Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia - INPA. Programa de Pós-Graduação em Entomologia

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1 Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia - INPA Programa de Pós-Graduação em Entomologia Identificação e caracterização morfológica de hemócitos em Ectemnaspis rorotaense (Floch & Abonnenc) e Ectemnaspis trombetense (Hamada, Py-Daniel & Adler) (Diptera: Simuliidae) Juciane Conceição da Silva Manaus, Amazonas Abril de 2014 i

2 Juciane Conceição da Silva Identificação e caracterização morfológica de hemócitos em Ectemnaspis rorotaense (Floch & Abonnenc) e Ectemnaspis trombetense (Hamada, Py-Daniel & Adler) (Diptera: Simuliidae) Orientador: Dr. Jansen Fernandes de Medeiros Coorientador: Dr. Felipe Arley Costa Pessoa Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Entomologia do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas, área de concentração em Entomologia. Manaus, Amazonas Abril de 2014 ii

3 Banca Examinadora da Defesa Pública Presencial TITULARES: Dr. Wanderli Pedro Tadei Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia Dr. Cristovão Alves da Costa Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia Dra. Ormezinda Celeste Cristo Fernandes Instituto Leônidas e Maria Deane - Fiocruz Amazonas SUPRENTES: Dr. Wuelton Marcelo Monteiro Fundação de Medicina Tropical Dr. João Antonio Cyrino Zequi Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia Dissertação defendida e aprovada em: 28/04/2014 iii

4 Ficha Catalográfica S586 Silva, Juciane Conceição da Identificação e caracterização morfológica de hemócitos em Ectemnaspis rorotaense (Floch & Abonnenc) e Ectemnaspis trombetense (Hamada, Py-Daniel & Adle) (Diptera: Simuliidae) / Juciane Conceição da Silva. --- Manaus: [s.n], 2014 Xv, 66f.: il. Color. Dissertação (mestrado) ---INPA, Manaus, Orientador: Jansen Fernandes -Medeiros Co-orientador: Felipe Arley Costa Pessoa, Área de concentração: Entomologia 1. Microscopia óptica. 2. Simulídeos, 3. Hemócitos. I. Título CDD Sinopse: Foram identificadas, caracterizadas e contabilizadas os tipos celulares do sistema de defesa (hemócitos) nos diferentes estágios de vida, larva, pupa e adultos das espécies Ectemnaspis rorotaense (Floch & Abonnenc) e Ectemnaspis trombetense (Hamada, Py-Daniel & Adle). Foram identificados quatro tipos celulares: prohemócitos, granulócitos, oenocitóide e plasmatócitos. Palavras-chave: Microscopia óptica, Microscopia eletrônica de transmissão, células. iv

5 Dedico Aos meus pais, Terezinha e Francisco (in Memoriam) e a meus irmãos, Janaina, Neto, Joene, Joelma, Jarlene e Jaeliton. A meu esposo Flávio por estar sempre ao meu lado em todos os momentos e a minha filha Sarah Leticia, minha fonte de inspiração. v

6 Agradecimentos Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), ao Programa de Pós- Graduação em Entomologia, e aos professores do curso de mestrado que contribuíram para a minha formação profissional durante essa jornada. Ao Instituto Leônidas e Maria Deane pela estrutura laboratorial e logística disponibilizada na realização desse trabalho. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal em Nível Superior, CAPES, pela concessão da bolsa de mestrado. Ao Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães, pela estrutura laboratorial para realização de uma parte desse trabalho. Aos meus orientadores Dr. Jansen Fernandes Medeiros e Dr. Felipe Arley Costa Pessoa pela orientação, pelos ensinamentos científicos, companheirismo, paciência e principalmente por não medirem esforços para que fosse possível a realização desse trabalho. Aos Doutores Fábio Brayner e Luiz Alves que foram essenciais para obtenção dos resultados desse trabalho, obrigada pela oportunidade de fazer estágio no laboratório de Biologia Celular e Molecular da FIOCRUZ-PE, pelos ensinamentos e a também pela amizade. Serei eternamente grata por tudo. À Dra. Claudia Maria Rios Velásquez pelos ensinamentos, disponibilidade de tempo e valiosas sugestões durante a execução desse trabalho. A meu esposo Flávio, pelo companheirismo, atenção, paciência e principalmente por entender minha ausência em alguns momentos. À minha filha Sarah Letícia, minha fonte de inspiração e de incentivo. À minha família, minha mãe Terezinha e meus irmãos Janaina, Neto, Joene, Joelma, Jarlene e Jaeliton, pelo amor e apoio em todos os momentos da minha vida. vi

7 À Dra. Helena Araújo, pelo treinamento inicial que possibilitou a execução da metodologia desse trabalho. À Dra. Giselle Almeida Oliveira, pelas contribuições e valiosas sugestões durante minha preparação para aula de qualificação. Aos amigos mestrandos do laboratório EDTA, Antônio e Emanuelle, pela ajuda nas coletas, pelo companheirismo, discussões científicas, é muito bom saber que sempre posso contar com vocês. À doutoranda Ana Paula Sampaio, pela ajuda no processamento de material e por ter mim acolhido durante meu estágio no Laboratório de Biologia Celular e Molecular da FIOCRUZ-PE. Obrigada amiga. Ao amigo Rafael Padilha do laboratório de Microscopia eletrônica do LIKA, pelo auxilio no processamento de material e na obtenção de imagens. A toda equipe do laboratório de Biologia Celular e Molecular da FIOCRUZ-PE, em especial aos colegas Gabriel e Cássia pelo treinamento durante meu estágio. Aos bolsistas de iniciação cientifica do Laboratório de Ecologia de Doenças Transmissíveis na Amazônia, Jéssica, Eric, Jordan e Maria, pelo companheirismo e ajuda nas coletas de campo e em especial a Jeane pelo auxilio e companhia no processamento de material. Aos técnicos do ILMD Patrícia Mello amizade e Diego Leite e Ricardo Motta, pelo auxilio nas coletas de campo, pelos momentos de descontração e principalmente pela amizade. Aos amigos e companheiros de café, Vagner Bastos e Tatiane Becker, pela companhia e ajuda na etapa de finalização do trabalho. Aos colegas do ILMD, Mary, Katiane, Valdinete, Tatiane, George e Victor, pelas palavras de incentivo e pela amizade. vii

8 A toda turma de Entomologia 2012, pelos momentos de alegria e de companheirismo durante essa jornada em especial ao amigo Leandro Leal, pelas discursões cientifica e por sempre estar disposto a ajudar. viii

9 O sucesso nasce do querer, da determinação e persistência em se chegar a um objetivo. Mesmo não atingindo o alvo, quem busca e vence obstáculos, no mínimo fará coisas admiráveis. José de Alencar ix

10 Resumo Os simulídeos são insetos de interesse médico-veterinário por veicularem diferentes organismos patogênicos aos homens e animais, entretanto pouco se conhece sobre o sistema de defesa contra ação de patógenos nesses insetos. Os hemócitos são células do sistema imune dos insetos e entre as principais funções desenvolvidas por essas células estão à fagocitose, a encapsulação e a coagulação. Esse trabalho foi realizado com duas espécies de Simuliidae do estado do Amazonas e teve como objetivos identificar e caracterizar os tipos de hemócitos encontrados na hemolinfa de Ectemnaspis rorotaense e Ectemnaspis trombetense. Os simulídeos (larvas e pupas) foram coletados no município de Presidente Figueiredo, estado do Amazonas. As células foram caracterizadas através da microscopia óptica e microscopia eletrônica de transmissão. A contagem diferencial das células foi realizada através do microscópio de luz em campo claro e para diferenciação celular foram consideradas características morfológicas. Foram identificadas quatro tipos de células na hemolinfa de larvas, pupas e adultos de E. rorotaense e E. trombetense: prohemócitos, plasmatócitos, granulócitos e oenocitóides. Os prohemócitos foram as menores células observadas, sendo caracterizadas pela presença de um núcleo volumoso em relação ao citoplasma. Os granulócitos são caracterizados pela presença grânulos, apresentando variação no tamanho e na forma. Nessas células também foi observado um núcleo grande e excêntrico. Os oenocitóides possuem núcleo pouco desenvolvido que geralmente está localizado na região central. Os plasmatócitos observados apresentaram grandes projeções da membrana citoplasmática e foi o tipo celular que apresentou maior variação morfológica. Em E. rorotaense foi encontrado um maior número de plamatócitos no estágio de larva, granulócitos em pupa e prohemócitos no adulto. Enquanto em E. trombetense os prohemócitos foi mais abundantes no estágio de larva, os plasmatócitos em pupa, e plasmatócitos e granulócitos em adultos. Esse estudo de caracterização celular pode ser utilizado como modelo para futuros estudos em espécies de simulídeos vetoras. x

11 Abstract The black flies are insects of medical and veterinary importance due to transmit different pathogens to humans and animals however, little is known about the action of defense system of these insects against infection of these pathogens. The hemocytes are cells of immunological system of insects and their functions are to realize phagocytosis, and participte of coagulation process and encapsulation. The aims of this work were to identify and characterize hemocyte types found in Ectemnaspis rorotaense and E. trombetense. The black flies (larvae and pupae) were collected in Presidente Figueiredo municipality, Amazonas state, Brazil. The cells were characterized by optical and transmission electron microscopy. The differential count of cells was performed by light microscopy and to cell differentiation was used morphological characters. The types of cells found in hemolymph were prohemocytes, plasmatocytes, granulocytes and oenocytoids. The prohemocytes were smallest cells observed and characterized by the presence of a large nuclei compared to the cytoplasm. The granulocytes are characterized by the presence of granules with variation in size and shape. This cells were observed large and eccentric nucleus. The oenocytoids have less developed nucleus and located in the central region. The plasmatocytes showed many morphological variations and large projections in cytoplasmatic membrane. In E. rorotaense was found a large number of plasmatocytes, granulocytes and prohemocytes respectively in stages of larvae, pupae, and adults. While in E. trombetense was found was found a large number of prohemocytes, plasmatocytes respectively in larvae and pupae, and the same amount of plasmatocytes and granulocytes in adults. This study cell characterization can be used as a model for future studies on species of blackfly vectors. xi

12 SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS... XIV LISTA DE TABELAS... XVII 1. INTRODUÇÃO FAMÍLIA SIMULIIDAE Características gerais e distribuição Biologia e ecologia Importância médica, veterinária e econômica dos Simuliidae Estudos com Simuliidae na Amazônia Espécies Ectemnaspis rorotaense e E. trombetense Mecanismo de defesa dos insetos Hemolinfa Hemócitos Estudos com hemócitos de insetos OBJETIVOS Objetivo Geral Objetivos específicos MATERIAL E MÉTODOS Coleta de simulídeos Coleta de hemolinfa Microscopia de Luz Contagem diferencial de hemócitos Microscopia Eletrônica de Transmissão RESULTADOS CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DOS HEMÓCITOS DE ECTEMNASPIS ROROTAENSE E ECTEMNASPIS TROMBETENSE Prohemócitos Granulócitos Oenocitóides Plasmatócitos xii

13 CONTAGEM DIFERENCIAL DOS HEMÓCITOS EM LARVAS, PUPAS E ADULTOS DE ECTEMNASPIS ROROTAENSE E DE ECTEMNASPIS TROMBETENSE DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS xiii

14 LISTA DE FIGURAS Figura 1: Locais de coleta de simulídeos das espécies Ectemnaspis rorotaense e Ectemnaspis trombetense. (A) Mapa do estado do Amazonas mostrando a localização do município de Presidente Figueiredo. (B) Imagem de satélite mostrando a localização das áreas de coleta..30 Figura 2: Locais de coleta de larvas e pupas das espécies Ectemnaspis rorotaense e Ectemnaspis trombetense. (a) Cachoeira da Naza no Km 6 e (b) Cachoeira do Sossego da Pantera no Km 20, Município de Presidente Figueiredo, Amazonas, Brasil Figura 3: Transporte e tratamento do material coletado em campo. (a) Armazenamento e transporte de substratos com imaturos de simulídeos. (b) Frascos para separação individual das pupas das espécies das duas espécies do estudo. (c) Adultos emergidos de Ectemnaspis. rorotaense e Ectemnaspis trombetense Figura 4: Procedimento para coleta de hemolinfa. (a) - Simulídeos adormecidos no gelo; (b) - Sistema utilizado para perfusão da hemolinfa (1- Lupa estériomicroscopio, 2- Capilar de vidro, 3- Suporte para capilar); (c) Procedimento de coleta da hemolinfa em adulto de simulídeo ( 1- Capilar inoculando anticoagulante, 2- Liberação de hemolinfa ) Figura 5: Procedimento para coloração das células e montagem das lâminas para microscopia òptica. (a) - Kit Panótico para coloração das lâminas. (b) - Lâminas de vidro coradas; (c) - Microscópio òptico Figura 6: Procedimento para microscopia de transmissão. (a) - Emblocamento de material em resina; (b) - Ultramicrometro, utilizado para realizar os cortes ultrafinos do material em resina; (c) - Microscópio eletrônico de transmissão utilizado para obter as imagens das células Figura 7: Caracterização de hemócitos de Ectemnaspis. rorotaense em microscopia óptica. (A) Prohemócitos, com núcleo grande (seta fina) ocupando quase todo o citoplasma; (B) Granulócito apresentando forma irregular e com presença de grânulos no citoplasma (seta fina vermelha); (C) Oenocitóide com um pequeno núcleo localizado centralmente (seta fina); (D) Plasmatócito com visíveis extensões da membrana citoplasmática (seta grossa) e um núcleo centralizado (seta fina) xiv

15 Figura 8: Caracterização de hemócitos de Ectemnaspis trombetense em microscopia óptica. (A) - Prohemócitos, exibindo um núcleo grande (seta fina) ocupando quase todo o citoplasma, (B) Granulócito, com muitos grânulos presentes no citoplasma (seta vermelha) e núcleo grande localizado centralmente (seta fina); (C) Oenocitóide com um núcleo pouco desenvolvido (seta fina); (D) - Plasmatócito apresentando uma grande projeção da membrana citoplasmatica (seta grossa) Figura 9: Caracterização dos hemócitos de Ectemnaspis rorotaense em microscopia eletrônica de transmissão. (A) Prohemócito apresentando um núcleo volumoso (V), citoplasma com algumas mitocôndrias (m) e retículo endoplasmático (Re). (B) Granulócito com presença de heterocromatina no núcleo (N), citoplasma apresentando projeções da membrana (seta grande), reticulo endoplasmático (Re), grânulos (g) e vesículas (ve). (C) Oenocitóide exibindo um pequeno núcleo (N), no citoplasma presença de mitocôndrias (m), vesículas (Ve) e reticulo endoplasmático (Re). (D) Plasmatócito exibindo forma alongada e projeções da membrana citoplasmática (seta grande), no citoplasma presença de mitocôndrias (m), vesícula (Ve) e retículo endoplasmático (Re) Figura 10: Caracterização dos hemócitos de Ectemnaspis trombetense em microscopia eletrônica de transmissão. (A) Prohemócito apresentando um núcleo volumoso (V), citoplasma com pequena projeção da membrana (seta grande), algumas mitocôndrias (m) e reticulo endoplasmático (Re). (B) Granulócito com presença de heterocromatina no núcleo (N), citoplasma apresentando projeções da membrana (seta grande), reticulo endoplasmático (Re), grânulos (G) e vesículas (Ve). (C) Oenocitóide exibindo um pequeno núcleo (N), no citoplasma presença de mitocôndrias (m), vesículas (Ve) e reticulo endoplasmático (Re). (D) Plasmatócito exibindo forma alongada, no citoplasma apresenta mitocôndrias (m), vesícula (Ve) e retículo endoplasmático (Re) Figura 11: Diferenças morfológicas observadas em hemócitos de Ectemnaspis rorotaense e Ectemnaspis trombetense em microscopia óptica. (A-C) Prohemócitos apresentando diferentes padrões de morfologia e em alguns foram observados indícios de divisão celular e a presença de pequenas projeções da membrana citoplasmática. (D-F) Granulócitos apresentando membrana plasmática irregular e com presença de visíveis grânulos xv

16 Figura 12: Diferenças morfológicas observadas em hemócitos de Ectemnaspis rorotaense e Ectemnaspis trombetense por microscopia óptica. (A-B) Oenocitóides com variações morfológicas, células apresentando núcleo pouco desenvolvido, localizado centralmente ou deslocado. (C-F) Plasmatócitos apresentaram maior variação morfológica, geralmente com longas projeções da membrana citoplasmática, com núcleo localizado no centro, em algumas células foi observado um núcleo deslocado Figura 13: Diferenças morfológicas observadas em plasmatócitos de Ectemnaspis rorotaense e E. trombetense por microscopia eletrônica de transmissão. (A) plasmatócito com forma irregular e com projeções da membrana citoplasmática. (B) plasmatócito com forma mais arredondada apresentando uma longa extensão da membrana citoplasmática. (C) plasmatócito com pequenas projeções da membrana. (D) célula com forma mais alongada e com um grande número de vacúolos no citoplasma Figura 14: Número de hemócitos encontrados em Ectemnaspis rorotaense, coletados na cachoeira Cachoeira da Naza, Km 6 e Sossego da Pantera, Km 20 no município de Presidente Figueiredo, estado do Amazonas. As letras maiúsculas e minúsculas nas barras indicam que houve uma diferença significativa após o teste de Kruskal-Wallis seguido de Student- Newman-Keuls xvi

17 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Número total de prohemócitos, plasmatócitos, oenocitóides e granulócitos encontrados em larvas, pupas e adultos da espécie Ectemnaspis rorotaense, coletados na Cachoeira da Naza, Km 6 e Sossego da Pantera, Km 20 no município de Presidente Figueiredo, estado do Amazonas, Brasil Tabela 2: Número total de prohemócitos, plasmatócitos, oenocitóides e granulócitos encontrados na hemolinfa de adultos de Ectemnaspis rorotaense, coletados na Cachoeira da Naza, Km 6 e Sossego da Pantera, Km 20 no município de Presidente Figueiredo, estado do Amazonas, Brasil Tabela 3: Número total de prohemócitos, plasmatócitos, oenocitóides e granulócitos encontrados na hemolinfa de larvas, pupas e adultos na espécie Ectemnaspis trombetense, coletados na Cachoeira da Naza, Km 6 e Sossego da Pantera, Km 20 no município de Presidente Figueiredo, estado do Amazonas Tabela 4: Número total de prohemócitos, plasmatócitos, oenocitóides e granulócitos encontrados na hemolinfa de adultos de Ectemnaspis trombetense, coletados na Cachoeira da Naza, Km 6 e Sossego da Pantera, Km 20 no município de Presidente Figueiredo, estado do Amazonas, Brasil xvii

18 1. INTRODUÇÃO Família Simuliidae 1.1. Características gerais e distribuição Os simulídeos são conhecidos popularmente no Brasil, como borrachudos ou piuns. Pertencem à ordem Diptera, subordem Nematocera, infraordem Culicomorpha, superfamília Simulioidea e família Simuliidae (Borkent 2012). Essa família está subdividida nas subfamílias Parasimuliinae que tem distribuição no Neártico, e Simuliinae que é cosmopolita (Adler e Crosskey 2014). Dentre os dípteros, a família Simuliidae é uma das mais estudadas, com espécies listadas no mundo, sendo 330 registradas para a região Neotropical. No Brasil são conhecidas 90 espécies, das quais 25 são registradas para o estado do Amazonas (Adler e Crosskey 2014) Biologia e ecologia Os simulídeos são insetos holometábolos passando durante seu ciclo de vida pelos estágios de ovo, larva, pupa, que se desenvolvem em ambiente aquático, e adulto em ambiente terreste (Crosskey 1990). As fêmeas ovipositam sobre substratos submersos (pedras e vegetações) em rios, igarapés, cachoeiras e corredeiras. Em cada postura são colocados em média de 100 a 600 ovos (Crosskey 1990). Esses são muito pequenos com cerca 100 a 400µm, forma ovóide e são revestidos por uma massa gelatinosa, esse estágio dura em média cerca de quatro a cinco dias em espécies neotropicais (Petry et al. 2006). 18

19 As larvas vivem fixas a diferentes substratos, como folhas, raízes, galhos, pedras e objetos presos à correnteza, podendo ocupar ambientes antropizados ou preservados (Hamada 1989; Hamada e Adler 2001). Durante essa fase se alimentam de matéria orgânica, bactérias, algas e zooplancton (Crosskey 1990; Shelley et al. 2010). As larvas passam por sete a nove estádios dependendo da espécie e das condições ambientais (Crosskey 1990). A espécie Psaroniocompsa incrustata (Lutz) passa por oito estádios larvais no nordeste brasileiro (Silva et al. 2008). As pupas dos simulídeos são coniformes, possuem um par de filamentos brânquias projetadas na área do tórax, vivem aderidas aos substratos. Esse estágio dura entre quatro a cinco dias em espécies na região neotropical. Após este período o adulto emerge dentro de uma bolha que estoura ao entrar em contato com o ar (Coscarón e Coscarón - Arias 2007). Os estágios imaturos (larva e pupa) são importantes para determinação taxonômica do grupo (Hamada e Adler 2001). Os adultos possuem aproximadamente entre 2 a 4 mm de comprimento, antenas curtas geralmente com 11 segmentos, aparelho bucal tipo sugador cortador de pele com uma probóscide curta e robusta, tórax arqueado, asas largas e hialinas, pernas curtas, corpo geralmente escuro ou negro e algumas vezes castanho - avermelhado ou amarelado (Coscarón e Coscarón - Arias 2007; Shelley et al. 2010). São facilmente reconhecidos pelo tipo de antenas, padrão de coloração do tórax e venação das asas (Adler e Currie 2009). Possuem hábito diurno, em algumas espécies ambos os sexos utilizam néctar das flores, seiva de plantas e sucos de frutas como fonte de alimento (Crosskey 1990; Medeiros et al. 2008). As fêmeas de algumas espécies são hematófagas, podendo ser transmissoras de agentes patogênicos para o homem e outros animais (Crosskey 1990). 19

20 1.3. Importância médica, veterinária e econômica dos Simuliidae As fêmeas hematófagas de algumas espécies são vetores de diversos patógenos como vírus, bactérias, protozoários e helmintos para humanos e outros animais (Crosskey 1990; Coscarón e Coscarón- Arias 2007). Dentre os patógenos transmitidos ao homem destaca-se a filária Onchocerca volvulus (Leuckart), causadora da oncocercose (cegueira dos rios), doença caracterizada pela formação de nódulos subcutâneos, prurido, alterações na pele e, na forma mais grave, pode levar a cegueira (Moraes et al. 1972; Moraes 1991). No Brasil é encontrada na área indígena Yanomami, localizada ao norte do estado do Amazonas e Roraima (Moraes et al. 1974; Moraes e Chaves 1974). Também são transmissores da Mansonella ozzardi (Manson), agente etiológico da mansonelose, que tem distribuição restrita em alguns países da América do Sul (Tavares 1981). No Brasil já foi encontrada nos estados do Amazonas, Mato Grosso, Roraima, Acre e Rôndonia (Deane 1949; Oliveira 1963; D Andretta et al. 1969; Adami et al. 2014; Velasques 2013). Os simulídeos são considerados como possíveis agentes do Pênfigo Foliáceo ou Fogo Selvagem, uma doença autoimune e endêmica caracterizada pela formação de bolha na pele e lesões cutâneas (Zaitz et al. 2000). Acredita-se que essa doença seja desencadeada por alergias a substâncias encontradas na saliva desses insetos (Diaz et al. 1989). Na região Norte do Brasil esses insetos também foram apontados como causadores da Síndrome Hemorrágica de Altamira (SHA), uma púrpura trombocitopênica caracterizada por hemorragias cutâneas, e, em alguns casos, sangramento das mucosas. Essa síndrome é possivelmente causada pela 20

21 hipersensibilidade à secreção salivar, após a exposição a um grande número de picadas de algumas espécies de simulídeos (Pinheiro et al. 1974; Costa-júnior et al. 1997). Esses insetos também são causadores em alguns locais de sérios danos econômicos no setor veterinário, uma vez que são transmissores de diversos patógenos aos animais. Na América do Norte são apontados como transmissores do protozoário Leucocytozoon Berestneff, que causa leucocitozoonose ou malária das aves, presente principalmente em perus, frangos, patos e gansos. Também são vetores da oncocercose bovina, uma infecção não patogênica causada por várias espécies de nematódeos do gênero Onchocerca. Além disso, as picadas desses insetos podem causar reações alérgicas em alguns animais, além do stress que consequentemente provoca a redução na produção de leite, da carne bovina e de ovos em aves (Crosskey 1990). Na América Latina foram apontados como prováveis vetores da Encefalite Equina, doença que pode afetar o homem de forma circunstancial (Homan et al. 1985). As picadas desses insetos muitas vezes além de incômodo podem causar reações alérgicas no homem e consequentemente influenciar de forma negativa na economia e no turismo dessas áreas afetadas (Crosskey 1990). Um exemplo é a espécie Chirostibia pertinax (Kollar) que, no estado de São Paulo, causa prejuízos econômicos nos setores da pecuária e turismo devido à sua abundância e voracidade (Araújo-Coutinho et al. 1988) Estudos com Simuliidae na Amazônia Devido a importância dos simulídeos e a sua participação no ciclo de transmissão de diferentes agentes patogênicos para o homem, no estado do Amazonas vários estudos foram realizados com esses insetos. 21

22 Até o presente seis espécie de simulídeos tem sido incriminada como vetoras de filárias para o homem: Thyrsopelma guianense (Wilse), Notolepria exiguua (Roubaud), Psaroniocompsa incrustata (Lutz), Cerqueirellum oyapockense (Floch e Abonnenc), Cerqueirellum amazonicum (Goeldi) e Cerqueirellum argentiscutum (Cerqueira 1959; Shelley e Shelley 1976; Shelley et al. 1980; Moraes et al. 1985; Shelley et al. 1997; Py- Daniel et al. 2000). Além dessas espécies, relativamente bem conhecidas, existem vários estudos com outras espécies de simulídeos no estado do Amazonas, referentes à biologia (Hamada 1998), ecologia (Hamada 1998; Medeiros et al. 2008), taxonomia clássica e molecular (Hamada e Adler 1998; Hamada e Adler 2001; Velásquez et al. 2002; Scarpassa e Hamada 2003; Py- Daniel et al. 2005; Alvan-Aguilar et al. 2005; Pessoa et al. 2008; Hamada et al. 2008; Hamada et al. 2010; Crainey et al. 2014). Estudos realizados por Hamada e Adler (2001) relataram abundância dos simulídeos nos municípios de Presidente Figueiredo, Manacapuru, Careiro da Várzea, Novo Airão e Itacoatiara, no estado do Amazonas, onde foram registradas onze espécies de simulídeos. Ectemnaspis rorotaense (Floch e Abonnenc) e E. trombetense (Hamada, Py- Daniel e Adler) fazem parte dessas espécies coletadas na região Espécies Ectemnaspis rorotaense e E. trombetense As espécies E. rorotaense e E. trombetense pertencem ao grupo de espécies Perflavum (Adler e Crosskey 2013). A primeira espécie é encontrada na Guiana Francesa, Guiana, Colômbia, Venezuela e o Brasil, onde é encontrada nos estados do Amapá, Amazonas, Mato Grosso, Pará e Rondônia (Adler e Crosskey 2014). 22

23 Os adultos de E. rorotaense, possuem cerca de 2-2,5mm de comprimento, apresentam um padrão de coloração amarelada. Em um estudo realizado na Serra das Andorinhas no estado do Pará, foram registradas fêmeas de E. rorotaense atacando humanos (Monteiro-Santos 2008). Nesse estágio são morfologicamente muito semelhantes às espécies E. maroniense (Floch e Abonnenc) e E. suarezi (Ramírez Pérez, Rassi e Ramírez), nesse caso sendo necessários os estágios imaturos (larva de ultimo estádio e pupa) para diferenciação das espécies. As larvas de último instádio podem ser identificadas através da morfologia do histoblasto blaquial. As pupas de E. rorotaense possuem entre 17 e 23 filamentos brânquias, longos, finos e levemente pigmentados (Hamada e Adler 1998). As formas imaturas (larvas e pupas) dessa espécie são encontradas em ambientes mais conservados como em áreas de floresta, substratos tipo troncos, folhas secas e em decomposição. (Hamada e Adler 2001). A espécie E. trombetense é registrada no Brasil e na Guiana Francesa. No Brasil a espécie ocorre nos estados de Amazonas, Amapá, Pará e Roraima (Adler e Crosskey 2014). Os adultos de E. trombetense possuem o corpo amarelado e medem cerca de 2-4,6mm de comprimento. Na fase larval essa espécie pode ser diferenciada das demais espécies do grupo Perflavum pela forma do histoblasto branquial das larvas maduras. Os estágios imaturos são encontrados em ambientes de floresta, córregos e em locais com presença de cachoeiras (Hamada e Adler 1998). As pupas de E. trombetense possuem forma de bota ou sapatiformes, e apresentam coloração castanho escuro. Nessa fase podem ser reconhecidas pelo característico padrão de seus filamentos branquiais que varia entre 160 e 250 filamentos (Hamada e Adler 1998). Essas espécies são relativamente pouco estudadas, com apenas alguns trabalhos realizados no estado do Amazonas, que abordaram a biologia e taxonomia. Ambas as espécies 23

24 são abundantes nos municípios próximos de Manaus (Hamada e Adler 1998; Hamada e Adler 2001; Scarpassa e Hamada 2003) Mecanismo de defesa dos insetos Os insetos desenvolveram um eficiente sistema de defesa contra ação de patógenos. A cutícula externa, o revestimento quitinoso da traquéia, a armadura cibarial e a matriz peritrófica no intestino médio constituem as primeiras barreiras físicas de defesa dos insetos contra organismos invasores (Dunn 1986; Lemaitre e Hoffman 2007). A armadura cibarial presente em algumas espécies de insetos constitui também uma barreira física contra infecções, além de ser um fator indicativo da competência vetorial (Mcgreevy et al. 1978; Shelley et al. 1997). Espécies de simulídeos com armadura cibarial apresentam baixo índice de infecção por microfilarias (ex. C. oyapockense). Por outro lado, foi observado que fêmeas de T. guianense que não possuem dentes grandes nessa estrutura apresentaram maiores cargas de microfilarias, sugerindo que essa configuração morfológica do cibário seja uma característica importante para as espécies vetoras da oncocercose (Shelley et al. 1997). Quando as barreiras físicas de defesa são rompidas pelos invasores, eles penetram no interior dos insetos e entram em contato com a hemolinfa, ativando o sistema imune inato, que por sua vez é composto por uma resposta imune humoral e outra celular. A imunidade humoral é ativada por moléculas específicas do inseto que interagem com moléculas padrão do patógeno e ativam receptores de membrana nas células do corpo gorduroso, desencadeando cascatas de reações químicas que terminam na produção de moléculas efetoras para combater o invasor. A imunidade celular é mediada por células que, uma vez ativadas, 24

25 participam dos processos de fagocitose, encapsulação e melanização (Lemaitre e Hoffman 2007) Hemolinfa A hemolinfa é um fluido aquoso que circula na hemocele e contém íons, moléculas e células (hemócitos). Pode apresentar coloração clara ou mesmo incolor, podendo também ser amarelada ou esverdeada, raramente vermelha. O volume pode variar de acordo com o estágio da vida e com as condições fisiológicas do inseto, com cerca de 20 a 40% do peso total nas larvas e entre 5 e 40 % do peso corporal das pupas e adultos de alguns insetos. O plasma constitui a parte líquida da hemolinfa, onde também são encontradas muitas substâncias dissolvidas, tais como sais, açúcares, proteínas e hormônios. Estas substâncias podem variar entre insetos e entre diferentes fases da vida do mesmo inseto. A hemolinfa tem a função de mediar todas as trocas químicas entre os tecidos dos insetos (Chapman 1998; Triplehorn e Jonnson 2011; Gullan e Cranston 2007) Hemócitos Os hemócitos são as células do sistema imune dos insetos, alguns circulam livremente na hemolinfa e outros podem ser encontrados aderidos aos tecidos. Variam em quantidade de a por mm 3 de hemolinfa, dependendo do estágio de vida do inseto (Triplehorn e Jonnson 2011). Em estudos realizados com Drosophila Fállen, modelo utilizado para estudos do sistema imune, foi mostrado que uma primeira população de hemócitos é formada durante o estágio embrionário na mesoderma procefálica e uma segunda população durante o estágio larval, no gânglio linfático, o órgão hematopoiético (Wood e Jacinto 2007). 25

26 Os hemócitos podem apresentar formas diferentes quando expostos a diferentes condições, o que tem tornado difícil uma classificação universal dessas células (Chapman 1998). São classificados em sete tipos: prohemócitos, plasmatócitos, granulócitos, oenocitóides, coagulócitos, adipohemócitos e esferulócitos (Gupta 1985). No entanto em uma das classificações mais utilizadas para estas células, além dos tipos citados acima, são adicionados mais dois tipos: podócitos e vermiformes, que são encontradas em poucos insetos (Jones 1962). Essas células desempenham importantes funções de defesa como fagocitose, encapsulação e nodulação (Dunn 1986). A fagocitose é uma forma defesa contra vírus, bactérias, fungos ou protozoários. Esse processo ocorre através do reconhecimento, englobamento e destruição intracelular desses invasores. Os plasmatócitos e os granulócitos são os principais tipos de hemócitos envolvidos nesse mecanismo de defesa na maioria dos insetos (Ratcliffe et al. 1979). Em larvas de Drosophila os lamelócitos (= oenocitóides) são as células responsáveis pela fagocitose de microorganismos e de células apoptóticas (Lemaitre e Hoffaman 2007). A encapsulação ocorre quando o agente invasor é muito grande para ser fagocitado. Em larvas de Drosophila quando os lamelócitos circulantes na hemolinfa reconhecem um invasor emitem sinais para que no gânglio linfático ocorra a diferenciação de prohemócitos em lamelócitos. Essas células formam um revestimento (capsula) em torno do invasor, desencadeando uma cascata de melanização e consequentemente a morte do invasor (Lemaitre e Hoffman 2007). A nodulação é muito semelhante ao processo de encapsulação, que é ativada quando ocorre uma grande concentração de agentes invasores na hemolinfa, não sendo possível eliminá-los por fagocitose (Ratcliffe et al. 1979). Além das funções mencionadas 26

27 acima, os hemócitos também auxiliam na coagulação da hemolinfa e no armazenamento e distribuição de nutrientes (Gullan e Cranston 2007) Estudos com hemócitos de insetos O primeiro estudo que relata sobre hemócitos em invertebrados, segundo Jones (1962) foi realizado por Swammerdam (1669). Posteriormente Cuenot (1896), fez uma prévia observação sobre e função dessas células em diferentes espécies. No entanto foi Millara (1947), quem classificou pela primeira vez essas células em quatro tipos. Desde então a classificação dessas células vem sendo revista em vários estudos (Yeager 1945; Wigglesworth 1956; Jones 1962; Cunha et al. 1976; Gupta 1985; Lello et al. 1987; Berger e Slavícková 2008; Ghasemi et al. 2013). Estudo da hemolinfa de gafanhotos adultos machos Tropidacris collaris (Stoll) (Orthoptera, Romaleidae), através de microscopia de luz, mostraram os seguintes tipos de células: prohemócitos, plasmatócitos, coagulócitos e granulócitos, com maior abundância de plasmatócitos, que são importantes na fagocitose (Correia et al. 2005). Em larvas de Papilio demoleus (Linnaeus) (Lepidoptera: Papilionidae), usando microscopia eletrônica de varredura (MEV), foram identificados seis tipos de hemócitos: prohemócitos, plasmatócitos, adiphoemócitos, granulócitos, enocitóides e esferulócitos, vermiformes e podócitos (Jalali e Salehi 2008). Brayner et al. (2005) caracterizaram, através de microscopia ótica e microscopia eletrônica de transmissão, seis tipos de hemócitos em Culex quinquefasciatus: prohemócitos, esferulócitos, adipohemócitos, oenocitóides, plasmatócitos e granulócitos. Em um estudo de caracterização de hemócitos de fêmeas de Aedes aegypti (Linnaeus) e Aedes albopictus (Skuse), utilizando microscópia de luz e MET, foram identificados seis tipos de hemócitos: 27

28 prohemócitos, adipohemócitos, granulócitos, plasmatócitos, oenocitóides e trombocitóides (Araújo 2011). Em Simuliidae Rubtsov (1959) foi o primeiro a descrever os tipos celulares encontrados na hemolinfa de larvas, pupas e adultos de simulídeos paleártico, que ultilizando um sistema de classificação antiga, identificou os seguintes tipos celulares: oenocitos, oenocitóides, hemócitos granulares, proleucócitos, macronucleócitos, micronucleócito, hemócitos fusiformes, fagócitos, adipócitos. Luckhart (1992), utilizando microscopia ótica e MEV identificou quatro tipos de hemócitos em Simulium vittatum [=Psilozia vittata] (Zetterstedt): prohemócitos, plasmatócitos, granulócitos e esferulócitos. Posteriormente Cupp et al. (1997), descreveu alterações no número e na morfologia em hemócitos de Simulium vittatum [=Psilozia vittata] após infecção em laboratório com Onchocerca linealis. Estudos sobre resposta imune em Simuliidae são escassos. A região amazônica é área endêmica de filarioses transmitidas por simulídeos. Nenhum trabalho até o momento foi desenvolvido sobre o tema na região Neotropical. O presente trabalho caracterizou as células do sistema de defesa das espécies E. rorotaense e E. trombetense, que apesar de não serem espécies reconhecidas como vetoras, constituem, devido às facilidades de acesso aos criadouros, modelos para estudo de hemócitos. Esse passo é importante para compreender a dinâmica de interação parasitahospedeiro e de conhecimento da biologia e fisiologia desses insetos. 28

29 2. OBJETIVOS Objetivo Geral Realizar o estudo de caracterização e proporção de tipos celulares da hemolinfa de Ectemnaspis rorotaense e Ectemnaspis trombetense Objetivos específicos - Identificar os tipos de hemócitos em larvas, pupas e adultos de E. rorotaense e E. trombetense. - Descrever morfologicamente e ultra-estruturalmente os hemócitos presentes na hemolinfa E. rorotaense e E. trombetense. - Realizar a contagem diferencial dos hemócitos em larvas, pupas e adultos de E. rorotaense e E. trombetense. 29

30 3. MATERIAL E MÉTODOS Coleta de simulídeos As coletas dos simulídeos (larvas e pupas) foram realizadas no município de Presidente Figueiredo, estado do Amazonas, Brasil, localizado a aproximadamente 107 Km da cidade de Manaus, com uma área territorial de Km² e uma temperatura média de 28,5ºC (Figura 1a) (IBGE, 2013). As larvas e pupas foram coletadas no período de junho a dezembro de 2013, em duas corredeiras na rodovia AM 240: Cachoeira da Naza no Km 6 (Figuras 1b, 2a) e Sossego da Pantera no Km 20 (Figuras 1b, 2b). A B Figura 1: Locais de coleta de simulídeos das espécies Ectemnaspis rorotaense e Ectemnaspis trombetense. (A) Mapa do estado do Amazonas mostrando a localização do município de Presidente Figueiredo (Fonte: IBGE). (B) Imagem de satélite mostrando a localização das áreas de coleta (Fonte: GOOGLE MAPS). 30

31 Figura 2: Locais de coleta de larvas e pupas das espécies Ectemnaspis rorotaense e Ectemnaspis trombetense. (a) Cachoeira da Naza no Km 6 e (b) Cachoeira do Sossego da Pantera no Km 20, Município de Presidente Figueiredo, Amazonas, Brasil (Fonte: J. C. Silva). As larvas e pupas de E. rorotaense e de E. trombetense foram coletadas de forma manual através da remoção de substratos como, folhas verdes ou em decomposição, galhos e raízes submersas. Posteriormente, os substratos foram colocados em sacos plásticos contendo água do igarapé e acondicionados em caixas térmicas para manter a temperatura (Figura 3a), em seguida, foram transportadas para o Laboratório de Ecologia de Doenças Transmissíveis na Amazônia (EDTA) do Instituto Leônidas e Maria Deane Fiocruz Amazônia (ILMD), localizados na cidade de Manaus, Amazonas. As pupas maduras, caracterizadas por apresentarem aspecto geral mais escuro, foram separadas individualmente em frascos e mantidas a 27 o C para emergência dos adultos, que variou entre um e quatro dias (Figuras 3b e 3c). Posteriormente os adultos recém-emergidos foram identificados a nível específico segundo as chaves propostas por Hamada e Adler (2001) e Coscaron e Coscaron-Arias (2007). Para identificação das espécies foram utilizados caracteres morfológicos de larvas e pupas tais como: forma do histoblasto branquial, número e forma dos filamentos branquiais, forma do casulo e tubérculos cefálicos. A nomenclatura taxonômica utilizada seguiu a proposta de Py-Daniel e Sampaio (1994). 31

32 Figura 3: Transporte e tratamento do material coletado em campo. (a) Armazenamento e transporte de substratos com imaturos de simulídeos. (b) Frascos para separação individual das pupas das espécies das duas espécies do estudo. (c) Adultos emergidos de Ectemnaspis. rorotaense e Ectemnaspis trombetense (Fonte: J. C. Silva) Coleta de hemolinfa Para a coleta de hemolinfa de larvas, pupas e adultos recém-emergidos (um dia de vida), os indivíduos foram adormecidos no gelo por cerca de 1 a 2 minutos (Figura 4a), e em seguida foi realizado, com auxílio de um micro capilar de vidro acoplado a uma seringa Hamilton, uma perfusão na região torácica do inseto, onde foram inoculados 4μl de anticoagulante tampão de citrato (98 mm ClOH, 145 mm NaCl, 1,7 mm e EDTA e 41 mm de Ácido Cítrico) (Figuras 4b e 4c), imediatamente a hemolinfa foi coletada com auxilio de uma pipeta (Araújo et al. 2008). Após a coleta da hemolinfa, o material testemunho foi conservado em álcool a 70% e devidamente etiquetado. 32

33 Figura 4: Procedimento para coleta de hemolinfa. (a) - Simulídeos adormecidos no gelo; (b) - Sistema utilizado para perfusão da hemolinfa (1- Lupa estériomicroscopio, 2- Capilar de vidro, 3- Suporte para capilar); (c) Procedimento de coleta da hemolinfa em adulto de simulídeo (1- Capilar inoculando anticoagulante, 2- Liberação de hemolinfa ). (Fonte: J. C. Silva) Microscopia de Luz Após a coleta 10µl de hemolinfa foram colocadas individualmente em lâminas e deixadas para secar por um período de 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida as células foram coradas com o Kit Panótico Rápido (Laborclin), de acordo com o seguinte protocolo: inicialmente as células foram fixadas com o Metanol por 10 minutos, posteriormente foram imersas por um minuto na solução de xanteno 0,1% e por último imerso por um minuto na substância na solução de tiazina 0,1%. Em seguida as lâminas foram lavadas com água ultra pura e colocadas para secar à temperatura ambiente. Por fim, para montagem permanente das células foram adicionados meio Entellan (Merck) e lamínulas (Figuras 5a e 5b). No total foram montadas 100 lâminas de E. rorotaense e 50 lâminas de E. trombetense. Da primeira espécie foram selecionadas as 27 melhores lâminas e 19 lâminas para a segunda espécie. As lâminas foram analisadas em microscópio óptico em campo claro, modelo AX10 da ZEISS (Mager M2M) (Figura 5c). As células observadas foram fotografadas no aumento de 100X, com câmera acoplada ao microscópio utilizando os programas: Auto Montage do 33

34 EDTA do ILMD Fiocruz Amazônia e o programa ZEN pro 2012, do LIKA da Universidade Federal de Pernambuco e editadas usando o programa Adobe Photoshop. Para caracterização morfológica das células foram considerados: morfologia e o tamanho. Figura 5: Procedimento para coloração das células e montagem das lâminas para microscopia óptica. (a) - Kit Panótico para coloração das lâminas. (b) - Lâminas de vidro coradas; (c) - Microscópio óptico (Fonte: J. C. Silva) Contagem diferencial de hemócitos Para a contagem diferencial dos hemócitos em E. rorotaense e E. trombetense, foi realizada a coleta de hemolinfa como descrito anteriormente no item 3.2. A contagem das células foi realizada através do microscópio de luz em campo claro, em aumento de 100X. Foram utilizadas para diferenciação dos tipos celulares características morfológicas, como: tamanho celular, tamanho do núcleo, projeções da membrana citoplasmática e presença de grânulos (Brayner et al. 2005). A contagem diferencial das células foi analisada por estatística descritiva (total, média e desvio padrão) para todos os estágios (larva, pupa e adultos) e somente para os adultos foi comparada através dos testes Kruskal-Wallis e a posteriori de Student-Newman- 34

35 Keuls, analisados ao nível de significância de 5% (Ayres et al. 2007). As análises foram feitas no programa Bioestat Microscopia Eletrônica de Transmissão Foi coletada a hemolinfa de 200 adultos (machos e fêmeas) de Ectemnaspis rorotaense e de 200 adultos (machos e fêmeas) de Ectemnaspis trombetense, posteriormente colocada em microtubos de 1,5ml tratados com Sigmacote (Sigma) 24 horas antes do uso para evitar a adesão dos hemócitos na superfície interna dos mesmos (totalizando 4 pools contendo a hemolinfa de 60 indivíduos para cada espécie). A cada microtubo, contendo pool da hemolinfa foi adicionado fixador Karnovsky (glutaraldeido 2,5%, formaldeído 4,0% e tampão cacodilato de sódio 0,1 M ph 7.2), numa proporção de três partes de fixador Karnovsky e uma parte de hemolinfa. Em cada microtubo foi reunida a hemolinfa de 60 a 100 indivíduos dependendo da quantidade de adultos emergidos por dia. A hemolinfa foi centrifugada a 6000 rpm por 5 minutos, em seguida foi removido o excesso de fixador e a hemolinfa foi lavada três vezes consecutivas com tampão de cacodilato de sódio 0,1M ph 7,4. Em seguida as amostras foram pós fixadas, com tetróxido de ósmio 1% em tampão fosfato 0,1 M, ph 7,2, à temperatura ambiente e protegidos da luminosidade por 2 horas. Posteriormente foi centrifugado e retirado o excesso de ósmio e lavada novamente por três vezes consecutivas com tampão de cocodilato. Na etapa seguinte, a amostra foi desidratada com banhos de etanol em concentrações diferentes de 50%, 70%, 90% e três banhos a 100%. Cada banho durou 30 minutos a temperatura ambiente. Após a desidratação as amostras foram submetidas ao procedimento de infiltração e emblocamento (formação de blocos em resina) com séries crescentes de resina Epon 812 (Electron Microscopy Sciences) (Figura 6a). Posteriormente, com o auxílio de ultramicrótomo foram realizados cortes ultrafinos, em seguida as amostras foram contrastadas com citrato de chumbo, por 5 a 10 minutos, e acetato 35

36 de Uranila a 5%, por 20 a 30 minutos (Figura 6b) (Brayner et al.2005; Brayner et al. 2007; Araújo et al.2008). As análises dos cortes foram feitas em microscópio eletrônico de transmissão modelo Tecnai Spirit G1 Bio Twin da Fei Company, e as imagens foram obtidas por meio dos seguintes programas: Microscope User Interface (Fey Company) e TEM Imagine and Analysis, do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães - Fiocruz Recife (Figura 6c). Figura 6: Procedimento para microscopia de transmissão. (a) - Emblocamento de material em resina; (b) - Ultramicrótomo, utilizado para realizar os cortes ultrafinos do material em resina; (c) - Microscópio eletrônico de transmissão utilizado para obter as imagens das células (Fonte: J. C. Silva). 36

37 4. RESULTADOS Caracterização morfológica dos hemócitos de Ectemnaspis rorotaense e Ectemnaspis trombetense. Através da microscopia óptica e microscopia eletrônica de transmissão foram identificados quatro tipos morfológicos de células na hemolinfa de larvas, pupas e adultos de E. rorotaense: prohemócitos, plasmatócitos, granulócitos e oenocitóides (Figuras 7 e 9). Os mesmos tipos celulares foram encontrados na hemolinfa de larvas, pupas e adultos de E. trombetense (Figuras 8 e 10). Prohemócitos Os prohemócitos encontrados apresentam forma arredondada ou oval (Figuras 11A-C). São os menores tipos celulares observados na hemolinfa de E. rorotaense e E. trombetense variando de 5 a 10µm. Esse tipo celular é caracterizado pela presença de um núcleo volumoso em relação ao citoplasma, e em algumas dessas células foram visualizadas pequenas projeções da membrana citoplasmática (Figuras 7A e 8A). Em imagens de ultraestruturas foi observado no citoplasma a presença de poucas organelas, algumas mitocôndrias e reticulo endoplasmático (Figura 9A e 10A). Também foram encontrados agrupamentos com duas, três e quatro células (Figura 7A e 8A). Granulócitos Os granulócitos possuem forma arredondada e oval (11D F), variando de 20 a 25 µm, podem apresentar projeções da membrana plasmática. Mesmo em microscopia óptica foi possível visualizar grânulos no citoplasma dessas células (Figuras 7B e 8B). Através das imagens de ultraestrutura foi possível identificar no citoplasma o retículo endoplasmático rugoso, mitocôndrias, complexo de Golgi e algumas vesículas. Esse tipo celular é 37

38 caracterizado pela presença de grânulos com variação no tamanho e forma. Também foi observado um núcleo grande e geralmente excêntrico com ilhas de heterocromatina no seu interior (Figuras 9B e 10B). Oenocitóides Os oenocitóides apresentam formato arredondado ou oval (12A B), e em algumas ocasiões possuem projeções da membrana citoplasmática, o tamanho varia entre 10 e 15µm. São caracterizados por possuírem um núcleo pouco desenvolvido, que geralmente está localizado na região central (Figuras 7C e 8C). Em microscopia eletrônica apresentaram um citoplasma homogêneo com presença de mitocôndrias, vesículas, ribossomos e retículo endoplasmático rugoso (Figuras 9C e 10C). Plasmatócitos Os plasmatócitos observados apresentaram formas variadas (12C-F, 13A-D), com tamanho entre 45 e 55µm. Este tipo celular caracteriza-se pelas grandes projeções da membrana citoplasmática (Figuras 7D, 8D, 9D e 10D). Em imagens de ultraestrutura foi identificado no citoplasma o retículo endoplasmático rugoso, complexo de Golgi e vesículas que podem estar preenchidas com substâncias amorfas ou vazias. O núcleo dessas células geralmente é pequeno e excêntrico (Figuras 9D, 10D e 13A-D). 38

39 Figura 7: Caracterização de hemócitos de Ectemnaspis rorotaense em microscopia óptica. (A) Prohemócitos, com núcleo grande (seta fina) ocupando quase todo o citoplasma. (B) Granulócito apresentando forma irregular e com presença de grânulos no citoplasma (seta fina vermelha). (C) Oenocitóide com um pequeno núcleo localizado centralmente (seta fina). (D) Plasmatócito com visíveis extensões da membrana citoplasmática (seta grossa) e um núcleo centralizado (seta fina). Barra = 10µm. 39

40 Figura 8: Caracterização de hemócitos de Ectemnaspis trombetense em microscopia óptica. (A) - Prohemócitos, exibindo um núcleo grande (seta fina) ocupando quase todo o citoplasma. (B) Granulócito, com muitos grânulos presentes no citoplasma (seta vermelha) e núcleo grande localizado centralmente (seta fina). (C) Oenocitóide com um núcleo pouco desenvolvido (seta fina). (D) - Plasmatócito apresentando uma grande projeção da membrana citoplasmatica (seta grossa). Barra = 10 µm. 40

41 Figura 9: Caracterização dos hemócitos de Ectemnaspis rorotaense em microscopia eletrônica de transmissão. (A) Prohemócito apresentando um núcleo volumoso (N), citoplasma com algumas mitocôndrias (m) e retículo endoplasmático (Re). (B) Granulócito com presença de heterocromatina no núcleo (N), citoplasma apresentando projeções da membrana (seta grande), reticulo endoplasmático (Re), grânulos (g) e vesículas (Ve). (C) Oenocitóide exibindo um pequeno núcleo (N), no citoplasma presença de mitocôndrias (m), vesículas (Ve) e reticulo endoplasmático (Re). (D) Plasmatócito exibindo forma alongada e projeções da membrana citoplasmática (seta grande), no citoplasma presença de mitocôndrias (m), vesícula (Ve) e retículo endoplasmático (Re). 41

42 Figura 10: Caracterização dos hemócitos de Ectemnaspis trombetense em microscopia eletrônica de transmissão. (A) Prohemócito apresentando um núcleo volumoso (V), citoplasma com pequena projeção da membrana (seta grande), algumas mitocôndrias (m) e reticulo endoplasmático (Re). (B) Granulócito com presença de heterocromatina no núcleo (N), citoplasma apresentando projeções da membrana (seta grande), reticulo endoplasmático (Re), grânulos (g) e vesículas (Ve). (C) Oenocitóide exibindo um pequeno núcleo (N), no citoplasma presença de mitocôndrias (m), vesículas (Ve) e reticulo endoplasmático (Re). (D) Plasmatócito exibindo longa projeção da membrana plasmática (seta grande), no citoplasma presença de mitocôndrias (m), vesícula (Ve) e retículo endoplasmático (Re). 42

43 Figura 11: Diferenças morfológicas observadas em hemócitos de Ectemnaspis rorotaense e Ectemnaspis trombetense em microscopia óptica. (A-C) Prohemócitos apresentando diferentes padrões de morfologia e em alguns foram observados indícios de divisão celular e a presença de pequenas projeções da membrana citoplasmática. (D-F) Granulócitos apresentando membrana plasmática irregular e com presença de visíveis grânulos. Barra = 10 µm. 43

44 Figura 12: Diferenças morfológicas observadas em hemócitos de Ectemnaspis rorotaense e Ectemnaspis trombetense por microscopia óptica. (A-B) Oenocitóides com variações morfológicas, células apresentando núcleo pouco desenvolvido, localizado centralmente ou deslocado. (C-F) Plasmatócitos apresentaram maior variação morfológica, geralmente com longas projeções da membrana citoplasmática, com núcleo localizado no centro, em algumas células foi observado um núcleo deslocado. Barra = 10 µm. 44

45 Figura 13: Diferenças morfológicas observadas em plasmatócitos de Ectemnaspis rorotaense e Ectemnaspis trombetense por microscopia eletrônica de transmissão. (A) plasmatócito com forma irregular e com projeções da membrana citoplasmática. (B) plasmatócito com forma mais arredondada apresentando uma longa extensão da membrana citoplasmática. (C) plasmatócito com pequenas projeções da membrana. (D) célula com forma mais alongada e com um grande número de vacúolos no citoplasma 45

46 Contagem diferencial dos hemócitos em larvas, pupas e adultos de Ectemnaspis rorotaense e de Ectemnaspis trombetense. Em relação à contagem diferencial dos hemócitos, para a espécie E. rorotaense foi encontrado um maior número de plamatócitos no estágio de larva, granulócitos em pupa e prohemócitos no adulto (Tabela 1). No estágio adulto observou-se que prohemócitos apresentaram maior número em relação a outras células apresentando diferença estatística significativa (H = 7,9, gl = 3 p = 0,04) (Tabela 2). Com a análise a posteriori utilizando o teste de Student-Newman-Keuls foi observada diferença significativa entre os prohemócitos, oenócitos e granulócitos (p < 0,05) (Figura 14). Tabela 1: Número total de prohemócitos, plasmatócitos, oenocitóides e granulócitos encontrados em larvas, pupas e adultos da espécie Ectemnaspis rorotaense, coletados na Cachoeira da Naza, Km 6 e Sossego da Pantera, Km 20 no município de Presidente Figueiredo, estado do Amazonas, Brasil. Tipos de células Larva Pupa Adultos Prohemócitos ,0 ± 6,4 9,5 ± 12,1 Plasmatócitos ,6 ± 8,7 4,1 ± 5,6 Oenocitóides ,3 ± 1,7 3,0 ± 3,7 Granulócitos ,0 ± 3,7 4,4 ± 5,5 n larva = 6 lâminas, n pupa = 1, n adultos = 20 46

47 Tabela 2: Número total de prohemócitos, plasmatócitos, oenocitóides e granulócitos encontrados na hemolinfa de adultos de Ectemnaspis rorotaense, coletados na Cachoeira da Naza, Km 6 e Sossego da Pantera, Km 20 no município de Presidente Figueiredo, estado do Amazonas, Brasil. Prohemócito Plasmatócito Oenocitóide Granulócito Total Média e DP 9,5 ± 12,1 4,1 ± 5,6 3,0 ± 3,7 4,4 ± 5,5 Min - Máx n = 20 lâminas, DP = Desvio padrão, Min = Mínimo, Máx = Máximo. Figura 14: Número de hemócitos encontrados em Ectemnaspis rorotaense, coletados na cachoeira da Naza, Km 6 e Sossego da Pantera, Km 20 no município de Presidente Figueiredo, estado do Amazonas. As letras maiúsculas e minúsculas nas barras indicam que houve uma diferença significativa após o teste de Kruskal-Wallis seguido de Student-Newman-Keuls. Para a espécie E. trombetense foi observado um maior número de prohemócitos no estágio de larva e de plasmatócitos em pupa, e plasmatócitos e granulócitos em adultos 47