ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS EXTRATOS DAS SEMENTES DE GRANADILLA (Passiflora ligularis)

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1 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS EXTRATOS DAS SEMENTES DE GRANADILLA (Passiflora ligularis) T. R. J. Santos 1*, L. C. L. A. Santana 1 1- Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos- Laboratório de Microbiologia de Alimentos e Bioengenharia Universidade Federal de Sergipe, UFS CEP: São Cristovão SE Brasil, Telefone: 55 (75) * (tacilarayane@hotmail.com). RESUMO A granadilla é uma fruta exótica, nativa das montanhas dos Andes entre Bolívia e Venezuela, tendo o Peru como o principal produtor. No presente estudo, foi investigada a atividade antimicrobiana de extratos obtidos das sementes de granadilla frente às bactérias Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Serratia marcensces. As bactérias analisadas não apresentaram sensibilidade ao extrato aquoso. Para os extratos obtidos com metanol, etanol e acetona em diferentes concentrações obtiveram-se halos de inibição entre 7,5 a 12 mm para as bactérias analisadas. Os extratos com acetona a 80% foram os que apresentaram maior potencial antimicrobiano sendo as bactérias mais sensíveis Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis e Staphylococcus aureus, com halos de inibição entre 11 e 12 mm. Este trabalho foi pioneiro em avaliar o potencial antimicrobiano de extratos de sementes de granadilla. ABSTRACT The granadilla is an exotic fruit native from mountains of Andes between Bolivia and Venezuela, and Peru is the main producer. In the present study, it was investigated the antimicrobial activity of extracts obtained from seeds of granadilla against the bacteria Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli and Serratia marcensces. The bacteria were no sensitive to the aqueous extract. The different extracts obtained with methanol, ethanol and acetone showed diameters of inhibition zone of bacteria ranging from 7.5 to 12 mm. Extracts obtained with 80% acetone showed the highest antimicrobial potential being Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis and Staphylococcus aureus the most sensitive bacteria with inhibition halos between 11 and 12 mm. This work was the first to evaluate the antimicrobial potential of granadilla seed extracts. PALAVRAS-CHAVE: resíduo de fruta; fruta exótica; antimicrobiano natural; microbiologia. KEYWORDS: waste of fruit; exotic fruit; nature antimicrobial; microbiology.

2 1. INTRODUÇÃO As espécies de Passifloraceae são muito populares entre as frutas, são consideradas uma boa fonte de componentes fitoquímicos com atividade antioxidante, tais como compostos fenólicos, glicosídeos e alcaloides (ZERAIK e YARIWAKE, 2010). A granadilla (Passiflora ligularis) é uma espécie de maracujá, consumida in natura ou em sucos e sorvetes. A granadilla é nativa das montanhas dos Andes entre Bolívia e Venezuela, tendo o Peru como o principal produtor (LIM, 2012), é cultivada também nas terras altas legal na Indonésia, Nova Guiné, Jamaica, Sri Lanka, Índia e várias outras regiões tropicais do mundo (SARAVANAN e PARIMELAZHAGAN, 2014). No Brasil é obtida através de importação (SOUZA et al., 2015). O processamento de frutas gera grande quantidade de resíduos ricos em compostos bioativos, amplamente reconhecidos pelas suas propriedades promotoras de saúde e aplicações tecnológicas, como antioxidantes e antimicrobianos, representando, portanto, potenciais fontes naturais dessas substâncias (JORGE e MALACRIDA, 2008), superando muitas vezes o teor nas porções comestíveis das frutas (SHUI e LEONG, 2006). A granadilla, uma fruta que apresenta uma gama de funcionalidades ao seu uso, o que acarreta na produção considerável de resíduos que muitas vezes não tem um destino apropriado. Deste fruto, cerca de 70% são descartadas cascas e sementes, e 30% são utilizados (polpa) (FERRARI et al., 2004). O que representa um maior volume em relação à polpa, tornando importante o estudo para sua utilização. Pesquisadores têm relatado que, a polpa de granadilla é rica em compostos polifenólicos, tais como ácido elágico, ácido gálico, rutina, canferol e teores de ácido cafeico, o que demonstra potente antioxidante, propriedades antidiabéticas e antimicrobianos. Desta forma, tornam-se importante estudar os subprodutos da granadilla para verificar a atividade antimicrobiana devido os compostos fitoquímicos encontrados na polpa (SARAVANAN e PARIMELAZHAGAN, 2014). A fruta exótica granadilla é pouco conhecida no Brasil, e os estudos na literatura relacionado à mesma são poucos (FERRARI et al., 2004; ASTURIZAGA et al., 2006; SARAVANAN e PARIMELAZHAGAN, 2014). A polpa pode ser consumida, também, com iogurte ou adicionada a coquetéis e salada de frutas e, a partir dela, processar compotas, geleias e suco concentrado ou congelado (ASTURIZAGA et al., 2006). Seus subprodutos são descartados sem nenhum aproveitamento, necessitando de estudos que demonstrem seu potencial antimicrobiano como uma alternativa sustentável para esses subprodutos. Nesse contexto, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o potencial antimicrobiano dos extratos de resíduos (sementes) da fruta exótica granadilla (Passiflora ligularis) utilizando diferentes concentrações e tipos de solventes. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Material O experimento foi conduzido no Laboratório de Microbiologia de Alimentos e Bioengenharia da Universidade Federal de Sergipe, UFS. As granadillas foram obtidas no Mercado Municipal de São Paulo, São Paulo - SP. Inicialmente, os frutos foram selecionados e submetidos ao processo de lavagem em água corrente e imersos por 15 min em solução clorada 200 ppm. Em seguida, as sementes foram separadas da polpa e cascas. As sementes foram pesadas e submetidas à secagem a 50 ºC em estufa por 24 h. Após esse período, as sementes foram trituradas para obtenção de um pó, a qual foi acondicionada em um frasco de polietileno conforme demonstrado na Figura 1 e mantido sob congelamento (-18 ºC) até o desenvolvimento das análises.

3 Figura 1 - Fruta granadilla (Passiflora ligularis) e suas respectivas sementes Fonte: (Este trabalho). 2.2 Preparação dos extratos Diferentes extratos das sementes de granadilla foram obtidos com água destilada e com os solventes acetona, metanol e etanol nas concentrações de 40%, 50%, 60%, 70% e 80% de acordo com a metodologia descrita por Sujata et al. (2011) com algumas modificações. Frascos Erlenmeyers contendo os extratos foram agitados em shaker orbital a 200 rpm, temperatura de 30 ºC durante 1 h. Posteriormente, as amostras foram filtradas em papel filtro e o sobrenadante obtido foi analisado quanto ao potencial antimicrobiano frente às bactérias patogênicas. 2.3 Atividade antimicrobiana Os extratos dos resíduos de frutas exóticas foram avaliados quanto à atividade antimicrobiana através da técnica de difusão em discos, conforme o National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2012) frente às bactérias Staphylococcus aureus (INCQS 00014), Escherichia coli (INCQS 00032), Bacillus cereus (INCQS 00003), Bacillus subtilis (INCQS 00002), Serratia marcensces (INCQS 00131), Enterococcus faecalis (INCQS 00531) e Pseudomonas aeruginosa (INCQS 00025). Todos os micro-organismos foram adquiridos da Fundação Oswaldo Cruz, Manguinhos, RJ. Os extratos das sementes da granadilla com diferentes concentrações foram adicionados em discos de papel (6 mm de diâmetro) nas placas de petri placas contendo ágar Mueller- Hinton e semeadas, e em seguida levados para a incubação a temperatura de 35 ºC durante 24 horas. A sensibilidade para os diferentes extratos foi classificada pelo diâmetro dos halos de inibição proposto por Ponce et al. (2003): não é sensível (diâmetros < 8 mm); sensíveis (diâmetros entre 9-14 mm); muito sensível (diâmetros entre mm) e extremamente sensível (diâmetros > 20 mm). Os testes foram realizados em duplicata. 2.4 Análise estatística Os resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e comparados pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade utilizando o software estatístico ASSISTAT 7.7.

4 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Potencial antimicrobiano dos extratos de sementes de granadilla Os diâmetros de halos de inibição das bactérias obtidos com os diferentes extratos das sementes de granadilla estão demonstrados na Tabela 1. Tabela 1. Atividade antimicrobiana dos extratos de sementes de granadilla frente às bactérias. C S B. cereus B. subtilis E. faecalis Halos de inibição (mm) S. aureus E. coli P. aeruginosa S. marcensces - A.D 6,0±0,0 6,0±0,0 6,0±0,0 6,0±0,0 6,0±0,0 6,0±0,0 6,0±0,0 A 10,5 ±0,5 10,5±0,5 10,0±0,0 10,0±0,0 6,0±0,0 8,5±0,5 6,0±0,0 40 % M 6,0 ±0,0 6,0±0,0 6,0±0,0 6,0±0,0 6,0±0,0 6,0±0,0 6,0±0,0 E 6,0 ±0,0 6,0±0,0 6,0 ±0,0 6,0±0,0 6,0 ±0,0 6,0±0,0 7,5±0,0 A 11,0± 0,0 10,5±0,5 11,0 ±0,0 11,0±0,0 6,0±0,0 9,0±1,0 9,5±0,5 50 % M 6,0±0,0 6,0±0,0 6,0±0,0 6,0±0,0 6,0±0,0 6,0±0,0 6,0±0,0 E 6,0±0,0 6,0±0,0 7,5 ±0,5 6,0±0,0 8,0±0,0 6,0±0,0 8,0±0,0 A 11,0±0,0 10,5±0,5 11,0±1,0 11,0±1,0 6,0±0,0 9,0±1,0 10,0±0,0 60 % M 9,5 ±0,5 8,5±0,5 6,0±0,0 8,0±0,0 7,5±0,5 6,0±0,0 8,5±0,5 E 8,5±0,5 6,0±0,0 8,0±0,0 6,0±0,0 8,0±0,0 6,0±0,0 8,5±0,5 A 11,0 ±0,0 11,0±1,0 11,0±1,0 12,0±0,0 9,5±0,5 10,5±0,5 11,0±0,0 70 % M 9,5±1,5 9,0±0,0 8,5±0,5 8,5±0,5 8,0±0,0 8,5±0,5 9,0 ±0,0 E 8,5±0,5 6,0±0,0 8,0±0,0 6,0±0,0 7,5±0,5 6,0±0,0 8,0±0,0 A 12,0± 0,0 12,0±1,0 12,0±1,0 12,0±0,0 11,0±0,0 11,5±0,5 11,0±0,0 80 % M 9,5 ±0,5 6,0±0,0 10,0±0,0 6,0±0,0 11,0±0,0 10,0±0,0 9,0±0,0 E 9,0 ±0,0 6,0±0,0 7,5±0,5 6,0±0,0 7,5±0,5 6,0±0,0 8,0±0,0 *C: concentração; S: substância; A.D: água destilada; A: acetona; M: metanol; E: etanol. Os halos de inibição variaram entre 6 a 12 mm sobre o crescimento de bactérias Grampositivas e Gram-negativas. Nenhuma das bactérias analisadas apresentaram sensibilidade ao extrato obtido com água destilada. Em relação aos extratos hidro alcoólicos, o grupo das Gram-positivas, Bacillus cereus demonstrou sensibilidade aos extratos com todas as concentrações de acetona, com o extrato de metanol a 60%, 70% e 80% e com extrato de etanol a 80%. O Bacillus subtilis foi sensível a todos os extratos com acetona e metanol 70%. Esta bactéria não foi sensível a nenhum extrato com etanol. E. faecalis foi sensível ao extrato de acetona em todas as concentrações, metanol 80% e para o extrato de etanol não foi constatada sensibilidade em nenhuma das concentrações testadas. S. aureus, exibiu sensibilidade ao extrato de acetona em todas as concentrações e com extratos de metanol e etanol não obteve sensibilidade. Para o grupo das Gram-negativas, a E. coli foi sensível aos extratos de acetona 70% e 80%, metanol 80% e não foi sensível aos extratos de etanol. A P. aeruginosa apresentou sensibilidade aos extratos de acetona de 50% a 80%, metanol 80% e não sensível aos extratos de etanol. A S. marcensces foi sensível aos extratos de acetona de 50% a 80%, metanol a 70% e 80% e não foi sensível aos extratos de etanol. A maior sensibilidade de bactérias Gram-positivas pode ser devido às diferenças na estrutura em relação às Gram-negativas, principalmente na parede bacteriana, que pode ter dificultado a ação dos antimicrobianos naturais testados (SOARES et al., 2013).

5 4. CONCLUSÃO Os extratos das sementes de granadilla obtidos com acetona em concentrações variando de 40% a 80% demonstraram potencial antimicrobiano frente às bactérias Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Serratia marcensces. As sementes de granadilla tornam-se uma alternativa para estudos futuros de aplicação dos seus extratos como antimicrobianos naturais em sistemas de alimentos. 5. AGRADECIMENTOS A Universidade Federal de Sergipe e a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa de mestrado ao primeiro autor do trabalho. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Asturizaga, A. S., Ollgaard, B.; Balsley, H. (2006). Algunos frutos comestibles de los Andes centrales. Botánica Económica de los Andes Centrales, p Clinical and Laboratory Standards Institute (NCCLS/CLSI,). (2012). Antimicrobial disk and dilution susceptibility tests for bacteria isolated from animals (11. ed.). Approved Standard. Wayne, PA (CLSI document M02-A11 Clinical and Laboratory Standards Institute), vol. 32 (1). Ferrari, R. A., Colussi, F., Ayub, R. A. (2004). Caracterização de subprodutos da industrialização do maracujá-aproveitamento das sementes. Revista Brasileira de Fruticultura, 26 (1). Jorge, N.; Malacrida, C. R. (2008). Extratos de sementes de mamão (Carica papaya L.) como fonte de antioxidantes naturais. Alimentos e Nutrição, 19 (3), Lim, T. K. (2012). Edible medicinal and non-medicinal plantsfruits. (4. ed). New York: Springer. Ponce, A. G., Fritz, R., Del Valle, C., Roura, S. I. (2003). Antimicrobial activity of essential oils on the native microflora of organic Swiss chard. Lebensmittel-Wissenschaft und-technologie, 36, Saravanan, S.; Parimelazhagan, T (2014). In vitro antioxidant, antimicrobial and anti-diabetic properties of polyphenols of Passiflora ligularis Juss. fruit pulp. Food Science and Human Wellness, 3 (2), Shui, G., Leong, L. P. (2006). Residue from star fruit as valuable source for functional food ingredients and antioxidant nutraceuticals. Food Chemistry, 97 (1), Soares, K. A., Resende, A., Júnior Silva, W., Pandolfo, C. (2013). Avaliação da atividade antimicrobiana de extrato de alecrim-do-campo (Baccharis dracunculifolia) sobre bactérias gram negativas e gram positivas. Ensaios e Ciência: Ciências Biológicas, Agrárias e da Saúde, 17 (4), Souza, A. D., Aoyama, E. M., Furlan, M. R. (2015). Tempo e condição de armazenamento das sementes na germinação e desenvolvimento de Passiflora ligularis Juss. Revista em Agronegócio e Meio Ambiente, 8 (1), Sujata, V. R., Rathod, V. S., Yesane, D. P. (2011). Screening of three wild edible fruits for their antioxidant potential. Current Botany, 2 (1), Zeraik, M. L., Yariwake, J. H. (2010). Quantification of isoorientin and total flavonoids in Passiflora edulis fruit pulp by HPLC-UV/DAD. Microchemical Journal, 96 (1),