obtain more efficient results and simplified protocols in an attempt to obtain quality plants at low cost. In consideration of the above and the importance of species conservation, the objective of this study was to develop in vivo propagation of Schomburgkia gloriosa with simplified culture medium. The experimental design was completely randomized, in which seeds were grown in MS medium with half concentration of macronutrients and two other media based on Hyponex and Kristalon laranja. The results after 180 days showed that the MS medium composed of half concentration of macronutrients produced the best in vitro results to seeds, since it produced the greatest plant height, plant fresh weight and length of roots and leaves. As well as being the most efficient, the use of this medium reduces costs, thus it is a viable alternative for production of plantlets with both commercial and ecological ends. Key words: orchid, ornamental, propagation, agribusiness. 1 Alunos de Iniciação Científica do Centro Universitário Hermínio Ometto Uniararas. Av. Maximiliano Baruto, 500. CEP: Araras, SP. Brasil. 2 Aluno do Curso de Bacharelado em Ciências Biológicas Unicamp. Cidade Universitária Zeferino Vaz Distrito de Barão Geraldo, CEP: Campinas, SP., Brasil. 3 Mestranda do Departamento de Biotecnologia UFSCAR. Rodovia Washington Luís, km 235, 310, CEP: São Carlos, SP., Brasil. 4 Mestranda do Departamento de Ciências Biológicas Fisiologia e Bioquímica de Plantas ESALQ/USP, Piracicaba, Caixa Postal 199, CEP , Piracicaba, SP., Brasil. 5 Docente do Centro Universitário Hermínio Ometto Uniararas. Av. Maximiliano Baruto, 500. CEP: Araras, SP. Brasil. Pós-Doutorando do Departamento de Biologia. Universidade de Aveiro, CEP: , Aveiro, AV., Portugal. * Autor para correspondência: pedroso@uniararas.br Fecha de Recepción: 22 Diciembre, Fecha de Aceptación: 30 Mayo, 2012.

2 54 IDESIA (Chile) Volumen 30, Nº 2, Mayo-Agosto, 2012 Introdução Orchidaceae compreende aproximadamente 780 gêneros e espécies, apresentando-se como uma das maiores famílias de angiospermas (Pridgeon et al., 2009). No Brasil são encontradas espécies e aproximadamente 200 gêneros (Barros, 1990, Dressler, 2005; Souza e Lorenzi, 2005, Campos, 2008). Estas são consideradas as plantas ornamentais mais apreciadas economicamente (Sheehan, 1992, Colombo et al., 2004), contudo, muitos representantes da família vêm sendo dizimados levando a um empobrecimento gradativo da biodiversidade nacional (Menezes, 1985, 1987, Carneiro et al., 2001). O gênero Schomburgkia Lindl. é composto por cerca de 18 espécies de orquídeas, geralmente epífitas, encontradas na América Tropical e no Oeste da Índia. A distribuição geográfica do gênero estende-se do sul do México através da América Central e as ilhas do Oeste Indiano para a porção norte da América do Sul. Seus representantes vegetam em regiões úmidas, em elevações de 100 a 1000 metros, normalmente em matas úmidas margeando lagos, rios ou riachos, com luminosidade na faixa de intensidade de 400 a 800 µmol.m 2.s 1. (Jones, 1973). Schomburgkia gloriosa Lindl., apresenta grandes pseudobulbos fusiformes com 2-4 folhas longas e estreitas separadas por distintos inter-nós pequenos; raízes finas, muitas vezes surpreendentemente fracas em proporção ao grande porte vegetativo; inflorescência terminal sempre ereta, geralmente ramificada na cúpula com 5-15 flores que apresentam pétalas e sépalas onduladas e marrons; o labelo é estreito e de coloração roxo-claro (Jones, 1966). Uma das formas de aumentar a produção de mudas da espécie com qualidade genética, reduzindo dessa forma os extrativismos é a semeadura in vitro (Pedroso-de-Moraes, 2000, Stancato et al., 2001, Martini, 2001). Entretanto, as técnicas existentes para germinação in vitro necessitam de aperfeiçoamento, pois a resposta às condições do cultivo in vitro varia fortemente entre gêneros, espécies e até mesmo plantas de um mesmo genótipo cultivadas sob diferentes condições ambientais. Além disso, plantas que sofrem alterações anuais ou mesmo diárias de fatores climáticos, parecem exibir ritmos fisiológicos endógenos que podem se tornar críticos para o estabelecimento da cultura (Arditti e Ernst, 1992). Não há meio de cultura específico adequado às exigências de gêneros, espécies e clones. Em geral, é difícil compreender o motivo pelo qual certas combinações de meio e condições de cultivo obtém sucesso e outras fracassam (Ventura et al., 2002). Estudos in vitro com orquídeas demonstram que a diminuição de custos é possível pela simplificação dos meios de cultura atuais, principalmente pelo emprego de fertilizantes como base de meios de cultura, visando à produção em larga escala de representantes de Orchidaceae que requerem condições de cultivo específicas (Stancato et al., 2001, Pedroso-de-Moraes et al., 2009a, b). Considerando a importância da conservação de espécies de orquídeas e a obtenção de plantas com qualidade e menor custo, este trabalho teve como objetivo avaliar o crescimento de plântulas in vitro de Schomburgkia gloriosa Lindl. em meio de cultura simplificados. Materiais e Métodos Para a realização do trabalho, cinco flores de diferentes indivíduos de Schomburgkia gloriosa Lindl. foram autopolinizadas artificialmente em setembro de Seis meses após a autopolinização, foram coletadas sementes dos frutos maduros, as quais foram levadas ao Laboratório de Botânica e Estudos Ambientais do Centro Universitário Hermínio Ometto Uniararas, situado no município de Araras, São Paulo, Brasil. Foram preparados três tipos de meios de cultura, sendo o primeiro constituído da metade da concentração de macronutrientes do meio MS (Murashige e Skoog, 1962), o qual foi usado como controle, e os outros dois meios constituídos de Hyponex Scotts (NPK 6,5-9-19) ou Kristalon laranja Yara (NPK ) a 2 g.l 1, acrescidos de 1 g.l 1 de carvão ativado, 30 g.l 1 de sacarose com ph ajustado para ph 5,8 antes da adição de 7 g.l 1 de agar-banana. Logo após, 50 ml de cada meio de cultura foram vertidos em quatro frascos de 250 ml e esterilizados em autoclave a 121 C e 1 atm de pressão durante 20 minutos (Arditti e Ernst, 1992). Para a desinfestação das sementes, optou-se pela utilização de hipoclorito de sódio a 5%, as quais foram submetidas à agitação na solução durante cinco minutos, em tubos para centrífuga. Posteriormente, os tubos foram mergulhados em álcool 70% e levados à câmara de fluxo laminar, onde as sementes foram lavadas quatro vezes com

3 Crescimento in vitro de Schomburgkia gloriosa Lindl. em meio de cultivo simplificados 55 água destilada e depositadas nos frascos contendo os meios de cultura. Foram semeados quatro frascos por tratamentos, sendo inoculadas, por recipiente, 1g de sementes. Os frascos semeados foram fechados com tampa plástica transparente ou metálica e mantidos durante 180 dias em câmara climática (B.O.D. MA 403), à temperatura constante de 25ºC, sob fotoperíodo de 12 horas e intensidade luminosa de aproximadamente 116 µmol.m 2.s 1. Foram avaliados o número de raízes (NR), o comprimento total da plântula (CTP), da maior raiz (CMR) e da maior folha (CMF), a massa fresca total (MFT) e a massa seca total (MST), obtida colocando-se o material em temperatura de 65ºC até atingir a massa seca constate. As medidas foram obtidas utilizando-se paquímetro digital e balança analítica. Para a análise estatística dos dados foi utilizada ANOVA e em seguida as médias foram submetidas ao teste de Tukey (a= 0,05) utilizando o aplicativo BioEstat 5. Resultados e Discussão Plântulas de Schomburgkia gloriosa cultivadas em meio de cultura MS composto por metade da concentração de macro-nutrientes apresentaram as maiores médias para todas as variáveis analisadas. O meio à base do fertilizante Hyponex apresentou resultado igual ao MS na variável Número de Raízes (NR) e o meio com Krystalon Laranja obteve, juntamente com o meio MS, melhores valores para Massa Seca Total (MST) (Tab. 1). Assim como no presente estudo, ensaios com a espécie Cattleya cinnabarina van den Berg, obtiveram plantas mais vigorosas quando cultivadas em meio de cultura MS composto com a metade dos macronutrientes da formulação original (Stancato e Faria, 1996). Da mesma forma, estudos com a espécie Catasetum fimbriatum Lindl., obtiveram maior formação de número de raízes em meio MS modificado com a metade dos macronutrientes e com o meio à base de adubo NPK (Oliveira e Faria, 2005). Ainda, reduções em 1/2, 1/3 ou 1/4 na concentração dos sais de macronutrientes do referido meio de cultura, possibilitaram melhor enraizamento in vitro de Rubus sp. (Dantas et al., 2000). Tais resultados corroboram com a afirmação de George e Sherrington (1984) a respeito da possibilidade de reduzir a concentração de sais do meio MS, para diversas espécies, visando melhor desenvolvimento das plantas e redução nos custos. O fato do meio de cultura MS ser rico em macronutrientes, micronutrientes, vitaminas e aminoácidos, enquanto os fertilizantes comerciais apresentam apenas nitrogênio, fósforo e potássio, influenciou no desenvolvimento das plântulas, levando a hipótese de que S. gloriosa tem uma maior necessidade desses nutrientes frente a outras espécies de orquídeas. Tal afirmação é confirmada pelos melhores resultados encontrados para Cattleya loddigesii Lindl. e Cattleya tigrina A. Rich., respectivamente, quando Krystalon laranja e Hyponex foram utilizados nas mesmas condições experimentais (Pedroso-de-Moraes et al., 2009a, b). Com relação a tais resultados, é válido salientar que as interações entre nutrientes modulam o crescimento de plantas, sendo que, a disponibilidade de água e o suprimento adequado de nitrogênio exercem importância particular (Marschner, 1995). Tabela 1: Valores médios para comprimento total da plântula (CTP), número de raízes (NR), massa fresca total (MFT), massa seca total (MST), comprimento da maior raiz (CMR) e comprimento da maior folha (CMF) de Schomburgkia gloriosa Lindl. após 180 dias de cultivo in vitro nos meios de cultura ½ MS, Hyponex (HY) e Kristalon laranja (KR). CV = Coeficiente de Variação. Meios de Cultura CTP (cm) NR Variáveis Avaliadas MFT (g) MS 3.40 A A 0.70 A 0.20 A 2.6 A 1.53 A HY 1.54 C 3.00 A 0.50 C 0.16 B 1.3 C 0.66 C KR 2.70 B 1.81 B 0.60 B 0.21 A 2.2 B 1.25 B MST (g) CMR (cm) CV % CMF (cm) 1 Médias seguidas de letras iguais, na mesma coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5 % de significância.

4 56 IDESIA (Chile) Volumen 30, Nº 2, Mayo-Agosto, 2012 Em estudos com as orquídeas Brassavola perrinii Lindl. e Cattleya forbesii Lindl. X Brassavola perrinii Lindl., foram obtidos bons resultados para o crescimento das plântulas em meio MS e meio contendo fertilizante Hyponex acrescidos de 20 g.l 1 de polpa de banana. Tais resultados foram atribuídos aos altos teores de potássio e fósforo encontrados na polpa do fruto partenocárpico (Vidoz et al., 1999). Tal constatação corrobora com experimentos in vitro realizados para várias culturas, os quais têm demonstrado que a polpa da banana é o melhor suplemento para a diferenciação de órgãos e promotor do crescimento de raízes e folhas (Arditti, 1968, Valmayor e Price, 1970, Arditti, 1992, Caldas et al., 1998). Assim, pode-se inferir que a adição de 7 g.l 1 de ágar-banana no meio de cultivo contendo fertilizante Hyponex foi fundamental para se obter o mesmo número de raízes que as plântulas cultivadas em meio MS, uma vez que, o emprego desse composto proporciona melhora no desenvolvimento de plântulas, permitindo maior vigor e crescimento durante essa fase (Reinert e Mohr,1967). Em relação ao meio de cultivo a base do fertilizante Krystalon laranja, mesmo com o acréscimo de ágar-banana, obteve-se o mesmo valor de massa seca total que o meio MS reduzido pelo fato de existirem quantidades equivalentes de sais nitrogenados nesses dois meios. O meio MS completo não tem se mostrado satisfatório para algumas espécies, como no caso da germinação de sementes de mangabeira, em que foi obtida maior germinabilidade em meio nutritivo MS/2 em relação ao meio MS completo. Tais resultados são devidos à diminuição do potencial osmótico promovido pela redução das concentrações de macro e micronutrientes do referido meio (Grattapaglia e Machado, 1990). Além disso, os meios com formulações básicas diluídas para 50% têm possibilitado melhor enraizamento, como por exemplo, de macieiras cultivadas in vitro (Skriskandarajah e Mullins, 1981, Zimmerman e Broome, 1981, Zimmerman e Fordham, 1985, Damiano et al., 1991), simplesmente pelo fato do crescimento radicial ser afetado por altas concentrações de sais, que inibem o desenvolvimento das brotações (Caldas et al., 1990). Com isso, pode-se inferir que as baixas concentrações de sais minerais foram essenciais para a espécie em estudo na medida em que proporcionaram, em geral, maior crescimento, enfatizando dados da literatura que comprovam a baixa demanda por nutrientes minerais que as orquídeas epífitas exibem (Arditti, 1992, Knudson, 1946). Tal hipótese é reforçada pelo fato de espécies de orquídeas cultivadas in vitro necessitarem de baixa concentração de sais minerais no meio de cultura (Pedroso-de-Moraes et al., 2009a, Pedroso-de- Moraes et al., 2009b, Cordeiro et al., 2011, Cunha et al., 2011), uma vez que vivem em ambientes com baixa disponibilidade de nutrientes (Stancato, 2008). Os resultados encontrados confirmam que o meio de cultura ideal deve ser determinado utilizando fórmulas nutritivas mais adequadas para otimizar a qualidade das plantas produzidas in vitro (Oliveira e Faria, 2005). Conclusões O meio de cultura MS com metade da concentração de macronutrientes é o mais adequado para o desenvolvimento in vitro de plântulas de Schomburgkia gloriosa Lindl. Os meios de cultivo simplificados compostos pelos fertilizantes Krystalon laranja e Hyponex não se apresentaram satisfatórios para o crescimento in vitro da espécie. Literatura Citada Arditti, J Germination and growth of orchids on banana fruit tissue and some of its extracts. American Orchid Society Bulletin, West Palm Beach, v. 37, pp Arditti, J.; Ernest, R Micropropagation of orchids. New York: John Wiley & Sons, 682p. Barros, F Diversidade taxonômica e distribuição geográfica das Orchidaceae brasileiras. Acta Botanica Brasilica, v. 4, p Caldas, L.S.; Haridasan, P.; Ferreira, M.E Meios nutritivos. In: Torres, A.C.; Caldas, L.S. (Eds.). Técnicas e aplicações da cultura de tecidos de plantas. Brasília: ABCTP/Embrapa-CBPH, pp Caldas, L.S.; Haridasan, P.; Ferreira, M.E Meios nutritivos. In: Torres, A.C.; Caldas L.S.; Buso J.A. (Ed.). Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: EMBRAPA-SPI, v. 1, pp Campos, F.A.D.B Considerações sobre a Família Orquidaceae: taxonomia, antropismo, valor econômico e tecnologia. O mundo da saúde, v. 32, pp

5 Crescimento in vitro de Schomburgkia gloriosa Lindl. em meio de cultivo simplificados 57 Carneiro, M.F.; Carneio, R.I.F.; Oliveira, S.A.; Leite Júnior, C.B.; Pacheco, R.A.; Souza, M.M.; Ramos, T.V Bromélias e orquídeas na região dos Cerrados Dados preliminares. In: Congresso Brasileiro de Floricultura e Plantas Ornamentais,13.; 2001, São Paulo. Anais... Sociedade Brasileira de Floricultura e Plantas Ornamentais. p. 13. Colombo, L.A.; Faria, R.T.; Carvalho, J.F.R.P.; Assis, A.M.; Fonseca, I.C.B Influência do fungicida clorotalonil no desenvolvimento vegetativo e no enraizamento in vitro de duas espécies de orquídeas brasileiras. Maringá. Acta Scientiarum, pp , Cordeiro, G.M.; Pedroso-de-Moraes, C.; Massaro, R.; Cunha, T Desenvolvimento in vitro de Cattleya amethystoglossa Lindley X (Cattleya dupreana X Laelia purpurata Lindley) em diferentes meio de cultura. 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