VARIABILIDADE GENÉTICA: A IMPORTÂNCIA DA CONSERVAÇÃO DO PÓLEN EM BATATA (Solanum tuberosum L.) PARA O DESENVOLVIMENTO DE VARIEDADES ADAPTADAS.

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1 VARIABILIDADE GENÉTICA: A IMPORTÂNCIA DA CONSERVAÇÃO DO PÓLEN EM BATATA (Solanum tuberosum L.) PARA O DESENVOLVIMENTO DE VARIEDADES ADAPTADAS. GENETIC VARIABILITY: THE IMPORTANCE OF POLLEN IN POTATO CONSERVATION (Solanum tuberosum L.) FOR VARIETIES ADAPTED DEVELOPMENT. Daiana Döring Wolter¹, Cristine da Fonseca², Margareth Divers³, Gustavo Sessa Fialho 4 ¹ Universidade Federal de Pelotas/PPGA - Melhoramento Vegetal, daianawolter@gmail.com ² Universidade Federal de Pelotas/PPG - Sistemas de Produção Agrícola Familiar, cristinefonseca@hotmail.com ³ Universidade Federal de Pelotas/ PPG - Fitossanidade, margaretholivers@gmail.com 4 Universidade Federal de Pelotas/IFM - Pelotas, gustavo.fialho@ufpel.edu.br Resumo: Em melhoramento genético o desenvolvimento de cultivares prioriza características agronômicas específicas, onde há perda de variabilidade genética. Em decorrência das mudanças climáticas e aumento da demanda por alimentos produzidos em sistemas de produção de base ecológica 1, surge a necessidade de desenvolver materiais com base genética ampla, que estejam adaptados as especificidades do local. Com o objetivo de contribuir para o desenvolvimento de variedades de batata (Solanum tuberosum L) mais rústicas e adaptadas as condições edafoclimáticas da região sul do Brasil, o Programa de Melhoramento da Embrapa Clima Temperado, verificou a influência do tempo de armazenamento na viabilidade de pólen de duas cultivares de batata. Foram avaliados os métodos do carmin propiônico e de germinação de pólen in vitro, utilizando diferentes tempos de armazenamento. Aumentam-se os dias de armazenamento, a viabilidade do pólen diminui. Palavras-chave: adaptação, pólen, viabilidade, orgânico, Solanum tuberosum L. Abstract: In breeding to develop cultivars prioritizes specific agronomic characteristics, where there is loss of genetic variability. As a result of climate change and increased demand for food produced in ecologically-based production systems, there is a need to develop materials with broad genetic base, that are adapted to the specific characteristics of the site. In order to contribute to the development of varieties of potato (Solanum tuberosum L) more rustic and suitable soil and climatic conditions of south Brazil, the Breeding Program of Embrapa Temperate Climate, found the influence of storage time on pollen viability two 1 PRODUÇÃO DE BASE ECOLÓGICA: Segundo Caporal e Costabeber, a opção pela terminologia agricultura de base ecológica tem a intenção de distinguir os estilos de agricultura resultantes da aplicação dos princípios e conceitos da Agroecologia, tanto do modelo de agricultura convencional ou agroquímica, como também de estilos de agricultura que estão surgindo a partir das orientações emanadas das correntes da Intensificação Verde, da Revolução Verde Verde ou Dupla Revolução Verde, cuja tendência, marcadamente ecotecnocrática, tem sido a incorporação parcial de elementos de caráter ambientalista ou conservacionista nas práticas agrícolas convencionais (greening process), o que se constitui uma vã tentativa de recauchutagem do modelo da Revolução Verde, sem, porém, qualquer propósito de alterar fundamentalmente as frágeis bases que até agora lhe deram sustentação (2004).

2 potato cultivars. We evaluated the methods propionic carmine and in vitro pollen germination using different storage times. It increases the days of storage, pollen viability decreases. Keywords: adjustment, pollen, viability, organic, Solanum tuberosum L. Introdução No âmbito nacional, a Política Nacional de Agroecologia e Produção Orgânica - PNAPO 2, instituída pelo decreto n 7.794/2012, e que deu origem ao Plano Nacional de Agroecologia e Produção Orgânica PLANAPO, constitui um ato relevante no sentido de ampliar as atividades que promovam o desenvolvimento rural sustentável. Em nível internacional, o acordo de cooperação realizado entre diversas nações e a ONU Organização das Nações Unidas, onde o Brasil assume o compromisso em 2015, quando se tornou signatário da Agenda 2030 para o Desenvolvimento Sustentável, a fim de trabalhar os 17 objetivos estabelecidos no plano de ação, os quais visam alavancar o desenvolvimento sustentável e estabelecer a paz entre as nações (ONU, 2015). Dentro desta perspectiva, observa-se atualmente uma crescente demanda da sociedade por alimentos livre de agrotóxicos, que tenham sido produzidos em sistemas de produção de base ecológica 3. A área de produção orgânica no Brasil abrange 950 mil hectares e o Rio Grande do Sul é o estado com maior número de agricultores vinculados ao Cadastro Nacional de produtores Orgânicos (MAPA, 2016). Embora a legislação de orgânicos permita a utilização de sementes produzidas de forma convencional e fora da unidade de produção agrícola familiar, para que a cultura se desenvolva e produza satisfatoriamente é fundamental a adaptação do material as condições locais. No mundo mais de 200 milhões de toneladas de batatas são consumidos anualmente, com uma média de 31 quilos por pessoa. Peru e Brasil são os principais produtores na América Latina, com mais de 8 milhões de toneladas por ano em áreas de 317 e 132 mil hectares, respectivamente (FAOSTAT, 2016). A propagação da batata pode ser feita de forma assexuada, no entanto, a utilização de sementes botânicas, pelos melhoristas, para a produção de novas cultivares e o emprego da polinização controlada, em cruzamentos inter e intraespecíficos, para ampliar a base 2 PNAPO: integrar, articular e adequar políticas, programas e ações indutores da transição agroecológica, da produção orgânica e de base agroecológica, como contribuição para o desenvolvimento sustentável e a qualidade de vida da população, por meio do uso sustentável dos recursos naturais e da oferta e consumo de alimentos saudáveis decreto n (2012). 3 PRODUÇÃO DE BASE ECOLÓGICA: Segundo Caporal e Costabeber, a opção pela terminologia agricultura de base ecológica tem a intenção de distinguir os estilos de agricultura resultantes da aplicação dos princípios e conceitos da Agroecologia, tanto do modelo de agricultura convencional ou agroquímica, como também de estilos de agricultura que estão surgindo a partir das orientações emanadas das correntes da Intensificação Verde, da Revolução Verde Verde ou Dupla Revolução Verde, cuja tendência, marcadamente ecotecnocrática, tem sido a incorporação parcial de elementos de caráter ambientalista ou conservacionista nas práticas agrícolas convencionais (greening process), o que se constitui uma vã tentativa de recauchutagem do modelo da Revolução Verde, sem, porém, qualquer propósito de alterar fundamentalmente as frágeis bases que até agora lhe deram sustentação (2014).

3 genética da cultura, defrontam-se com o problema da grande variação na quantidade de pólen viável produzido pelas diferentes cultivares de batata (NETO et al., 2008). A escolha de genitores tem por base os objetivos do programa de melhoramento (TARN et al., 1992) e constitui a etapa mais importante do processo, onde busca-se explorar o máximo da variabilidade genética, dentro de famílias (SOUZA et al., 2004). No entanto, o aproveitamento de qualquer genótipo como genitor depende da sua capacidade de florescer, produzir frutos e sementes viáveis (PINTO; MARTINS, 1994). O desenvolvimento de métodos para determinar a viabilidade do pólen é útil em programas de melhoramento, pois permite realizar a avaliação prévia de genótipos quanto à sua capacidade de produzir frutos e sementes (SOARES et al., 2016). Diante do exposto, objetivou-se verificar a influência do tempo de armazenamento na viabilidade de pólen de batata, utilizando dois métodos distintos e genitores do Programa de Melhoramento Genético de Batata da Embrapa Clima Temperado. Metodologia O experimento foi conduzido no Laboratório de Melhoramento Genético da Embrapa Clima Temperado, Pelotas-RS, Brasil (31 40 S e W; 60m a.n.m.) na safra de cultivo de outono de Foram utilizadas duas cultivares de batata com aptidão para fritura, Markies e Ludmila. O plantio foi efetuado em vasos com capacidade para 5L, contendo substrato vegetal Plantmax. Para indução do florescimento, o período da noite foi interrompido com o fornecimento de duas horas de luz, utilizando lâmpadas de 160W. A temperatura foi mantida a 20±5ºC com a utilização de aquecedores, ventiladores e o manejo das aberturas da casa-de-vegetação. No mínimo cinco flores foram coletadas, para compor cada amostra de pólen, destas foram retiradas as anteras, as quais foram posteriormente armazenadas em BOD a 25 C por 24 horas para a extração do pólen. O pólen foi extraído com o auxílio de um coletor-vibrador, identificado e armazenado em geladeira a temperatura de 4ºC. Foram avaliadas quatro datas de armazenamento do pólen: 0, 15, 35 e 42 dias. O delineamento utilizado foi de blocos inteiramente casualizados, com quatro repetições de cada genótipo, para cada um dos métodos descritos abaixo. Para a avaliação da viabilidade de pólen, foi utilizado o método do carmin propiônico: colorante gelatina de acetocarmin glicerol a 2%. Com o auxílio de um pincel, uma amostra de pólen foi batida sobre uma lâmina para microscópio, sobre a amostra de pólen, colocouse uma gota de carmin e fechou-se o conjunto com uma lamínula. Após 24 horas do preparo das lâminas, foi realizada a contagem de 250 grãos de pólen na objetiva de 20X, os quais foram classificados em viáveis e não viáveis, sendo considerados viáveis os grãos de pólen que adquiriram cor azul, enquanto que os não viáveis permaneceram incolores. Para o método de avaliação da germinação in vitro dos grãos de pólen, foi utilizado o meio de ágar, açúcar e boro. O meio de cultivo continha as concentrações de 10% de açúcar e ácido bórico 10mg 100mL -1, devido à sua influência na germinação do pólen (PELOQUIN, 1961). Com auxílio de um pincel, uma amostra de pólen foi batida sobre uma lâmina para microscópio, adaptada com dois anéis para sustentação do meio nutritivo, para germinação dos grãos de pólen. As lâminas foram acomodadas em placas de Petri com papel-toalha umedecido, fechadas e acondicionadas em câmara de crescimento, por 24 horas a 25ºC.

4 Os dados foram submetidos à análise de variância e havendo significância a 5%, foram ajustados por polinômios ortogonais. Resultados No teste com o método de germinação in vitro de pólen, não ocorreu o resultado esperado. Todos os tratamentos que o pólen estava viável apresentaram crescimento do tubo polínico excessivo, o que inviabilizou a coleta de dados, não sendo possível diferenciar os grãos de pólen nas contagens. Esses testes são utilizados como estratégia para armazenar pólens a fim de realizar cruzamentos controlados entre parentais que apresentam florescimento em épocas distintas, ou ainda se encontrem em regiões diferentes, de modo que o pólen esteja disponível quando houver demanda (TECHIO, et al., 2006; FRANZON; RASEIRA, 2006). Com relação ao método de coloração de pólen, a ANOVA revelou diferenças significativas (p 0,05) para a fonte de variação cultivar e tempo de armazenamento para a variável viabilidade de pólen. Entretanto, não houve interação significativa entre os fatores cultivar x tempo de armazenamento (C x T), indicando que a variação causada pelo efeito do tempo de armazenamento sob as cultivares foi de magnitude semelhante. O coeficiente de variação da análise realizada foi de 9,74%, o que demonstra precisão suficiente nos dados apresentados, conforme a Tabela 1. Tabela 1. Resumo da análise de variância para a viabilidade de pólen (%), estudado em duas cultivares de batata. UFPel, Pelotas, GL Quadrado Médio Fonte de variação Viabilidade de pólen (%) Cultivar (C) 1 330,24* Tempo de armazenamento (T) ,78* C x T 3 81,76 Repetição 3 80,47 Resíduo 21 41,23 Média Geral 61,11 Coeficiente de Variação (%) 9,74 *Significativo a 5% de probabilidade de erro. Na Tabela 3 estão representados os valores percentuais das médias de pólens viáveis das cultivares utilizadas, pelo método de coloração de Carmim acético 2%. O percentual médio de pólens viáveis pelo método de coloração, foi de 61,11% para as cultivares estudas. Embora o teste de médias tenha apresentado média superior para a cultivar Ludmilla, a resposta dos dois genótipos em relação ao tempo de armazenamento foi similar, ocorrendo à tendência de perda de viabilidade ao longo do período analisado. Tabela 3. Teste de médias para viabilidade de pólen (%), estudado em dois genótipos de batata. UFPel, Pelotas - RS, 2016.

5 Genótipos Viabilidade de pólen (%) 64, Ludmilla 2 a* 57, Markies 0 b *Médias seguidas pela mesma letra na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade de erro. Segundo o método de coloração, consideram-se como grãos de pólen viáveis aqueles corados em azul e como grãos de pólen inviáveis os que não foram corados. Na Figura 1 é possível verificar que ao final do período de armazenamento estudado houve uma redução visível da viabilidade de pólen, quando comparado ao pólen sem armazenamento (0 dias). Figura 1. Grãos de pólen viáveis (corados de azul) e inviáveis (não corados) de batata (Solanum tuberosum L). A- Pólen armazenado a 0 dias. B- Pólen armazenado aos 42 dias. UFPel, Pelotas - RS, A análise de polinômios ortogonais para as cultivares estudadas apresentou uma regressão linear simples. Conforme apresentado na Tabela 1 (ANOVA), não houve interação significativa entre os fatores C x T, portanto, ambas as cultivares apresentaram o mesmo comportamento, ou seja, conforme aumentam-se os dias de armazenamento a percentagem de viabilidade de pólen tende a diminuir (Figura 2). Nesta mesma figura, é possível observar que para manter um percentual de viabilidade aceitável, ou seja, próximo a 60%, o indicado seria realizar o armazenamento do pólen até no máximo 30 dias.

6 Figura 2. Viabilidade de pólen de batata, durante quatro períodos de armazenamento à 4 C (0, 15, 35 e 42 dias). UFPel, Pelotas - RS, O presente trabalho não obteve resultados para o método de germinação in vitro, o qual pode ser explicado por duas hipóteses, a concentração dos compostos utilizados no meio de cultura e o tempo de crescimento do tubo polínico. As concentrações utilizadas para elaboração do meio de cultura poderiam estar excessivas, já que o tem a função de proporcionar o equilíbrio osmótico entre o pólen e o meio, bem como, fornecer energia para auxiliar o processo de desenvolvimento do tubo polínico (SHARAFI; BAHMANI, 2011) e, a adição de boro tem como finalidade interagir com o açúcar formando um complexo ionizável açúcar-borato, que reage mais rapidamente com as membranas celulares (SEYREK et al., 2016), o que pode ter ocasionado um crescimento excessivo do tubo polínico, impossibilitando a contagem dos grãos de pólen germinados. Muitas vezes, modificações de protocolos são necessários em diferentes espécies e mesmo entre os genótipos da mesma espécie, para que ocorra a germinação do pólen e adequado crescimento do tubo polínico (PHAM et al., 2015). A viabilidade polínica está diretamente relacionada com a fecundação e consequente formação dos frutos (NASCIMENTO et al., 2012), além disso é um modo de verificar a fertilidade masculina, e possibilita monitorar o pólen em armazenamento (HISTER; TEDESCO, 2016). Das duas cultivares estudadas, a que manteve maior viabilidade de pólen foi a cultivar Ludmilla, apresentando significativamente pólen mais fértil que a cultivar Markies. Este resultado sugere um maior potencial de uso e um tempo maior de armazenamento do pólen da cultivar Ludmilla. Entretanto a tendência entre as cultivares utilizadas é diminuir a viabilidade quanto maior for o tempo de armazenamento. Através do gráfico de regressão linear observamos que entre o intervalo dos dias, o pólen mantém a viabilidade superior aos 60%, valor considerável, pois o pólen conservado deve preservar sua viabilidade e manter a capacidade de germinação. tornando-se uma importante ferramenta para o melhoramento. Sua conservação é importante para pesquisas básicas, assim como para o intercâmbio e preservação de germoplasma (MOURA et al., 2015). Conclusão

7 A viabilidade de pólen é afetada ao longo do armazenamento à 4ºC, nas cultivares estudadas. O teste de germinação in vitro deve ser repetido, com menor tempo de permanência na câmara de crescimento, e concentrações menores de açúcar e boro. Embora a metodologia apresentada dificilmente seja reproduzida pelos agricultores, o resultado esperado, variabilidade genética, é de grande importância na produção orgânica de batatas. Outros estudos, que identifiquem melhores métodos de armazenamento, com diferentes cultivares deverão ser feitos para verificar a estabilidade genética do pólen conforme aumenta o tempo e a temperatura. Referências Bibliográficas: CAPORAL, F. R, COSTABEBER, J. A. Agroecologia e Extensão Rural: Contribuições para a promoção do desenvolvimento rural sustentável. Brasília DF. MDA/SAF/DATER- IICA, FAO. Faostat Statistics Database. Disponível em: < Acesso em 27 de julho de FRANZON, R.C. RASEIRA, M.do C.B. Germinação in vitro e armazenamento do pólen de Eugenia involucrata DC (Myrtaceae). Revista Brasileira de Fruticultura, v.28, p.18-20, GADUM J; PINTO C.A.B.P.; RIOS, M.C.D. Desempenho agronômico e reação de clones de batata (Solanum tuberosum) ao PVY. Ciência e Agrotecnologia, v.27, p , HISTER, C.,; TEDESCO, S. Estimation of pollen viability of strawberry guava (Psidium cattleianum Sabine) through distinct staining methods. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v.18, p , MAPA Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento: Disponível em Consultado em setembro de 2016 MOURA, C.R.F.; MACHADO, C.A.; LEDO, A.S. In vitro germination and viability of pollen grains of coconut accessions. Revista Ciência Agronômica, v.46, p , NASCIMENTO, N.F.F.; RÊGO, E.R.; NASCIMENTO, M.F.; FINGER, F.L.; BRUCKNER, C.H.;, SILVA NETO, J.J. & RÊGO, M.M. Heritability and variability of morphological traits in a segregating generation of ornamental pepper. Acta Horticulturae, v.953, p , NETO, J.E.B.; DEL NERO, M.; KAVATI, R.; PINTO-MAGLIO, C.A.F. Viabilidade e conservação de pólen de três anonas comerciais. Bragantia, v.68, p , PELOQUIM, S.J. Germination of Solanum pollen on artificial media. American Potato Journal, v.38, p , 1961.

8 PHAM, V.T.; HERRERO, M.; HORMAZA, J.I. Effect of temperature on pollen germination and pollen tube growth in longan (Dimocarpus longan Lour.). Scientia Horticulturae, v.197, p , PINTO, C.A.B.P. & MARTINS, P.R. Indução de florescimento e pegamento de frutos em polinizações controladas em batata. Ciência e Prática, v.18, p , SEYREK, U.A.; QU, X., HUANG, C.; TAO, J., ZHONG, M.; WU, H.; XU, X. Influence of Storage Time on Pollen Traits in Actinidia eriantha. Agricultural Sciences, v.7, p.373, SHARAFI, Y. & BAHMANI, A. Pollen Germination, Tube Growth and Longevity in Some Cultivars of Vitis vinifera L. African Journal of Microbiology Research, v.5, p SOARES, T.L.; SOUZA, E.H.; COSTA, M.A.P.C.; SILVA, S. O.; SANTOS-SEREJO, J.A. Viability of pollen grains of tetraploid banana. Bragantia, v.75, p , SOUZA, V. Q.; PEREIRA, A. da S.; FRITSCHE NETO, R.; SILVA, G. O.; OLIVEIRA, A. C. Potential of selection among and within potato clonal families. Crop Breeding and Applied Biotechnology, v.5, p.47-54, TARN, T.R.; TAI, G.C.C.; DE JONG, H.; MURPHY, A.M.; SEABROOK, J.E.A. Breeding potatoes for long day, temperate climates. Plant Breeding, v.9, p , TECHIO, V.H.; DAVIDE, L.C.; PEDROZO, C.A.; PEREIRA, A.V. Viabilidade dos grãos de pólen de acessos de capim-elefante, milheto e híbridos interespecíficos (capim-elefante x milheto). Revista Acta Scientia Biologica, v.28, p.7-12, 2006.