EFEITOS DE EXPOSIÇÕES AGUDAS AO ALUMÍNIO EM ÁGUA ÁCIDA NA REGULAÇÃO IÔNICA DO PEIXE NEOTROPICAL Prochilodus lineatus,

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1 12 EFEITOS DE EXPOSIÇÕES AGUDAS AO ALUMÍNIO EM ÁGUA ÁCIDA NA REGULAÇÃO IÔNICA DO PEIXE NEOTROPICAL Prochilodus lineatus, Marina M.P. Camargo 1, Cláudia B.R. Martinez 2 e Marisa N. Fernandes 1 1 Universidade Federal de São Carlos, Depto. Ciências Fisiológicas, Rod. Washington Luiz, Km 235, São Carlos- SP; 2 Universidade Estadual de Londrina, Depto. Ciências Fisiológicas, Rod. Celso Garcia Cid, Km 38, Londrina-PR. marina_uel@yahoo.com.br RESUMO Juvenis do peixe Prochilodus lineatus foram expostos a 2 μg.l -1 de Al dissolvido em água ácida (grupo Al), somente ph ácido (grupo ph) ou à água limpa (grupo CTR) por 6, 24 e 96h para avaliar seus efeitos em parâmetros osmo-iônicos, atividade da enzima Na/K ATPase branquial e na densidade e distribuição de células-cloreto [CC]. Os peixes expostos ao Al mostraram todos os parâmetros osmo-iônicos significativamente menores após 24 e 96h. A imunohistoquímica indicou um menor número de CC nas brânquias dos animais do grupo Al, após 24 e 96h. A atividade da enzima Na/K ATPase foi menor nos animais expostos ao Al em todos os tempos experimentais. Os resultados permitiram concluir que exposições agudas à concentração de Al utilizada prejudicaram principalmente a capacidade de hiperregulação dos peixes, já que afetaram a tomada ativa de íons nas brânquias. O uso de biomarcadores osmo-iônicos mostrou-se bastante apropriado para o monitoramento da contaminação por Al. ABSTRACT Juveniles of the neotropical fish Prochilodus lineatus were exposed to 2 μg.l -1 of dissolved Al in acid water (group Al), only to acid water (group ph) or to clean water (group CTR) for 6, 24 and 96h to evaluate its effects on osmo-ionic parameters, activity of Na/KATPase enzyme in the gills and the density and number of chloride-cells (CC). All the osmo-ionic parameters studied showed smaller values in the fish exposed to Al after 24 and 96h. Imunohistochemistry reaction showed a smaller number of CC in the gills of fish exposed to Al after 24 and 96h. The activity of Na/K ATPase was reduced in the same fish, in all experimental periods. Results presented here allowed to conclude that fish acutely exposed to the concentration of Al used have the hyperregulation capacity affected since the active uptake of ions in the gills was impaired in those fish. The use of osmo-ionic biomarkers showed to be usefull in the monitoring of Al contamination.

2 13 INTRODUÇÃO/OBJETIVOS A toxicidade do Al é extremamente alta para peixes (Exley, 23) sendo as brânquias descritas como o órgão mais afetado pela contaminação por Al (Witters et al., 1992; Peuranen et al., 22). As brânquias são reconhecidas como principal órgão-alvo da ação de poluentes (Dang et al., 2; Cerqueira e Fernandes, 22) já que trata-se de um órgão multifuncional com especial importância na osmorregulação em peixes (Hwang e Lee, 28) em função da presença de células ricas em mitocôndrias, as chamadas células-cloreto (Hirose et al., 23). As células-cloreto (CC), além da presença de muitas mitocôndrias, possuem ainda canais de Na +, trocadores Cl - /HCO 3 -, bomba Na/K ATPase, refletindo sua importância no transporte ativo de íons nas brânquias (Clairborne et al., 22). Para manter a homeostase dos fluidos corporais, teleósteos de água doce compensam a perda de íons por difusão e o ganho osmótico de água absorvendo ativamente Ca 2+, Na + e Cl - através das brânquias e produzindo muita urina diluída, respectivamente (Hirose et al., 23). Assim, a análise de íons e osmolaridade plasmática, associada ao exame da densidade e localização das CC, além da atividade de enzimas transportadoras de íons nas brânquias, devem auxiliar o entendimento do mecanismo de toxicidade do Al para teleósteos dulcícolas (Vuorinen et al., 23), sendo portanto que tais parâmetros foram analisados nas brânquias e no plasma dos animais do presente trabalho, para avaliar os efeitos de exposições agudas ao alumínio em ph ácido na espécie de peixe Prochilodus lineatus. Esta espécie foi escolhida por ser representativa da ictiofauna neotropical, além de ser considerada uma espécie bioindicadora em potencial (Simonato et al., 26; Vanzella et al., 27). MATERIAL E MÉTODOS Exemplares jovens de P. lineatus (n=115) foram expostos à água limpa no grupo CTR, à água ácida no grupo ph (ph 5, devido à adição de HCL 5%); e no grupo Al à água ácida com Al. O alumínio foi adicionado à água como Al 2 (SO 4 ) 3 em uma concentração nominal de 1 mg Al.L -1. As amostragens ocorreram após 6, 24 e 96h. Após cada período experimental, os peixes foram anestesiados com benzocaína, seguido da retirada de uma amostra de sangue pela veia caudal. Os animais foram então sacrificados para a retirada das brânquias, usadas na reação de imunohistoquímica e análise enzimática. Imediatamente após a coleta, o sangue foi centrifugado, e as amostras de plasma foram congeladas (-2ºC) até o momento das análises da osmolaridade (por congelamento) e das concentrações de íons (Na + em fotômetro de chama e Cl - por meio de kit espectrofotômetro). Imediatamente após serem retirados 4 arcos branquiais foram fixadas em Bouin por 6 h e incluídos em parafina. Lâminas com cortes de 8 μm de espessura foram submetidas à reação indireta de imunohistoquímica para identificação da Na/K ATPase, segundo Dang et al. (2). Para a quantificação das células-cloreto as lâminas foram analisadas em um fotomicroscópio e as células-cloreto (CC) subdivididas em CC no filamento (CCF) e nas lamelas (CCL). Após a lavagem, os outros 4 arcos branquiais foram congelados em tampão SEI a - 2ºC até o momento do ensaio para determinar a atividade da enzima Na-K ATPase segundo Quabius et al. (1997).Para cada parâmetro as diferenças entre os grupos foram testadas pela ANOVA e identificadas pelo teste de Student-Newman-Keuls (SNK), considerando P<,5 como significativo.

3 14 RESULTADOS/DISCUSSÃO O valor médio de Al total foi de 4 μg.al.l -1 e o de Al dissolvido foi de 2 μg.al.l -1 nos aquários do grupo Al. Tais valores já foram previamente testados em peixes (Witters et al., 1996; D Cruz et al., 1998) e têm sido relatados como comuns em águas superficiais no Brasil (Flues et al., 22; CETESB, 28). Os peixes expostos ao Al mostraram valores significativamente menores de osmolaridade, Na + e Cl - (Fig.1) quando comparados com o grupo CTR após 24 e 96h. Osmolaridade Sódio mosm.lh2o * * mmol.l * # * # Cloreto mmol.l * * * # Fig. 1.Osmolaridade plasmática, concentração plasmática de sódio e cloreto de P. lineatus expostos por 6, 24 e 96 h à água limpa (CTR) ou aos grupos ph e Al. As barras indicam a média e as linhas verticais, o DP. * indica diferença significativa do grupo CTR e # indica diferença significativa do grupo ph (P <,5). A imunohistoquímica nas brânquias dos animais expostos ao Al em todos os tempos experimentais revelou um número menor de CC tanto nas lamelas (CCL) como nos filamentos (CCF), após comparação com os animais CTR (Tabela 1).. A análise da enzima Na/K ATPase nas brânquias dos peixes expostos ao Al, em todos os tempos experimentais, indicou uma inibição significativa da atividade desta enzima (em média 5% de redução) após comparação com os animais CTR (Fig. 2). As alterações osmo-iônicas verificadas nos peixes expostos ao Al provavelmente têm relação com alterações nas CC das brânquias desses peixes e na atividade da Na/K ATPase, como já descrito anteriormente (Lingwood et al., 26; Silva et al., 27). Tais células são as principais transportadoras de íons em teleósteos (Wendelaar Bonga, 1997; Dang et al., 2) e redução na sua densidade ou na atividade da enzima indica falha na tomada ativa de íons, como também confirmado pelos valores iônicos diminuídos nos animais expostos ao Al.

4 15 Tabela 1. Número de células-cloreto (cc.mm -1 ) identificadas nos filamentos (CCF) e nas lamelas (CCL) das brânquias dos peixes expostos ao ph e ao Al, ou somente à água limpa (CTR), por 6h, 24h e 96h. Grupo 6 horas 24 horas 96 horas CCF CCL CCF CCL CCF CCL CTR 39,1±11, 4,7±29,8 55,2±26,3 72,8±28, 58,5±11, 29,5±1,3 ph 38,7±14,5 51,6±27,* 8,2±34,2* 14,6±39,* 55,±22, 12,2±5,3* Al 37,4±12,4 28,±8,4*# 29,2±2,9*# 54,8±23,6*# 38,6±13,6*# 1,7±9,7*# Valores indicam média ± DP. * indica valor significativamente diferente do grupo CTR respectivo, e # indica valor significativamente diferente do grupo ph respectivo, P <,5. % do CTR Atividade da Na-K-ATPase * # * # * # Fig. 2. Atividade da enzima Na/K ATPase nas brânquias de P. lineatus expostos por 6, 24 e 96 horas à água limpa (CTR) ou aos grupos ph e Al. As barras indicam a porcentagem da atividade da enzima dos grupos ph e Al em relação ao grupo CTR. * indica diferença significativa do grupo CTR e # indica diferença significativa do grupo ph (P <,5). CONCLUSÕES O presente estudo demonstrou que a exposição de P. lineatus ao Al em ph ácido induziu alterações osmo-iônicas, devido principalmente aos efeitos do Al sobre a atividade da enzima Na/K ATPase e na densidade e distribuição das CC nas brânquias. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CETESB, 28. Cetesb Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental -Relatório da qualidade das águas interiores do estado de São Paulo 27. Série Relatórios, Cetesb, São Paulo, 537p.

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6 17 SIMONATO, J.D.; ALBINATI, A.C.; MARTINEZ, C.B.R. 26. Effects of the Water Soluble Fraction of Diesel Fuel Oil on Some Functional Parameters of the Neotropical Freshwater Fish Prochilodus lineatus Valenciennes. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 76, VANZELLA, T.P.; MARTINEZ, C.B.R.; CÓLUS, I.M.S. 27. Genotoxic and mutagenic effects of diesel oil water soluble fraction on a neotropical fish species. Mutat Res 631, WENDELAAR BONGA, S.E., The stress in fish. Physiol. Rev., 77, WITTERS, H.E.; VAN PUYMBROECK, S.; VANDERBORGHT, O.I.J Branchial and renal ion fluxes and transepithelial electrical potential differences in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss: effects of aluminium at low ph. Environ. Biol. Fish., 34, WITTERS, H.E.; PUYMBROECK, S.V.; STOUTHART, J.H.X.; WENDELAAR BONGA, S.E Physicochemical changes of aluminium in mixing zone: mortality and physiological disturbances in brown trout (Salmo trutta L.). Environ. Toxicol. Chem. 15 (6),