MANCHA PRETA DOS CITROS: EXPRESSÃO DOS SINTOMAS EM FRUTOS PELA INOCULAÇÃO COM CONÍDIOS E CONTROLE DO AGENTE CAUSAL (Guignardia citricarpa)

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL MANCHA PRETA DOS CITROS: EXPRESSÃO DOS SINTOMAS EM FRUTOS PELA INOCULAÇÃO COM CONÍDIOS E CONTROLE DO AGENTE CAUSAL (Guignardia citricarpa) Taís Ferreira de Almeida Engenheira Agrônoma JABOTICABAL SÃO PAULO BRASIL 2009

2 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL MANCHA PRETA DOS CITROS: EXPRESSÃO DOS SINTOMAS EM FRUTOS PELA INOCULAÇÃO COM CONÍDIOS E CONTROLE DO AGENTE CAUSAL (Guignardia citricarpa) Taís Ferreira de Almeida Orientador: Prof. Dr. Antonio de Goes Co-Orientador: Dr. Renato Ferrari dos Reis Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutora em Agronomia (Produção Vegetal). JABOTICABAL SÃO PAULO BRASIL Maio de 2009

3 Almeida, Taís Ferreira de A447m Mancha preta dos citros: expressão dos sintomas em frutos pela inoculação com conídios e controle do agente causal (Guignardia citricarpa) / Taís Ferreira de Almeida Jaboticabal, xii, 66 f. : il.; 28 cm Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Orientador: Antonio de Goes Banca examinadora: Jaime Maia dos Santos, Edson Luiz Furtado, Rita de Cássia Panizzi, Marcel Bellato Spósito Bibliografia 1. Citrus. 2. Fungicidas. 3. Patogenicidade. I. Título. II. Jaboticabal - Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 634.3:632.4 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal.

4 DADOS CURRICULARES DA AUTORA TAÍS FERREIRA DE ALMEIDA Nascida aos 19 de agosto de 1977, na cidade de Brasília - DF. Filha de Marly Ferreira de Almeida e Celso Braga Corrêa de Almeida. Em março de 2001 obteve o grau de Engenheira Agrônoma pela Universidade Federal de Goiás GO (UFG). No período de 2001 a 2003, dedicou-se ao ensino, na Escola Agrotécnica Federal de Urutaí (CEFET) e na Universidade Estadual de Goiás (UEG). Em agosto de 2003 concluiu o curso de Produção e Tecnologia de Sementes na Universidade Federal de Lavras (UFLA), obtendo o título de especialista. Em fevereiro de 2005, na Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias FCAV UNESP Jaboticabal, sob orientação da Profa. Dra. Margarete Camargo e Co-Orientação da Profa. Dra. Rita de Cássia Panizzi, obteve o título de mestre, no curso de Produção Vegetal com o trabalho intitulado: Extratos vegetais no controle de Colletotrichum acutatum, agente causal da flor preta do morangueiro. Em março de 2005, ingressou no curso de Produção Vegetal dessa mesma instituição para realização do Doutorado estudando epidemiologia e o controle da mancha preta dos frutos cítricos (MPC). Desde fevereiro de 2008 é responsável pela disciplina de Fitopatologia na Escola Superior de Agronomia de Paraguaçu Paulista (ESAPP) da Fundação Gammon de Ensino.

5 A Deus, e seus bons espíritos por sempre me mostrarem o caminho correto Aos meus queridos pais, Celso e Marly, pelo amor incondicional, incentivo e apoio em todas as etapas da minha vida me ensinando todos os dias a ser uma pessoa mais completa Aos meus amados irmãos, Fábio e Daniel, que sempre me ajudaram e apoiaram, tornando a minha vida mais feliz DEDICO E OFEREÇO

6 AGRADECIMENTOS Ao Professor Dr. Antonio de Goes, acima tudo pela sua amizade, pela oportunidade do convívio, paciência, dedicação e por compartilhar generosamente comigo suas idéias e recursos. Ao Dr. Renato Ferrari dos Reis, pela amizade e ajuda na condução e melhoria deste trabalho. Ao Professor Dr. Jaime Maia dos Santos, pelo carinho, amizade e ensinamentos. Aos Professores do Departamento de Fitossanidade Dra. Margarete Camargo, Dra. Rita de Cássia Panizzi e Dr. Modesto Barreto, pelo convívio e aprendizado. A Gabriella, minha irmã, a ti minha gratidão pela amizade sincera dedicada durante esses anos, com palavras encorajadoras e principalmente pelo carinho. Por estar sempre presente e me incentivando em todos os momentos. Aos meus sobrinhos Mathilde e Anselme, que trouxeram mais alegria a minha família. Aos amigões Étore, Pedro, Eduardo, Vanessa (Rapidex), Ana Elisa (Istaka), Ronilda, Fabiana, Eliana, David e Bruno pela prestimosa colaboração e carinho, prevalecendo sempre o cultivo da nossa amizade que tornaram os momentos difíceis em alegria. A presença de vocês é extremamente prazerosa. Ao engenheiro agrônomo Ricardo Baldassari pela amizade e troca permanente de idéias. Ao Rodrigo pelo carinho e a sua família, sempre acolhedora e prestativa. A todos os colegas do Laboratório de Fitopatologia, pela agradável convivência nestes anos. Aos funcionários do Departamento de Fitossanidade, pela colaboração. Em especial a Lúcia Rita pelo momento do café filosófico e ao Wanderlei, exemplo de prestatividade e alto astral. À UNESP Universidade Estadual Paulista, pela oportunidade da realização do curso.

7 À Coordenadoria de Aperfeiçoamento e Pesquisa do Ensino Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de estudo. À ESAPP Escola Superior de Agronomia de Paraguaçu Paulista pelo apoio e incentivo. Aos meus alunos, pelo prazeroso convívio. A todos que diretamente ou indiretamente contribuíram na realização deste trabalho.

8 vii SUMÁRIO Página RESUMO... ix SUMMARY... xi CAPÍTULO 1 CONSIDERAÇÕES GERAIS INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Histórico da doença Etiologia e Epidemiologia Sintomatologia Controle REFERÊNCIAS CAPÍTULO 2 Expressão de sintomas de Guignardia citricarpa em frutos cítricos inoculados com suspensão conidial RESUMO INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODOS Preparo do inóculo Metodologia de inoculação RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS CAPÍTULO 3 Período de suscetibilidade de frutos de laranjeira doce a Guignardia citricarpa e efeito da aplicação de endofíticos na supressão de sintomas da mancha preta do citros RESUMO INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODOS Período de suscetibilidade de frutos de laranjeira Pêra-Rio a conídios de Guignardia citricarpa... 38

9 viii Influência da forma endofítica de Guignardia mangiferae na supressão de sintomas de Guignardia citricarpa (Phyllosticta citricarpa) RESULTADOS E DISCUSSÃO Período de suscetibilidade de frutos de laranjeira Pêra-Rio a conídios de Guignardia citricarpa Influência da forma endofítica de Guignardia mangiferae na supressão de sintomas de Guignardia citricarpa (Phyllosticta citricarpa) CONCLUSÕES REFERÊNCIAS CAPÍTULO 4 Avaliação de fungicidas no controle de Guignardia citricarpa em frutos cítricos RESUMO INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODOS RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS... 63

10 ix MANCHA PRETA DOS CITROS: EXPRESSÃO DOS SINTOMAS EM FRUTOS PELA INOCULAÇÃO COM CONÍDIOS E CONTROLE DO AGENTE CAUSAL (Guignardia citricarpa) RESUMO A mancha preta dos citros (MPC) doença causada pelo fungo Guignardia citricarpa Kiely [anamorfo: Phyllosticta citricarpa (McAlp.) Van der Aa], é a principal doença fúngica da cultura no Brasil. Todas as variedades de laranjeiras doces são suscetíveis ao patógeno, que deprecia comercialmente os frutos, além de provocar sua queda prematura e elevar substancialmente o custo de produção. Até o presente momento, informações acerca da etiologia da doença são escassas. Portanto, o presente trabalho teve como objetivos: determinar os tipos de sintomas expressos por G. citricarpa em frutos cítricos inoculados com suspensão de conídios; desenvolver uma metodologia de inoculação de G. citricarpa a qual seja eficiente e permita estabelecer relações qualitativa e quantitativa, tanto em termos de níveis de severidade e tipos de inóculo; determinar em casa de vegetação o período de suscetibilidade dos frutos de laranjeira Pêra-Rio a G. citricarpa; verificar a influência da forma endofítica de G. mangifera na expressão de sintomas de G. citricarpa e; avaliar a relação da eficiência de controle químico da MPC versus o tempo de exposição dos frutos à descarga de conídios de G. citricarpa. Foi observado que G. citricarpa inoculada em suspensão conidial em frutos de laranjeira Pêra-Rio produzem sintomas do tipo mancha dura, mancha sardenta, mancha virulenta e falsa melanose. Quando inoculada em frutos de tangor Murcott produzem sintomas do tipo falsa melanose e mancha dura. Frutos de laranjeira Pêra-Rio mostraram-se mais suscetíveis a G. citricarpa que o tangor Murcott. A metodologia de inoculação de conídios de G. citricarpa, mostrou-se eficiente, prática e rápida, permitindo quantificar o inóculo, fato inovador. Em relação à suscetibilidade, os frutos de laranjeira Pêra-Rio quando inoculados com a G. citricarpa apresentaram 56,94% dos frutos com sintomas de MPC quando inoculados com 4,5 cm de diâmetro, 50% com 5,5 cm de diâmetro e 27,75% quando inoculados com 7 cm de diâmetro, sendo observado apenas sintomas do tipo mancha dura e mancha sardenta.

11 x Foi observado que os frutos inoculados G. mangiferae apresentaram menor índice de doença, sendo expresso apenas lesões do tipo mancha dura as quais, não evoluíram com o passar do tempo. Em relação à eficiência de controle químico versus tempo de exposição dos frutos à descarga de conídios, independente do período de exposição ao inóculo, a maior eficiência foi obtida com carbendazim, benomyl e pyraclostrobin. Palavras-chave: Citrus, fungicidas, Guignardia mangiferae, Phyllosticta citricarpa

12 xi CITRUS BLACK SPOT: EXPRESSION OF SYMPTOMS IN FRUITS BY INOCULATION WITH CONIDIA AND CAUSAL AGENT CONTROL (Guignardia citricarpa) SUMMARY - Citrus black spot (CBS), caused by Guignardia citricarpa Kiely [anamorph: Phyllosticta citricarpa (McAlp.) Van der Aa], is of the most import citrus disease in Brazil. Practically, all varieties of sweet oranges are susceptible to pathogen, which depreciates commercially the fruits, causes drop prematurely and increase substantially the cost of production. Until now, information about the etiology of the disease is scarce. Therefore, this study aimed to determine the types of symptoms expressed by G. citricarpa in citrus inoculated with conidial suspension, to develop a method of inoculation with G. citricarpa which to be efficient and allow a qualitative and quantitative relations with levels of severity and inoculum types, to determine in greenhouse the period of susceptibility sweet orange fruits of 'Pêra-Rio' to G. citricarpa; the influence of endophytic form of G. mangiferae in the suppression of symptoms of G. citricarpa; and to evaluate the efficiency of chemical control of CBS vs exposure time of fruit to discharge of conidia of G. citricarpa. Conidia of G. citricarpa inoculated in sweet orange Pêra-Rio produced symptoms of the types: hard spot, freckled spot, virulent spot and false melanose. When conidia inoculated in Murcott tangor fruits the symptoms were of the type false melanose hard spot. Sweet orange fruits showed more susceptible than Murcott tangor. The methodology of inoculation of conidia used in this work showed very efficient and practice allowing discriminative studies related to the inoculum and, additional alternative to studies related to Citrus-G. citricarpa pathosystem. For the susceptibility, sweet orange fruits with 4.5 cm diameter, inoculated with G. citricarpa showed 56.94% of fruit with symptoms of MPC, 50% of fruits with 5.5 cm diameter and 27.75% when inoculated with 7 cm in diameter, is only observed symptoms of type hard spot and freckled spot. All endophytic inoculation showed a reduction in severity of the disease inoculated G. citricarpa, observing just hard spot lesion. Regarding the efficiency of chemical control vs time of exposure of fruit to the

13 xii discharge of conidia, regardless of period of exposure to inoculum, the best efficiency was obtained with carbendazim, benomyl and pyraclostrobin. Keywords: Citrus, fungicide, Guignardia mangiferae, Phyllosticta citricarpa

14 1 CAPÍTULO 1 CONSIDERAÇÕES GERAIS 1. Introdução Atualmente a citricultura brasileira ocupa uma área de aproximadamente 800 mil hectares, tendo o Estado de São Paulo cerca de 565 mil hectares, distribuídos em 330 municípios e em propriedades (AGRIANUAL, 2008). A produção destinada à industrialização corresponde a cerca de 85%, cujo suco produzido é exportado para vários países, incluindo-se principalmente Países Baixos, Estados Unidos, Japão e China. O Brasil exportou em 2007 mais de 1 milhão de toneladas de suco de laranja, refletindo em aumento de 6,8% em relação ao ano anterior (ASSOCITRUS, 2008). O Brasil detém 30% da produção mundial de laranja e 59% da produção de suco, sendo o Estado de São Paulo e a Flórida os maiores detentores da oferta mundial, um caso raríssimo tratando-se de commodities agrícolas (NEVES & JANK, 2006). As exportações de suco concentrado de laranja (Fcoj) na safra 2007/2008 representaram um volume de produção de de toneladas, tendo os mercados NAFTA (EUA, Canadá e México) e União Européia como os maiores importadores. Em relação às exportações de laranja in natura, o volume registrado da safra 2007/2008 correspondeu a 53 mil toneladas (ABECITRUS, 2009). O sistema agroindustrial da laranja, no Brasil, atende cerca de 50% da demanda e 75% das transações internacionais, trazendo anualmente mais de US$1 bilhão em créditos de exportação para o Brasil, e uma parcela do PIB equivalente a US$ 5 bilhões de dólares (ABECITRUS, 2009). Atualmente a citricultura nacional enfrenta vários problemas, com o conseqüente aumento do custo de produção, pela elevação do preço da terra, pela manutenção dos contratos nos moldes atuais e pela pressão crescente da cultura da cana-de-açúcar. A área ocupada por canaviais no país é de aproximadamente 6,7 milhões de hectares,

15 2 sendo 3,5 milhões só no Estado de São Paulo. Os pomares de citros, porém, não chegam a 800 mil ha no País e ocupam menos de 600 mil ha no Estado de São Paulo. O poder de sobreposição dos canaviais acentua a competição com os citros pelas mesmas regiões produtoras, especialmente no Estado de São Paulo. Frente a tais fatores, a citricultura paulista encontra-se em queda, sendo o custo de produção da laranja para indústria maior que a remuneração do produtor (AGRIANUAL, 2008). Apesar da grande importância social e econômica, a citricultura ressente-se de vários problemas fitossanitários, em especial a Mancha Preta dos Citros (MPC), doença causada pelo fungo Guignardia citricarpa Kiely, cuja forma imperfeita corresponde a Phyllosticta citricarpa McAlp. Van der Aa (SUTTON & WATERSTON, 1966). Os principais sintomas apresentados por essa doença são as lesões no fruto, que os depreciam para o mercado de frutas in natura, o amadurecimento precoce e a queda acentuada (CALAVAN, 1960; KLOTZ, 1978). Nos frutos as lesões restringem-se à casca, prejudicando dessa forma a sua aparência, inviabilizando a sua comercialização para o mercado de frutas frescas (MAUCH-MANI & METRAUX, 1998). Em áreas com alta pressão de inóculo, e ausência de controle da doença, pode resultar em mais de 80% de queda dos frutos (KLOTZ, 1978; SPÓSITO, 2003). Dada à possibilidade de contaminação microbiológica, muitas vezes os frutos caídos tornam-se rejeitados pela indústria, aumentando significativamente os prejuízos. Um outro agravante redunda da condição de ser uma praga quarentenária A1 para os países da União Européia e nos Estados Unidos da América, o que resulta em grande restrição às exportações de frutos in natura para os mesmos (AGUILAR-VILDOSO et al., 2002). No caso de frutos exposrtados e, de acordo com a Normativa ora em vigor, a simples presença de um fruto com sintoma já implica em rechaço da carga, já que o nível de tolerância à doença é zero (SPÓSITO, 2003). Diante do exposto, e dada à gravidade da MPC e os elevados prejuízos causados os objetivos do presente estudo foram: (i) Determinar os sintomas expressos por G. citricarpa em frutos cítricos inoculados com suspensão conidial; (ii) Determinar uma metodologia eficiente para inoculação de G. citricarpa; (iii) Determinar em casa de vegetação o período de suscetibilidade dos frutos de laranja Pêra-Rio a G. citricarpa;

16 3 (iv) Determinar a influência de G. mangiferae na supressão de sintomas de G. citricarpa; (v) Determinar a eficiência de fungicidas de diferentes grupos, isoladamente, em relação ao controle de G. citricarpa. 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Histórico da doença Os primeiros relatos da presença de sintomas da doença datam-se em 1895, em regiões próximas a Sidney, Austrália, afetando frutos de laranja Valência nas fases de pré e em pós-colheita (SUTTON & WATERSTON, 1966). Atualmente a MPC encontra-se assinalada em vários países da África como Moçambique, Zimbábue, África do Sul, Quênia, Swazilândia, Nigéria e Rodonésia; da Ásia, como na China, Coréia, Hong-Kong, Filipinas, Taiwan e Japão; da Oceania como a Austrália e da América do Sul, como Argentina, Peru, Uruguai, Venezuela e Brasil (KOTZÉ, 1988; ROBBS & BITTENCOURT, 1995; TIMMER et al., 2000). Dentre esses países, as maiores perdas têm sido registradas na África do Sul, Japão, Argentina e principalmente no Brasil (GOES, 2005). No Brasil, os primeiros relatos da MPC datam entre os anos de 1938 e 1940 (AVERNA-SACCÁ, 1940) em frutos expostos em uma feira livre no município de Piracicaba, no Estado de São Paulo. Por várias décadas a doença permaneceu esquecida, ressurgindo no início da década de 80, quando foi relatada no Estado do Rio de Janeiro, causando perdas consideráveis em mexerica do Rio. Uma década depois, ainda nesse Estado, GOES et al. (1990) relataram a presença sintomas da MPC em frutos de laranjas Lima, Seleta, Folha Murcha, Natal, Pêra-Rio e Valência. No início da década de 90 a doença foi verificada em frutos cítricos de pomares localizados nos municípios de Mogi-Guaçu, Mogi-Mirim e Conchal (GOES & FEICHTENBERGER, 1993). Nos anos subseqüentes, de forma rápida a doença ampliou a sua distribuição

17 4 geográfica, estendendo-se para vários outros municípios da região. Atualmente a doença encontra-se presente em praticamente todos os municípios produtores do Estado de São Paulo, e também em todos os Estados das regiões Sul, Sudeste (COSTA et al., 2003; ANDRADE et al., 2004; BALDASSARI et al., 2004; GASPAROTTO et al., 2004; THEODORO et al., 2004 e CAIXETA et al., 2005), Centro- Oeste e em dois outros Estados da região Norte: Amazonas e Rondônia (A. Goes, março de 2009, Informações pessoais). No momento apenas a região Nordeste pode ser considerada como área livre da doença. 2.2 Etiologia e Epidemiologia A mancha preta do citros é causada por Guignardia citricarpa (KIELY, 1948), cuja forma imperfeita corresponde a Phyllosticta citricarpa (Van der Aa, 1973). Esse patógeno produz dois tipos de inóculo: conídios e ascósporos (McONIE, 1964; KOTZÉ, 1981), cuja importância individual nas epidemias não foi completamente esclarecida. Segundo SIVANESAM (1984), G. citricarpa é um Ascomicota, da ordem Dothideales e família Dothideacea. Este fungo possui estroma plectenquimatoso, pseudotécio globoso a subgloboso, ascas medindo 125 a 360 µm de diâmetro contendo forma de clava, sendo arredondado e bitunicado na extremidade superior. Seu interior contém oito ascósporos unicelulares, hialinos, ligeiramente cinzentos, rombóides, contendo grânulos e um grande vacúolo central. Os ascósporos são cobertos por um quepe gelatinoso na extremidade, medindo 8 a 17µm x 3,3 a 8µm. Nos pseudotécios maduros podem ainda ser encontrados pseudoparáfises. De acordo com JOHNSTON e FULLERTON (1988), as formas anamórficas e teleomórficas geralmente são encontradas associadas, embora não seja uma regra para G. citricarpa sob condições de laboratório. As estruturas de frutificação da forma assexuada (P. citricarpa) são representadas pelos picnídios, que são estruturas reprodutivas pequenas, globosas, pretas e semi-eruptivas. Em corte vertical

18 5 apresentam 70 a 330µm de diâmetro, com parede marrom escura e células pseudoparenquimatosas. De acordo com McONIE (1964), na fase perfeita o fungo produz pseudotécios e ascósporos somente em folhas em decomposição no solo, não sendo encontrados em lesões de frutos e em folhas ainda aderidas às plantas. Os pseudotécios são globosos ( µm de diâmetro), apresentando ostíolo circular e não papilado, podendo encontrar-se isolados ou agregados (SUTTON & WATERSTON, 1966). De acordo com KOTZÉ (1981), para as condições da África do Sul os ascósporos constituem-se na principal fonte de inóculo, e se desenvolvem em folhas em decomposição, de 40 a 180 dias depois da sua queda no solo. A produção dos ascósporos é favorecida pela alternância entre períodos de molhamento e secagem das folhas, condição freqüente durante a estação chuvosa do ano. Sua morfologia favorece sua disseminação a longas distâncias pelo ar, ou a curtas distâncias através do respingo de gotas d água das folhas caídas ao solo, até a superfície de órgãos da parte baixa das plantas (FEICHTENBERGER et al., 1997). Na fase anamórfica o fungo produz picnídios em lesões contidas em frutos e pedúnculo, assim como em folhas aderidas (SIVANESAN, 1984). São também produzidos em grande quantidade em folhas cítricas caídas sob a copa das plantas (McONIE, 1964) e, principalmente, em ramos secos. Os conídios apresentam forma obovóide a elíptica (8-10,5 x 5,5-7µm de diâmetro), são hialinos, unicelulares, multigutulados, com um apêndice hialino numa das extremidades, que é facilmente destacado dos conídios (PUNITHALINGAM & WOODHAMS, 1982; FEICHTENBERGER et al., 1997). Os conídios são disseminados mais apropriadamente a curtas distâncias. Esses emergem através do ostíolo e são envolvidos por uma substância mucilaginosa. Em condições naturais essa mucilagem apresenta coloração creme claro, de aspecto brilhante, servindo de proteção contra o ressecamento das estruturas do fungo, quando expostas em ambiente adverso (PUNITHALINGAM & WOODHAMS, 1982). Os esporos germinam na superfície de órgãos suscetíveis, produzindo apressórios. Uma delgada hifa de infecção é então formada a partir do apressório, que

19 6 penetra através da cutícula e forma uma pequena massa de hifas entre a cutícula e a epiderme (KOTZÉ, 1981). Nessa forma de micélio subcuticular quiescente, o fungo pode permanecer dormente por até 12 meses. Esse período de dormência pode ser interrompido quando o fruto atinge seu tamanho final e inicia a maturação, ou com condições ambientais representadas por exposição dos frutos à intensa radiação. Em particular para o Estado de São Paulo, os conídios são importantes na epidemiologia da doença, dado ao reduzido número de variedades cultivadas e à sua elevada suscetibilidade, e ao clima favorável para o desenvolvimento da doença. Além disso, dada à ocorrência de vários fluxos de florada, propicia-se a formação de frutos de forma extemporânea, o que redunda na coexistência de frutos de diferentes tamanhos e idade. Tal fato faz com que na presença de inóculo e com ambiente favorável para as infecções haja um forte incremento dos níveis da doença, possibilitando o seu progresso ao longo dos anos. Com exceção da laranja azeda e seus híbridos, os quais são resistentes G. citricarpa (KOTZÉ, 1981), e a lima ácida Tahiti, a qual é insensível ao mesmo (BALDASSARI et al., 2008), praticamente todas as demais espécies cítricas de importância econômica são suscetíveis ao patógeno. 2.3 Sintomatologia A MPC é uma doença praticamente exclusiva de frutos, donde redunda a produção de quatro tipos de sintomas (HERBERT,1989),sendo: (i) mancha dura: sintoma mais comum e típico da doença. Em geral aparece quando os frutos iniciam a maturação. Em frutos verdes, um halo amarelado aparece circundando as lesões, enquanto que no caso de frutos maduros ocorre o contrário, sendo produzido um halo verde ao redor das lesões, que apresentam o centro deprimido de cor marrom-claro ou cinza-escuro e as bordas salientes, de coloração marrom-escura. No interior dessas lesões aparecem pequenas pontuações negras, que são os picnídios do fungo; (ii) manchas sardentas: aparecem depois que os frutos já atingiram a maturação, estando

20 7 com a casca apresentando coloração amarelada ou alaranjada. As lesões são levemente deprimidas e avermelhadas. Elas podem coalescer, formando uma grande lesão, ou permanecerem pequenas e individualizadas; (iii) manchas virulentas: desenvolvem-se normalmente no final da safra, quando os frutos estão maduros e as temperaturas mais elevadas, e podem também ocorrer após a colheita, durante o transporte e o armazenamento dos frutos. As lesões aparecem como resultado do desenvolvimento e coalescência de lesões dos dois tipos anteriores, dando origem a grandes lesões deprimidas, de centro acinzentado e bordos salientes de coloração marrom-escuro ou vermelho-escuro. No centro dessas lesões aparecem muitas pontuações escuras, que são os picnídios. A casca do fruto fica necrosada na área da lesão, mas a parte interna do fruto não é afetada; (iv) manchas do tipo falsa melanose: normalmente aparecem quando o fruto encontra-se com cerca de 4-5 meses após a queda das pétalas. Segundo McONIE (1964), os sintomas da falsa melanose, nas condições da África do Sul, aparecem quatro a cinco meses após a queda das pétalas. Caracterizamse pela presença de manchas irregulares, com textura áspera ao tato, de tamanho variado, mas predominantemente pequenas, com cerca de 2mm de diâmetro. Nas fases subseqüentes, as lesões individualizadas são normalmente circundadas por numerosos pontos escuros, constituindo as lesões satélites. Em tais lesões, ao contrário das anteriores, não são formados picnídios. Além dos sintomas anteriores, no Brasil encontra-se descrito o sintoma designado mancha trincada (GOES et al., 2000). Tal sintoma é inicialmente observado em frutos ainda verdes, onde são produzidas manchas de aspecto oleoso. Posteriormente, quando da maturação dos frutos as regiões exibindo as manchas apresentam trincas. Hoje já se sabe que o sintoma tipo mancha trincada redunda do efeito da interação G. citricarpa e o ácaro da falsa ferrugem (Phyllocoptruta oleivora), (NOZAKI, 2007). Há, também, outro tipo de sintoma descrito, designado mancha rendilhada (FUNDECITRUS, 2003), o qual aparenta ser um variante do sintoma tipo falsa melanose.

21 8 Os sintomas da MPC em geral são observados em maior freqüência na fase inicial de maturação dos frutos. Posteriormente, quando nas fases de maturação e, sob elevada temperatura, estresse hídrico e plantas debilitadas, os sintomas aparecem com maior severidade. Também, quando na presença de pragas como ácaros e cochonilhas, especialmente Parlatoria ziziphus e P. pergandii, pode haver agravavamento dos sintomas nos frutos, com conseqüente queda prematura dos mesmos. Em folhas os sintomas são pouco freqüentes, mas quando presentes assemelham-se àqueles do tipo mancha dura dos frutos, com centro deprimido e os bordas salientes escuros. Um fato de importância relevante trata-se do aparecimento de sintomas de MPC nas fases de pós-colheita. Tem-se verificado que frutos, mesmo após criteriosa seleção e tratamento pós-colheita, têm exibido sintomas nas fases de transporte e durante o armazenamento, no local do destino. Esse aspecto assume importância muito relevante quando no caso de exportações, dada à possibilidade do rechaço da carga. Assim, o conhecimento dos mecanismos envolvidos na expressão dos diferentes tipos de sintomas, assim como a determinação de alternativas que viabilizem a sua supressão tornam-se de importância relevante, podendo significar a possibilidade de aumento das exportações de frutos pelas empresas brasileiras (SCALOPPI, 2006). Até o presente não foram encontrados relatos relacionados à origem dos diferentes tipos de sintomas. Admite-se que, alguns deles, devido à individualização das lesões, estejam relacionados às infecções originárias de ascósporos, já que esses podem ser levados pelo vento e dessa forma serem espalhados aleatoriamente. Outros tipos de sintomas, em razão do baixo nível de individualização das lesões, pressupõemse sejam originários de conídios, já que os mesmos, após dispersão da mucilagem possam ser espalhados na superfície dos frutos, na maioria das vezes apresentam-se concentrados. Para McONIE (1967), apenas os tecidos tenros dos frutos cítricos mostram-se suscetíveis à infecção por G. citricarpa e, portanto, com o passar do tempo, os frutos vão se tornando naturalmente resistentes. Para KELLERMAN & KOTZÉ (1977), os frutos estão suscetíveis do período compreendido entre a antese até as 16 semanas

22 9 subsequentes. Por outro lado, para KIELY (1948) e KOTZÉ (1981), o período crítico de suscetibilidade do fruto, nas condições da África do Sul, varia de 17 a 21 semanas após a queda de pétalas. Por outro lado, de acordo com CALAVAN (1960), para as condições da Austrália, a extensão do período de suscetibilidade para a laranja Valência não é completamente esclarecida, podendo, no entanto, alcançar cerca de seis meses após a queda de pétalas. Tal ponto de vista quanto ao longo período de suscetibilidade é também compartilhado por KLOTZ (1978) e BALDASSARI et al. (2006), os quais obtiveram sintomas em frutos inoculados com pelo menos até 24 semanas após a queda das pétalas. 2.4 Controle A MPC pode ser originada por dois tipos de inóculo: conídios ou ascósporos. Não existe um consenso sobre quais das formas, entre conídios e ascósporos, mostram-se de maior importância uma vez a doença já tenha sido estabelecida. Dessa forma, o controle deve ser voltado para a eliminação e/ou supressão das duas fontes de inóculo, ou pelo menos, minimizar a produção dos mesmos. No caso do controle voltado para os ascósporos faz-se importante reduzir a sua produção mediante: (i) manejo da vegetação verde (gramíneas e leguminosas) em ruas de plantio, com roçadeiras ecológicas; (ii) uso de decompositores de folhas como a uréia ou formulações prontas, como Compostaid e Stable Aid, aplicados por meio das barras de herbicidas; (iii) eliminação física das folhas com o uso de flammer (queimador à gás) ou rastelos mecânicos conjugados com trinchas e; (iv) supressão ou minimização da queda de folhas das plantas. Para o caso dos conídios, já que esses na sua maioria são formados em galhos secos recomenda-se controlar os fatores que predispõem à sua formação, como (i) bom manejo nutricional das plantas, notadamente quanto ao adequado fornecimento de cobre, (ii) controle de rubelose (Erytricium salmonicolor) e demais doenças que causam o secamento de galhos e ramos; (iii)

23 10 minimizar e/ou evitar a quebra de galhos e ramos (GOES & ALMEIDA, 2007) e; poda de galhos secos. Outra alternativa empregada e que tem redundado em melhores resultados de controle baseia-se no uso de fungicidas. Entretanto, além do custo consideravelmente elevado,nem sempre os resultados alcançam o nível desejável. Dentre os fungicidas adotam-se os de modo de ação dos tipos protetores, ou da mistura desses com fungicidas sistêmicos, sempre associados com óleo mineral ou vegetal. Normalmente bons resultados de controle são obtidos mediante ao emprego de duas pulverizações com fungicidas cúpricos, em intervalo de 25 a 28 dias, iniciando na fase de ¾ de pétalas caídas. Posteriormente são necessárias pulverizações adicionais envolvendo a mistura anteriormente mencionada, iniciando aos dias após a segunda pulverização com fungicida cúprico, complementando-se com outras pulverizações em intervalos de dias, em número dependente da uniformidade do florescimento, desenvolvimento dos frutos, pluviosidade e destino final dos frutos. No caso de variedades de laranjas tardias e as de meia-estação, dependendo do nível de inóculo da área, são necessárias três aplicações da combinação de fungicidas. Dentre os fungicidas sistêmicos, os que proporcionam bom controle do patógeno e que possuem registro junto ao Ministério da Agricultura incluem-se os pertencentes aos benzimidazóis, como tiofanato metílico e carbendazim, e os do grupo das estrobilurinas, como azoxystrobin, pyraclostrobin e trifloxystrobin. Todos os grupos químicos mostram-se eficientes, porém devem ser utilizados em mistura com fungicidas protetores e nas dosagens recomendadas pelos respectivos fabricantes. Dentre os protetores incluem os fungicidas cúpricos e ditiocarbamatos. Um detalhe importante refere-se à qualidade dos óleos, os quais devem conter emulsificantes em quantidade e de qualidade necessárias para propiciar boa miscibilidade em água, proporcionando uma mistura uniforme e estável (GOES & ALMEIDA, 2007). Como os esporos produzidos pelo patógeno podem-se disseminar ou dispersarem de forma aleatória, os mesmos podem atingir diferentes regiões dos frutos, incluindo aqueles que eventualmente estejam em locais difíceis de serem alcançados quando das pulverizações, de tal forma que a pulverização deve ser feita com

24 11 equipamentos de boa qualidade, calibração adequada e velocidade compatível, de tal forma que proporcione uma excelente cobertura dos frutos. O número e tamanho das gotas devem ser bem dimensionados para que o alvo seja uniformemente atingido. 3. Referências ABECITRUS. Exportação de Laranja. Disponível em: < em 05 de janeiro de AGRIANUAL 2008: Anuário da Agricultura Brasileira. São Paulo: FNP, p AGUILAR-VILDOSO, C. I.; RIBEIRO, J. G. B.; FEICHTENBERGER, E. GOES, A. de; SPÓSITO, M. B. Manual técnico de procedimentos da mancha preta dos citros. Brasília: MAPA/DAS/DDIV, ANDRADE, T.; THEODORO, G.F.; GOES, A.; BALDASSARI, R.B. Mancha preta (G. citricarpa) dos citros no Estado de Santa Catarina. Summa Phytopathologica, Botucatu, v.30, p. 126, ASSOCITRUS. Disponível em <http// Acesso em: 25 de novembro AVERNA-SACCÁ, R. Pústulas pretas sobre laranjas doces produzidas por Phoma citricarpa. Revista Agrícola, Piracicaba, v.15, p , BALDASSARI, R.B.; REIS, R.F.; GOES, A. Susceptibility of fruits of the Valência and Natal sweet orange varieties to Guignardia citricarpa and the influence of the

25 12 coexistence of healthy and symptomatic fruits. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v.31, p BALDASSARI, R.B.; REIS, R.F.; GOES, A. de. Relato de mancha preta do citros em pomares do estado de Minas Gerais. In: CONGRESSO PAULISTA DE FITOPATOLOGIA, , Campinas. Anais Campinas, p.126, BALDASSARI, R.B.; WICKERT, E.; GOES, A. Pathogenicity, colony morphology and diversity of isolates of Guignardia citricarpa and G. mangiferae isolated from Citrus spp. European Journal of Plant Pathology, Dordrecht, v.120, p , CAIXETA, M.P.; CORAZA NUNES, M.J.; VIDA, J.B.; NUNES, W N.; TESSMANN, D.J.; ZANUTO, C.A.; MULLER, G.R. Ocorrência da pinta preta dos citros (Guignardia citricarpa) no estado do Paraná. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v.30, n. 1, p. 136, CALAVAN, E.C. Black spot of citrus. The California Citrograph, Los Angeles, v.46, n.11, p.21-24, COSTA, H.; VENTURA, J.A.; ARLEU, R.J.; AGUILAR-VILDOSO, C.I. Ocorrência de pinta Preta (Guignardia citricarpa) em citros no Estado do Espírito Santo. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 28, p. 205, Suplemento FEICHTENBERGER, E. Mancha preta ou pinta preta dos citros. Laranja & Cia, Matão, v.43, p.10-11, FEICHTENBERGER, E.; MÜLLER, G.W.; GUIRADO, N. Doenças do citros. In: KIMATI, H., AMORIM, L.; BERGAMIM FILHO, A.; CAMARGO, L.E.A.; REZENDE, J.A.M. (Ed.). Manual de fitopatologia: doenças das plantas cultivadas. 3 ed. São Paulo: Agronômica Ceres, v.2, p , 1997.

26 13 FUNDECITRUS. Manual de pinta preta, Araraquara: Fundo Paulista de Defesa da Citricultura, 2003, 7p. GASPAROTTO, L.; GOES, A.; PEREIRA, J.C.R.; BALDASSARI, R.B. Ocorrência da Mancha preta (G. citricarpa) dos citros no Estado de Amazonas. Summa Phytopathologica, Botucatu, v.30, p. 126, GOES, A. de; BARROS, J.C.S.M. de; PINHEIRO, J.E. Controle da pinta preta dos frutos de tangerina Rio (Citrus deliciosa) ocasionada por Phyllosticta citricarpa. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v.15, p.73-75, GOES, A.; FEICHTENBERGER, E. Ocorrência da Mancha Preta causada por Phyllosticta citricarpa (Mc Alp) Van der Aa (Guignardia citricarpa Kiely) em pomares cítricos do Estado de São Paulo. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v.18, p.318, GOES, A.; BALDASSARI, R.B.; FEICHTENBERGER, E.; AGUILAR-VILDOSO, C.I.; SPÓSITO, M.B. Craked spot, a new symptom of citrus black spot in Brazil. Proceedings of the International Society of Citriculture, Orlando, Florida, p , GOES, A. Etiologia, aspectos epidemiológicos e controle de Guignardia citricarpa, agente causal da mancha preta do citros. Relatório Técnico. 100 p GOES, A.; ALMEIDA, T.F. Atualização em Pinta Preta. Citricultura Atual, Cordeirópolis, n. 61, p HERBERT, J.A. Citrus black spot. Citrus and Subtropical Fruit Research Institute, Nelspruit. Citrus H.30, 1989.

27 14 JOHNSTON, P.R.; FULLERTON, R.A. Cryptosporiopsis citri sp. nov., cause of a citrus leaf spot in the Pacific Islands. New Zealand Journal of Experimental Agriculture, Wellington, v.16, p , KIELY, T.B. Control and epiphytology of black spot of citrus on the central coast of New South Wales. New South Wales: Department of Agriculture Science, p.88. (Bulletin), KELLERMAN, C.R.; KOTZÉ, J.M. The black spot disease of citrus and its control in South Africa. Proceedings International Society Citriculture, Sun City, v.3, 1977, p KLOTZ, L.J. Fungal, bacterial, and nonparasitic diseases and injuries originating in the seebed, nursery, and orchard. In: REUTHER, W.; CALAVAN, E.C.; CARMAN, G.E. (Ed.) The Citrus Industry. Riverside, University of California, p KOTZÉ, J. M. A strain of Guignardia citricarpa, the citrus black spot pathogen. Resistant to benomyl in Souyh Africa, Plant Disease, St. Paul, v.65, p.945, KOTZÉ, J.M. Black spot. In: WHITESIDE, J. O.; GARNSEY, S. M.; TIMMER, L. W. (Ed). Compedium of Citrus Diseases, St. Paul, American Phytopathological Society Press, p MAUCH-MANI, B.; METRAUX, J.P. Salicylic acid and systemic acquired resistance to plant pathogen attack. Annals of Botany, Oxford, v.82, p , McONIE, K. C. The latent occurrence in Citrus and other hosts of a Guignardia easily confused with G. citricarpa, the citrus black spot pathogen. Phytopathology, St.Paul, v.54, p.40-43, 1964.

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30 17 CAPÍTULO 2 - EXPRESSÃO DE SINTOMAS DE Guignardia citricarpa EM FRUTOS CÍTRICOS INOCULADOS COM SUSPENSÃO CONIDIAL RESUMO - A mancha preta dos citros (MPC), doença causada pelo fungo Guignardia citricarpa (Phyllosticta citricarpa), causa lesões nos frutos depreciando-os comercialmente e restringindo as exportações para países onde a doença é considerada praga quarentenária A1. O objetivo deste trabalho foi analisar os tipos de sintomas de mancha preta do citros em frutos de laranjeira Pêra-Rio e tangor Murcott inoculados com suspensão conidial. Foram empregadas as concentrações de inóculo contendo 10 4 e 10 8 conídios.ml -1. A inoculação deu-se em frutos com 2,5-3,0 cm de diâmetro, utilizando-se atomizador manual do tipo De Vilbs. Após a inoculação as plantas foram submetidas a duas condições: (i) câmara úmida por 48h e transferidas para casa de vegetação e, (ii) mantidas a céu aberto. Os frutos foram avaliados semanalmente quanto à presença e ausência de sintomas, tipos de sintomas expressos e, incidência da doença. Após 40 dias da inoculação verificou-se que a maioria dos frutos apresentava sintomas. Em frutos de laranjeira Pêra-Rio inoculados à concentração de 10 4 conídios.ml -1, os sintomas foram do tipo mancha dura, os quais, em alguns casos, evoluíram para mancha virulenta. Na concentração de 10 8 conídios.ml -1 foram observados sintomas do tipo falsa melanose e, esporadicamente, sintomas do tipo mancha sardenta. Em frutos de tangor Murcott, independente da concentração da suspensão de inóculo empregada, os sintomas produzidos foram do tipo falsa melanose, com algumas lesões do tipo mancha dura. A metodologia de inoculação empregada no presente trabalho mostrou-se eficiente, sendo, portanto, uma alternativa adicional para estudos relacionados ao patossistema Citrus-G. citricarpa. Palavras-chave: Citrus reticulata, Citrus sinensis, Phyllosticta citricarpa

31 Introdução A mancha preta dos citros (MPC), causada por Guignardia citricarpa (Phyllosticta citricarpa), causa lesões na casca dos frutos, depreciando-os comercialmente e restringindo as exportações por tratar-se de praga quarentenária A1 para vários países. Além disso, o seu controle é oneroso e, dependendo do nível de severidade dos sintomas, pode causar significativa queda prematura dos frutos. Com exceção da laranja azeda (Citrus aurantium L.) e seus híbridos e a lima ácida Tahiti (C. latifolia), todas as variedades de laranja doces (C. sinensis L.), especialmente as de maturação tardia, são suscetíveis ao patógeno. Incluem-se também como espécies suscetíveis os limões verdadeiros (C. limon L.), pomelos (C. paradisi Macfad.), algumas tangerinas como a Ponkan (C. reticulata Blanco), Cravo (C. reticulata) e mexerica do Rio (C. deliciosa), a lima da Pérsia e tangor, especialmente o Murcott (C. reticulata x C. sinensis L.). Segundo a literatura, G. citricarpa é responsável por cinco tipos de sintomas designados falsa melanose, mancha dura, mancha sardenta, mancha virulenta (HERBERT, 1989) e mancha trincada (GOES et al., 2000). E ainda, de acordo com FUNDECITRUS (2008), um sexto tipo de sintoma também encontra-se associado, denominado mancha rendilhada, caracterizada pela presença de lesões superficiais, sem borda definida, e textura lisa, que aparecem quando os frutos ainda estão verdes. Existem dois tipos de inóculo responsáveis pela doença. A primeira via é representada pelos ascósporos (fase sexual), formados exclusivamente em pseudotécios nas folhas caídas (McONIE, 1964a). A segunda é representada pelos conídios (fase assexual), os quais são formados nas lesões existentes nos frutos, em folhas ainda aderidas nas plantas e, também, em ramos secos (KOTZÉ, 1981). Na África do Sul, McONIE (1964b) demonstrou mediante experimentos envolvendo armadilhas caça-esporos, ensacamento de frutos e pulverizações com fungicidas, que as infecções iniciais dos frutos coincidiram com um período de elevada descarga de ascósporos. Posteriormente outros pesquisadores convenceram-se de que

32 19 os ascósporos constituíam-se na principal fonte de inóculo nesse país (McONIE, 1967; KELLERMAN & KOTZÉ, 1977; SCHUTTE et al., 1997). No Brasil, apesar da escassez de informações quanto ao caráter epidemiológico de G. citricarpa, o comportamento da MPC aparenta ser diferente. Neste país, o papel dos conídios é tão importante quanto o dos ascósporos em virtude da ocorrência simultânea de frutos sintomáticos e frutos jovens suscetíveis, principalmente nas variedades que apresentam vários surtos de florescimento e nas de maturação tardia (FEICHTENBERGER,1996, BALDASSARI et al., 2006). Outro agravante é o longo período de condições favoráveis à liberação de ascósporos (REIS et al., 2006) e produção de conídios. Dessa forma, o conhecimento dos mecanismos envolvidos na expressão dos diferentes tipos de sintomas de G. citricarpa é fundamental para determinação de alternativas que viabilizem a sua supressão. Embora a primeira citação quanto à ocorrência de G. citricarpa em frutos cítricos tenha ocorrido em 1895, na Austrália, ressente-se ainda da falta de uma metodologia de inoculação prática, eficiente e que permita o estabelecimento de relações de caráter qualitativo e quantitativo. As metodologias disponíveis no momento baseiam-se na deposição de folhas cítricas, infectadas e secas, sobre frutos na fase crítica de suscetibilidade (McONIE, 1964a), emprego de suspensão de ascósporos (LEMIR et al., 2000), ou na deposição de discos foliares previamente colonizados por G. citricarpa, contendo picnídios, conídios e possivelmente pseudotécios e ascósporos sobre frutos em estádios suscetíveis (BALDASSARI et al., 2008). Dentre tais metodologias, a primeira foi utilizada por vários anos, mas, ultimamente, a que vem prevalecendo é a última, a qual, embora eficiente e prática, apresenta a limitação do estabelecimento de relações quanto a concentrações de inóculo, tipos de sintomas e aspectos fitopatométricos. O objetivo do presente trabalho foi: (i) determinar os tipos de sintomas expressos por G. citricarpa em frutos cítricos inoculados com suspensão conidial e (ii) desenvolver uma metodologia de inoculação de G. citricarpa eficiente que permita estabelecer relações qualitativa e quantitativa, tanto em termos de níveis de severidade e quanto aos tipos de inóculo empregados.

33 Material e Métodos Os experimentos foram conduzidos no laboratório e casa de vegetação do Departamento de Fitossanidade da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias UNESP, Jaboticabal, São Paulo, Brasil Preparo da suspensão conidial de Guignardia citricarpa Todas as inoculações foram realizadas com o isolado 315 de G. citricarpa, de cultura monospórica, obtido da região de Conchal/SP, reconhecidamente patogênico, conforme testes de inoculação realizados por Baldassari (2001). O fungo foi cultivado em meio de cultura batata-dextrose-ágar (BDA) contido em placas de Petri, e mantido em estufas para B.O.D. a 25 C, com fotoperíodo alte rnado (12h luz/12h escuro) por 30 dias. A partir dessa cultura obteve-se suspensão conidial a qual foi calibrada para a concentração desejada. Os conídios foram removidos das colônias mediante a deposição de 10 ml de água esterilizada, seguido da raspagem superficial com pincel de cerdas duras. Posteriormente, a suspensão foi filtrada em camada dupla de gaze e ajustada para duas concentrações: 10 4 conídios.ml -1 e 10 8 conídios.ml -1, aferidas em câmara de Neubauer. No momento da inoculação foi adicionada à suspensão suco de laranja (1% v/v) + 10g/L de sacarose Metodologia de inoculação A inoculação foi realizada em frutos de plantas de laranjeiras Pêra-Rio e tangoreiro Murcott, com aproximadamente três anos de idade, enxertadas em limoeiro Cravo e mantidas em vaso, em casa de vegetação. Foram empregados quatro plantas de laranjeiras Pêra-Rio e quatro plantas de tangoreiro Murcott. A inoculação deu-se

34 21 em frutos com cerca de 2,5-3,0 cm de diâmetro, utilizando-se atomizador manual do tipo De Vilbs. Para tal, foram empregados 12 frutos, previamente selecionados para cada uma das concentrações mencionadas. Foram realizados dois experimentos: no primeiro, os frutos de laranjeira Pêra-Rio e tangor Murcott, após a inoculação foram ensacados com saco de papel cristal 15x15cm, sendo as respectivas plantas mantidas em câmara úmida durante 48 h em sala de nebulização com umidade aproximada de 100%. Posteriormente, os sacos de papel foram retirados e as plantas transferidas para casa de vegetação. No segundo experimento, utilizou-se a mesma metodologia descrita anteriormente, porém, as plantas após a inoculação foram mantidas à céu aberto, não sendo submetidas à condição de câmara úmida. Os frutos permaneceram ensacados até o final do experimento. A inoculação-controle foi realizada em paralelo, sendo empregado apenas água destilada. Os experimentos foram repetidos três vezes, nos períodos 02/2007, 05/2007 e 08/2007, em frutos da mesma idade, obtidos com indução da florada. As interpretações dos resultados deram-se de forma qualitativa, avaliandose quanto à presença ou ausência e tipos de sintomas expressos e, quantitativa, determinando o número de frutos sintomáticos. 2.3 Resultados e Discussão Os primeiros sintomas de MPC foram observados em alguns frutos, aos 40 dias após a inoculação de laranjeiras Pêra-Rio e tangor Murcott. Porém, aos 90 dias após a inoculação praticamente todos os frutos inoculados exibiam sintomas de MPC. Ambas as concentrações de inóculo avaliadas foram altamente eficientes na indução de sintomas da MPC. Os frutos de laranjeira Pêra-Rio apresentaram maior número de frutos sintomáticos que os de tangor Murcott (Tabela 1 e 2). Todas as épocas de inoculação mostraram-se eficientes para expressão de sintomas de MPC.

35 22 Tabela 1. Número de frutos de laranjeiras Pêra-Rio apresentando sintomas de mancha preta do citros, inoculados com suspensão conidial de Phyllosticta citricarpa nas concentrações de 10 4 e 10 8 conídios.ml -1, avaliados aos 40 e 90 dias após a inoculação (DAI). Jaboticabal/SP, 2009 Época de Inoculação Total de frutos Número de frutos sintomáticos 10 4 conídios.ml conídios.ml -1 avaliados 40 DAI 90 DAI 40 DAI 90 DAI 02/ bb 12 aa 10 bb 12 aa 05/ cb 10 aa 10 bb 12 aa 08/ ab 12 aa 12 aa 12 aa *Médias seguidas pela mesma letra minúscula nas colunas ou maiúscula nas linhas não diferem estatisticamente entre si (Tukey, P 0,05). A maior expressão de sintomas em tangor Murcott, semelhante ao observado para frutos de laranjeiras Pêra-Rio, foi obtida na concentração contendo 10 8 conidios.ml -1, aos 90 dias após a inoculação. Entretanto, em frutos dessa espécie cítrica a expressão de sintomas foi 83,3% àquela observada em frutos de laranjeira Pêra-Rio (Tabela 2). Tabela 2. Número de frutos de tangor Murcott apresentando sintomas de Guignardia citricarpa, inoculados com suspensão conidial nas concentrações de 10 4 e 10 8 conídios.ml -1, avaliados aos 40 e 90 dias após a inoculação (DAI). Jaboticabal/SP, 2009 Época de Inoculação Total de frutos Número de frutos sintomáticos 10 4 conídios.ml conídios.ml -1 avaliados 40 DAI 90 DAI 40 DAI 90 DAI 02/ ab 09 aa 08 bb 09 ba 05/ ab 09 aa 05 ab 10 aa 08/ ab 10 aa 06 ab 11 aa *Médias seguidas pela mesma letra minúscula nas colunas ou maiúscula nas linhas não diferem estatisticamente entre si (Tukey, P 0,05). Quando das avaliações realizadas aos 40 e 90 dias após a inoculação, em frutos de laranjeira Pêra-Rio inoculados com G. citricarpa na concentração de 10 4 conídios.ml -1 houve predomínio dos sintomas do tipo mancha dura. Entretanto, nos estádios subseqüentes, até a colheita, houve incremento nos níveis de severidade dos sintomas, dando origem aos do tipo mancha virulenta (Figura 1). Quando da

36 23 concentração de 108 conídios.ml-1 predominaram os sintomas do tipo falsa melanose, e, em menor freqüência, os do tipo mancha sardenta (Figura 2). A B B Figura 1. Sintomas de mancha preta do citros em frutos de laranjeira Pêra-Rio inoculados com suspensão de conídios de Phyllosticta citricarpa contendo 104 conídios.ml-1. A Sintoma do tipo mancha dura (lesões levemente arredondadas, deprimidas e com centro acinzentado) e, B - Sintomas dos tipos mancha dura e mancha virulenta (manchas coalescentes).

37 24 A B Figura 2. Sintomas de mancha preta do citros em frutos de laranjeira Pêra-Rio inoculados com suspensão de conídios de Phyllosticta citricarpa contendo 10 8 conídios.ml -1. A sintomas do tipo falsa melanose (manchas escuras e superficiais) e, B - sintomas dos tipos falsa melanose e mancha sardenta (manchas avermelhadas). Para o caso de frutos de tangor Murcott, independente da concentração avaliada predominou o sintoma do tipo falsa melanose, embora os do tipo mancha dura estivessem também presentes, porém com freqüência muito baixa (Figura 3). Nessa espécie, independente do desenvolvimento fenológico dos frutos, não houve alterações dos tipos de sintomas originalmente observados.

38 25 A B Figura 3. Sintomas de mancha preta do citros em frutos de tangor Murcott inoculados com suspensão de conídios de Phyllosticta citricarpa contendo 106 e 108 conídios.ml-1. A Aos 40 dias após a inoculação e B Aos 90 dias após a inoculação. Em folhas de laranjeira Pêra-Rio, próximas e logo abaixo dos frutos inoculados com suspensão de conídios de P. citricarpa a108 conídios.ml-1, foram observados sintomas de MPC, caracterizados pela presença de manchas escuras, de diferentes formas, sendo algumas do tipo mancha dura e outras de aspecto oleoso, irregulares, dispersas, assemelhando às do tipo falsa melanose. Provavelmente tais infecções

39 26 resultaram do respingo e/ou escorrimento da suspensão conidial (Figura 4), com demonstração, assim, da expressão de sintomas resultantes da inoculação artificial. Isolamentos realizados a partir de algumas das lesões comprovaram a presença do patógeno. Figura 4. Sintomas mancha preta do citros em folhas de laranjeira Pêra-Rio localizadas próximas aos frutos inoculados com suspensão de conídios de Phyllosticta citricarpa contendo 10 8 conídios.ml -1. Independente do ambiente pós-inoculação, em casa de vegetação ou ambiente à céu aberto, não houve diferença em relação à incidência da doença. No caso da testemunha, em nenhuma das circunstâncias avaliadas foi observada a presença de sintomas de MPC. Atualmente, a metodologia de inoculação mais usualmente utilizada é a desenvolvida por BALDASSARI et al. (2008), a qual consiste na deposição de discos de folhas cítricas colonizados por G. citricarpa sobre frutos cítricos. Entretanto, nessa metodologia as respostas da inoculação são, de modo geral, de caráter quase que exclusivo de natureza qualitativa, visto a inviabilidade da quantificação do inóculo presente nos discos foliares. A metodologia de inoculação empregada no presente trabalho também mostrouse muito eficiente como alternativa para a discriminação dostipos de sintomas conseqüentes do inóculo empregado, sendo, portanto, uma alternativa adicional para estudos relacionados ao patossistema Citrus-G. citricarpa. Além disso, a metodologia ora proposta, com o emprego exclusivo de conídios, dada à facilidade da padronização

40 27 do inóculo empregado permite avaliar simultaneamente isolados de diferentes procedências quanto ao seu comportamento patogênico, tipos de sintomas produzidos e níveis de severidade da doença. Os conídios de G. citricarpa são produzidos em picnídios, e quando da sua maturidade são extruídos pelo ostíolo. Posteriormente, através da água os mesmos são removidos e dispersos para o plano mais baixo da copa das plantas. Devido à arquitetura das plantas cítricas, esses conídios são dispersos na forma de cascata, sendo espalhados por toda a planta, especialmente nas partes mais externas da planta. Dada à forma de dispersão dos conídios, envolvidos em mucilagem, mesmo quando da presença de chuvas de grande intensidade, há a tendência de muitos conídios encontrarem-se agrupados. Em conseqüência disso, sob condições ambientais favoráveis há a sua germinação e infecção. Em termos gerais, o sintoma predominante nessa situação é o do tipo falsa melanose. No presente estudo, esse ponto de vista, anteriormente não comprovado, mostrou-se coerente e convergente, já que quando do emprego de concentração de inóculo a 10 8 conídios.ml -1 houve predominantemente a produção de tal tipo de sintoma. Por outro lado, quando do emprego da concentração a 10 4 conídios.ml -1 houve predomínio dos sintomas dos tipos mancha dura e mancha virulenta. No presente estudo, mesmo com o emprego exclusivo de conídios, com exceção do sintoma do tipo mancha trincada, todos os demais citados pela literatura foram observados, incluindo o do tipo mancha virulenta, que, conforme a literatura, resulta da coalescência de lesões dos tipos mancha dura e mancha sardenta (HERBERT, 1989; FUNDECITRUS 2008; THE BRITISH SOCIETY FOR PLANT PATHOLOGY, 2009). Conforme HERBERT (1989), algumas lesões superficiais, do tipo falsa melanose, pode evoluir para as do tipo mancha dura. Entretanto, embora este aspecto transicional não possa ser descartado em algumas situações, no presente estudo isso não foi observado, com exceção apenas quanto à formação do sintoma do tipo mancha virulenta a partir dos sintomas do tipo mancha sardenta, quando a concentração do inóculo foi 10 4 conídios.ml -1. Em tangor Murcott houve predominância de sintomas do tipo falsa melanose.

41 28 Embora ainda não exista um consenso sobre quais das duas formas de inóculo de G. citricapa, conídios ou ascósporos, mostram-se de maior importância uma vez à doença tenha já sido estabelecida, os resultados aqui apresentados tornam evidentes a relevância dos conídios. Neste caso, preconizando minimizar o impacto resultante da sua disponibilidade, já que esses são formados em galhos secos, recomenda-se controlar os fatores que predispõem à sua formação, como (i) bom manejo nutricional das plantas, notadamente quanto ao adequado fornecimento de cobre, (ii) controle de rubelose (Erytricium salmonicolor) e demais doenças que causam o secamento de galhos e ramos; (iii) minimizar e/ou evitar a quebra de galhos e ramos e; (iv) poda de galhos secos. Também, além das medidas preconizadas, o controle químico faz-se imprescindível, cujo rigor do patógeno dependerá do nível de infecção nos pomares e destino final dos frutos. A metodologia de inoculação empregada no presente trabalho mostrou-se muito eficiente, o que permite estudos discriminativos quanto aos sintomas conseqüentes do inóculo empregado, avaliação do período de incubação em diferentes variedades e diferentes estádios fenológicos sendo, portanto, uma alternativa adicional para estudos relacionados ao patossistema Citrus-G. citricarpa. 2.4 Conclusões Guignardia citricarpa inoculada em suspensão conidial em frutos de laranjeira Pêra-Rio produzem sintomas dos tipos mancha dura, mancha sardenta, mancha virulenta e falsa melanose. Guignardia citricarpa inoculada em suspensão conidial em frutos de tangor Murcott produzem sintomas do tipo falsa melanose e mancha dura. Frutos de laranjeira Pêra-Rio mostram-se mais suscetíveis a Guignardia citricarpa que os de tangor Murcott. A metodologia de inoculação de conídios de Guignardia citricarpa, desenvolvida no presente estudo, mostra-se eficiente e prática.

42 Bibliografia BAAYEN, R.P.; BONANTS, P.J.M.; VERKLEY, G.P.; CARROLL, G.C.; VAN DER AA, M.; WEERDT, M.; BROUWERSHAVEN, G.C.; SCHUTTE, G.C.; MACCHERONI, Jr., W.; GLIENKE-BLANCO, C.; AZEVEDO, J.L. Nonpathogenic strains of the citrus black spot fungus, Guignardia citricarpa, identified as a cosmopolitan endophyte of woody plants, Guignardia mangiferae, (Phyllosticta capitalensis). Phytopathology, St. Paul, v.92, n.5, p , BALDASSARI, R.B.; REIS, R.F.; GOES, A. Susceptibility of fruits of the Valência and Natal sweet orange varieties to Guignardia citricarpa and the influence of the coexistence of healthy and symptomatic fruits. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v.31, p BALDASSARI, R.B.; REIS, R.F.; GOES, A. A new method for inoculation of fruit with Guignardia citricarpa, the causal agent of citrus black spot. European Journal of Plant Pathology, Dordrecht, v.123, p.1-4, FEICHTENBERGER, E. Mancha preta dos citros no estado de São Paulo. Laranja, Cordeirópolis, v.17, p , FUNDECITRUS. Mancha preta dos citros. (janeiro, 2008). GOES, A.; BALDASSARI, R.B.; FEICHTENBERGER, E.; SPÓSITO, M.B.; AGUILAR- VILDOSO, C.I. Cracked spot, a new symptom of citrus black spot (Guignardia citricarpa) in Brazil. 9th International Citrus Congress of the International Society of Citriculture, Orlando HERBERT J.A. Citrus black spot. Citrus and Subtropical Fruit Research Institute, Citrus H

43 30 KELLERMAN, C.R. & KOTZÉ, J.M. The black spot disease of citrus and its control in South Africa. Proceedings International Society Citriculture, Sun City, v.3, p , KOTZÉ, J.M. Epidemiology and control of citrus black spot in South África. Plant Disease, St. Paul, v.65, p , LEMIR A.H.M.; STADNIK M.J.; BUCHENAUER H.; CANTON N.V. In vitro production of ascospores and pathogenicity of Guignardia citricarpa, causal agent of citrus black spot. Summa Phytopathologica, Jaboticabal, v.26, p , McONIE K. C. Source of inoculum of G. citricarpa, the citrus black spot pathogen. Phytopathology, St. Paul, v.54, p.64-67,1964a. McONIE K. C. The latent occurrence in citrus and other hosts of a Guignardia easily confused with G. citricarpa, the citrus black spot pathogen. Phytopathology St. Paul, v.54, p.40-43,1964b. McONIE K.C. Germination and infection of citrus by ascospore of G. citricarpa, in relation to control of black spot. Phytopathology, St. Paul, v.57, p ,1967. REIS, R.F.; GOES, A.;TIMMER, L.W. Effect of temperature, leaf wetness, and rainfall on the production of Guignardia citricarpa ascospores and on black spot severity on sweet orange. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 31, p.29-34, SCHUTTE, G.C.; BEETON, K.V.; KOTZÉ, J.M. Rind stippling on valencia oranges by cooper fungicides used for control of citrus black spot in South Africa. Plant Disease, St. Paul, v.81, p , 1997.

44 31 The British Society for Plant Pathology. Disponível em: < em 10 de fevereiro de Van der Aa H.A. Studies in Phyllosticta I. Studies in Micology v.5, 1973.

45 32 CAPÍTULO 3 PERÍODO DE SUSCETIBILIDADE DE FRUTOS DE LARANJEIRA DOCE A Guignardia citricarpa E EFEITO DA APLICAÇÃO DE Guignardia mangiferae NA EXPRESSÃO DE SINTOMAS DA MANCHA PRETA DO CITROS EM FRUTOS RESUMO Este estudo teve como objetivo determinar o período de suscetibilidade de frutos de laranjeira Pêra-Rio a Guignardia citricarpa e verificar a influência da aplicação da forma endofítica, Guignardia mangiferae, na supressão de sintomas mancha preta dos citros. Para tal, frutos de laranjeira Pêra-Rio da mesma florada, com diâmetros de 4,5; 5,5 e 7 cm foram inoculados com G. citricarpa através da aspersão de suspensão de conídios utilizando atomizador manual do tipo De Vilbs. A concentração da suspensão conidial foi ajustada para 10 4 conídios.ml -1, sendo que no momento da inoculação foi adicionado suco de laranja e dextrose à solução. As avaliações foram realizadas em intervalos semanais, quanto à presença e ausência de sintomas, assim como os tipos de sintomas expressos. Foram inoculados 24 frutos para cada estádio de desenvolvimento. Para o estudo da influência da forma endofítica na supressão de sintomas da MPC, empregou-se frutos de laranjeira Pêra-Rio, com 2,5 a 3 cm de diâmetro, os quais foram inoculados com G. mangiferae nas seguintes concentrações (conídios.ml -1 ): 10 4, 10 6 e A inoculação de G. citricarpa deu-se mediante suspensão contendo 10 6 conídios.ml -1, realizada em dois intervalos de tempo: 48 horas antes e 48 horas após a inoculação da forma endofítica. Como controle utilizou-se plantas inoculadas apenas com a forma endofítica e plantas inoculadas apenas com a forma patogênica. Em todas as inoculações adicionou-se à suspensão conidial suco de laranja e dextrose no momento da inoculação. Foram inoculados 20 frutos para cada concentração testada. Mediante emprego de escala de nota foram realizadas avaliações aos 60, 90 e 120 dias após a inoculação da forma patogênica. No primeiro estudo, 56,94% dos frutos apresentaram sintomas de MPC quando inoculados em frutos com 4,5 cm de diâmetro, 50% com 5,5 cm de diâmetro e 27,75% quando inoculados em frutos com diâmetro 7 cm. Em todas as situações

46 33 foram observadas apenas sintomas dos tipos mancha dura e mancha sardenta. No segundo estudo foi observado que os frutos protegidos com a forma endofítica apresentaram menor índice de doença causada por G. citricarpa. Palavras-Chave: Citrus sinensis, Guignardia mangiferae, Phyllosticta citricarpa, Indução de resistência

47 Introdução A mancha preta dos citros é causada por Guignardia citricarpa (Phyllosticta citricarpa) e afeta folhas, ramos e frutos, os quais, quando severamente afetados, ficam depreciados ou impróprios para o mercado de fruta fresca (McONIE, 1964; KOTZÉ, 1981). As perdas provocadas podem ser muito elevadas, principalmente em limões e laranjas doces de maturação tardia. É uma doença quarentenária A1 para os países da União Européia e Estados Unidos da América, limitando sobremaneira a possibilidade de exportação de frutos produzidos no Brasil, especialmente do Estado de São Paulo. O fungo produz pseudotécios e ascósporos em folhas em decomposição no solo (McONIE, 1964; SUTTON & WATERSTON, 1966). Na fase imperfeita, o fungo produz picnídios em lesões contidas em frutos e em folhas aderidas e, ocasionalmente, no pedúnculo de frutos (SIVANESAN, 1984). São também produzidos em grande quantidade em folhas cítricas caídas sob a copa das plantas (McONIE, 1964), cuja importância epidemiológica é muito limitada, já que, via de regra, somente os conídios dispersos por respingos podem alcançar os tecidos da planta hospedeira, especialmente os frutos. Segundo HERBERT (1989), quatro tipos de sintomas podem ocorrer em frutos: mancha dura, mancha sardenta, mancha virulenta e falsa melanose. Entretanto, além desses sintomas, no Brasil encontra-se descrito o sintoma designado mancha trincada (GOES et al., 2000), o qual aparece em frutos ainda verdes, expressos na forma de manchas superficiais que, na maturidade apresentam trincas nas áreas correspondentes. Os sintomas da doença são favorecidos por vários fatores, dos quais os mais importantes são a radiação solar intensa e as altas temperaturas por ocasião da maturação dos frutos, maior incidência de raios solares nos frutos expostos, estresse hídrico e debilidade das plantas (KOTZÉ, 1981; FEICHTENBERGER, 1996). Um aspecto importante a ser destacado refere-se ao longo período de incubação apresentado pelo fungo. Na presença de umidade, o fungo emite um peg de infecção o qual penetra na cutícula e se expande para dentro do tecido, na forma de uma massa

48 35 de micélio, permanecendo entre a cutícula e a epiderme. Essa se constitui na chamada infecção quiescente que, posteriormente, dá origem às lesões típicas da doença (MOTTA, 2009). Entretanto, os mecanismos envolvidos no processo de formação destas infecções e consequentemente dos diferentes tipos de sintomas produzidos não são completamente conhecidos. De acordo com KLOTZ (1978) e BALDASSARI et al. (2006), o período de suscetibilidade dos frutos corresponde desde a fase de queda das pétalas, até pelo menos 24 semanas (KELLERMAN & KOTZÉ, 1977). Segundo FEICHTENBERGER et al. (1997), as medidas de controle de G. citricarpa envolvem o plantio de mudas sadias, práticas culturais que visem minimizar a formação e liberação de ascósporos e conídios, e pulverizações com fungicidas sistêmicos (benzimidazóis ou estrobilurinas) ou protetores (cúpricos ou ditiocarbamatos) visando a proteção dos frutos durante o principal período de sua suscetibilidade, de pelo menos 4-5 meses após a queda das pétalas. Normalmente os tratamentos que proporcionam as melhores respostas redundam do emprego da mistura de fungicidas sistêmicos e protetores, acrescidos de óleos mineral ou vegetal. Essa combinação possibilita também o manejo da resistência do fungo aos fungicidas sistêmicos. Entretanto, problemas relacionados ao uso de fungicidas redundam do impacto negativo ao ambiente e restrições de ordem pública e econômica, além de, muitas vezes, os resultados obtidos mostrar-se aquém dos níveis desejáveis. De acordo com CARROLL (1988), o termo endófito aplica-se para organismos que causam colonizações assintomáticas no hospedeiro, excluindo desta forma os organismos patogênicos. A constatação dos microrganismos endofíticos no tecido vegetal pode ser evidenciada por análise microscópica ou por isolamento em meios de cultivo. No caso de Guignardia, a separação da forma patogênica da endofítica é facilmente realizada em meio de cultura aveia-dextrose-ágar (ADA), já que a forma patogênica produz colônias cujas bordas apresentam halo amarelo (BALDASSARI et al.,2008). Inicialmente, pensava-se que em citros G. citricarpa poderia ser encontrada na forma de infecção assintomática em plantas sadias, e como patógeno em lesões

49 36 características da doença MPC. Entretanto, BLANCO (1999) comparou geneticamente por meio de marcadores de RAPD, linhagens de populações obtidas de tecidos sintomáticos e de tecidos assintomáticos, de diversas regiões e hospedeiros, constatando a existência de três populações de Guignardia geneticamente diferentes, coexistindo em citros. Segundo a pesquisadora tratavam-se de duas formas endofíticas e uma patogênica, sugerindo que talvez estas três populações pudessem pertencer a espécies distintas. De fato, estudos posteriores realizados por BAAYEN et al. (2002) comprovaram o envolvimento de uma espécie adicional denominada G. mangiferae (anamorfo Phyllosticta capitalensis). Segundo esses investigadores, essas duas formas apresentam padrões distintos quanto à taxa de desenvolvimento vegetativo em meios de cultura, coloração de colônias e morfologia dos conídios. A coexistência de duas espécies de Guignardia, uma patogênica, G. citricarpa, e outra endofítica, G. mangiferae, co-habitando plantas cítricas já havia sido também descritapor KIELY (1948) e WAGER (1952). A forma endofítica, já há muitos anos havia também sido isolada por WAGER (1952) de plantas nativas da província de Cape, África do Sul, sem contudo serem observados sintomas da doença em plantas cítricas.não há, no momento, estudos relativos ao processo co-evolucionário entre as espécies de Guignardia que coabitam as espécies cítricas. Também não existem estudos acerca do balanço biológico entre as diferentes populações. Entretanto, considerando os estudos realizados por McONIE (1964), sabe-se, que pelo menos para as condições da África do Sul, ambas as populações de Guignardia coexistem há muitos anos. Dessa forma, dada a semelhança das condições climáticas e aspectos bio-ecológicos aos quais ambas as espécies se desenvolvem, é de se presumir que tal interação também ocorra nas condições do Brasil, já há muitos anos. Os próprios resultados de pesquisas obtidos por BLANCO (1999) dão sustentação a essa hipótese. A importância relativa da coexistência de formas endofíticas e patogênicas num mesmo hospedeiro é praticamente obscura, não obstante haja relato de que espécies de fungos endofíticos apresentam ação antimicrobiana. Dessa forma, admitindo que o balanço populacional de ambas as espécies seja importante no equilíbrio presença e ausência de sintomas, torna-se razoável admitir que as práticas culturais adotadas e

50 37 que redundem nesse balanço possa favorecer uma dessas populações. Coincidentemente, para o caso das plantas cítricas no Estado de São Paulo, até a década de 80 do século passado, eram poucas as doenças fúngicas cujas intervenções químicas faziam-se necessárias. Entretanto, no final daquela década, com o surgimento da Podridão floral dos citros, causada por Colletotrichum acutatum, tornou-se necessária a realização de muitas pulverizações com fungicidas, na maioria das vezes de ação sistêmica, o qual provavelmente pode ter alterado o balanço biológico previamente existente, com reflexos na incidência e severidade das doenças fúngicas. E, também, de forma coincidente, no mesmo período e principalmente em algumas áreas onde as pulverizações visando o controle de C. acutatum tornaram-se freqüentes, houve o surgimento de frutos com sintomas de G. citricarpa. Nesse contexto, suspeitase que as freqüentes pulverizações com fungicidas nos pomares cítricos ocasionaram um desequilíbrio entre as populações de fungos endofíticos e patogênicos de Guignardia. Nesse contexto, admite-se que sob a predominância de populações da forma endofítica de Guignardia, no caso, G. mangiferae, há menor colonização ou desenvolvimento da forma patogênica, G. citricarpa. Porém, com a alteração do equilíbrio, a forma patogênica pode tornar-se predominante, advindo grande quantidade de doença, fato esse que tem sido observado nas condições da citricultura do Estado de São Paulo. Entretanto, pouco ou nada se sabe sobre esta interação, razão pela qual estudos dessa natureza fazem-se necessários e prementes. Diante do contexto anteriormente mencionado o presente trabalho teve por objetivo: (i) determinar o período de suscetibilidade de frutos de laranjeira Pêra-Rio a G. citricarpa inoculada através de suspensão conidial e, (ii) avaliar a influência da forma endofítica, G. mangiferae, na expressão de sintomas da forma patogênica G. citricarpa.

51 Material e Métodos O presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Fitopatologia e casa de vegetação pertencente ao Departamento de Fitossanidade, da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP, Campus de Jaboticabal. Todos os isolados utilizados neste estudo são provenientes da coleção obtida por BALDASSARI (2005), pertencente à Micoteca dessa Instituição Período de suscetibilidade de frutos de laranjeira Pêra-Rio a conídios de Guignardia citricarpa Plantas de laranjeira Pêra-Rio, com aproximadamente dois anos de idade, mantidos em casa de vegetação foram induzidas à floração para obtenção de frutos da mesma florada. Para tal, as plantas foram tratadas com uma mistura de: 100g de Sulfato de Zinco + 100g de Nitrato de Potássio + 1,5g ácido Bórico + 50g de Cal para 20L de água, de acordo com metodologia proposta por BALDASSARI (comunicação pessoal). Para aplicação, foi empregado pulverizador pressurizado a CO 2, 50 lb/pol 2. Sete dias após a pulverização das plantas, estas foram submetidas à poda e submetidas a estresse hídrico, com suspensão do seu molhamento por aproximadamente 20 dias. Por ocasião do fluxo de brotação foi realizada nova pulverização, empregando, porém, metade da dose inicial. Cada planta continha, ao final, no mínimo seis frutos, os quais foram previamente selecionados para as inoculações, em diferentes estádios de desenvolvimento. Ao final, foram selecionados três grupos de frutos por tamanho: (i) 4,5 cm; (ii) 5,5 cm e (iii) 7 cm. Para inoculação empregou-se suspensão de conídio de Phyllosticta citricarpa na concentração de 10 4 conídios.ml -1, adicionando à suspensão dextrose e suco de laranja. Para cada estádio de desenvolvimento de frutos avaliado foram empregados quatro a cinco plantas. Para cada tratamento foram empregados 24 frutos.

52 39 As avaliações foram realizadas semanalmente, sendo observada a presença ou ausência de sintomas e, quando presentes, o tipo de sintoma apresentado. Na última avaliação, e quando da presença de sintomas, foi realizado reisolamento para confirmação da presença do patógeno. O experimento foi realizado em duas épocas, 03/2007 e 08/ Influência de Guignardia mangiferae na expressão de Guignardia citricarpa Como endofítico (G. mangiferae) foi utilizado isolado obtido de plantas cítricas da região de Conchal/SP, enquanto que o isolado patogênico (G. citricarpa) proveio na forma de uma cultura monospórica oriunda de ascósporos obtidos de folhas de laranjeira Pêra-Rio, coletada igualmente naquele município. No estudo foram utilizadas plantas de laranjeiras Pêra-Rio, com dois anos de idade, enxertadas em limoeiro Cravo, e mantidas em vasos com capacidade para 20 litros de solo, contendo frutos de aproximadamente 2,5-3,0 cm de diâmetro. A metodologia de inoculação, tanto para a forma endofítica como para a patogênica, foi semelhante à citada no item As concentrações de G. mangiferae utilizadas foram (conídios.ml -1 ): (T1) 10 4, (T2) 10 6 e (T3) A concentração da suspensão conidial para a G. citricarpa foi de 10 6 conídios.ml -1. A forma patogênica foi inoculada em dois intervalos: (i) 48 horas antes da inoculação da forma endofítica e, (ii) 48 horas após a inoculação da forma endofítica. Cada tratamento foi constituído de quatro repetições, sendo cada planta considerada uma unidade amostral. Para cada tratamento foram inoculados 20 frutos. Os frutos foram avaliados em relação à incidência, e também quanto à severidade, a qual foi determinada mediante escala de notas adaptada de FAGAN & GOES (2000), variando de 0 (ausência de sintomas) a 6 (sintomas severos).

53 40 A severidade dos sintomas da doença foi expressa em índice de doença (ID), conforme WHEELER (1969) sendo: I D m 1 = N i = 0 i. n i onde: ID = índice de doença; N = número total de frutos avaliados; i = nota da doença; ni = número de frutos com nota i; m = nota máxima. As avaliações foram realizadas aos 60, 90 e 120 dias após a inoculação da forma patogênica. Para a análise de variância foi utilizado o programa ESTAT (v.2), enquanto as médias foram comparadas pelo teste de Tukey. 3.3 Resultados e Discussão Período de suscetibilidade de frutos de laranjeira Pêra-Rio a Guignardia citricarpa inoculados com conídios Resultados positivos de patogenicidade foram obtidos quando da inoculação de frutos de laranja Pêra-Rio nas fases de 4,5, 5,5 e 7,0 cm de diâmetro, ou seja, em fase que antecederam e/ou concomitantemente ao processo de maturação. Nestas fases, a incidência da doença variou de 27,75% quando inoculado em frutos com 7,0 cm, a 56,94% quando inoculado em frutos com diâmetro de 4,5 (Tabela 1), denotandose, assim, uma relação inversamente proporcional e negativa quanto a tamanho e incidência de frutos sintomáticos.

54 41 Tabela 1. Número de frutos de laranjeira Pêra-Rio apresentando sintomas de mancha preta do citros após sua inoculação com suspensão contendo 10 6 conídios.ml -1 de Phyllosticta citricarpa, em diferentes estádios de desenvolvimento Época de avaliação Diâmetro do fruto 4,5 cm 5,5 cm 7,0 cm 40 dias após inoculação dias após inoculação dias após inoculação Média (%) 13,6 (56,94%) 12 (50,0%) 6,6 (27,75%) Em nenhuma situação os frutos apresentaram mais de três lesões por fruto, havendo predomínio de sintomas do tipo mancha dura e mancha sardenta (Figuras 1 e 2). Em função do estádio avançado de maturação dos frutos, a partir de 50 dias após a inoculação houve freqüente queda dos mesmos, impossibilitando assim a análise estatística dos dados. De acordo com a literatura, os tecidos dos frutos cítricos são mais suscetíveis quando ainda muito tenros (McONIE, 1964), tornando mais resistentes com o transcorrer do seu desenvolvimento, embora a suscetibilidade se estenda até por cerca de 17 a 21 semanas após a queda das pétalas (KOTZÉ, 1988). Anteriormente, KLOTZ (1978) havia ressaltado que os frutos cítricos mostravam-se suscetíveis por pelo menos 24 semanas após a queda das pétalas. Este fato foi posteriormente comprovado por BALDASSARI et al. (2006), o qual verificou mediante ensacamento e exposição de frutos de laranjeiras Natal e Valência a ocorrência de infecções naturais de G. citricarpa por pelo menos seis meses após a queda das pétalas, convergindo com os resultados alcançados por KLOTZ (1978). Além disso, os resultados ora obtidos demosntraram que ao lado do estádio de desenvolvimento dos frutos, a elevada pressão de inóculo é um componente igualmente importante na geração de sintomas.

55 42 Figura 1. Sintomas do tipo mancha dura em fruto de laranjeira Pêra-Rio inoculado com suspensão contendo 10 4 conídios.ml -1 de Guignardia citricarpa observados aos 50 dias após a inoculação. Figura 2. Sintomas do tipo mancha sardenta em fruto de laranjeira Pêra-Rio inoculado com suspensão contendo 10 4 conídios.ml -1 de Guignardia citricarpa observados aos 50 dias após a inoculação. No presente estudo foi observado que frutos nas fases que antecederam e/ou concomitantemente ao processo de maturação mostraram-se suscetíveis, demonstrando que os mesmos, já em fases adiantadas ainda se mostram suscetíveis ao patógeno. Tal resultado, em termos práticos se reveste da maior importância já que os programas de controle do patógeno contemplam a proteção dos frutos por até cerca de seis meses após a queda das pétalas.

56 43 Em termos gerais, o controle de G. citricarpa baseia-se no uso de duas aplicações de fungicidas cúpricos, em intervalo de quatro semanas, sendo a primeira na fase de ¾ de pétalas caídas. Posteriormente, e dependendo do nível de inóculo, grupo de maturação e condições ambientais prevalecentes são realizadas duas a três pulverizações adicionais com fungicidas sistêmicos e protetores, com o controle se estendendo por cinco a seis meses. Dessa forma, diante do resultado ora verificado, torna-se justificável, no caso da produção de frutos cítricos voltados para o comércio in natura, rever o atual programa de controle de G. citricarpa, de tal forma que o mesmo contemple a proteção necessária. Para o caso de frutos destinados à exportação, a revisão de tal preceito faz-se imprescindível, haja vista o caráter quarentenário da MPC, sendo de tolerância zero para os países da Comunidade Européia e Estados Unidos da América, conforme preceitos estabelecidos (OEPP/EPPO, 2007) Influência de Guignardia mangiferae na expressão de sintomas de Guignardia citricarpa Verificou-se que G. mangiferae contribuiu à redução significativamente a severidade de sintomas em frutos de laranjeira Pêra-Rio previamente infectados por G. citricarpa. Houve diferença estatisticamente significativa (P 0,01) quando comparado com a testemunha (Figura 3). A melhor resposta foi observada quando o isolado endofítico foi inoculado 48 horas antes da inoculação da forma patogênica, independentemente da concentração avaliada. Em relação à época de avaliação não houve diferença estatística nas avaliações realizadas aose 45 e 90 dias após a inoculação da forma patogênica. A maior expressão de sintomas foi verificada aos 120 dias após a inoculação dos frutos. Nos frutos inoculados apenas com a forma endofítica não foi observada a presença de sintomas. Quando presentes, os sintomas foram sempre do tipo mancha dura, sendo a severidadedos sintomas da doença baixa em todos os tratamentos, cujas notas foram

57 44 inferiores a dois, com exceção da testemunha. Tais níveis de sevridade mantiveram-se inalterados, mesmo quando da maturação dos frutos. Quando da inoculação de frutos com o isolado endofítico, os níveis de severidade de sintomas decorrentes de G. citricarpa, em termos de índice de doença (ID) variaram de 0,25 e 0,75, enquanto que nos inoculados apenas com Guignardia citricarpa o valor de ID foi 1,16. Denota-se assim que, em nenhum dos casos as médias observadas atingiram valores de ID acima de 3,0, considerados críticos quanto ao potencial de queda de frutos, como demonstrado por FAGAN & GOES (2000). Tabela 2. Efeito da inoculação de isolado endofítico,guignardia mangifera nos níveis de severidade de sintomas de mancha preta do citros causados por Guignardia citricarpa, em frutos de laranjeira Pêra-Rio`. Concentração da suspensão conidial de G. Índice de Doença (ID) Intervalo de inoculação de Guignardia mangiferae mangiferae 48 horas antes da inoculação de Guignardia citricarpa 48 horas após a inoculação de Guignardia citricarpa 10 4 conídios.ml -1 0,38 bb 0,78 ba 10 6 conídios.ml -1 0,25 bb 0,51 bca 10 8 conídios.ml -1 0,39 bb 0,34 ca Testemunha 1,16 aa 1,16 aa *Médias seguidas pela mesma letra minúscula nas colunas ou maiúscula nas linhas não diferem estatisticamente entre si (Tukey, P 0,05). Embora não esteja totalmente esclarecido, em algumas situações os endofíticos quando presentes levam a um melhor desempenho das plantas (CLAY, 1987), como aumento de área foliar e maior número de ramificações (LATCH & CHRISTENSEN, 1985), maior tolerância ao ataque de insetos (CARROLL & CARROLL, 1978; CLAY, 1987; CLEMENTE et al., 1990; CARROLL, 1988; AZEVEDO et al., 2000), resistência a doenças e parasitas (WHITE Jr. & COLE, 1985; WHITE Jr. & COLE, 1986; CLARK et al., 1989; CALHOUN et al., 1992), resistência a nematóides (WILSON et al., 1991) e à herbivoria, pela produção de toxinas (WHITE Jr. & COLE, 1985). A entrada da maioria dos fungos, patogênicos ou não, na planta hospedeira depende da diferenciação do micélio em estruturas especializadas, denominadas de apressórios (KUBO et al.,1996). Uma vez dentro do hospedeiro, ocorre a colonização

58 45 da planta. Baseado nesta informação pressupõe-se que o tecido vegetal já colonizado pela forma endofítica dificulta ou impossibilita a colonização da forma patogênica, impedindo que a mesma cause infecções severas, e, dessa forma, minimizando a expressão dos sintomas. Segundo PETRINI (1986), todas as espécies vegetais possuem fungos endofíticos, levando-o a sugerir que todas as plantas podem, potencialmente, ser hospedeiras destes microrganismos. De acordo com os resultados obtidos, pressupõe-se que isolados de fungos endofíticos apresentam potencial de controle de G. citricarpa, contribuindo à melhoria do controle da MPC. PHONGPAICHIT et al. (2006) isolaram e identificaram através de seqüências ITS, quatro linhagens endofíticas de G. mangiferae de plantas de Garcinia encontradas no Sul da Tailândia. Os autores demonstraram ainda a atividade antimicrobiana destas linhagens contra o patógeno Streptomyces aureus. 3.4 Conclusões Frutos de laranjeira Pêra-Rio são suscetíveis a Guignardia citricarpa, mesmo quando apresentam diâmetro de 7,0 cm; Isolados de Guignardia mangiferae apresentam potencial para minimização dos sintomas causados por Guignardia citricarpa em frutos de laranjeira Pêra-Rio. 3.5 Bibliografia AZEVEDO, A. C. S.; FURLANETO, M. C.; SOSA-GÓMEZ, D. R.; FUNGARO, M. H. P. Molecular Characterization of Paecilomyces fumoroseus (Deuteromycotina: Hyphomycetes) Isolates. Scientia Agrícola, Piracicaba, v.57, n.4, p , 2000.

59 46 BAAYEN, R. P.; BONANTS, P. J. M.; VERKLEY, G.; CARROLL, G. C.; VAN DERAA, M.; WEERDT, M.; BROUWERSHAVEN, G. C.; SCHUTTE, G. C.; MACCHERONI Jr., W.; GLIENKE-BLANCO, C; AZEVEDO, J. L. Nonpathogenic Strains of the Citrus Black Spot Fungus, Guignardia citricarpa, Identified as a Cosmopolitan Endophyte of Woody Plants, Guignardia mangiferae, (Phyllosticta capitalensis). Phytopathology, St. Paul, v.92, n.5, p , BALDASSARI, R.B.; REIS, R.F.; GOES, A. Susceptibility of fruits of the Valência and Natal sweet orange varieties to Guignardia citricarpa and the influence of the coexistence of healthy and symptomatic fruits. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v.31, p BALDASSARI, R.B.; BRANDIMARTE, I.; ANDRADE, A.G.; SOUZA, D.C.G.; MORETTO, C.; GOES, A. Indução da expressão precoce de sintomas de Guignardia citricarpa em frutos de laranjeira Pêra-Rio. Revista Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal, v. 29, p BLANCO, C. Guignardia citricarpa Kiely: Análise genética, cariotípica e interação com o hospedeiro. Piracicaba, p. Tese (Doutorado área de Concentração: Genética e Melhoramento de Plantas) Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo. CALHOUN, L. A.; FINDLAY, J. A.; MILLER, J. D.; WHITNEY, N. J. Metabolites toxic to spruce budworm from balsam for needle endophytes. Mycological Research, Cambridge, v.96, n.4, p , CARROLL, G. C. Fungal endophytes in stems and leaves: from latent pathogen to mutualistic symbiont. Ecology, Brooklym, v.69, p. 2-9, 1988.

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64 51 CAPÍTULO 4 AVALIAÇÃO DE FUNGICIDAS NO CONTROLE DE Guignardia citricarpa EM FRUTOS CÍTRICOS RESUMO - Os níveis atuais de incidência e severidade demonstrados pela Mancha preta dos citros (MPC) nos pomares cítricos do Estado de São Paulo demonstram a gravidade e as condições ideais de adaptação climática encontradas pelo fungo causal, Guignardia citricarpa. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a eficiência de controle de alguns fungicidas pertencentes aos principais grupos químicos e determinar a extensão de sua eficiência quando frutos foram expostos à liberação/dispersão de conídios de G. citricarpa por tempo variado. Utilizouse plantas de laranjeira Pêra-Rio com aproximadamente três anos de idade, plantadas em vasos, e mantidas em casa de vegetação, as quais receberam os seguinte tratamentos (g ou ml de i.a.100l -1 ): T1) carbendazim (25); T2) benomyl (25); T3) pyraclostrobin (3,75); T4) hidróxido de cobre (94,2 de cobre metálico); T5) dimetilditiocarbamato de ferro (200); T6) testemunha. Todos os tratamentos com fungicidas foram acrescidos de óleo mineral Assist a 0,25% (v/v). Para a dispersão de conídios, 24h após o tratamento com fungicidas, frutos apresentando sintomas de mancha preta do citros foram depositados sobre tela de arame galvanizado, e esta adequadamente mantida em plano acima de plantas contendo frutos em estádio suscetível, com aproximadamente 2,5 cm de diâmetro. Empregou-se um sistema de nebulização sincronizada, com alternância de molhamento/suspensão da nebulização. Sob estas condições, foi propiciada uma condição de tal forma que conídios de G. citricarpa fossem produzidos e dispersos a partir dos frutos sintomáticos, por duas, três e quatro semanas contínuas. Foram usadas seis plantas por tratamento, totalizando pelo menos 24 frutos. Após cada período de exposição ao inóculo, as plantas foram transferidas para casa de vegetação, cuja avaliação deu-se a partir de 30 dias após o tratamento. Para efeito de análises foram considerados os dados correspondentes a três avaliações, realizadas em intervalos de 30 dias. Os melhores resultados de controle

65 52 foram obtidos mediante ao emprego dos fungicidas carbendazim, benomyl e pyraclostrobin. Palavras-Chave: Citrus, estrobilurina, mancha preta dos citros.

66 Introdução O controle químico da mancha preta dos frutos cítricos (MPC) iniciou-se na década de 50, na Austrália e na África do Sul. Os primeiros produtos químicos com eficiência foram os cúpricos, especialmente o oxicloreto de cobre e a calda bordalesa (CALAVAN, 1960), aplicados em torno de 3 a 4 pulverizações, sendo a primeira realizada no florescimento ou imediatamente após a queda de pétalas e, as demais, em intervalos de até seis semanas. Entretanto, tais tratamentos quando realizados em pomares velhos o nível de controle mostrava-se aquém dos níveis desejáveis, além de comprometer a qualidade da casca da fruta decorrente de danos na casca dos mesmos, tornando-os depreciados (KOTZÉ, 1964; KOTZÉ, 1981). Na década subseqüente, com a introdução dos fungicidas ditiocarbamatos, houve uma significativa melhoria no controle da MPC e na qualidade da fruta, passando a ser utilizado de forma rotineira nos pomares, sempre associado ao oxicloreto de cobre, utilizado agora em menor escala. A partir dos anos 70, com advento dos fungicidas sistêmicos, verificou-se o maior avanço no controle da doença. No caso da África do Sul, as 4 ou 5 aplicações com fungicidas ditiocarbamatos, antes necessárias para o controle da doença, foram eficientemente substituídas por apenas uma aplicação de benzimidazol associado com óleo mineral (KOTZÉ, 1981). Entretanto, embora o sucesso do emprego dos benzimidazóis tenha sido elevado, em meados dos anos 80 foi constatada na África do Sul linhagens de G. citricarpa resistente aos benzimidazóis, o que implicou em grandes mudanças nas estratégias de controle (HERBERT,1989). Dentre as mudanças ocorridas incluíram-se o retorno ao uso dos fungicidas protetores, principalmente os ditiocarbamatos e cúpricos (GOES, 2005). A partir de 1990, novas moléculas como as estrobilurinas surgiram no mercado, constituindo em um novo alento no controle de várias doenças fúngicas, notadamente aqueles patógenos de difícil controle ou que se mostravam insensíveis aos fungicidas convencionalmente utilizados.

67 54 Os primeiros testes com fungicidas do grupo das estrobilurinas visando o controle de G. citricarpa foram realizados na África do Sul (TOLLIG et al., 1996), com resultados altamente promissores. Posteriormente, vários ensaios foram igualmente realizados na Argentina (FOGLIATA et al., 2004) e Brasil (GOES & WIT, 1999; GOES, 2002; FELlPPE et al., 2004), igualmente com bons resultados de controle. Não obstante a importância e os vários anos de ocorrência da doença em vários países, poucas são as estratégias a serem adotadas. Dessa forma, dada à suscetibilidade das principais espécies cítricas de importância econômica, o controle do patógeno baseia-se quase que essencialmente no uso de fungicidas. Normalmente são usados fungicidas protetores, especialmente os cúpricos, nas fases de pósflorescimento, seguido de pulverizações, com a mistura em tanque de fungicidas protetores e sistêmicos acrescidos de óleos mineral ou vegetal, miscíveis em água (GOES et al., 1990; GOES,1998; GOES & WIT, 1999; FEICHTENBERGER et al., 2000; GOES, 2002). O número de pulverizações, assim como as condições operacionais de funcionamento dos turbopulverizadores é dependente de uma série de fatores, incluindo nível de inóculo na área, variedades, idade e tamanho das plantas e condições edáficas e ambientais. Em termos gerais, para pomares velhos e com elevados níveis de incidência e severidade da doença, combinado com variedades tardias, são realizadas pelo menos duas aplicações com fungicidas sistêmicos quando os frutos são destinados para a indústria. Para o caso da produção de frutos destinados ao comércio in natura é utilizado um número maior de pulverizações. Mesmo para o caso da produção de frutos para o processamento industrial excepcionalmente pode ser necessário um número maior de pulverizações. Tem se verificado ao longo dos anos que, mesmo sob boas condições operacionais, assim como com o emprego de adequado intervalo de pulverizações, as respostas de controle têm se mostrado aquém dos níveis desejáveis. Várias hipóteses têm sido levantadas para a questão, incluindo escapes nas pulverizações, volume de calda inadequado, baixo volume de ar aplicado na pulverização, adaptação do fungo ao ingrediente ativo empregado, entre outros. Embora tais fatores possam, de fato, refletir no nível de controle, a duração da disponibilidade de inóculo não foi ainda considerada,

68 55 razão pela qual julgou-se oportuna a realização do presente trabalho. Concomitantemente, a determinação do tempo de proteção e/ou do controle proporcionado pelos fungicidas faz-se imprescindível sendo, pois, contemplado no presente estudo. 4.2 Material e Métodos Os estudos foram conduzidos no Laboratório de Fitopatologia e casa de vegetação pertencentes ao Departamento de Fitossanidade, da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP, Campus de Jaboticabal. Foram utilizadas plantas de laranjeiras Pêra-Rio (Citrus sinensis), com três anos de idade, enxertadas em limoeiro Cravo (C. limonia), contendo frutos em estádios suscetíveis, com 2,5 a 3,0 cm de diâmetro. Os fungicidas avaliados foram Derosal (Bayer Protection of Plants, Levekusen, German; carbendazin), Benlate (Du Pont Co., Delaware, England, metil-1-(butilcarbamoil)-2-benzimidazol 1-carbamato (benomyl), Comet (Basf The Chemical Co., German, pyraclostrobin), Ferbam Granuflo (Taminco Inc., Smyrna, GA, dimetil ditiocarbamato de ferro), Kocide WDG (Du Pont Co., Delaware, England, hidróxido de cobre). Neste estudo, implantado em 25/11/2006, foram empregados os seguintes tratamentos e dosagens (g ou ml de i.a.100l -1 ): T1) carbendazim (25); T2) benomyl (25); T3) pyraclostrobin (3,75); T4) hidróxido de cobre (94,2 de cobre metálico); T5) dimetil-ditiocarbamato de ferro (200); T6) testemunha. Todos os tratamentos foram acrescidos de óleo mineral Assist a 0,25% (v/v). Os fungicidas foram aplicados por meio de um pulverizador costal 24horas da inoculação por conídios. Para plantas da testemunha foi empregada apenas pulverização com água. A metodologia de dispersão dos conídios foi realizada mediante a deposição sobre telas de arame galvanizado frutos cítricos apresentado sintomas do tipo mancha dura, com níveis de severidade entre 5 a 6, obtidos da região de Rincão SP. A citada tela foi montada em estrutura de tal forma que o inóculo disperso, se depositasse sobre

69 56 frutos, sadios e em estádio suscetível, existentes em plantas mantidas num plano inferior (Figura 1). Foram utilizados entre frutos por planta. Para favorecer a dispersão dos conídios empregou-se um sistema de nebulização sincronizada, com alternância molhamento/suspensão da nebulização, por intervalos de 5 min e 10 min, respectivamente. Frutos sadios foram expostos ao inóculo por duas, três e quatro semanas ininterruptivamente. Com essa metodologia simulou-se uma condição de produção/dispersão de conídios que ocorre sob condições normais nos pomares cítricos. Figura 1. Vista parcial de tela de arame galvanizado contendo frutos com sintomas da mancha preta dos citros (Guignardia citricarpa), para dispersão de conídios sobre frutos de laranjeira Pêra-Rio localizadas em plano inferior, por meio de nebulização num sistema de alternância de nebulização, durante duas, três e quatro semanas. Após cada período de exposição ao inóculo, as plantas foram transferidas para casa de vegetação, cuja avaliação deu-se a partir de 30 dias após o tratamento. Para efeito de análises foram considerados os dados correspondentes a três avaliações, realizadas em intervalos de 30 dias. Na avaliação dos frutos tomou-se como referência os valores de incidência, severidade e tipos de sintomas produzidos. Para determinação da incidência da doença, considerou-se o número de frutos sintomáticos, enquanto que para severidade utilizou-se escala diagramática proposta por SPÓSITO et al., (2004), levando-se em conta sintomas dos tipos mancha dura e falsa melanose.