POTENCIAL ANTIMICROBIANO DE ÓLEOS RESINAS DE ESPECIARIAS E PLANTAS AMAZÔNICAS FRENTE A PATÓGENOS DE IMPORTÂNCIA ALIMENTAR

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1 POTENCIAL ANTIMICROBIANO DE ÓLEOS RESINAS DE ESPECIARIAS E PLANTAS AMAZÔNICAS FRENTE A PATÓGENOS DE IMPORTÂNCIA ALIMENTAR D.M.D. Mayer 1, M. Nitschke 1 1- Departamento Físico-Química Instituto de Química de São Carlos (IQSC) - USP, Av. Trabalhador São Carlense, 400, Caixa Postal 780, CEP , São Carlos, SP, Brasil, Telefone: +55 (16) e- mail: debora.mayer@usp.br; nitschke@usp.br RESUMO O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antimicrobiana de óleos resinas de alho (Allium sativum), aipo (Apium raveolens), gengibre (Zingiber officinale) e noz moscada (Myristica fragans); e óleos de espécies nativas da Amazônia, maracujá (Passiflora edulis), buriti (Mauritia flexuosa), pracaxi (Pentaclerathra macroloba) e patauá (Oenocarpus bataua) frente aos patógenos alimentares Listeria monocytogenes, Bacillus cereus e Escherichia coli (EHEC). Os resultados mostraram que o óleo resina de aipo e o de noz moscada apresentaram concentração inibitória mínima (CIM) de 3% e 0,75%, respectivamente frente a L. monocytogenes e CIM de 1,5% e 0,031% para B. cereus. O óleo resina de aipo apresentou atividade bacteriostática e a de noz moscada mostrou ação bactericida para L. monocytogenes na concentração de 1,5%. A bactéria E. coli foi resistente a ação de todos os óleos testados. Os óleos resinas de aipo e noz moscada podem ser explorados para o controle destes importantes patógenos alimentares. ABSTRACT The aim of this study was to evaluate antimicrobial activity of the oleoresins from garlic (Allium sativum), celery (Apium graveolens), ginger (Zingiber officinale) and nutmeg (Myristica fragrans); and Amazon native species oils from passion fruit (Passiflora edulis), buriti (Mauritia flexuosa), pracaxi (Pentaclerathra macroloba) and patauá (Oenocarpus bataua) against the food pathogens Listeria monocytogenes, Bacillus cereus and Escherichia coli (EHEC). The results showed that celery and nutmeg oleoresins have activity with the minimum inhibitory concentration (MIC) of 3% and 0.75% for L. monocytogenes and MIC 1.5% and 0.031% for B. cereus respectively. Celery oil presented bacteriostatic activity whereas nutmeg presented minimum bactericidal concentration of 1.5% for L. monocytogenes. E. coli was resistant to the action of all tested oils. Celery and nutmeg oleoresin can be explored to control those important food pathogens. PALAVRAS-CHAVE: Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, aipo, noz moscada. KEYWORDS: Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, celery, nutmeg 1. INTRODUÇÃO Segundo o Centro de Vigilância Epidemiológica (CVE) do Estado de São Paulo, as gastroenterites/doenças diarreicas agudas (DDA) são, no mundo, importantes causas de morbidade. A OMS estima a ocorrência de dois milhões de óbitos por DDA ao ano, em todo o mundo, sendo que o alimento é na atualidade, um importante veiculador de DDA. Mais de 30% da população, em países industrializados, é afetada por doenças transmitidas por alimentos (CVE, 2009). A cada ano, o CDC

2 (Centers for Disease Control and Prevention), estima que aproximadamente 48 milhões de americanos ficam doentes, são hospitalizados e morrem de doenças transmitidas por alimentos (DTA). A diarreia aguda é o sintoma mais comum de doenças transmitidas por alimentos, entretanto outras consequências graves incluem insuficiência renal e hepática, distúrbios neurais, câncer e morte (CDC, 2014). Atualmente, com o surgimento de cepas resistentes aos antibióticos e a relutância do consumo de alimentos quimicamente aditivados têm-se incentivado a busca por agentes antimicrobianos naturais. As substâncias obtidas a partir de plantas são preferidas em relação aos bactericidas sintéticos, pois são usadas na medicina tradicional por um longo tempo, sendo em geral consideradas seguras pelos consumidores (Leonard et al., 2010). Estudos têm sido realizados, principalmente in vitro, sobre a atividade antibacteriana dos óleos essenciais frente aos patógenos de origem alimentar (Oussalah et al., 2007). De acordo com a pesquisa de Jadhav et al. (2013), foi demonstrado que o óleo essencial de Achillea millefolium possui atividade inibitória em células planctônicas e biofilmes de Listeria monocytogenes e Listeria innocua, isoladas de ambiente de processamento de alimentos. O óleo resina (OR) é um produto de origem vegetal viscoso e espesso que consiste de óleo volátil, óleo fixo, cera, resina, e compostos que atuam como fixadores para os voláteis. Apresenta a vantagem de possuir maior vida de prateleira, pois são praticamente isentos de água, diminuindo a degradação oxidativa, a perda de sabor e a contaminação microbiológica (Sowbhagya, 2014). O presente estudo tem como objetivo avaliar a atividade de óleos resinas de especiarias e óleos de plantas amazônicas no controle do crescimento de células planctônicas de patógenos de importância alimentar. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Óleos Foram utilizados os óleos resinas de: alho (Allium sativum L.), aipo (Apium graviolens L.), gengibre (Zingiber officinale Roscoe) e noz moscada (Myristica fragans Hout); e os óleos de espécies nativas da Amazônia: maracujá (Passiflora edulis), buriti (Mauritia flexuosa), pracaxi (Pentaclerathra macroloba) e patauá (Oenocarpus bataua), fornecidos por Beraca Sabará Químicos e Ingredientes S.A. 2.2 Preparo dos Óleos Para a determinação da CIM foi preparada uma mistura de 4% - 6% dos óleos e propilenoglicol na proporção 2:1. Esta mistura foi acrescida de TSYEB (Tryptone Soy Yeast Extract Broth) contendo 0,02% de Tween 80, homogeneizada em vortex, filtrada (0,22 µm) e novamente homogeneizada (Figura 1) para proceder os ensaios antimicrobianos. Figura 1 Fotografia da mistura contendo 4% OR de noz moscada: a) antes de ser filtrada; e b) após ser filtrada

3 2.3 Microrganismos As cepas utilizadas nesta pesquisa foram: Listeria monocytogenes ATCC 19112; Bacillus cereus ATCC 33018; e Escherichia coli (EHEC) ATCC associadas a contaminação alimentar. 2.4 Meios de Cultura: Para os ensaios foram utilizados: Caldo Triptona de Soja com Extrato de Levedura (TSYEB - Tryptone Soy Yeast Extract Broth); e Agar Triptona de Soja com Extrato de Levedura (TSYEA - Tryptone Soy Yeast Extract Agar); ambos da marca Himedia. O ph final dos meios foi ajustado para 7,3 +/- 0, Padronização do Inóculo Bacteriano As culturas foram inoculadas em placas com TSYEA a partir do estoque (-20 C) e incubadas por 24 h a 37 C. Com auxílio de uma alça esterilizada, algumas colônias de culturas foram selecionadas e transferidas para solução salina (NaCl 0,86%) ajustando a população para aproximadamente 10 8 UFC/mL, utilizando como referência o padrão 0,5 da escala de McFarland. 2.6 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a Concentração Bactericida Mínima (CBM) A atividade antimicrobiana dos óleos foi avaliada através da determinação da CIM utilizando metodologia de microdiluição em caldo (CLSI, 2012). Primeiramente, todas as cavidades das placas de microdiluição de poliestireno (96 poços) foram adicionadas de 100 µl de caldo de cultivo. Na sequência, foram adicionados 100 microlitros de amostra contendo o óleo (50% v/v) a um volume igual do caldo e diluídos serialmente no gradiente de concentração de 25% v/v a 0,781% v/v. O inóculo bacteriano padronizado foi diluído para 10 7 UFC/mL, e 20 microlitros deste inóculo foram adicionados a cada poço e incubados durante 24 h a 37º C. Controles positivos de crescimento (inóculo + caldo de cultura) e controles de solvente (inóculo + caldo de cultura + solvente) também foram incluídos na placa. A inibição do crescimento bacteriano nas cavidades contendo o óleo foi avaliada visualmente em comparação com o crescimento em cavidades de controle. O corante brometo de tetrazolio (MTT 1 mg ml -1 ) foi utilizado para melhor evidenciar a viabilidade celular. Os valores de CIM foram definidos como as menores concentrações do óleo que inibiram o crescimento visível das bactérias. Para a determinação da CBM dos óleos, alíquotas de todas as cavidades onde não foi observado crescimento bacteriano foram transferidas para placas TSYEA e incubadas durante 24 h a 37º C. A menor concentração do óleo onde não houve crescimento foi registrada como a CBM. 2.7 Análise Estatística Os valores de CIM e CBM foram expressos como a moda de no mínimo três repetições independentes. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os ensaios mostraram que dentre as amostras testadas, as OR de aipo e noz moscada apresentaram atividade antimicrobiana. L. monocytogenes foi sensível ao OR de aipo com CIM de 3% e a noz moscada com CIM de 0,75%. Para B. cereus o OR de aipo e de noz moscada apresentaram CIM de 1,5% e 0,03125%, respectivamente. Os valores de CIM dos óleos resinas de noz moscada e aipo podem ser observados na Tabela 1.

4 Tabela 1 Valores de Concentração Inibitória Mínima dos OR de noz moscada e aipo frente aos patógenos. Óleos resinas Bactérias L. monocytogenes E. coli B. cereus Noz moscada 0,75% > 3% 0,03125% Aipo 3% > 3% 1,5% Os demais óleos de alho (Allium sativum), gengibre (Zingiber officinale), maracujá (Passiflora edulis), buriti (Mauritia flexuosa), pracaxi (Pentaclerathra macroloba) e patauá (Oenocarpus bataua) não apresentaram concentração inibitória mínima frente aos patógenos, dentro da faixa de concentração testada. A Figura 2 ilustra o ensaio antimicrobiano e a obtenção do valor de CIM para o OR de noz moscada frente ao patógeno B. cereus. Figura 2 Ilustração da determinação de CIM do óleo resina de noz moscada (Myristica fragrans Hout), concentração %, para B. cereus. A noz moscada e o aipo são especiarias ricas em terpenos, hidrocarbonetos alifáticos, cetonas e sesquiterpenos (Hassanen et al., 2015; Gupta et al., 2013). Os produtos do metabolismo secundário das plantas apresentam atividade contra vários microrganismos. Os principais compostos isolados são terpenos e seus derivados oxigenados, e terpenóides, incluindo compostos fenólicos (Probst, 2012). A atividade antimicrobiana de terpenos isolados de diversas plantas e os mecanismos envolvidos são citados por alguns pesquisadores os monoterpenos através da mudança de potencial de membrana, interferem na integridade e funcionamento da membrana celular (Greay e Hammer, 2011). Em linhagens de S. aureus produtoras de endotoxinas, os terpenos podem interferir na expressão de genes codificadores de fatores de virulência e em Salmonella enterica com a expressão de proteínas de membrana e citoplasmáticas (Qiu et al., 2011; Di Pasqua et al, 2010). A concentração bactericida mínima, determinada nesta pesquisa, do OR de noz moscada frente a L. monocytogenes pode ser observada na Figura 3. Figura 3 Determinação da CBM do óleo resina de noz moscada (Myristica fragrans Hout) para L. monocytogenes.

5 Para o OR de noz moscada foi encontrada a CBM de 1,5% frente a L. monocytogenes; enquanto que para B. cereus não houve ação bactericida, mas bacteriostática. O óleo de aipo apresentou atividade bacteriostática frente aos patógenos. A bactéria E. coli foi resistente a ação de todos os óleos testados. 4. CONCLUSÕES Os ensaios antimicrobianos realizados demonstraram que óleos resinas de aipo e noz moscada apresentaram ação antimicrobiana frente aos patógenos Gram positivos. A atividade antimicrobiana demonstrada pela OR de noz-moscada e de aipo frente a B. cereus e L. monocytogenes pode ser explorada para desenvolvimento de novas formulações visando o controle destes importantes patógenos alimentares. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Centers for Disease Control and Prevention. (2014). Estimates of Foodborne Illness in the United States. U.S. Department of Health & Human Services, USA. Disponível em: Centro de Vigilância Epidemiológica. (2009). Surtos de doenças transmitidas por água e alimentos. Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo. Disponível em: ftp://ftp.cve.saude.sp.gov.br/doc_tec/hidrica/doc/surtodta_pergresp.pdf Clinical and Laboratory Standards Institute. (2012). Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard, 9th ed. CLSI publication M07-A9. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA. Di Pasqua, R., Mamone, G., Ferranti, P., Ercolini, D., Mauriello, G. (2010). Changes in the proteome of Salmonella enterica serovar Thompson as stress adaptation to sublethal concentrations of thymol. Proteomics, 10(5), Greay, SJ e Hammer, KA. (2011). Recent developments in the bioactivity of mono- and diterpenes: anticancer and antimicrobial activity. Phytochemistry Reviews, 14, 1-6. Guptaa, A. D., Bansalb, V. K., Babuc, V., Maithila, N. (2013). Chemistry, antioxidant and antimicrobial potential of nutmeg (Myristica fragrans Houtt). Journal of Genetic Engineering and Biotechnology, 11(1), Hassanen, N. H. M., Eissa, A. M. F., & Hafez, S. A. M. (2015). Original Research Article Antioxidant and antimicrobial activity of celery (Apium graveolens) and coriander (Coriandrum sativum) herb and seed essential oils. International jornal of current microbiology and Applied Sciences, 4(3), Jadhav, S.; Shah, R.; Bhayne, M.; Palombo, E. A. (2013). Inhibitory activity of yarrow essential oil on Listeria planktonic cells and biofilms. Food Control, 29,

6 Leonard, C. M., Virijevic, S., Regnier, T., & Combrinck, S. (2010). Bioactivity of selected essential oils and some componentes on Listeria monocytogenes biofilms. South African Journal of Botany, 76(4), Oussalah, M., Cailleta, S., Saucierc, L., Lacroixa, M. (2007). Inhibitory effects of selected plant essential oils on the growth of four pathogenic bacteria: E. coli O157:H7, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes. Food Control, 18(5), Probst, I. D. S. (2012). Atividade antibacteriana de óleos essenciais e avaliação de potencial sinérgico (Dissertação de Mestrado). Instituto de Biociências de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, São Paulo. Qiu, J., Zhang, X., Luo, M., Li, H., Dong, J., Wang, J., Leng, B., Wang, X., Feng, H., Ren, W., Deng, X. (2011). Subinhibitory concentrations of perilla oil affect the expression of secreted virulence factor genes in Staphylococcus aureus. PLoS ONE, 6(1). Sowbhagya, H. B. (2014). Chemistry, technology, and nutraceutical functions of celery (Apium graveolens L.): an overview. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 54(3),