AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO ULTRA-SOM NA CICATRIZAÇÃO MUSCULAR ATRAVÉS DE PARÂMETROS DE ESTRESSE OXIDATIVO EM MODELO ANIMAL DE LESÃO MUSCULAR

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1 1 UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE LUCIANA BOCACCIO SPERB DE FREITAS AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO ULTRA-SOM NA CICATRIZAÇÃO MUSCULAR ATRAVÉS DE PARÂMETROS DE ESTRESSE OXIDATIVO EM MODELO ANIMAL DE LESÃO MUSCULAR CRICIÚMA, SETEMBRO DE 2007

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3 2 LUCIANA BOCACCIO SPERB DE FREITAS AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO ULTRA-SOM NA CICATRIZAÇÃO MUSCULAR ATRAVÉS DE PARÂMETROS DE ESTRESSE OXIDATIVO EM MODELO ANIMAL DE LESÃO MUSCULAR Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde pra obtenção do Titulo de Mestre em Ciências da Saúde. Orientador: Prof. Dr. Emilio Luiz Streck Co-orientador: Prof. Dr. Ricardo Aurino Pinho CRICIÚMA, SETEMBRO DE 2007

4 3 Dedico este trabalho a toda minha família que me incentivou e me auxiliou em todos os momentos. Em especial ao Tiago, meu marido e ao Gabriel, meu filho, o maior motivo para vencer este desafio.

5 4 AGRADECIMENTO Ao final do trabalho proposto pode-se sentir a importância das contribuições de pessoas que ao ajudarem, mesmo supondo ser contribuições simples ou obrigações, muitas vezes não avaliam o peso de suas atitudes para quem as recebeu. Minha profunda gratidão a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a elaboração deste trabalho em especial: Prof. Dr. Emilio Streck, pela amizade, dedicação e disponibilidade, pelos ensinamentos, pela paciência e por acreditar neste trabalho, e principalmente pela confiança e oportunidade de trabalhar sob sua orientação. Prof. Dr. Ricardo Pinho, pela amizade, apoio e confiança durante a realização deste trabalho. Tiago, meu marido, por ter me apoiado em meus sonhos, me incentivando sempre e pela ajuda na formulação deste trabalho. Gabriel, meu filho, que por algumas vezes não teve a atenção necessária, mas que eu amo muito! Aos meus pais, Decio e Maria Helena, que sempre me apoiaram e estiveram ao meu lado me incentivando. Todo meu carinho. A minha irmã, Cândice, por todo apoio, ajuda e incentivo. Paulo e Luis Gustavo, pela ajuda, dedicação e paciência na realização deste trabalho, que por muitas vezes deixaram a vida acadêmica para me auxiliar. Aos colegas do Laboratório de Fisiopatologia Experimental e Laboratório de Fisiologia e Bioquímica do Exercício pela ajuda nos experimentos e ótima convivência.

6 5 RESUMO Contusão muscular é a forma de lesão mais comum que afeta a função muscular, entre atletas e não atletas. Tratamentos para aumentar o processo normal de reparo e regeneração são importantes para a ampla variedade de pacientes. O ultra-som terapêutico tem sido utilizado para promover o reparo tecidual, especialmente para aumentar a proliferação de células e a síntese protéica. O presente estudo aponta para a investigação do efeito do ultra-som pulsado terapêutico nos parâmetros de estresse oxidativo, tais como as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), conteúdo de carbonilação de proteínas e a atividade das enzimas antioxidantes catalase e superóxido desmutase (SOD), em músculo esquelético após lesão. Ratos Wistar foram submetidos a modelo animal de lesão muscular (gastrocnêmio) e o ultra-som pulsado terapêutico foi usado uma vez ao dia. No primeiro, terceiro e quinto dia após a lesão, os animais foram mortos por decapitação e os parâmetros de estresse oxidativo foram avaliados. Os níveis de creatina quinase sérica foram utilizados para comprovar a lesão muscular esquelética; esses níveis aumentaram nos animais com lesão muscular, indicando que o modelo animal de lesão foi eficaz. Além disso, o TBARS não foi alterado após a lesão muscular, quando comparado ao grupo sham. A carbonilação de proteínas aumentou após a lesão muscular. As atividades de catalase e SOD diminuíram no primeiro dia após a lesão e não estavam alteraradas no terceiro e quinto dias. O ultra-som pulsado terapêutico diminuiu os níveis de TBARS após a lesão muscular, quando comparado ao grupo com lesão muscular sem tratamento. A avaliação do conteúdo de carbonilação de proteínas apresentou resultados similares. Especula-se que o ultra-som pulsado terapêutico parece proteger o tecido da lesão oxidativa. Além disso, o ultra-som pulsado terapêutico diminuiu as atividades de catalase e SOD, especialmente no primeiro dia seguinte a lesão. Palavras chave: ultra-som pulsado terapêutico; lesão muscular; estresse oxidativo

7 6 ABSTRACT Contusion muscle are a very common form of both athletic and non-athletic injury, that affect muscle function. Treatments to augment the normal repair and regeneration processes are important to a wide variety of patients. Therapeutic ultrasound has been claimed to promote tissue repair, especially by enhancing cell proliferation and protein synthesis. The present study aimed to investigate the effect of therapeutic pulsed ultrasound on parameters of oxidative stress, named thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS), protein carbonyl content and the activities of antioxidant enzymes catalase and superoxide dismutase (SOD), in skeletal muscle after injury. Wistar rats were submitted to an animal model of muscle (gastrocnemius) laceration. Therapeutic pulsed ultrasound was used once a day. One, three or five days after muscle laceration, the animals were killed by decapitation and oxidative stress parameters were evaluated. Serum CK levels were increased in muscle-injured animals, indicating that the laceration animal model was successful. Besides, TBARS were not altered after muscle injury, when compared to sham group. Protein carbonyl content was increased after muscle laceration. Catalase and SOD activities were increased one day after muscle injury and not altered at days 3 and 5. Therapeutic pulsed ultrasound decreased TBARS levels after muscle laceration when compared to injured muscle-animals without treatment. Protein carbonyl content evaluation presented similar results. It is tempting to speculate that therapeutic pulsed ultrasound seems to protect the tissue from oxidative injury. Moreover, therapeutic pulsed ultrasound diminished catalase and SOD activities, especially at the first day following muscle laceration. Keywords: therapeutic pulsed ultrasound; muscle injury; oxidative stress.

8 7 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1. Representação esquemática das três fases da cicatrização 13 Figura 2. Estresse Oxidativo 25

9 8 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ATP adenosina trifosfato CAT catalase CK creatina quinase DNA ácido desoxirribonucléico ERN espécies reativas de nitrogênio ERO espécies reativas de oxigênio LPO lipoperoxidação MHz Mega Hertz NADPH nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato PDGF fator de crescimento derivado das plaquetas SOD superóxido dismutase TBARS espécies reativas de ácido tiobarbitúrico TNF-α fator de necrose tumoral α UNESC Universidade do Extremo Sul Catarinense US ultra-som

10 9 SUMÁRIO I INTRODUÇÂO 10 1 Lesão Muscular Esquelética Tecido Muscular Lesão e cicatrização muscular 12 2 Ultra-som Histórico Efeitos biológicos do Ultra-som 18 3 Terapia Ultra-sônica e a lesão muscular 22 4 Espécies reativas de oxigênio Definição Estresse oxidativo 26 II OBJETIVOS 28 1 Objetivo Geral 28 2 Objetivos Específicos 28 III RESULTADOS Artigo: Effect of therapeutic pulsed ultrasound on parameters of 29 oxidative stress in skeletal muscle after injury. Cell Biology International 31 (2007) IV DISCUSSÃO 30 1 Discussão 30 2 Conclusões 36 3 Perspectivas 37 REFERÊNCIAS 38

11 10 I INTRODUÇÃO 1. Lesão Muscular Esquelética 1.1 Tecido Muscular Os tecidos musculares dividem-se em três tipos: esquelético, cardíaco e liso. Os cardíacos e esqueléticos possuem morfologia estriada e constituem os blocos contráteis do corpo. O músculo esquelético representa a grande massa tecidual do corpo, constituindo 40% a 45% do peso corporal total. Sua estrutura é composta por células musculares, organizadas em redes de nervos e vasos sangüíneos, e pela matriz extracelular do tecido conjuntivo (Riegel, 1999; Huard et al., 2002). As células que constituem os músculos esqueléticos são multinucleadas, chamadas fibras, devido a seu aspecto alongado que atinge a massa muscular de uma extremidade à outra. Sua membrana externa é chamada de sarcolema, seu citoplasma é o sarcoplasma e o conteúdo sarcoplasmático é constituído por um número variável de organelas incluindo: o complexo de golgi, mitocôndrias, retículo sarcoplasmático, mioglobinas, além das miofibrilas, que são feixes alongados de cadeias peptídicas. As miofibrilas estão divididas em módulos funcionais denominados sarcômeros (Huard et al., 2002; Järvinen et al., 2005). São considerados elementos estruturais básicos do músculo esquelético a miofibrila e o tecido conjuntivo. A miofibrila, juntamente com seus nervos, é responsável pela função contrátil da fibra, enquanto que o tecido conjuntivo provido de sua estrutura une células musculares durante a contração muscular e abraça os capilares e nervos dentro da estrutura muscular (Lopes et al., 1993; Järvinen et al., 2005).

12 11 As miofibrilas são unidas entre si e envolvidas por tecido conjuntivo em três níveis denominados endomisio, perimísio, epimisio. O endomisio é o tecido conjuntivo que cerca as miofibrilas individualmente, enquanto que, o perimísio circunda pacotes ou fascículos de miofibrilas. Por fim, o epimisio é o tecido conjuntivo mais externo do músculo esquelético, consideravelmente forte e grosso envolto a todos os fascículos (Lopes et al., 1993; Huard et al., 2002; Järvinen et al., 2005). Dependendo do teor de mioglobina deriva a denominação dos músculos em brancos ou vermelhos, embora uma mesma massa muscular contenha fibras dos dois tipos musculares, variando entre os diferentes músculos do corpo. Os músculos vermelhos apresentam grande quantidade de mioglobina que pode armazenar algum oxigênio, sendo, por isso, usados em esforços submáximos de longa duração. Estruturalmente, são mais resistentes à tensão, devido ao maior teor de colágeno nos espaços interfibrilares, e suas fibras são do tipo I - de contração lenta e ricas em mitocôndrias. Os músculos brancos têm pouca mioglobina, mas elevada capacidade ATPásica e alta atividade das enzimas glicolíticas, menos mitocôndrias que os vermelhos, são especializados em realizar glicólise anaeróbica, utilizados em trabalho máximo e supra-máximo. Suas fibras são do tipo II, ou de contração rápida (Bassel-Duby & Olson, 2006). As fibras de contração lenta além de ricas em mitocôndrias possuem muitos capilares circundantes a cada fibra, exibem um metabolismo oxidativo, tem baixa velocidade de encurtamento e alta resistência à fadiga (Järvinen et al., 2005; Bassel-Duby & Olson, 2006). As células satélites podem ser encontradas achatadas contra a fibra muscular, ou ocupando depressões pouco profundas na sua superfície. Estas células

13 12 localizam-se entre o sarcolema e a lâmina basal da fibra muscular, logo são revestidas pela mesma capa envolvente de glicoproteínas e fibras reticulares. O número de células satélites encontradas em um determinado músculo esquelético é inversamente proporcional à idade desse tecido. São mais numerosas nos músculos oxidativos (ricos em fibras tipo I) e desempenham um papel importante na regeneração e no crescimento muscular (Zammit et al., 2006). 1.2 Lesão e cicatrização muscular A lesão muscular é a lesão mais comum que ocorre em esportes, com incidência variando de 10% a 55% de todas as lesões. Estas lesões ocorrem por diferentes mecanismos, incluindo trauma direto: laceração, contusão e tensão; e trauma indireto: isquemia e disfunção neurológica e toxinas (Huard et al., 2002; Chan et al, 2003; Järvinen et al., 2005; Tidball, 2005; Toumi & Best, 2006). A laceração muscular é uma lesão incomum no esporte, enquanto que 90% de todas as lesões esportivas relatadas estão entre contusão e tensão. A contusão muscular ocorre quando o músculo é submetido à repentina força compressiva, tal como um golpe direto. O trauma muscular por contusão atinge tipicamente o local de contato no esporte. Ao considerarmos corrida e salto, temos atividades mais comuns de lesão por tensão (Tidball, 2005; Toumi & Best, 2006). Na tensão a força tênsil excessiva submetida sobre o músculo leva as miofibrilas à tensão acima do possível e conseqüentemente à ruptura próximo à junção musculotendínea. Quando o tipo de contusão for uma força externa causando a lesão músculo esquelética, a ruptura ocorre no local de impacto ou adjacente a ele. Ao considerarmos a tensão muscular, a lesão será localizada na junção músculo tendínea. A tensão muscular concentra a preocupação em

14 13 músculos superficiais principalmente nos que passam por duas articulações, tais como os músculos reto femoral, semitendinoso e gastrocnêmio (Huard et al., 2002; Järvinen et al., 2005; Toumi et al., 2006). A lesão muscular envolve uma série de processos no tecido, principalmente a degeneração intrínseca da fibra muscular e destruição da lâmina basal, o que caracteriza uma desorganização das miofibrilas nos sarcômeros, ruptura de mitocôndrias e retículos sarcoplasmáticos, descontinuidade do sarcolema, alterações dos níveis de cálcio, autodigestão e morte celular (Tidball, 1995; Huard et al., 2002; Oliveira, 2004). O que distingue a cicatrização músculo esquelética da cicatrização de lesão óssea é que a cicatrização músculo esquelética se dá através do processo de reparo, e a cura óssea pelo processo de regeneração. A maioria dos tecidos do corpo, ao serem lesados apresentaram cicatriz, ou seja, o tecido resultante do processo de cicatrização é diferente do anterior à lesão, ao considerarmos um osso que quebra, o tecido cicatrizado é idêntico ao existente antes da lesão (Järvinen et al., 2005). A cicatrização da lesão músculo esquelética segue completamente um padrão constante, sem relação à causa (contusão, tensão ou laceração) (Järvinen et al., 2005). No processo cicatricial têm sido identificadas três fases: inflamatória, de regeneração e fibrose, conforme demonstra a figura 1. A primeira fase, inflamatória ou fase de destruição é caracterizada pela ruptura e proteção à necrose das miofibrilas, pela formação de hematoma e pela reação inflamatória. O inicio da reação inflamatória é amplificado pelas células satélites que através da liberação de substâncias químicas para as partes necrosadas das miofibrilas, aumentam o extravasamento de células inflamatórias. Após a lesão

15 14 muscular, com a ruptura de miofibras e vasos sanguíneos do tecido muscular as células inflamatórias têm direto acesso ao local da lesão, rápida e seqüencialmente ocorre a invasão do local, pois são os macrófagos e fibroblastos que quando ativados produzem um sinal quimiotático adicional para células inflamatórias circulantes. Assim, a inflamação aguda é considerada a proteção do corpo em resposta ao tecido lesado. A população de células inflamatórias no local da lesão pode persistir por dias ou semanas, enquanto ocorrer o reparo, a regeneração e o crescimento muscular (Tidball, 1995; Järvinen et al., 2005; Toumi et al., 2006). Figura 1: representação esquemática das três fases da cicatrização tecidual (Adaptado de Huard et al., 2002) A inflamação é caracterizada pela formação de coágulo e atividade de substâncias biologicamente ativas como prostaglandinas, serotoninas e fator de

16 15 crescimento derivado das plaquetas (PDGF). Neste período a liberação de histamina aumenta a permeabilidade dos capilares, ocasionando edema na região lesada. Os neutrófilos têm a função de eliminar as partículas estranhas do local lesado, os mastócitos fagocitam as bactérias e debris do tecido lesionado, além de serem outra fonte de substâncias biologicamente ativas que auxiliarão o processo de reparo (Kitchen & Bazin, 2001; Starkey, 2002; Low & Reed, 2003). Os neutrófilos rapidamente invadem o tecido muscular lesado e promovem várias funções importantes que contribuem para inflamação e cicatrização (Toumi et al., 2006). O quadro geral que surge de estudos é que neutrófilos e macrófagos dominam a base da resposta inflamatória em músculos, o que inicia após a lesão. Dados experimentais demonstram que neutrófilos promovem dano muscular após a lesão, mas evidências experimentais para a função de neutrófilos, no reparo muscular, não têm sido atingidas. Macrófagos podem promover qualquer lesão muscular ou proliferação in vitro, embora seu papel in vivo após lesão muscular permaneça mal compreendido. Recentes resultados demonstram que o processo inflamatório tem benefício global e um efeito prejudicial na função muscular, isso se deve pelo fato de a resposta ser influenciada pela prévia história de lesão, e pela provável interação entre músculo e invasão de células inflamatórias (Tidball, 1995; Toumi et al., 2006). Os neutrófilos representam a 1ª linha de defesa a agentes infecciosos após uma lesão. Estudos relatam que os neutrófilos participam não somente na fagocitose, como também participam na promoção de lesão (Toumi & Best, 2006). No mecanismo da relação entre a resposta inflamatória à lesão e os danos adicionais, o dano mecânico inicial é a infiltração de células inflamatórias nas

17 16 miofibrilas e sequencialmente os neutrófilos produzem a liberação de radicais livres de oxigênio (Toumi & Best, 2006; Toumi et al., 2006). A maioria dos tecidos contém fator de crescimento guardados em forma inativa na matriz extracelular, usado quando intensamente necessita-se, por exemplo, no reparo de lesão. Estes fatores de crescimento armazenados são produzidos pelas células residentes normais e inativados por sua aderência aos proteoglicans e outros constituintes da matriz extracelular. No evento de dano tecidual o rompimento da integralidade normal do tecido resulta na ativação e liberação desta ligação membrana extracelular - fator de crescimento, e assim, direto ao processo de reparo (Järvinen et al., 2005). A respeito do fator de crescimento das citocinas, há evidência direta de que o fator-α de necrose tumoral (TNF-α) tem um papel fisiológico na regeneração da lesão músculo esquelética. A inibição desta atividade durante a cicatrização resulta em leve déficit na força de recuperação do músculo (Huard et al., 2002; Järvinen et al., 2005). Na fase aguda da lesão muscular, leucócitos polimorfonucleares são as células mais abundantes no local da lesão, mas ainda no primeiro dia eles são substituídos pelos monócitos. Conforme os princípios básicos da inflamação, estes monócitos são transformados em macrófagos que ativamente fagocitam os debris necróticos circundantes às células satélites, enquanto simultaneamente enviam fatores solúveis para esta regeneração celular (Järvinen et al., 2005). Embora as implicações clínicas não estejam definidas, é concebível que limitar certo aspecto inflamatório representa uma nova estratégia de tratamento (Toumi & Best, 2006).

18 17 Alguns dias após a lesão inicia-se a segunda fase ou de proliferação, onde os fagócitos migram para a área lesada e formam um tecido de granulação, o que determinará o acúmulo de substância basal e de colágeno na área lesada, preparando a reconstrução dos tecidos danificados. Uma nova camada epidérmica se forma e um movimento centrípeto da pele circunjacente provoca uma redução do tamanho da ferida, processo chamado de contração da ferida (Menetrey et al., 2000; Huard et al., 2002; Zammit et al., 2006). A terceira e última fase é a de maturação ou remodelagem, na qual o tecido de granulação é substituído pelo fibroso, quando o colágeno e os fibroblastos se realinham, tentando adaptar-se à orientação e função do tecido original. Esta fase pode continuar por meses ou até anos após a ocorrência da fase proliferativa do reparo (Kitchen & Bazin, 2001; Starkey, 2002; Low & Reed, 2003; Zammit et al., 2006).

19 18 2. Ultra-Som 2.1 Histórico O Ultra-som (US) teve sua descoberta em 1880, quando o casal Pierre e Marie Curie descobriu o efeito piezoelétrico através da aplicação de uma corrente elétrica senoidal sobre um cristal de quartzo colocado entre duas placas metálicas; estes cientistas constataram a geração de uma vibração de alta freqüência. Langevin, Tournier e Howeck construíram pela primeira vez, em 1917, em Paris, um aparelho piezoelétrico que, embora tivesse utilidade para a Marinha, apresentava aplicações no campo da biologia, observando-se que sob a ação dos ultra-sons que emitia, morriam pequenos peixes depois de grandes convulsões (Haar, 2007). Na Fisioterapia a terapia ultra-sônica é definida pelas oscilações de ondas cinéticas ou mecânicas produzidas pelo transdutor vibratório, que aplicado sobre a pele atravessa e penetra no organismo em diferentes profundidades, dependendo da freqüência, que varia de 0,75 a 3,0 MHz, sendo utilizado no tratamento de pequenas lesões musculares, acelerando o processo de cicatrização muscular e epitelial (Robertson & Ward, 1997; Haar, 2007). Desde a sua descoberta, a utilização do US, provoca nos pesquisadores estudos incessantes, tendo com finalidade a verificação da sua eficácia nos processos de regeneração muscular. 2.2 Efeitos biológicos do Ultra-som Os efeitos do US dependem de muitos fatores físicos e biológicos, tais como a intensidade, tempo de exposição, estrutura espacial e temporal do campo ultrasônico e estado fisiológico do objeto. Este grande número de variáveis complica a compreensão exata do mecanismo de ação do ultra-som na interação com os

20 19 tecidos biológicos (Sarvazyan et al., 1982; Richardson, 1989; Robertson, 2002; Gann, 2003). Independente do tipo de mecanismo de interação que está agindo no tecido biológico estudado, o objetivo principal é estabelecer limiares para a intensidade ultra-sônica, abaixo dos quais não provoca efeito lesivo. Experimentos realizados com o US demonstram que a interação com os tecidos biológicos provocam alterações fisiológicas que podem ser benéficas ou provocar danos (Ferrari, 1987; Haar, 2007). Os mecanismos físicos envolvidos na terapêutica do US que induzem respostas clinicamente significantes sobre as células, tecidos, órgãos e organismo são geralmente classificados em mecanismo térmico e não térmico (Dyson,1987). Térmico É decorrente da absorção das ondas ultra-sônicas pelo tecido que se transforma em calor. A vibração celular e de suas partículas provoca um atrito entre elas, produzindo assim o efeito térmico. A produção de calor é maior nas áreas limítrofe músculo/osso (Dyson,1987). No US com feixe contínuo, prevalece o efeito térmico, o que não ocorre com o feixe ultra-sônico pulsátil ou intermitente, promovendo ação analgésica, antiinflamatória ou antiespasmódica na zona tratada. Melhora a circulação do local e região, promovendo uma leve hiperemia (Silva, 1987; Machado, 1991; Kitchen & Bazin, 2001; Low & Reed, 2003). O tecido ao ser estimulado pelo plexo terminal nervoso ocorre vasodilatação em extremidades, e com isso, temos o efeito térmico provocando um aumento do

21 20 fluxo sanguíneo, o que produzirá reflexamente nos capilares e arteríolas uma vasodilatação reflexa (Dyson,1987; Kitchen & Bazin, 2001; Low & Reed, 2003). Não Térmico ou Mecânico As ondas ultra-sônicas, ao penetrarem no tecido, provocam vibrações sobre os mesmo em nível celular (micromassagem), acelerando a velocidade de difusão de íons através da membrana celular e o intercâmbio de fluidos, favorecendo o processo de difusão e melhorando o metabolismo celular. O potencial da membrana é alterado, produzindo a sua despolarização. Além disso, regula o desequilíbrio, auxilia a liberação de aderências, pela separação das fibras colágenas (Dyson, 1987; Silva, 1987; Machado, 1991). Com o aumento das trocas e da vasodilatação, teremos mais anticorpos, leucócitos e eletrólitos na área, o que concorrerá para uma maior defesa, além de aumentar consideravelmente o retorno venoso e linfático, facilitando a absorção de edemas (Machado, 1991). O US age através dos fatores mecânicos e térmicos, que provocam uma série de reações químicas que aceleram as reações e aumentam a condutibilidade das ações, como a liberação de substâncias vasodilatadoras, facilitando a dispersão dos líquidos e a desagregação de moléculas complexas (Silva, 1987; Machado, 1991). As ondas ultra-sônicas sofrem reflexão de mais ou menos 99% ao incidir ar/pele, parte daí a importância de se evitar gases e a necessidade de utilizar substâncias de acoplamento (gel, óleo, água, almofada de gel) entre o emissor e a pele do paciente (Machado, 1991; Low & Reed, 2003; Agne, 2004; Yang et al., 2005).

22 21 O US pode provocar a formação de bolhas ou cavidades micrométricas nos líquidos contendo gás, causada por pressões negativas no tecido durante a rarefação. Esta formação de bolhas pode quebrar ligações moleculares entre o gás e o tecido (cavitação transitória). O colapso das bolhas libera energia que pode também quebrar ligações. Radicais livres produzidos durante a quebra de ligações podem levar a reação de oxidação (Kitchen & Bazin, 2001; Agne, 2004). Portanto, trata-se de um efeito destrutivo ou danoso, constituindo uma lesão celular provocada por força excessiva de tração e compressão das ondas do ultrasom (Kitchen & Bazin, 2001; Agne, 2004). Se for evitado um campo de ondas estacionárias e se forem utilizadas baixas intensidades durante a terapia, será improvável a ocorrência desta cavitação temporária (Kitchen & Bazin, 2001; Agne, 2004).

23 22 3. Terapia Ultra-sônica e a lesão muscular A terapia por US influencia a atividade das células, plaquetas, mastócitos, macrófagos e neutrófilos envolvidos na fase inflamatória do processo de regeneração tecidual, acelerando o processo de cicatrização. As ondas ultra-sônicas produzem o aumento da permeabilidade da membrana e das plaquetas facilitando a liberação de serotonina. Os mastócitos terão o rompimento de sua membrana celular em resposta ao aumento dos níveis de cálcio intracelular, liberando histamina. A capacidade de efetuar o transporte do cálcio através das membranas celulares, segundo mensageiro, pode exercer efeito profundo na atividade celular, aumentando a síntese e secreção dos fatores de lesão pelas células envolvidas no processo de cicatrização (Sarvazyan, 1982; Kitchen & Bazin, 2001; Low & Reed, 2003). Na fase de proliferação ou granulação, que inicia aproximadamente três dias após a lesão, no período em que as células são expostas a níveis terapêuticos de US a motilidade dos fibroblastos estará aumentada, não tendo comprovação na literatura sobre a ação desta terapia no estímulo da atividade dos fibroblastos. Outro efeito está relacionado ao aumento da velocidade de angiogênese e aumento na secreção de colágeno presentes nesta fase. No artigo de revisão de Maxwell (1992) foi observado que a utilização da terapia ultra-sônica pode gerar radicais livres que prejudicam a fase de granulação, outros estudos afirmam que o US pode potencializar ou inibir o processo infamatório (Maxwell, 1992; Maxwell et al., 1994; Menetrey, 1999; Low & Reed, 2003). O estágio de remodelamento pode durar meses ou anos, até que o novo tecido esteja com a formação e estrutura próximas ao tecido outrora lesado. O tratamento com US fornece melhor resistência tênsil e elasticidade do colágeno maduro, quando o tratamento é realizado desde o processo inflamatório até a fase

24 23 de remodelagem no processo do período cicatricial (Kitchen & Bazin, 2001; Low & Reed, 2003; Fisher et al., 2003). No entanto, os mecanismos fisiológicos e bioquímicos responsáveis pelos efeitos benéficos do US, são pouco conhecidos. Nesse contexto, esse trabalho visa aprofundar conhecimentos sobre a ação fisiológica do US terapêutico no processo de cicatrização do tecido muscular, através do estresse oxidativo em modelo animal de lesão muscular.

25 24 4. Espécies reativas de oxigênio 4.1. Definição Em 1954, Gerham e Gilbert propuseram que alguns efeitos tóxicos do oxigênio poderiam ocorrer pela formação de radicais livres de oxigênio. Os radicais livres são definidos como qualquer espécie química capaz de existir de forma independente e que contenham em sua estrutura elétrons desemparelhados. Assim, os radicais livres têm um grande potencial reativo, reagindo com moléculas como lipídios, proteínas e ácidos nucléicos, o que por sua vez pode ocasionar a morte celular. Dentre os radicais livres existem dois grupos: as espécies reativas de oxigênio (ERO) e as espécies reativas de nitrogênio (ERN) (Halliwell & Gutteridge, 2007). As espécies reativas de oxigênio (ERO) são produzidas na cadeia mitocondrial, onde 90-95% do oxigênio consumido é reduzido à água. As EROs podem ser geradas nos processos inflamatórios, na metabolização de gordura pela -oxidação, na degradação da xantina à ácido úrico e na auto-oxidação de catecolaminas (Halliwell & Gutteridge, 2007). Durante a respiração celular, na cadeia transportadora de elétrons, o oxigênio é reduzido à água. A molécula de oxigênio pode aceitar um total de quatro elétrons para a sua redução a duas moléculas de água, mas esta redução pode acontecer com apenas um elétron por vez, ocasionando a produção de ERO, e por conseqüência a produção de radicais livres de oxigênio. Dois a cinco por cento do oxigênio é desviado formando os radicais livres (Matsuo & Kaneko, 2001). Em adição a fagocitose, a invasão e ativação de neutrófilos no local da lesão músculo esquelética pode conduzir a liberação de radicais livres de oxigênio e proteases como potencial causa de lesão. Neutrófilos contêm mais de quarenta

26 25 enzimas hidrolíticas e moléculas tóxicas em seus grânulos e podem gerar vários oxidantes, tais como, ânion superóxido, peróxido de hidrogênio e ácido hipoclorídrico (Toumi & Best, 2006). Os radicais livres são produzidos em muitos processos fisiológicos e exercem funções importantes no organismo, participando da fagocitose, processos de sinalização celular e estão envolvidos na síntese e regulação de algumas proteínas, em condições fisiológicas. O problema constitui-se quando a produção dos níveis totais de ERO for maior que a capacidade de defesa, podendo ocasionar danos celulares (Bondy & Le Bel, 1993). A produção das espécies reativas de oxigênio ocorre em três fases; na primeira fase ocorre a inicialização onde duas moléculas se fundem e formam um radical, após temos a progressão, fase em que o radical se liga a outra molécula qualquer, gerando um radical livre e finalmente o término quando a geração de radical termina (Halliwell & Gutteridge, 2007). Os radicais livres são gerados conforme as fases descritas acima, o ânion superóxido é o primeiro radical livre formado. Na cadeia respiratória mitocondrial, 5% do oxigênio utilizado não é completamente reduzido à água, e ocorre a formação de ânion superóxido (Cadenas & Davies, 2000; Halliwell & Gutteridge, 2007). O complexo NADPH oxidase localizado em neutrófilos ativados e macrófagos podem iniciar uma bomba respiratória que conduz a produção de ânion superóxido e que pode rapidamente ser convertido em peróxido de hidrogênio. Além disso a mieloperoxidase (enzima presente em neutrófilos e macrófagos) pode gerar ácido hipoclorídrico, um agente de oxidação altamente reativo. Estudos que analisaram a relação entre lesão muscular e concentração de neutrófilos, sugerem

27 26 que a invasão de neutrófilos e macrófagos exarceba a lesão muscular (Toumi & Best, 2006). Em estudos, os níveis de radicais livres de oxigênio foram medidos no músculo após 24 horas da lesão e os resultados sugerem que existe uma relação entre infiltração de neutrófilos e o grau de dano muscular após estiramento do músculo (Toumi & Best, 2006) Estresse oxidativo Os radicais livres são formados no metabolismo celular. As defesas antioxidantes, enzimáticas e não-enzimáticas, atuam contra a toxicidade dessas espécies e são responsáveis pela homeostase entre a eliminação e a produção de radicais livres. Em condições extremas ocorre o aumento da produção de radicais livres, que são responsáveis por ultrapassar a capacidade antioxidante normal presente no organismo humano ou ocasionar um déficit das defesas antioxidantes no organismo, favorecendo o aumento do estresse oxidativo (Bondy & Le Bel, 1993; Cadenas & Davies, 2000). Figura 2. Estresse oxidativo (Adaptado de Marks et al., 1996).

28 27 O estresse oxidativo pode provocar perda da função celular por causar alterações no metabolismo das células. Estudos mensuraram os níveis de radicais livres de oxigênio no músculo após a lesão muscular, constatando um aumento destes níveis no local da lesão nas primeiras 24 horas. Conseqüentemente estes estudos sugerem que existe uma relação entre infiltração de neutrófilos e o grau de dano muscular (Toumi & Best, 2006). Após iniciada a lesão, o estresse oxidativo pode aumentar pela presença de neutrófilos e macrófagos no local de lesão. A produção de radicais livres causa dano nas membranas lipídicas e produz necrose nas células (Toumi & Best, 2006; Toumi et al., 2006).

29 28 II. OBJETIVOS: 1. Objetivo Geral Estudar o efeito do ultra-som terapêutico na cicatrização músculo esquelética induzida em ratos, bem como as alterações na geração de espécies reativas de oxigênio. 2. Objetivos Específicos Verificar o efeito do tratamento de ultra-som terapêutico sob lesões musculares em gastrocnêmio de ratos com os seguintes parâmetros: 1) nível sérico de creatina quinase, para validar o modelo e comprovar a lesão muscular; 2) medida de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), um marcador de lipoperoxidação; 3) oxidação de proteínas; 4) em gastrocnêmio atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase e catalase.

30 29 III RESULTADOS ARTIGO Effect of therapeutic pulsed ultrasound on parameters of oxidative stress in skeletal muscle after injury Luciana S. Freitas, Tiago P. Freitas, Paulo C. Silveira, Luís G. Rocha, Ricardo A. Pinho, Emilio L. Streck Artigo publicado na revista Cell Biology International 31 (2007)

31 30 IV DISCUSSÃO 1. Discussão A lesão muscular esquelética freqüentemente ocorre em esportes profissionais ou em atividades diárias. A maioria das lesões por esforço é causada por episódios de estiramento repentino e freqüentemente causam significante morbidade. Mecanismos que causam a lesão provocam o rompimento do tecido conjuntivo e componentes miocelulares incluindo sarcolema, miofibrilas e citoesqueleto (Kasemkijwattana et al., 1998; Menetrey et al.,2000). O tratamento realizado com o objetivo de diminuir a reação inflamatória e promover a cicatrização tecidual é a imobilização do local e o uso de antiinflamatórios não-esteroidais, levando a um tempo prolongado de afastamento de suas atividades laborais, nem sempre com uma eficácia comprovada (Guozhen et al., 2005). Nikolaou et al. (1987) admitem que após a lesão provocada por esforço, a cicatrização da lesão muscular sete dias após apresentava inflamação reduzida e a fibrose por colágeno mais avançada. Os achados desse estudo demonstram que a recuperação funcional do músculo ocorre 48 horas após, a despeito da inflamação e cicatrização ativas (Nikolaou et al., 1987). Os efeitos do US dependem de muitos fatores físicos e biológicos (Sarvazyan,1983; Richardson, 1989; Robertson, 2002; Gann, 2003). Experimentos realizados com o ultra-som demonstram que a interação com os tecidos biológicos provoca alterações fisiológicas que podem ser benéficas ou provocar danos (Ferrari, 1987; Haar, 2007). A terapia por US influencia a atividade das células, plaquetas, mastócitos, macrófagos e neutrófilos envolvidas na fase inflamatória do processo de regeneração tecidual, acelerando o processo de cicatrização. (Sarvazyan,1983; Kitchen & Bazin, 2001; Low & Reed, 2003).

32 31 Duarte & Xavier (1983) afirmam que a energia ultra-sônica aplicada ao local lesado se identifica com a necessidade orgânica de promover potencial elétrico para disparar o mecanismo de reparo e acelerá-lo, restaurar o fluxo sanguíneo, permitindo assim a continuidade da vida celular e possibilitando seu desempenho. Logo, concluíram que a presença de cargas elétricas no osso é vital, não só para o desenvolvimento ósseo, mas para o reparo tecidual (Duarte & Xavier,1983; Duarte, 1983). Dyson (1987) observou a regeneração tecidual em feridas experimentais de coelhos, demonstrando que o uso de US pulsado aumentou o processo de regeneração em 30% quando comparado ao controle não estimulado. Em estudos que investigaram a ação do ultra-som pulsado em úlceras varicosas, foi verificada uma redução significativa das ulcerações quando comparadas ao controle o que permitiu concluir que o US terapêutico pode estimular o processo de reparação tecidual (Dyson, 1987). Trabalhos experimentais de Duarte (1983) comprovaram que o tratamento com parâmetros específicos de US de baixa intensidade estimula a neoformação óssea em animais, acelerando não somente o processo de regeneração de tecidos moles como também a consolidação de fraturas (Duarte & Xavier, 1983; Duarte, 1983). Efeitos da utilização do US pulsado no tratamento de lesão muscular experimental aguda por esmagamento do músculo reto femoral de coelhos, foram investigados por Menezes e colaboradores (1999). Dentre os resultados encontrados nas propriedades mecânicas foi evidenciado maior suporte de carga e deformação para os músculos tratados, indicando uma ação benéfica do US sobre o processo de reparação muscular (Menezes et al., 1999).

33 32 Outro estudo avaliou os efeitos precoce e tardio do US terapêutico sobre o processo de cicatrização de tendões flexores de coelhos. Os resultados encontrados evidenciaram um significativo abrandamento da reação inflamatória, com menor grau de necrose, um aumento da proliferação de fibroblastos e aumento da deposição de fibras colágenas na fase tardia da cicatrização do tendão, indicando uma ação favorável da utilização do US no processo tardio da cicatrização (Leung et al., 2004). Neste estudo foram mensurados parâmetros de estresse oxidativo no primeiro, terceiro e quinto dias após lesão muscular. A figura 1 do artigo demonstra que os níveis de creatina quinase aumentaram por cinco dias após lesão muscular e que a mais alta atividade da enzima ocorre no primeiro dia quando comparada ao grupo sham (animais sem lesão). Estes resultados indicam que a laceração no modelo animal foi bem sucedida. A figura 2A demonstra que o ácido tiobarbitúrico TBARS, um marcador de lipoperoxidação, não foi alterado no primeiro, terceiro ou quinto dias após a lesão muscular, quando comparados ao grupo sham. A figura 2B demonstra diferentes resultados para o conteúdo de proteína carbonil. Foi verificado que no primeiro, terceiro e quinto dias após lesão muscular os níveis de proteína carbonil foram aumentados, quando comparados ao grupo sham. Estes resultados indicam que as proteínas são provavelmente mais afetadas pela lesão muscular que os lipídios. A figura 2C mostrou que a atividade de catalase é significantemente aumentada no primeiro dia após a lesão muscular e não é alterada no terceiro e quinto dias. O mesmo resultado foi obtido para a atividade da superóxido desmutase (SOD), o que pode ser visualizado na figura 2D. As figuras 3, 4 e 5 demonstram um efeito do ultra-som terapêutico nos níveis de creatina quinase sérica, TBARS, conteúdo de proteína carbonil e atividade de

34 33 catalase e SOD. Estes resultados mostraram que o US terapêutico pulsado diminuiu os níveis da atividade CK sérica nos músculos lesados dos animais após o primeiro dia de lesão, quando comparados com os animais que não receberam a terapia ultrasônica. Sobre o terceiro e quinto dias, a terapia por US demonstrou não ter efeito sobre os níveis de CK sérica (figura 3). Esta pesquisa também verificou que a terapia por US pulsado diminuiu os níveis de TBARS no gastrocnêmico no primeiro, terceiro e quinto dia após lesão, quando comparados com os animais que não receberam tratamento, especialmente com a dose de 1,0 W/cm 2 (figura 4). Contudo, pode-se observar na figura 2A, os níveis de TBARS não aumentaram na musculatura lesada do animal, quando comparados ao grupo sham (animais sem lesão). Esses achados demonstram que a lipoperoxidação provavelmente não está presente no processo de cicatrização muscular. O figura 4B demonstra que a avaliação do conteúdo de proteínas carbonil apresentou resultados similares. Verificou-se que a terapia por ultra-som diminuiu o dano de proteínas. Juntos estes resultados levam a sugerir que a terapia ultrasônica pode proteger o tecido lesado do dano oxidativo. Os resultados deste estudo também demonstram que a terapia por US diminui a atividade de catalase (figura 5A) e SOD (figura 5B) no primeiro dia seguido à lesão muscular. Sobre o terceiro dia, nenhuma das enzimas foram alteradas. Sobre o quinto dia, a atividade de catalase não foi alterada e a atividade da SOD apresentou diminuição. Estes resultados mostram que a terapia por US reduziu a atividade das enzimas antioxidantes, especialmente no primeiro dia após a lesão muscular. Muitos estudos apontam para novos achados de dados sobre os efeitos biológicos da terapia por US, relativo ao uso no tratamento de lesão muscular. O

35 34 mecanismo exato sobre os efeitos do US no reparo de tecido é provavelmente relatado nos efeitos mecânicos ao contrário dos efeitos térmicos (Dinno et al., 1989; Karnes & Burton, 2002). Neste contexto, acredita-se que o estímulo mecânico que provém de ondas ultra-sônicas pode ativar o caminho sinal-transdução envolvido na cicatrização (Markert et al., 2005). Já tem sido demonstrado que o US altera a atividade de plaquetas, neutrófilos e macrófagos envolvidos na fase inflamatória do processo de cicatrização muscular, acelerando este processo. Outro efeito é o aumento da velocidade de angiogênese (Rantanen et al., 1999). O complexo NADPH oxidase localizado em neutrófilos ativados e macrófagos podem iniciar uma bomba respiratória que conduz a produção de ânion superóxido e que pode rapidamente ser convertido em peróxido de hidrogênio. Além disso a mieloperoxidase (enzima presente em neutrófilos e macrófagos) pode gerar ácido hipoclorídrico, um agente de oxidação altamente reativo. Estudos que analisaram a relação entre lesão muscular e concentração de neutrófilos, sugerem que a invasão de neutrófilos e macrófagos exarceba a lesão muscular (Toumi & Best, 2006). Em estudos, os níveis de radicais livres de oxigênio foram medidos no músculo após 24 horas da lesão e os resultados sugerem que existe uma relação entre infiltração de neutrófilos e o grau de dano muscular após estiramento do músculo (Toumi & Best, 2006). Resultados de estudos anteriores sobre a efetividade do US na cicatrização tecidual são ainda contraditórios, alguns pesquisadores acharam efeitos na regeneração de miofibras esqueléticas, fibroblastos ou úlcera e feridas. Os diferentes resultados podem ser explicados pelos diferentes tipos de tecidos

36 35 examinados, modelos e modo das lesões, intensidade e freqüência do tratamento ultra-sônico (Karnes & Burton, 2002). Neste estudo, foi usado US terapêutico pulsado para o tratamento de lesão muscular. Nesta terapia por US pulsado, o efeito térmico é mínimo. Nesta modalidade, a emissão é interrompida periodicamente, intercalando pausas. Assim, um calor mínimo é gerado durante o impulso (Fisher et al., 2003). Verificou-se que a terapia por US pulsado apresenta um efeito protetor de lipídios e proteínas marcadores de dano oxidativo. Esta terapia também inibiu as atividades de catalase e SOD no primeiro dia após a lesão muscular. Os resultados deste estudo indicam que a terapia por US pulsado apresenta efeitos benéficos no processo de cicatrização muscular, especialmente na diminuição de TBARS e conteúdo de proteínas carbonil. Estudos adicionais serão realizados em nosso laboratório para melhor entendimento dos efeitos biológicos da terapia por US pulsado e contínuo na lesão muscular.

37 36 2. Conclusões Parâmetros de estresse oxidativo foram analisados no primeiro, terceiro e quinto dias após lesão, com ou sem a terapia por US pulsado, e com diferentes doses de US. Com esse trabalho, conclui-se que: 1. Os níveis de creatina quinase sérica aumentaram na lesão muscular animal, indicando que o modelo animal de lesão foi eficaz. 2. TBARS não foram alterados após lesão muscular, quando comparados ao grupo sham. 3. O conteúdo de carbonilação de proteínas aumentou após a lesão muscular. 4. As atividades de catalase e SOD aumentaram no primeiro dia após a lesão muscular e não alteraram no terceiro e quinto dias. 5. A terapia por ultra-som pulsado diminuiu os níveis de TBARS após a lesão muscular, quando comparados aos animais com lesão muscular e sem tratamento. 6. A avaliação do conteúdo de carbonilação de proteínas apresentou resultados similares ao TBARS. 7. A terapia por US pulsado também diminuiu as atividades da catalase e da SOD, especialmente no primeiro dia seguinte à lesão muscular.

38 37 3. Perspectivas A partir do presente trabalho pretende-se continuar as pesquisas realizando estudos: com o modelo ultra-sônico além da forma pulsada, a contínua; realização do teste cometa, para analisar lesões em nível de DNA; marcador de dano ao DNA; atividade dos complexos I, II, III e IV da cadeia respiratória mitocondrial; realização de histologia; introdução de fármacos antiinflamatórios juntamente com a corrente ultrasônica, a fim de proporcionar um melhor processo de regeneração muscular; realização de ultra-som em tecido epitelial; a utilização desta terapia como tratamento de pequenas fraturas ósseas.

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