Boletim de Pesquisa 120 e Desenvolvimento ISSN Março, 2006

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1 Boletim de Pesquisa 120 e Desenvolvimento ISSN Março, 2006 Indução de organogênese em lisianthus, Eustoma grandiflorum, a partir de fragmentos foliares cultivados in vitro

2 República Federativa do Brasil Luiz Inácio Lula da Silva Presidente Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento Roberto Rodrigues Ministro Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Conselho de Administração Luis Carlos Guedes Pinto Presidente Silvio Crestana Vice-Presidente Alexandre Kalil Pires Ernesto Paterniani Helio Tollini Marcelo Barbosa Saintive Membros Diretoria-Executiva da Embrapa Silvio Crestana Diretor Presidente José Geraldo Eugênio de França Kepler Euclides Filho Tatiana Deane de Abreu Sá Diretores Executivos Embrapa Recursos Genéticos e Bioteconologia José Manuel Cabral de Sousa Dias Chefe-Geral Maurício Antônio Lopes Chefe-Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento Sergio Mauro Folle Chefe-Adjunto de Comunicação e Negócios Maria do Rosário de Moraes Chefe-Adjunto de Administração 2

3 Recursos Genéticos e Biotecnologia ISSN Março, 2006 Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento 120 Indução de organogênese em lisianthus, Eustoma grandiflorum, a partir de fragmentos foliares cultivados in vitro L. Pedro Barrueto Cid Jairo de Moraes Teixeira Brasília, DF

4 Exemplares desta edição podem ser adquiridos na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Serviço de Atendimento ao Cidadão Parque Estação Biológica, Av. W/5 Norte (Final) Brasília, DF CEP Caixa Postal PABX: (61) Fax: (61) e.mail:sac@cenargen.embrapa.br Comitê de Publicações Presidente: Sergio Mauro Folle Secretário-Executivo: Maria da Graça Simões Pires Negrão Membros: Arthur da Silva Mariante Maria de Fátima Batista Maurício Machain Franco Regina Maria Dechechi Carneiro Sueli Correa Marques de Mello Vera Tavares de Campos Carneiro Supervisor editorial: Maria da Graça S. P. Negrão Normalização Bibliográfica: Ligia Sardinha Fortes Editoração eletrônica: Maria da Graça S. P. Negrão 1ª edição 1ª impressão (2006): B 268 Barrueto Cid, Luis Pedro. Indução de organogênese em lisianthus, Eustoma grandiflorum, a partir de fragmentos foliares cultivados in vitro. / Luis Pedro Barrueto Cid e Jairo de Moraes Teixeira. Brasília, DF : Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, p. - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento / Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, ISSN ; 120). 1. Lisianthus. 2. Planta cultura de tecidos. 3. Regeneração. 4. Picloram. 5. BAP. I. Teixeira, Jairo de Moraes. II. Série CDD 20 4

5 Sumário Abstract... 7 Introdução... 7 Material e Métodos... 8 Referências Bibliográficas Resultados e Discussão... 9 Resumo

6 Indução de organogênese em lisianthus, Eustoma grandiflorum, a partir de fragmentos foliares cultivados in vitro L. Pedro Barrueto Cid 1 Jairo de Moraes Teixeira 2 Resumo Sementes de lisianthus após serem esterilizadas com hiploclorito, 2,5 %, foram inoculadas em placas de Petri contendo meio SP mais 100 mg/l de Claforan, e condições de laboratório de 40 µe m -2 s -1, 16 h de luz e temperatura de 25 ± 2 C, condições padrão. Após 10 dias, as plântulas obtidas foram transferidas para tubos de ensaios contendo o mesmo meio SP, porém, sem antibiótico nem reguladores de crescimento. Aproximadamente após 40 dias, segmentos foliares das plantas obtidas foram retiradas, cortadas, 1cm 2, e inoculadas em placas de Petri contendo meio básico SP suplementado com 0,0; 2,0; 4,0 e 8,0 µm de Picloram, 45 dias após, exceto na concentração 0,0, foi verificada indução de calos em todos os tratamentos; a seguir, os calos induzidos foram transferidos para o mesmo meio, mas, suplementados com:0,0; 1,5; 3,0;6,0; e 12 µm de BAP por 50 dias. Após esse período, foi observada indução de brotos em todos os tratamentos sendo que, a concentração de 1,5 µm de BAP foi superior. Quando isolados e colocados os brotos em tubos com meio SP cresceram e enraizaram normalmente após 30 dias, porém, o enraizamento foi melhor quando os brotos foram tratados previamente com 2.5 µm de AIB. Durante a fase de indução de calos e de regeneração o material ficou sob condições padrão de luz e temperatura. No laboratório, após 10 dias, as plantas foram transferidas para copos plásticos com vermiculita esterilizada e logo, transferidas satisfatoriamente para solo em casa de vegetação. As plantas estabelecidas apresentaram alta % de sobrevivência sob condições de 25 C e 75% UR. Termos para indexação: cultura de tecidos, regeneração, Picloram, BAP 1 Pesquisador Embrapa/Cenargen Brasília-DF. 2 Florativa Biotecnológica - Brasília-DF. 6

7 Organogenesis inductions in lisianthus, Eutoma grandiflorum, from foliar fragments cultivated in vitro Abstract A study on organogenesis in vitro of lisianthus was made. For that lisianthus seeds after being surface disinfested with sodium hypochlorite 2.5 % were inoculated in Petri dishes containing SP basal medium plus 100 mg/l of sodium cefotaxime and laboratory conditions of 40 µe m -2 s -1, 16 h light and temperature of 25 ± 2 C, standard conditions. After 10 days, seedlings obtained were transferred to tubes containing the same SP basal medium, but, without antibiotic or plant growth regulator. Approximately 40 days later, the leaf segments from seedlings were isolated and cut, 1 cm 2, and inoculated in Petri dishes containing SP basal medium plus 0.0; 2.0;4.0 or 8.0 µm Picloram, 45 days later, except for 0.0 concentration, it was verified callus induction in all treatments. Calluses were transferred to the same basal medium, but, supplemented with 0.0; 1.5; 3.0; 6.0 or 12.0 µm BAP. Fifty days later, it was observed shoot induction in all treatments, being, 1,5 µm BAP superior. When shoots were isolated and placed in tube with SP basal medium growth and rooting was observed 40 days later, but, rooting was better when the shoots were submitted prior with 2.5 µm AIB. During the phase of callus inductions and callus regeneration the material was kept under standard conditions of light and temperature. In the laboratory the plants were transferred to plastic pot with sterilized vermiculite for 10 days and then, in greenhouse conditions, transplanted successfully to soil. Established plant grew under conditions of around 25 C and 75% RH. Index term: tissue culture, regeneration, Picloram, BAP 7

8 Introdução Lisianthus é uma planta que produz flores de corte com longa duração de póscolheita por isso mesmo, muito apreciada no mercado americano, europeu e asiático existindo uma forte demanda por flores com tonalidades amarelas, laranja, vermelho e azul (LEDGER et al., 1997). Nos países emergentes, notadamente países latino-americanos, e Brasil em especial, o cultivo agronômico desta planta ainda é incipiente, porém, está cada vez mais acentuado-se. Portanto, torna-se necessário disponibilizar procedimentos de propagação mais eficientes visando agilizar e modernizar seu sistema de produção, inclusive, com auxilio da micropropagação onde há carência de trabalhos nesta espécie, com vistas a tornar o agronegócio nacional, mais competitivo para a exportação. Por isso, o presente trabalho disponibiliza uma metodologia, com base na micropropagação, visando trabalhos de transformação genética para melhorar seu aspecto ornamental ou aumentar a oferta de genótipos elites para cultivo no campo. Material e Métodos Em câmara de fluxo laminar, sementes de lisianthus, Eustoma grandiflorum pertencente à família Gentianaceae, foram submetidas a hipoclorito de sódio, 2,5 % (v/v) de cloro ativo, por 10 minutos em agitação, a seguir lavadas com água esterilizada e deionizada, sendo que, depois as sementes, 10 por placa, foram inoculadas em 5 placas de Petri, 10 x 100 mm, com aproximadamente 25 ml de meio SP (BARRUETO CID, 2005) suplementado com 100 mg/l de Claforan (Cefotaxima sódica: Hoechst/Roussel). Depois de 10 dias, as plântulas obtidas foram transferidas para o mesmo meio, mas, em tubos de ensaio, 15 x 150 mm, com 15 ml de meio desprovido de antibiótico. Aproximadamente 40 dias depois das plântulas obtidas, segmentos foliares transversais, aproximadamente de 1 cm 2, foram retirados e inoculados 5 por placa de Petri, 9mm x 100 mm, com 3 repetições, contendo meio nutritivo SP, 25 ml, suplementado com Picloram 0,0; 2,0; 4,0 e 8 µm. Aproximadamente após 45 dias, os calos induzidos foram transferidos para placas de Petri, 3 por placa e 3 8

9 repetições, contendo a mesma quantidade de meio SP, porém, suplementado com BAP (6-benzilaminopurina) : 0,0;1,5; 3,0; 6,0 e 12 µm por 50 dias. Após este período, o material foi avaliado e transferido para SP sem nenhum regulador de crescimento. Após 30 dias, brotos com 10 a 20 mm foram retirados e transferidos para meio SP suplementados com 2.5 µm de ácido indol butírico (AIB) por 15 dias, após o qual, os brotos voltaram novamente para o mesmo meio, mas, sem AIB (BARRUETO CID et al., 1997). Enraizadas as plântulas, e depois de um período de aclimatação em copos plásticos, 300ml, com vermiculita esterilizada e cobertura plástica transparente por 10 dias no laboratório, foram satisfatoriamente transferidas para terra em casa de vegetação cuja temperatura média foi de 25 C umidade relativa 75 % e irrigação periódica manual. Durante todo o processo in vitro, as sementes primeiro e as plântulas depois, ficaram numa temperatura de 26 ± 2 C, irradiância de aproximadamente 40 µe m - 2 s -1 com fotoperíodo de 16 h luz. Resultados e Discussão No tocante à assepsia das sementes, foi observada uma baixíssima porcentagem de contaminação (3%). Com respeito à germinação, já com 10 dias praticamente estavam todas germinadas na placa de Petri e com 30 dias, nos tubos de ensaios, as plântulas tinham se desenvolvidos plenamente, inclusive, com raiz, o que facilitou sua transferência para terra ou vermiculita. A alta porcentagem de germinação, crescimento e enraizamento das plântulas, confirma um efeito não fitotóxico do Claforan (BARRUETO CID e DURZAN, 2003) confirmando também, que o tratamento inicial com hipoclorito de sódio na dose usada não foi prejudicial, apesar, do diminuto tamanho das sementes desta espécie. Em relação à indução de calos, Picloram se revelou como um bom agente auxínico, já que em todas as concentrações testadas, exceto 0,0, foi observada formação de calos, os quais eram compactos, úmidos e esverdeados, especialmente nas concentrações de 4 e 8 µm ( Fig. 1 A). 9

10 A B C D E F Figura 1. Organogênese de lisianthus a partir de fragmento foliar. Fig.1A: calo obtido com 4 µm de Picloram 45 dias de idade e aproximadamente 20 mm de comprimento. Fig.1B: brotos em presença de meio SP sem BAP com 60 dias de idade, porém, induzido previamente com BAP 3,0 µm. Fig. 1C: plântula obtida de Fig.B e enraizada com AIB 70 mm de comprimento. Fig. 1D: planta transferida para terra em casa de vegetação apresentando rosetamento. Fig. 1E: a mesma planta de D porém depois de tirada da casa de vegetação e exposta a alternância de temperatura mais pronunciada entre o dia e a noite (condições de campo). Fig.1 F: floração de E, observar os vários botões florais. No concernente à indução de brotos por explante e por tratamento aos 50 dias, foi constatado que para as concentrações de 0,0; 1,5; 3,0; 6,0 e 12 µm, as médias e seus respectivos desvios padrões encontram-se na Fig. 2. Por esta figura observa-se um efeito linear da citocinina sobre a indução de brotos de lisianthus com uma clara queda na concentração de 12,0 µm. De fato, foi observado que 50 % das repetições desta concentração apresentaram regeneração zero. No controle, houve 33 % de repetições sem apresentar brotações, sendo que neste tratamento também houve baixo número de brotos por repetição ( 2). Diferente foi o caso de 1.5; 3.0 e 6,0 µm onde as médias foram 3 ou 4 vezes o valor do controle (Fig.2). 10

11 Número de brotos Controle 1,5 um 3,0 um 6,0 um 12,0 um BAP Fig. 2. Efeito de BAP no número de brotos de lisianthus a partir de calos de origem foliar após 60 dias. Paek e Hahn (2000), também obtiveram alta porcentagem de indução de brotos, mas em compensação, registraram problemas com vitrificação, talvez pelo fato, de ter usado altas concentrações de BAP e cinetina ( µm) o que não foi o presente caso. Cabe precisar que após 30 dias em meio SP sem BAP, foi observada uma grande número de brotos em todas as concentrações dificultando a contagem dos mesmos,(fig.1b) brotos que, quando colocados sob AIB enraizaram vigorosamente aos 30 dias, (Fig.1C), e sua transferencia para vermiculita primeiro e para terra depois, foi realizada com 90 % de sobrevivência. Não obstante, o desenvolvimentos das plantas na casa de vegetação foi lento e de pouco alongamento dos entre-nós do seu eixo caulinar (aspecto rosetado),( Fig.1D), fenômeno este, atribuído a altas temperaturas (HARBAUGH et al., 1992), e que obviamente dificulta a produção de hastes florais. Para favorecer a floração houve que tirar as plantas da casa de vegetação e deixá-las sob condições de campo, no qual, a acentuada diferença de temperatura entre o dia e a noite favoreceu o alongamento caulinar e a floração posterior (1Fig. E-F). 11

12 Embora a regeneração de lisianthus tenha-se reportado inicialmente usando meio básico MS (SEMENIUK e GRIESBACH, 1987), os resultados do presente trabalho atestam que meio SP foi satisfatório e igualmente adequado tanto a nível de germinação, crescimento de plântulas, indução de calos e de brotos, sendo assim, o presente protocolo oferece uma metodologia simples e eficiente para micropropagar esta espécie, especialmente, porque a regeneração do material é oriunda de folha que potencializa trabalhos de transformação, no qual, eficientes protocolos de regeneração e de clonagem são requeridos,por exemplo, procurando resistência para Botrytis, ou tonalidades especiais com mais vistosas pétalas para satisfazer as preferências de um mercado consumidor cada vez mais exigente. Referências Bibliográficas BARRUETO CID, L. P.; GOMES, A. C.M.; COSTA, S. B. R. da; TEIXEIRA, J. B. Micropropagação of Miconia sp, a woody Melastomaceae from Brazil, using thidiazuron as plant growth regulator. Revista Brasileira Fisiologia Vegetal, v. 9, p.21-25, BARRUETO CID, L. P.; DURZAN, D. J. Efeito da cefotaxima na germinação,crescimento e brotação de gemas axilares, sob condições in vitro. Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, p. (Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento, 49). BARRUETO CID, L. P. El cultivo de tejidos. In: PRIETO, H.; JORDAN, M.; BARRUETO CID, L. P.; CORDEIRO, M. C. R.; DURZAN, D. J. Biotecnologia vegetal. Santiago-Chile: Instituto de Investigaciones Agropecuárias, HARBAUGH, B. K.; ROH, M. S.; LAWSON, R. H.; PEMBERTON, B. Rosetting of lisianthus cultivars exposed to high temperature. Horticultural Science, v. 27, p , LEDGER, S. E.; DEROLES, S. C.; MANSON, D. G.; BRADLEY, J. M.; GIVEN, N. K. Transformation of lisianthus (Eustoma grandiflorum). Plant Cell Reports, v. 16, p , PAEK, K. Y.; HAHN, E. J. Cytokinins, auxin and activated charcoal affect organogenesis and anatomical characteristics of shoot-tip cultures of lisianthus [Eustoma grandiflorum (Raf.) Shinn]. In Vitro (P), v. 36, p ,

13 SEMENIUK, P.; GRIESBACH, R. J. In vitro propagation of prairie gentian. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, v. 8, p ,