Anatomia e distribuição topoquímica de componentes em materiais lignocelulósicos

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1 Anatomia e distribuição topoquímica de componentes em materiais lignocelulósicos André Ferraz Departamento de Biotecnologia Escola de Engenharia de Lorena Universidade de São Paulo Lorena, SP

2 Outline - Why to study anatomy and topochemical distribution of components in lignocellulosic materials? - Wood and non-wood anatomy - Cell wall structure: SEM and cell wall models - Polysaccharide and lignin localization in wood cell walls - Lignified cells do not permit enzyme infiltration - Lignocellulosic materials with reduced lignin content are easier to be hydrolyzed

3 Why to study anatomy of lignocelullosic materials and component topochemistry? 1. Enzymatic hydrolysis of polysaccharides is supposed to be a key step in cellulosic ethanol production Is cellulose free an clean as shown in this figure? 2. Understanding cell wall structure is useful for any type of application of lignocellulosic materials

4 Softwood Lignified cells are arranged in a complex matrix! It is necessary to study the anatomy of lignocellulosic materials

5 O que deveríamos poder responder... Madeira e gramíneas são similares em termos anatômicos? Onde está a cellulose e a hemicelulose que se pretende utilizar (ou digerir com enzimas)? A lignina ocorre em todos os tipos de células? A concentração varia de acordo com a região celular?

6 Wood and non-wood anatomy Ref. básica: Geoffrey Daniel 2009 Wood and Fibre Morphology.. In: Pulp and Paper Chemistry and Technology Vol 1: Wood Chemistry and Wood Biotechnology. Edited by Monica Ek, Göran Gellerstedt, Gunnar Henriksson

7 Cell formation and cell wall components deposition during wood growth C >> fusiform cell in the cambium B >> bark cell W >> xylem cell somente parede Growing steps: primária (E) E: elongation S: thickening of the cell wall L: lignification of the cell wall deposição de parede secundária (S)

8 Cell distribution in the xylem of conifer wood (X) corte transversal, (T) corte tangencial e (R) corte radial. (E) representa células juvenis - crescimento rápido e (L) células tardias - crescimento lento. Na figura 3b, as setas indicam as células que compõem o raio

9 Tabela 1. Tipos de células em madeiras de coníferas Longitudinais A. Função de suporte ou condução ou ainda ambos 1. Traqueídeos longitudinais 2. Traqueídeos fibrilares B. Função de secreção ou estocagem 1. Parênquima longitudinal 2. Células epiteliais Transversais A. Função de suporte ou condução ou ainda ambos 1. Traqueídeos do raio B. Função de secreção ou estocagem 1. Parênquima do raio 2. Células epiteliais As células epiteliais secretam resinas nos canais de resinas que ocorrem em algumas coníferas, principalmente as espécies de Pinus

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11 Cell distribution in a the xylem of angiosperm wood (X) corte transversal, (R) corte radial e (T) corte tangencial. (E) indica os elementos de vaso que conectados formam um "tubo" denominado vaso com a função essencial de conduzir líquidos

12 Tabela 2. Tipos de células em madeiras de folhosas Longitudinais A. Função de suporte ou condução ou ainda ambos 1. Elementos de vasos 2. Fibras 3. Traqueídeos B. Função de estocagem 1. Parênquima longitudinal Transversais A. Função de suporte ou condução ou ainda ambos 1. Não há B. Função de estocagem 1. Parênquima do raio

13 Dimensões proporcionais em células de angiospermas

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15 Conexão entre os elementos de vaso

16 Pontuações na parede celular

17 Anatomia em gramíneas

18 Grass non-wood

19 Cana Arroz

20 Abundance of different cell types

21 Cell wall structure: SEM and cell wall models

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23 Closer view of cell wall structure: SEM and cell wall models

24 Cellulose distribution

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26 >>> Mapping lignin in wood cell walls by UVmicrospectrophotometry can help to direct our studies

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29 Mapping lignin in wood cell walls with basis on the Zeiss USMP-80 microscope

30 Lignin localization in wood cell walls Koch G., Kleist G. (2001). Application of scanning UV microspectrophotometry to localise lignins and phenolic extractives in plant cell walls. Holzforschung 55:

31 Mapping lignin in wood cell walls by UVmicrospectrophotometry Untreated P. taeda Partially delignified P. taeda Delignified P. taeda Mendonça et al., Wood Sci Technol. 2004

32 Fibers from rind observed in the J&M microscope 1 µm-thick cut fixed in epoxi resin Example of a selected point (1 µm 2 ) to record the UV spectrum 400 x

33 Vessel from rind observed in J&M microscope 400 x

34 Parenchyma from rind observed in a J&M microscope 400 x

35 Absrobância Absorbância Spectral reproducibility obtained from several fibers 0,6 0,4 0,2 rd fiber 1 rd fiber 2 rd fiber 3 rd fiber 4 rd fiber 5 media rd fiber 0-0, Comprimento de onda (nm) 0,6 0,5 0,4 rd fiber 1 rd fiber 2 media rd fiber 0,3 0,2 0,1 0-0,1-0, Comprimento de onda (nm)

36 Absorbância Absorbância Average spectrum from different cells in sugar cane Células da região de "rind" Células da região do "pith" 0,6 media rd vessel 0,6 media pith vessel media rd fiber media pith fiber 0,4 media rd paren 0,4 media pith paren 0,2 0, , Comprimento de onda (nm) -0, Comprimento de onda (nm) 280 nm > aromatic ring substituted with oxygenated groups 315 nm > aromatic ring conjugated with alfa-carbonil or alfa-beta unsaturation >>> in grasses, correspond to ferulic and coumaric acids

37 Spectrum shift as a consequence of ferulic and coumaric acid (1:1 mixture) addition to a lignin solution He and Terashima, Holzforschung, 1991

38 Total ferulic and coumaric acids in sugar cane Type % (w/w) Ester 2.5 Ether and Ester 5.2

39 Untreated sugar cane Rind fibers 280 nm Pith fibers Similar lignin contents

40 0 0,12 0,20 0,26 0,33 0,39 0,46 0,52 0,59 0,65 0,72 0,78 0,85 0,91 0,97 Frequência 3-D and Histograms Example: Fibers from rind 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 Valores de absorbância

41 0 0,12 0,20 0,26 0,33 0,39 0,46 0,52 0,59 0,65 0,72 0,78 0,85 0,91 0,97 Frequência Data processing and average absorbance based on weighed absorbance values Amostra RD04, fibra de rind abs frequencia freq normalizada freq xabs , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,91 5 0, , ,97 5 0, , soma , equivale a absorbância média 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 Weighed average Absorbance = 0,40 0 Valores de absorbância Average Abs = Sum(Abs i x freq i )/Sum freq i

42 Rind fibers Abs m =0, nm Pith fibers Abs m =0,39 Similar lignin contents

43 Absorbância Absorbância Average spectrum from different cells in sugar cane Células da região de "rind" Células da região do "pith" 0,6 media rd vessel 0,6 media pith vessel media rd fiber media pith fiber 0,4 media rd paren 0,4 media pith paren 0,2 0, , Comprimento de onda (nm) -0, Comprimento de onda (nm) 280 nm > aromatic ring substituted with oxygenated groups 315 nm > aromatic ring conjugated with alfa-carbonil or alfa-beta unsaturation >>> in grasses corresponds to ferulic and coumaric acids

44 Rind fibers 315 nm: indicative of ferulic and coumaric acids Pith fibers Similar ferulic acid contents

45 Rind Vessel (large wall) 280 nm Pith Vessel (large wall) Lower lignin content Average abs does not make sense / different cells in the image

46 Absorbância Absorbância Average spectrum from different cells in sugar cane Células da região de "rind" Células da região do "pith" 0,6 media rd vessel 0,6 media pith vessel media rd fiber media pith fiber 0,4 media rd paren 0,4 media pith paren 0,2 0, , Comprimento de onda (nm) -0, Comprimento de onda (nm) 280 nm > aromatic ring substituted with oxygenated groups 315 nm > aromatic ring conjugated with alfa-carbonil or alfa-beta unsaturation >>> in grasses corresponds to ferulic and coumaric acids

47 Rind Vessel (large wall) 315 nm Pith Vessel (large wall) Lower ferulic acid content

48 Rind Parenchyma Abs m =0, nm Pith Parenchyma Abs m =0,18 Significantly lower lignin content

49 Absorbância Absorbância Average spectrum from different cells in sugar cane Células da região de "rind" Células da região do "pith" 0,6 media rd vessel 0,6 media pith vessel media rd fiber media pith fiber 0,4 media rd paren 0,4 media pith paren 0,2 0, , Comprimento de onda (nm) -0, Comprimento de onda (nm) 280 nm > aromatic ring substituted with oxygenated groups 315 nm > aromatic ring conjugated with alfa-carbonil or alfa-beta unsaturation >>> in grasses corresponds to ferulic and coumaric acids

50 Rind Parenchyma 315 nm Pith Parenchyma lower Ferulic acid content

51 Hemicellulose localization in cell walls Immunohistochemistry Primary antibody: monoclonal antibody to (1-3,1-4)-ß-glucan (MOUSE IgG) Secondary antibody: Alexa Fluor 514 Fluorophore

52 Xylan localization Example o immunofluorescence localization of substitute xylans in fiber (F) and vessel (V) cell walls of mature xylen from apen wood. LM11 denotes the antibody used to bind to substituted xylan structures. The bar size corresponds to 10 m. Note that the cell corners and middle lamella were poorly labeled whereas secondary walls were strongly labeled with the LM 11 antibody indicating the regions where substitute xylan predominates in the mature xylem (Reproduced from Kim et al. 2012)

53 Hemiceluloses Xiloglucanas Típicas em paredes primárias (1 3),(1 4)-β-D-GLUCANAS Típicas em paredes primárias Glucuronoarabinoxilana Típicas em paredes secundárias

54 Medula Distribuição de beta-glucanas Híbrido 58 - Aumento: 50x Interface Córtex 9/9/

55 Distribuição de beta-glucanas Feixe vascular Híbrido 58 medula (aumento 200x)

56 200x 100x Imunofluorescência - Híbrido 58 - Medula Anticorpo primário: LM10 (Xilana) e LM11 (Arabinoxilana) Secundário: Alexa Fluor 568. TX2 Brilho e contraste normalizado - Controles LM10 LM11

57 200x 100x Imunofluorescência - Híbrido 58 - Interface Anticorpo primário: LM10 (Xilana) e LM11 (Arabinoxilana) Secundário: Alexa Fluor 568. TX2 Brilho e contraste normalizado - Controles LM10 LM11

58 200x 100x Imunofluorescência - Híbrido 58 - Córtex Anticorpo primário: LM10 (Xilana) e LM11 (Arabinoxilana) Secundário: Alexa Fluor 568. TX2 Brilho e contraste normalizado - Controles LM10 LM11