ORGANOGÊNESE IN VITRO DO CLONE 3336 DE Eucalyptus urograndis. IN VITRO ORGANOGENESIS OF Eucalyptus urograndis CLONE 3336

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1 ORGANOGÊNESE IN VITRO DO CLONE 3336 DE Eucalyptus urograndis IN VITRO ORGANOGENESIS OF Eucalyptus urograndis CLONE 3336 BETTENCOURT, GISELA MANUELA DE FRANÇA 1 ; DEGENHARDT- GOLDBACH, JULIANA 2 1 Acadêmica do Curso Superior de Tecnologia em Bioprocessos e Biotecnologia da Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR). 2 Engª. Agrónoma, Pesquisadora da Embrapa Florestas (Colombo, PR). Endereço eletrônico para correspondência: Juliana Degenhardt-Goldbach, <juliana@cnpf.embraba.br> Empraba Florestas. Estrada da Ribeira Km 111.Cep , Colombo PR

2 RESUMO: O gênero Eucalyptus (Família Myrtaceace), vem se destacando no setor florestal devido ao seu rápido crescimento, alta produtividade e boa qualidade da madeira Técnicas de micropropagação in vitro tem sido utilizada para a propagação de clones e obtenção de mudas comerciais em larga escala. Muitas pesquisas estão voltadas para o desenvolvimento de protocolos eficientes de organogênese in vitro de espécies de interesse econômico, para posteriormente serem utilizados no processo de transformação genética. Este trabalho teve como objetivo avaliar a resposta organogênica do clone 3336 do híbrido Eucalyptus urograndis em diferentes meios de culturas, concentrações e combinações de fitorreguladores vegetais, visando obter um protocolo de regeneração eficiente para a transformação genética. Foram utilizados explantes foliares de material juvenil mantido in vitro. Foram testados os meios WPM, JADS, QL e MS, todos suplementados com 0,5 μm de TDZ e 0,1 de ANA. Avaliou-se o efeito das auxinas ANA e 2,4-D combinadas com o TDZ, e o efeito das combinações entre as citocininas TDZ e BAP com ANA. Após 60 dias, os experimentos foram avaliados quanto à porcentagem de formação de calos, de brotações adventícias e de oxidação, através do teste de separação de médias Tukey ou Kruskal-wallis (p>0,05). Observou-se formação de calos em todos os tratamentos. O meio WPM com 0,5 μm de TDZ e 0,1 de ANA foi o que apresentou melhor desempenho na formação de brotações adventícias (45%). Altas concentrações de ANA e 2,4-D, e a combinação do BAP com ANA, mostraram-se poucos eficientes na regeneração de brotos. As maiores taxas de oxidação foram observadas no meio MS e no JADS com as auxinas ANA e 2,4-D. O meio WPM suplementado com 0,5 μm de TDZ e 0,1 de ANA é o mais indicado para a regeneração in vitro do clone 3336 do híbrido Eucalyptus urograndis. Palavras chaves: Meios de cultura. TDZ. ANA. 2,4-D. BAP. 2

3 ABSTRACT: Eucalyptus genus (Myrtaceace) has been prominent in the foresty sector due to its rapid growth woody, high productivity and wood quality. In vitro micropropagation techniques have been used for large scale propagation of selected clones. Many researches are focused on the development of efficient protocols for in vitro organogenesis of economic important clones, to use in the genetic transformation. This study aimed to evaluate the organogenic response of the clone 3336 of Eucalyptus urograndis hybrid in different culture media, concentrations and combinations of plant growth regulators in order to obtain an efficient regeneration protocol for genetic transformation. Leaves of the clone were used as explants. The media tested were WPM, JADS, QL and MS, all supplemented with 0.5 μm of TDZ and 0.1 μm of NAA. We evaluated the effect of NAA or 2,4-D combinated with TDZ and also the effect of combinations of BAP or TDZ with NAA. After 60 days, the experiments were evaluated for the percentage of callus formation, adventitious shoots formation and oxidation. Callus indictions was observed in all media tested. WPM medium with 0.5 mm TDZ and 0.1 NAA showed the best performance in the formation of buds (45%). High concentrations of the auxins NAA and 2,4-D, and the combination of BAP with NAA, showed lower effectiveness in shoot regeneration. The highest oxidation rates were observed in MS medium and JADS with the auxins NAA and 2,4-D. WPM medium supplemented with 0.5 μm of TDZ and 0.1 μm of NAA is the most suitable for in vitro regeneration of the clone 3336 from Eucalyptus urograndis. Keywords: Culture media. TDZ. NAA. 2,4-D. BAP. 3

4 1. INTRODUÇÃO O eucalipto é um dos gêneros florestais mais importantes no Brasil (Malysz et al., 2011). O híbrido Eucalyptus urograndis, desenvolvido por meio do cruzamento do E. grandis x E. urophylla, vem se destacando na sivicultura brasileira. Este híbrido apresenta caraterísticas favoráveis das duas espécies (Braga, 2008). As técnicas da micropropagação in vitro são empregadas na propagação de clones e mudas comerciais em larga escala, para a obtenção de plantas de genótipos superiores, isentas de vírus para a preservação de germoplasma, isto em um ambiente estéril e controlado, e em curto espaço físico e período de tempo (Ribeiro, 2006; Pimentel et al., 2008; Gabriel, 2009; Gutiérrez et al., 2011). Em espécies florestais, também são aplicadas para o rejuvenescimento (Wendling & Xavier, 2001; Schuch et al., 2008), proporcionando alta fidelidade genética, maior produtividade, uniformidade e desempenho no campo, (Gutiérrez et al., 2011). Em alguns métodos da transformação genética de plantas, como o método de transformação por Agrobacterium, as técnicas de regeneração in vitro são utilizadas como etapa final, para obtenção das plantas transformadas. A organogênese in vitro é o processo que visa a formação de brotações e raízes adventícias, a partir de calo ou diretamente dos tecidos vegetais (Bertozzo & Machado, 2010) e, é a técnica mais utilizada na transformação genética. A organogênese indireta, advinda de calo, segue pelas etapas de desdiferenciação das células, aquisição de competência, indução, determinação, diferenciação e formação do órgão (Peres, 2002). Como em qualquer outra técnica na cultura de tecidos vegetais, o processo de organogêse in vitro está sujeito a fatores internos e externos, como o genótipo do explante, a interação entre o explante e o meio de cultura, a composição do meio de cultura e a concentração e combinação dos fitorreguladores, em particular auxinas e citocininas, assim como os fatores ambientais sujeitos no cultivo (Alves et al., 2004; Ribeiro et al., 2010). Segundo Gabriel (2009), outro fator que interfere na capacidade de resposta in vitro é o tipo de explante, assim como o seu estágio de desenvolvimento. Existem relatos na literatura, de trabalhos com Eucalyptus por via da organogênese in vitro, com explantes de materiais juvenis, como hipocótilos, cotilédones, caule e folhas de material juvenil proveniente de sementes e embriões zigóticos, como também folhas de material mantido na fase de multiplicação in vitro (Alves et al., 2004). 4

5 Todavia, pelo sucesso de organogênese estar inteiramente ligado ao genótipo, ao tipo de explante, e aos outros aspectos mencionados anteriormente, há a necessidade de desenvolver protocolos eficientes para cada espécie assim como para os seus clones (Alves et al., 2004; Dibax, 2007; Batista et al., 2010; Borges, 2011). O presente trabalho teve como objetivo avaliar a resposta organogênica do clone 3336 do híbrido Eucalyptus urograndis em diferentes meios de culturas, concentrações e combinações de reguladores vegetais, visando obter um protocolo de regeneração eficiente para a transformação genética. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Material Vegetal Os experimentos foram realizados no laboratório de Cultura de Tecidos e Transformação da Embrapa Florestas, Colombo-Paraná. Foram utilizadas, como explantes iniciais, folhas de material jovem (com 5 semanas de cultivo) do clone 3336 do E. urograndis, mantidos in vitro na fase de multiplicação em meio de cultura MS (Murashige & Skoog, 1962) suplementado com 30 g.l -1 de sacarose, 0,2 mg.l -1 de BAP (6-benzilaminopurina), 0,1 mg.l -1 de inositol e 7,0 g.l -1 de ágar. 2.2 Organogênese in vitro Na indução de calos, foram avaliados diferentes meios de culturas e diferentes concentrações e combinações de reguladores vegetais. Para todos os experimentos, as folhas do material mantidas na fase de multiplicação foram cortadas na câmara de fluxo laminar com auxílio de materiais cirúrgicos e colocadas nos meios de cultura em placas de Petri com a face adaxial voltada para o meio de cultura. Os explantes permaneceram no escuro a 23 ± 2ºC por 28 dias, sendo repicados para o mesmo meio após 14 dias. Após esse período, foram transferidos para meio de indução de brotações por 32 dias, colocados em fotoperíodo de 16 h de luz, e também repicados a cada 14 dias para o mesmo meio. Após 120 dias os explantes serão transferidos para meio de multiplicação. Todos os meios foram suplementados com 30 g.l -1 de sacarose, 0,05 g.l -1 de mio-inositol para o meio JADS (Correia et al., 1995) e 0,1 g.l -1 para os demais meios, 0,5 mg.l -1 de Polivinilpirrolidona (PVP) e 7 g.l -1 de ágar. O ph dos mesmos, foi ajustado para 5,8 antes da autoclavagem por 20 minutos à 120 C. A citocinina TDZ 5

6 (tidiazuron), foi esterilizada por filtração, e em seguida adicionada ao meio autoclavado. Na fase de indução de calos, foi utilizado como controle o meio WPM (Lloyd & McCown, 1981) com 0,5 μm e 0,1 μm dos fitorreguladores TDZ e ANA (ácido naftalenoacético) e, para a indução de brotações adventícias, os explantes foram transferidos para o WPM suplementado por 5,0 μm de BAP e 0,5 μm de ANA Efeito de diferentes concentrações de macro e micronutrientes Os meios testados foram o WPM, JADS, QL (Quoirin e Leproive, 1977) e MS, todos com diferentes concentrações de micro e macronutrientes. Foi utilizada a combinação de 0,5 μm de TDZ e 0,1 μm de ANA Efeito do ácido naftalenoacético (ANA) Foram avaliadas diferentes concentrações de ANA, no meio de cultura JADS. O experimento consistiu de seis tratamentos (T1=controle, em μm de ANA: T2= 0,1; T3= 0,2; T4= 0,5; T5= 0,75 e T6= 1,0), todos combinados com 0,5 μm de TDZ. Para a indução de brotações adventícias utilizou-se o meio controle para o T1 e o JADS suplementado com 5,0 μm de BAP e 0,5 μm de ANA, para os tratamentos T2, T3, T4, T5 e T Efeito do ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) Foram testadas diferentes concentrações da auxina 2,4-D. O experimento consistiu de quatro tratamentos sendo T1: 0,5 μm de TDZ + 0,1 μm de ANA; T2: 0,5 μm de TDZ + 0,1 μm de ANA; T3: 0,5 μm de TDZ + 0,1 μm de 2,4-D e T4: 0,5 μm de TDZ + 0,5 μm de 2,4-D. Foi utilizado o meio JADS para os tratamentos T2, T3 e T Avaliação dos reguladores TDZ, ANA e BAP Foram avaliadas diferentes concentrações e combinações dos reguladores vegetais. O experimento consisitiu de 5 tratamentos sendo T1: 0,5 μm de TDZ + 0,1 μm de ANA; T2: 0,25 μm de TDZ + 0,1 μm ANA; T3: 5,0 μm de BAP + 0,1 μm de ANA; T4: 2,5 μm de BAP + 0,1 μm de ANA e T5: 0,25 μm de TDZ + 2,5 μm de BAP. 6

7 2.3 Avaliação dos experimentos Os experimentos consistiram de 6 repetições (placas de petri), com 10 explantes em cada repetição. Aos 60 dias após o início de cada experimento, foram avaliadas as porcentagens de formação de calos nos explantes, explantes com brotações adventícias e porcentagem de oxidação. As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do software R e, as médias dos tratamentos foram testadas quanto à normalidade. Quando apresentaram distribuição normal foram submetidas ao teste de separação de médias de Tukey (p>0,05), caso contrário eram avaliados pelo teste de Kruskal-wallis (p>0,05). 3. RESULTADOS E DISCUSSÕES 3.1 Efeito de diferentes concentrações de macro e micronutrientes Observou-se formação de calos em todos os tratamentos (95 a 100%) (Figura 1a.), sendo que não houveram diferenças estatísticas entre eles. Quanto à indução de brotações adventícias, o WPM apresentou melhor desempenho com 22% de regeneração de brotações, como pode ser observado na Figura 1c, e o pior desempenho foi do JADS (3%), mesmo assim não houve diferença estatística entre os meios de cultura. A menor porcentagem de oxidação foi do meio WPM, diferindo estatisticamente do MS que apresentou a maior taxa (Tabela 1). Tabela 1. Porcentagens de brotações adventícias e de oxidação, em diferentes meios de cultura suplementados com 0,5 μm de TDZ e 0,1 μm de ANA, após 60 dias de cultivo. Meio de cultura Aos 60 dias Formação de calos** Brotações adventícias** Oxidação* WPM 100 a 22 a c JADS 95 a 3 a b QL 100 a 10 a 55 ab MS a 6 a 95 a CV (%) ,4 Médias seguidas da mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelos testes de *Tukey (p>0,05) e **Kruskal-wallis (p>0,05). 7

8 O sucesso de organogênese está diretamente ligado ao genótipo e ao tipo de explante, macro e micro nutrientes, presença de fitorreguladores e às condições ambientais in vitro. Nisso, meios de culturas são formulados a fim de promover condições necessárias para o desenvolvimento in vitro dos explantes (Dibax, 2007; Borges, 2011). Contudo, para cada espécie e clone, é necessário a otimização da composição dos nutrientes do meio para o sucesso da regeneração in vitro. O WPM foi o que apresentou melhor desempenho na organogênese in vitro do clone Os resultados obtidos se assemelham aos obtidos por Dibax et al. (2010) em explantes cotiledonares de E. camaldulensis. Estes autores obtiveram os melhores resultados de regeneração de brotos nos meios MS e WPM (57,5 e 55%, respectivamente) suplementados com 2,70 μm de ANA e 4,44 μm de BAP. No entanto no meio JADS os mesmos obtiveram taxas de regeneração de brotos superiores aos resultados observados neste estudo (35%). Em relação ao MS, os resultados diferiram de González (2002), que obteve aos 120 dias maiores taxas de regeneração de brotações (33,3 e 32,5%) no meio MS modificado suplementado com 2,5 μm de ANA e 1,0 μm de TDZ. Existe pouco relato do uso do QL para organogênese em eucalipto. Foram publicados na literatura para regeneração in vitro de explantes foliares de espécies de Eucalyptus, o uso dos meios MS, B5 (Gamborg et al., 1968), LD (Lainé & David, 1994), WPM, JADS, G22 (Lainé & David, 1994), BIP (Tournier et al., 2003) e R5 (Lainé & David, 1994) (Dibax, 2007). Sendo o MS o mais utilizado para esse gênero, segundo Deus (2010). 3.2 Efeito do ácido naftalenoacético (ANA) Em todos os tratamentos observou-se 100% de formação de calos, indicando a efetividade da auxina ANA quando combinada com o TDZ no processo da calogênese. Após 60 dias, as combinações de 0,5 μm de TDZ e 0,25 μm de ANA e 0,5 μm de TDZ e 0,75 μm de ANA, apresentaram maiores porcentagem de brotações adventícias (25 e 21%), e a menor taxa de brotações foi promovida pelo tratamento com maior concentração da auxina, porém não foram observadas diferenças significativas entre os tratamentos (Tabela 2). Os tratamentos diferiram estatisticamente em relação às porcentagens de oxidação. As maiores taxas de oxidação foram nos tratamentos com o 8

9 meio JADS suplementados com altas concentrações de ANA. O meio WPM + 0,5 μm de TDZ + 0,1 μm de ANA foi o que apresentou a menor porcentagem de oxidação (Figura 1d). Tabela 2. Porcentagens de formação de calos, brotações adventícias e de oxidação, em diferentes concentrações da auxina ANA com o TDZ (em μm ) em nos meios WPM e JADS, após 60 dias de cultivo. Tratamentos Aos 60 dias Meio TDZ/ANA Formação de calos* Brotações** Oxidação** T1: WPM 0,5/0,1 100 a 18,3 a 20 f T2: JADS 0,5/0,1 100 a 15 a 65 d T3: JADS 0,5/0, a 25 a 50 e T4: JADS 0,5/0,5 100 a 13 a 73 c T5: JADS 0,5/0, a 21 a 88 a T6: JADS 0,5/0,1,0 100 a 8 a 81 b Médias seguidas da mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelos testes de *Tukey e **Kruskalwallis (p>0,05). A auxina ANA combinada com o TDZ, mostrou-se eficiente para a formação de calos no clone Alves et al. (2004) obtiveram resultados semelhantes na calogênese de explantes foliares de clones de E.grandis x E.urophylla, após testarem diferentes combinações de TDZ e ANA e de BAP e ANA no meio LD, sendo o melhor desempenho observado com 2,27 μm de TDZ e 0,54 μm de ANA. Porém, o resultado de regeneração de brotações foi inferior aos encontrados neste trabalho (8%). A efetividade da auxina ANA junto com a citocinina TDZ, in vitro, também foi demonstrada para o E. urophylla (Deus et al., 2007), E. saligma (Dibax, 2007) e, E. camuldenensis (Dibax et al., 2010). 3.3 Efeito do ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) Foram observados calos em todos os tratamentos, não apresentando diferenças significativas entre eles. Quanto à porcentagem de brotações adventícias formadas após 60 dias observou-se diferenças estatísticas entre os tratamentos. O meio controle com TDZ e ANA, apresentou o melhor desempenho com 30% (Tabela 3), sendo que o pior 9

10 desempenho foi do meio JADS suplementado com TDZ e a maior concentração da auxina 2,4-D (0,5 μm). Observou-se que a auxina 2,4-D promoveu maiores taxas de oxidação, sendo que estas mostraram-se proporcionais ao aumento da auxina. A menor taxa observada foi no meio WPM com TDZ e ANA. Tabela 3. Porcentagens de formação de calos, brotações adventícias e de oxidação, testando a auxina 2,4-D, aos 60 dias de cultivo. Tratamentos Aos 60 dias Meio TDZ/ANA TDZ/2,4-D Formação Brotações ** Oxidação** (μm) (μm) de calos** T1: WPM 0,5/0,1 100 a 30 a 51.6 c T2: JADS 0,5/0, a 20 b b T3: JADS 0,5/0, a 6.6 c 90.0 b T4: JADS 0,5/0,5 100 a 1.7 d 96.6 a CV (%) ,9 Médias seguidas da mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelos testes de *Tukey e **Kruskal-wallis (p>0,05). Arenhart & Zaffari (2008) após 60 dias, obtiveram 40% de regeneração de brotos em explantes foliares de E. grandis, utilizando o MS modificado com o 2,4-D isolado (4,52 μm) e o TDZ com ANA (2,27 μm e 0,54 μm). Resultados similares aos obtidos neste trabalho nos tratamentos realizados com TDZ e ANA, porém muito superiores aos resultados dos tratamentos com a auxina 2,4-D. Borges et al. (2007) e Deus (2010) também observaram efetividade do 2,4-D combinado com outra citocinina, em espécies de Eucalyptus. A auxina 2,4-D mostrou-se ineficaz para a regeneração de brotações no clone Isso demonstra que o uso desta auxina tenha comprometido a competência dos explantes do clone 3336 no processo de organogênese. 3.4 Avaliação dos reguladores TDZ, ANA e BAP Todos os parâmetros avaliados apresentaram diferenças estatísticas entre os tratamentos (Tabela 4). A maior taxa de formação de calos foi observada no tratamento com 0,25 μm de TDZ e 0,1 μm de ANA, com 100%. E o baixo desempenho de 10

11 calogênese, observou-se na maior concentração de BAP, na qual foram verificados explantes sem presença de calo, como pode ser observado na Figura 1b. Este mesmo tratamento também mostrou-se deletério na indução de brotações adventícias, com a menor porcentagem (5%). As maiores porcentagens de brotações foram observadas nos tratamentos com os fitorreguladores TDZ e ANA (45 e 42%, respectivamente). Quanto à porcentagem de oxidação, as diferentes combinações e concentrações dos fitorreguladores avaliados, também mostraram resultados diferentes. O TDZ e o ANA apresentaram maior porcentagem de oxidação, do que a combinação de BAP e ANA. O conjunto das duas citocininas TDZ e BAP, promoveram a menor taxa de oxidação (8%). Tabela 4. Porcentagens de formação de calos, brotações adventícias e oxidação dos tratamentos cultivados em meio WPM com diferentes concentrações e combinações de fitorreguladores, após 60 dias de cultivo. Tratamentos (em μm) T1: 0,5 TDZ + 0,1 ANA T2: 0,25 TDZ + 0,1 ANA T3: 5,0 BAP + 0,1 ANA T4: 2,5 BAP + 0,1 ANA T5: 0,25 TDZ + 2,5 BAP Formação de calos* Aos 60 dias Brotações** 98 b 45 a 26 b 100 a 42 a 38 a 81 d 5 c 26 c 86 c 13 b 18 c 90 c 11 b 8 d Oxidação** Médias seguidas da mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelos testes de *Tukey e **Kruskalwallis (p>0,05). A maior eficiência na formação de calos e posterior regeneração de brotos foi observada na combinação da citocinina TDZ com a auxina ANA, em detrimento da combinação do BAP. Como observado nos resultados aqui expostos, muitos autores relatam melhores resultados na organogênese quando utilizado o TDZ e ANA, para o eucalipto. Dibax (2007), obteve após 30 dias de cultivo de explantes foliares de E. saligna no meio MS modificado (com as concentrações de nitratos de potássio e amônio reduzidos à metade do meio MS), contendo ANA e TDZ, nas concentrações de 0,1 μm e 1,0 μm, 30% de explantes regenerando brotações, valores inferiores aos expostos neste 11

12 trabalho. No mesmo estudo, este autor obteve 40% de brotações adventícias no meio WPM com 2,70 μm de ANA e 4,44 μm de BAP. Bravo (2005) também obteve o melhor desempenho na regeneração de brotações em explantes cotiledonares de E. grandis, no meio JADS com ANA e BAP, com a média de 27,38% de regeneração. Estes resultados são muito superiores aos encontrados para o clone 3336, onde a maior porcentagem de formação de brotações foi de 13% em tratamentos com ANA e BAP. A oxidação fenólica é um dos grandes desafios enfrentados no cultivo in vitro de espécies lenhosas perenes (Deus, 2007). Neste trabalho, foram observadas oxidações em todos os tratamentos realizados. No geral as menores taxas foram observadas no meio WPM suplementado com as citocininas TDZ e BAP, combinadas com a auxina ANA. Quando avaliados os diferentes meios, o MS apresentou a maior taxa de oxidação. Este resultado difere do Dibax (2007) em E. saligna, onde observou menor taxa de oxidação (70%) em explantes cultivados no meio MS, porém com a concentração de nitratos de potássio e de amônio reduzida pela metade. Do mesmo modo, Borges (2011) observou na multiplicação de clones híbridos de E.globulus, que os explantes no meio JADS apresentavam-se mais escurecidos comparando com o MS, evidenciando a oxidação dos compostos fenólicos liberados pelo explante neste meio. Este fato também foi observado neste trabalho. Todavia, observou-se que altas concentrações das auxinas ANA e 2,4-D promoveram maiores taxas de oxidação. Santos et al., 2005, relataram o possível efeito tóxico do 2,4-D, quando avaliou o estabelecimento in vitro de salix (Salyx humboldtiana Willd). A oxidação pode estar relacionada com a formação dos compostos fenólicos, a excisão realizada nos explantes que promove danos celulares que contribuem na liberação destes compostos, que por consequência sofrem oxidação por ação de algumas enzimas, a idade e tipo de explante (Bravo, 2005; Deus, 2007) e González (2002), apontam a presença de luz como um fator favorável à oxidação fenólica dos explantes. Neste trabalho observou-se que os explantes mostravam-se mais escuros após serem transferidos para a luz. Barrueto Cid et al. (1999) relataram que a oxidação dos explantes, possivelmente seja devida a biossíntese de compostos fenólicos induzida pela luz e altas concentrações de citocininas nos meios de cultura. No entanto, foi utilizado o antioxidante PVP durante o processo de organogênese, como sugerido por Lainé e 12

13 David (1994), a fim de reduzir os efeitos negativos causados pela oxidação dos explantes. Figura 1. Organogênese in vitro do clone 3336 do E. grandis x E. urophylla. a) formação de calo no meio JADS com 0,1 μm de TDZ e 1,0 μm de ANA. b) Explantes não responsivos ao meio de cultura. c) formação de brotações adventícias no meio WPM 0,1 μm de TDZ e 0,5 μm de ANA. d) calo oxidado no meio JADS suplementado com 0,1 μm de TDZ e 1,0 μm de ANA. 5. CONCLUSÃO O meio mais indicado para a organogênese in vitro do clone 3336 do E. urograndis, é o WPM suplementado com 0,5 μm de TDZ + 0,1 μm de ANA, por ter apresentado uma taxa de regeneração de brotações de até 45% aos 60 dias, com baixa porcentagem de oxidação. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALVES, E. C. S. C. et al. Organogênese de explante foliar de clones de Eucalyptus grandis x E. urophylla. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v.39, n.5, p , maio 2004 BARRUETO CID, L. P. et al. Plant regeneration from seedling explants of Eucalyptus grandis x E. urophylla. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. p. 56: 17 23, BATISTA, T. R. et al. Efeito de AIA e BAP na Multiplicação de Eucalyptus urograndis. XIX Congresso de Pós-Graduação da UFLA. Outrubro, BERTOZZO, Fernanda; MACHADO, Isaac Stringueta.Meios de Cultura no desenvolvimento de Ápices Caulinares de Mamoneira (Ricinus communis L.) in vitro. Ciência em Agrotecnologia, Lavras, v. 34, n. 6, p , nov./dez., BORGES, S. R. et al. Multiplicação in vitro de clones híbridos de Eucalyptus globulus. Revista da Árvore. vol.35 n.2. Viçosa Mar./Apr BRAGA, José Lucio Pereira. Estabilidade Fenotípica de Clone de Eucalyptus urograndis, na Fazenda Bom Jardim - Aparecida- SP p. Monografia ( Curso de Engenharia Florestal) - Instituto de Florestas, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, CORREIA, D. et al. Efeito do Crescimento e desenvolvimento de gemas na multiplicação de Eucalyptus spp in vitro em meio de cultura líquido e sólido. Piracicaba Tese (Mestrado) - Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", Universidade de São Paulo

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