UNIVERSIDADE TUIUTI DO PARANÁ FACULDADE DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA RONÉRIO AUGUSTO BACH

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1 UNIVERSIDADE TUIUTI DO PARANÁ FACULDADE DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA RONÉRIO AUGUSTO BACH TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO RESSINCRONIZAÇÃO NA INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM TEMPO FIXO RELATÓRIO DE ESTÁGIO CURRICULAR REVISÃO DE LITERATURA CURITIBA 2016

2 UNIVERSIDADE TUIUTI DO PARANÁ FACULDADE DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA RONÉRIO AUGUSTO BACH TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO RESSINCRONIZAÇÃO NA INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM TEMPO FIXO RELATÓRIO DE ESTÁGIO CURRICULAR REVISÃO DE LITERATURA Trabalho de conclusão apresentado ao curso de Medicina Veterinária da Faculdade de Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade Tuiuti do Paraná como requisito avaliativo parcial do 9 semestre para obtenção do grau de Médico Veterinário. Orientador: Prof. MSc. João Filipi Scheffer Pereira CURITIBA 2016

3 Reitor Prof. Luiz Guilherme Rangel Santos Pró-Reitor Administrativo Sr. Carlos Eduardo Rangel Santos Pró-Reitoria Acadêmica Prof. Carmen Luiza da Silva Pró-Reitor de Planejamento e Avaliação Sr. Afonso Celso Rangel Santos Pró Reitoria de Pós Graduação, Pesquisa e Extensão Prof. Carmen Luiza da Silva Secretário Geral Sr. Bruno da Cunha Diniz Diretor da Faculdade de Ciências Biológicas e da Saúde Prof. João Henrique Faryniuk Coordenador do Curso de Medicina Veterinária Prof. Wellington Hartmann CAMPUS: PROF. SYDNEI LIMA SANTOS Rua: Sydnei A. Rangel Santos, 238 Santo Inácio CEP: Curitiba Paraná Fone: (41)

4 TERMO DE APROVAÇÃO RONÉRIO AUGUSTO BACH TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO RESSINCRONIZAÇÃO NA INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM TEMPO FIXO RELATÓRIO DE ESTÁGIO CURRICULAR REVISÃO DE LITERATURA Esta monografia foi julgada e aprovada para obtenção de grau de Médico Veterinário no Curso de Medicina Veterinária da Faculdade de Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade Tuiuti do Paraná. Curitiba, 27 de junho de 2016 Universidade Tuiuti do Paraná Banca Examinadora Prof. MSc. João Filipi Scheffer Prof. Dr. Odilei Rogério Prado Prof. Dr. Wellington Hartmann

5 APRESENTAÇÃO O presente trabalho de conclusão de curso apresentado ao curso de Medicina Veterinária da Faculdade de Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade Tuiuti do Paraná como requisito parcial para obtenção de grau de Médico Veterinário é composto por relatório de estágio e uma revisão bibliográfica. No relatório estão listadas as atividades realizadas durante o estágio curricular, realizado na empresa Geraembryo Reprodução Animal, com sua respectiva carga horária. Já a revisão bibliográfica é composta por uma pesquisa voltada ao tema de ressincronização na inseminação artificial em tempo fixo.

6 A toda minha família que esteve sempre presente durante esta trajetória, dedico.

7 Prefiro mil vezes tentar alcançar trunfos e glórias, mesmo me expondo a derrota, que formar fila com os pobres de espírito que não conhecem vitória e nem derrota J. Roosevelt

8 AGRADECIMENTOS Agradeço a todos que, de alguma forma, contribuíram para minha formação acadêmica. De maneira especial agradeço a minha família, a todos os mestres que me serviram de guia durante esta etapa e aos Médicos Veterinários que me concederam o estágio curricular e que acabaram por se tornar grandes amigos.

9 RESUMO A bovinocultura Brasileira encontra-se em destaque no cenário nacional e internacional. Detentora do segundo maior rebanho bovino do mundo e com o primeiro lugar no ranking de exportações a bovinocultura demonstra a importância econômica e social que estabelece no país. Buscando aprimorar os resultados obtidos é de suma importância que se apliquem, com qualidade, as biotecnologias reprodutivas disponíveis. Neste sentido a inseminação artificial em tempo fixo tem se mostrado como uma importante ferramenta de incremento de eficiência reprodutiva aos rebanhos bovinos de corte. As taxas de prenhez na IATF permitem afirmar que entre 25 e 70% das fêmeas não estarão prenhas ao final da estação de monta. Este fato levou ao desenvolvimento da técnica de ressincronização que visa propiciar uma segunda inseminação artificial nestas fêmeas não gravídicas. Além de incrementar as taxas de prenhez a ressincronização serve como alternativa para falta de touros para repasse e como alternativa para encurtar a estação de monta.

10 LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 Simulação de 3 ondas foliculares FIGURA 2 Taxa de prenhez acumulada em função dos dias da estação de monta.. 38 Protocolo utilizado para ressincronização associada ao desmame temporário 42 Protocolo utilizado para primeira inseminação artificial em tempo fixo Protocolo utilizado na segunda inseminação artificial em tempo fixo FIGURA 6 Protocolo hormonal para inseminação artificial em tempo fixo. 45 FIGURA 7 Protocolo para segunda inseminação artificial em tempo fixo após a ressincronização.. 45 FIGURA 8 Equipamentos utilizados para avaliação laboratorial de sêmen criopreservado Modelo de ficha de controle reprodutivo utilizada nas etapas 2 e 3 da IATF. 53 FIGURA 10 Caixa de leitura para diagnóstico de brucelose 54 FIGURA 11 Imagem ultrassonográfica de uma gestação gemelar 56 FIGURA 12 Lote de touros submetidos ao exame andrológico.. 57 FIGURA 13 Equipamentos utilizados na inseminação artificial 59 FIGURA 14 Lote de novilhas oriundas de cruzamento industrial (Nelore x Angus) submetidas ao protocolo de IATF e inseminadas com sêmen de touro Brangus ( MC Something Special 129W14) 60 Bezerros oriundos de vacas submetidas ao protocolo de IATF onde os pretos são fruto de inseminação artificial e os brancos de repasse com touro Nelore.. 60 Probe transvaginal e equipamento para sucção de oócitos conectado a uma agulha descartável 61 FIGURA 17 Bomba de sucção utilizada para obtenção de oócitos 61 FIGURA 18 Transportador de embriões utilizado no transporte dos embriões obtidos do laboratório até a fazenda.. 62 Equipamentos utilizados para manipulação de embriões: estereomicroscópio, placa aquecedora, filtro para embriões, placas e pipetas. 65 Equipamentos para coleta de embriões: filtro, sonda de Foley, meio de coleta, seringa e pinças 65 FIGURA 3 FIGURA 4 FIGURA 5 FIGURA 9 FIGURA 15 FIGURA 16 FIGURA 19 FIGURA 20

11 LISTA DE TABELAS TABELA 1 TABELA 2 TABELA 3 TABELA 4 TABELA 5 Controle farmacológico do ciclo estral, hormonios utilizados e ação farmacológica Atividades realizadas durante o estágio curricular e suas respectivas cargas horárias. 50 Hormônios utilizados em cada etapa e suas respectivas dosagens para controle da ovulação na inseminação artificial em tempo fixo. 58 Protocolo de sincronização de receptoras para transferência de embrião.. 64 Protocolo de sincronização de doadoras para transferência de embrião... 64

12 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS BE- Benzoato de estradiol CL- Corpo lúteo FD- Folículo dominante FGF- Folicular growth factor (fator de crescimento folicular) FSH- Hormônio folículo estimulante GnRH- Hormônio liberador de gonadotrofinas IA- Inseminação arificial IATF- Inseminação artificial em tempo fixo IEP- Intervalo entre partos LH- Hormônio luteinizante MAPA- Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento mg- Miligrama MGA- Acetato de melengestrol mm- milímetros MN- Monta natural OT- Ocitocina P4- Progesterona P4- Progesterona PGE's- Prostaglandinas PGF2ɑ- Prostaglandina 2ɑ PIB- Produto interno bruto TE- Transferência de embrião ecg- Gonadotrofina coriônica equina PMSG- Gonadotrofina do soro de égua gestante IM- Intra muscular VE- Valerato de estradiol ECC- Escore de condição corporal

13 EM- Estação de monta UI- Unidades internacionais ECP-Cipionato de estradiol FIV- Fertilização in vitro C Graus Celsius TE Transferência de embrião SRD Sem raça definida

14 SUMÁRIO CAPÍTULO I: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA INTRODUÇÃO CICLO ESTRAL FOLICULOGÊNESE Fase pré-antral Fase antral FASES DO CICLO ESTRAL Proestro Estro Metaestro Diestro HORMÔNIOS DA REPRODUÇÃO Hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) Hormônio folículo estimulante (FSH) e Hormônio luteinizante (LH) Estrógeno (E2) Progesterona (P4) Prostaglandinas (PGE's) Ocitocina (OT) INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM TEMPO FIXO (IATF) PROTOCOLOS HORMONAIS Prostaglandina (PGF2ɑ) Progestágenos Progesterona (P4) e Estradiol (E2) GnRH Gonadotropinas exógenas Programas combinados Sincronização com Nergestomet e Valerato de estradiol Sincronização com Progesterona, Benzoato de Estradiol e Prostaglandina F2ɑ Sincronização com GnRH e Prostaglandina F2ɑ ÍNDICES DE PRENHEZ RESSINCRONIZAÇÃO ÍNDICES DE PRENHEZ NA RESSINCRONIZAÇÃO...42 CAPÍTULO II: RELATÓRIO DE ESTÁGIO INTRODUÇÃO LOCAL DO ESTÁGIO ATIVIDADES REALIZADAS ANÁLISE DE SÊMEN AVALIAÇÃO GINECOLÓGICA CONFECÇÃO DE PLANILHAS DE CONTROLE REPRODUTIVO DIAGNÓSTICO DE BRUCELOSE E TUBERCULOSE DIAGNÓSTICO GESTACIONAL EXAME ANDROLÓGICO IATF OPU TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES CONCLUSÃO...66

15 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...67

16 CAPÍTULO I: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

17 16 1. INTRODUÇÃO A bovinocultura Brasileira encontra-se em destaque no cenário nacional e internacional. Detentora do segundo maior rebanho bovino do mundo e com o primeiro lugar no ranking de exportações a bovinocultura demonstra a importância econômica e social que estabelece no país. Somada com a agricultura a pecuária representa cerca de 23% do PIB nacional (MAPA, 2015). A bovinocultura de corte Brasileira era marcada pelo atraso e resistência às inovações tecnológicas porém existe um movimento, observado nos últimos anos, de profissionalização da atividade. Buscando maior lucratividade as biotecnologias reprodutivas e as técnicas administrativas estão se tornando, cada vez mais, indispensáveis (BARCELLOS, 2004). Como consequência dos sistemas de produção estabelecidos, onde os animais recebem de maneira direta e indireta todas as implicações climáticas o rebanho Brasileiro possui a característica de tolerância ao ambiente tropical aspecto que é concomitante com o baixo desempenho reprodutivo. Este aspecto pode ser comprovado ao avaliar o desempenho do rebanho nacional quanto a taxa de desfrute, por exemplo (CUNHA, 2013). A alta performance reprodutiva, na cadeia de produção de bovinos, é um requerimento primordial para se alcançar a máxima capacidade de produção e, consequentemente, um retorno financeiro satisfatório. Seguindo esta prerrogativa a aplicação de programas voltados a biotecnologia da reprodução na rotina das fazendas tem se mostrado relevante (BARUSELI, 2012). Neste sentido a inseminação artificial (IA) e a transferência de embriões (TE) são as biotécnicas mais efetivas na produção de bovinos (BÓ, 2004). A inseminação artificial permite inúmeras vantagens em relação a monta natural, tais como: padronização do rebanho, controle de doenças sexualmente transmissíveis, ordenação do trabalho na fazenda, diminuição de custos relativos à reposição de touros, maior possibilidade de cruzamento entre raças além da maior obtenção de indivíduos geneticamente superiores (BARUSELLI, 2005).

18 17 Apesar de todas as vantagens já citadas a IA apresenta como maior fator limitante a necessidade de observação de cios. Esta limitação se dá principalmente de acordo com o tamanho do rebanho e com o comportamento reprodutivo que é uma particularidade entre as raças (BARUSELLI, 2005). Esta afirmação pode ser aceita tendo em vista que existe uma grande ocorrência de cios noturnos e de curta duração entre os animais Bos indicus ( MIZUTA, 2003). Buscando eliminar a problemática da detecção de cios, foram iniciados os estudos de sincronização de crescimento folicular e ovulação. Desta maneira os níveis hormonais e a consequente ovulação podem ser manipulados e a visualização de cio se torna desnecessária (MAPLETOFT, 2005).

19 18 2. CICLO ESTRAL 2.1. FOLICULOGÊNESE A dinâmica folicular nos bovinos envolve desde o desenvolvimento pré-natal até os estágios mais avançados na vida reprodutiva do animal, caracterizada pelas etapas de ativação, crescimento e maturação dos oócitos. Ainda dentro destas características é possível dividir a foliculogênese entre as fases pré-antral e antral. (MAGALHÃES, 2012) Cada fase possui um diferente requerimento em relação a substância e concentração necessária (MAGALHÃES, 2012) Fase pré-antral A fase pré-antral é caracterizada pela ativação dos folículos de primordiais para primários e seu subsequente crescimento de primários para secundários (MAGALHÃES, 2012). Nos mamíferos os ovários possuem uma grande população folicular que se desenvolve durante a vida fetal. A transição do estágio de folículo primordial para os estágios de crescimento propriamente ditos é gradativa e inicia subitamente após o desenvolvimento dos folículos primordiais e continua durante toda a vida reprodutiva (MELLO, 2013). A caracterização de crescimento e desenvolvimento folicular se dá no momento em que se inicia a transição de folículos primordiais em folículos primários. Esta mudança é caracterizada pela proliferação e diferenciação das células da granulosa que passam do formato achatado para cuboide (AERTS, 2010). A ação das gonadotrofinas no desenvolvimento dos folículos pré-antrais é contraditória. O crescimento destes folículos até o diâmetro de 4 mm sem a

20 19 presença de FSH indica que apenas fatores ovarianos e locais são os atuantes nesta etapa (BURATINI, 2007). Em contrapartida estudos in vitro detectaram receptores ativos de FSH em folículos primários e secundários (MARTINS, 2008) Esta afirmação pode ser feita pois ao ser adicionado FSH ao meio de cultivo foi observado o aumento do diâmetro folicular e também a secreção de estradiol (OLIVEIRA, 2011). Muitos são os fatores de crescimento atuantes nos folículos nesta etapa de crescimento (MCNATTY, 1999) Fase antral A fase antral de desenvolvimento folicular é caracterizada, diferentemente da fase pré-antral, pela crítica dependência das gonadotrofinas ( BURATINI, 2007). A partir deste momento a ação folicular nos bovinos, a exemplo de como ocorre de maneira geral nos mamíferos, obedece um padrão de ondas reguladas pelas gonadotrofinas denominadas ondas de crescimento folicular (FORTUNE, 2001). Cada onda corresponde a uma etapa de crescimento folicular conjunto que dura, cerca de, 3 dias. Após este período apenas um folículo continuará crescendo enquanto os outros sofrerão decréscimo de tamanho ( folículos subordinados) dando origem ao termo diferenciação folicular ( BARUSELLI, 2007). Após a diferenciação, durante a primeira onda folicular, este folículo se torna anovulatório devido a baixa atividade pulsátil de LH secundária aos elevados níveis séricos de progesterona. A partir deste momento não há mais o fenômeno de dominância estabelecida pelo folículo que estava em desenvolvimento tornando possível o surgimento de outra onda de crescimento folicular. O folículo que se tornar dominante nesta nova onda poderá culminar em ovulação (FORTUNE, 2004). O momento da ovulação é determinado pela quantidade de ondas ovulatórias que cada indivíduo apresenta. Estudos apontam para diferenças evidentes entre Bos taurus e Bos indicus, onde os animais taurinos tendem a apresentar 2 a 3 ondas

21 20 de crescimento (WOLFENSON, 2004) enquanto os animais zebuínos apresentam, com mais frequência 3 ondas sendo possível a constatação de até 4 ondas (VIANA, 2000). A imagem a seguir demonstra uma simulação do crescimento folicular e cada etapa de acordo com a sua duração até o momento da ovulação. FIGURA 1: Simulação de três ondas foliculares e os hormônios atuantes Fonte: ABS Pecplan, 2015 Outra diferença a ser considerada entre os animais zebuínos e taurinos é a quantidade de folículos recrutados em cada onda de crescimento folicular, onde os taurinos tendem a apresentar um número maior de folículos em cada onda (33,4 ± 3,2 vs. 25,4 ± 2,5) (CARVALHO, 2007). Prosseguindo com as diferenças fisiológicas observadas entre os dois grupos animais pode ser citado o tamanho máximo do folículo ovulatório apresentado em cada um. Em animais Bos taurus são descritos diâmetros de 17,1mm e 16,5 mm para primeira e segunda onda folicular. Já para animais Bos indicus os diâmetros observados são de 11,3 mm e 12, 1 mm (BARUSELLI, 2007). 2.2 FASES DO CICLO ESTRAL Nas vacas o ciclo estral é o período compreendido entre dois fenômenos de estro consecutivos tendo uma duração normal de dias, sendo o mais comum o intervalo de 21 dias. Intervalos que se apresentem maiores ou menores que os

22 21 valores já citados podem indicar patologias ou detecção falha de cio (GUAQUETÁ, 2009). A expressão do comportamento de estro é resultado de um aumento progressivo nos níveis séricos de 17ß-estradiol produzido por um folículo dominante o qual acaba por estimular o pico de ovulatório de LH (GUAQUETÁ, 2009). O ciclo estral está conformado por quatro etapas que seguem diferenciações ováricas e hormonais que interagem para que a fêmea possa apresentar o ciclo dentro da normalidade. A primeira etapa é o proestro seguido pelo estro, metaestro e terminando no diestro (SAUMANDE, 2005) Proestro Nesta etapa inicial ocorre a diminuição da atividade da progesterona secretada pelo corpo lúteo devido a sua luteólise. Os baixos níveis de P4 propiciam o crescimento de um folículo pré-ovulatório, tendo em vista que inúmeros folículos antrais são recrutados porém apenas um será o folículo dominante e chegará até o momento da ovulação ( ALBUQUERQUE, 2004) Este folículo dominante se diferencia dos demais, neste momento, pois passa a ser responsivo às gonadotrofinas (FSH e LH) incrementando a síntese de estrógenos que propiciam o crescimento do diâmetro folicular. Estes estrógenos são produzidos de maneira ordenada pelas células que compõe a parede do folículo. Na camada mais externa estão as células da teca que se ligam ao LH e acabam por produzir andrógenos que são sintetizados pelas células da camada interna, denominadas células da granulosa, em estrógeno (SAUMANDE, 2005). Esta etapa tem uma duração de, em média, 3 dias (ALBUQUERQUE, 2004) Estro

23 22 A fase do estro é caracterizada pelos sinais evidentes de cio propiciados pelos elevados níveis séricos de estrógeno. Esta contínua produção de estrógeno pelo folículo ovulatório gera um pico na liberação de FSH e LH que acabam por estimular o folículo a incrementar a produção deste mesmo hormônio, a esse fenômeno é dado o nome de feed-back positivo. Esta contínua síntese hormonal é a responsável pelas contrações uterinas, que visam facilitar o encontro espermatozóide-oócito e também pela elevada produção de muco na vagina, cérvix e útero (SAUMANDE, 2005). A combinação de aumento de estrógeno e diminuição de progesterona induzem a um pico de LH, denominado pico ovulatório que, na presença de um folículo, incitará a ovulação em 24 horas (HAFEZ e HAFEZ, 2004) Metaestro O metaestro é a fase que se segue ao estro durante três a quatro dias. O pico de LH e FSH que já foram mencionados durante a fase de estro promovem o rompimento do folículo cerca de 30 horas após o animal aceitar a monta ou cerca de horas após o fim do estro proporcionando a liberação dos líquidos foliculares na cavidade abdominal e possibilitando a captação do folículo pelas fimbrias do ovário, fenômeno denominado ovulação (BALL, 2006). Após este evento fisiológico a parede do folículo ovulado é colapsada e a cavidade é preenchida por linfa e sangue provenientes dos capilares presentes em grande quantidade no folículo ovulatório (BERTAN, 2006). As células da teca e da granulosa do folículo colapsado o sensibilizam a ação do LH para que inicie a formação do corpo lúteo que irá produzir progesterona. Nesta etapa este hormônio prepara o útero para uma possível gestação e inibe o desencadeamento do um novo ciclo (SAUMANDE, 2005) Diestro

24 23 Esta é a fase mais prolongada do ciclo estral regulada pela ação da progesterona e presença do corpo lúteo (SAUMANDE, 2005) portanto esta é a única etapa responsiva a prostaglandina (PGF2ɑ)(FERREIRA, 2010). Os dias 16 a 18 são os mais críticos para a manutenção dos altos níveis séricos de progesterona pois se o animal não estiver gestante a ação da PGF2 ɑ causará a lise do corpo lúteo. Em, cerca de, 3 dias a ação pulsátil da PGF2ɑ levará a uma diminuição dos níveis séricos de progesterona possibilitando que o FSH estimule o crescimento de um novo folículo (SAUMANDE, 2005). O mecanismo de ação da prostaglandina sobre o corpo lúteo é bastante complexo. De maneira inicial foi constatado que o número de receptores para PGF2ɑ no corpo lúteo aumenta ao longo da fase luteal, por isso pode-se afirmar que existe uma capacidade luteolítica reduzida no início nesta fase quando realizada uma aplicação exógena. A ação luteolítica pode ser explicada pela ligação da PGF2ɑ em receptores específicos esteroidogênicos da célula luteal. Esta ligação estimula a ação de PKC interrompendo a produção de progesterona em diversas frentes: diminuindo a captação e o transporte de colesterol para o citoplasma e para a mitocôndria, mediando a ação antiesteroidogênica da PGF2ɑ nos LLC, promovendo uma down regulation nos receptores de LH e possivelmente aumentando a expressão e ativação das proteínas envolvidas no processo de apoptose (BERTAN, 2006). 2.3 HORMÔNIOS DA REPRODUÇÃO Hormônios são substâncias químicas sintetizadas e secretadas por órgãos, em uma porção do organismo, que são levadas pela corrente sanguínea ou linfática para outra parte do corpo onde regulam a atividade de orgãos-alvo específicos (ZANELLA, 2006). As ações hormonais clássicas podem ser definidas como inibição, regulação, e ativação de órgãos específicos. Entretanto órgãos como o útero e o hipotálamo atuam de maneira a não se encaixar nesta definição (HAFEZ e HAFEZ, 2004).

25 Hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) O GnRH é um decapeptídeo sintetizado por neurônios específicos localizados na região pré-óptica hipotalâmica (BRANDÃO, 2012) e liberado em padrão contínuo no macho e pulsátil na fêmea, sendo que sua amplitude e frequência variam de acordo com a fase do ciclo reprodutivo (ZANELLA, 2006). Este hormônio possui função central na reprodução de bovinos, uma vez que quando liberado é carreado até a hipófise através de um sistema peculiar denominado sistema porta-hipotalâmico-hipofisário. Como resposta a ativação neural imposta pela atividade pulsátil do GnRH são liberados LH e FSH (BRANDÃO, 2012) A liberação de GnRH é mediada por vários fatores intrínsecos e externos sendo que os mais relevantes, principalmente no pós parto, são: condição nutricional e a amamentação. Outro fator de regulação é a ação dos estrógenos ovarianos que, em casos, de anestro pós-parto funcionam como efeito depressor dos pulsos e em casos de animais ciclando funcionam como indutor do aumento da frequência pulsátil (CHAPPELL, 2000) Hormônio folículo estimulante (FSH) e Hormônio luteinizante (LH) Os hormônios FSH e LH são produzidos de maneira constante porém são liberados de maneiras peculiares. O FSH é liberado em padrão tônico e o LH é liberado em padrão pulsátil (BRANDÃO, 2012). Ainda existe uma outra maneira de liberação denominada de onda pré-ovulatória que é responsável pela ovulação e persiste, cerca de, 6 a 12 horas. Esta onda é estimulada pelo aumento da concentração de estrógeno no período de 3 dias antes da ovulação (HAFEZ e HAFEZ, 2004).

26 25 A principal função destes dois hormônios é a de estimular o crescimento e a maturação dos folículos ovarianos sendo que o LH será o responsável, após a ovulação, pela formação do corpo lúteo (BRANDÃO, 2012) Estrógeno (E2) O 17ß-estradiol é o mais importante estrógeno produzido, sintetizado pelas células da granulosa e da teca interna dos folículos sob ação sinérgica do FSH e LH (BRANDÃO, 2012). Este estrógeno atua primariamente no desenvolvimento sexual promovendo desenvolvimento glandular através de um maior fluxo de sangue local (HAFEZ, 2004). Também possui outros centros de ação como o sistema nervoso central onde promove os sinais de estro na fêmea, no útero aumentando a frequência e amplitude das contrações e potencializando o efeito da ocitocina e da PGF2ɑ, nas glândulas mamárias promovendo seu desenvolvimento, no hipotálamo exercendo o feed back negativo para liberação de FSH e LH além de atuar de maneira anabólica sobre o crescimento e o ganho de peso (ZANELLA, 2006). Além de todas as funções já citadas Trevisol (2013) afirma sobre a participação do estradiol na luteólise de duas maneiras. A primeira se dá por um estímulo hipotalâmico que aumenta a frequência de pulsos de ocitocina (OT) e a segunda por estímulos endometriais que promoverão a expressão para receptores de OT no estradiol Progesterona (P4) A progesterona é o progestágeno natural de maior prevalência sendo secretada pelo corpo lúteo através das células luteínicas, pela placenta e pelas glândulas adrenais, sendo que a produção mais importante se dá pelo CL (HAFEZ, 2004).

27 26 Este hormônio é imprescindível para regulação do funcionamento do sistema reprodutor feminino (ZANELLA, 2006), além de ser totalmente responsável pela manutenção da gestação uma vez que estimula a secreção das glândulas endometriais, inibe as contrações do miométrio, estimula o desenvolvimento dos alvéolos das glândulas mamárias, inibe o cio e, por fim, impossibilita o pico ovulatório de LH (BRANDÃO, 2012). Outro mecanismo, desencadeado pela progesterona, de suma importância para manutenção da gestação é a ação imunossupressora que impede que o sistema imunológico da mãe rejeite o feto por considerar seus antígenos de origem paterna não-próprios (HAFEZ, 2004) Prostaglandinas (PGE's) As prostaglandinas são importantes mediadores reprodutivos na fêmea bovina, dentre suas principais funções estão a luteólise, o reconhecimento maternofetal e a ovulação. O endométrio produz PGE's e PGF2ɑ durante todo o ciclo estral porém com um padrão de liberação específico (TREVISOL, 2013). A PGF2ɑ possui ação luteolítica em boa parte das espécies de mamíferos. Sua ação pode ser descrita de maneira que ao entrar em contato com o sistema arterial ovariano produz vasoconstrição que leva a luteólise (CUNNINGHAM, 2004). Outro mecanismo de ação da PGF2ɑ se dá a partir da sua ligação com os receptores de membrana nas células luteais esteróidogênicas estimulando a atividade da proteína quinase C que interrompe a produção de progesterona de diversas formas. Dentre elas: diminuindo a captação e o transporte de colesterol para o citoplasma e para a mitocôndria, promovendo retroalimentação negativa dos receptores de LH e, possivelmente, atuando sobre a ativação das proteínas envolvidas nos processos de apoptose (BERTAN, 2006) Ocitocina (OT)

28 27 A ocitocina é sintetizada no núcleo supraótico do hipotálamo sendo armazenada na neurohipófise até o momento de ser liberada para corrente sanguínea. Outro sítio de produção é o corpo lúteo. Durante o período receptivo da fêmea este hormônio promove contrações na musculatura lisa do útero e dos ovidutos favorecendo assim o encontro dos gametas (HAFEZ, 2004). Além da ação desempenhada durante o estro a ocitocina também possui função de contração das células mioepiteliais do alvéolo da glândula mamária promovendo a ejeção do leite (ZANELLA, 2006). Durante o fenômeno da luteólise a ocitocina também desempenha função. Nesta situação, induzidas pela ação do estrógeno, as células endometriais passam a formar receptores de ocitocina que, quando ativados, resultam na liberação de PGF2ɑ (BRANDÃO, 2012), desta maneira a ocitocina e a PGF2ɑ formam um fenômeno denominado retroalimentação positiva onde a ação de um estimula a liberação do outro e vice-versa (TREVISOL, 2013).

29 28 3.INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM TEMPO FIXO (IATF) Com a perspectiva de melhorar produtividade do rebanho inúmeras biotécnicas são destacadas, entre elas a inseminação artificial em tempo fixo (IATF) que visa inseminar animais em tempo pré-determinado e, com isso, facilitar o manejo, reduzir a mão de obra e concentrar as atividades principalmente no gado de corte em que a estação de monta (EM) é a principal estratégia de manejo reprodutivo (CUNHA, 2013). A manipulação estratégica das gestações e, consequentemente, dos partos é uma importante ferramenta do manejo reprodutivo de bovinos. Esta estratégia permite programar os nascimentos em momentos mais favoráveis do ano determinando maiores pesos ao nascer, maiores pesos à desmama e maiores chances de re-concepção principalmente em primíparas (SÁ FILHO, 2013). Quando se pretende avaliar a eficiência de um sistema de produção de bovinos de corte avalia-se, principalmente, as taxas de nascimento e desmame bem como o intervalo entre partos (IEP) das matrizes. Para tanto os valores ideais para estas taxas, viabilizando economicamente a atividade, giram em torno de 85 a 90% para taxa de prenhez e IEP não maior que 14 meses sendo que o ideal é de 12 meses. Para todos estes efeitos a IATF possui uma ação positiva que auxilia na busca e manutenção destes índices (LIMA, 2005). Tendo em vista esta avaliação dos índices zootécnicos alcançados em cada propriedade, a IATF também serve como estratégia para diminuir o intervalo entre partos e aumentar a taxa de primíparas prenhes no início da estação de monta (CUNHA, 2013). Considerando os aspectos mercadológicos a IATF permite aos pecuaristas aproveitar as diferentes oportunidades de mercado pela diferenciação dos bezerros produzidos, pelo aumento nas taxas de natalidade, com os ganhos genéticos e de homogeneidade de lotes, uma vez que a qualidade superior dos touros utilizados já é comprovada (MADUREIRA, 2013).

30 29 Sempre antes do início de um protocolo de IATF deve-se tomar total atenção as demais condições sanitárias, nutricionais e de manejo uma vez que todos estes fenômenos podem interferir nos resultados a serem obtidos (BARUSELLI, 2005). O uso desta biotécnica tem aumentado expressivamente no Brasil por via das facilidades de implementação dos programas de inseminação artificial em tempo fixo no campo e pelos resultados cada vez mais compensadores que estão sendo alcançados (ARAUJO, 2009). 3.1 PROTOCOLOS HORMONAIS Considerando todos estes fatores diversos protocolos hormonais foram desenvolvidos com a finalidade de controlar o crescimento folicular e induzir a ovulação, desta forma permitindo a sincronização do estro e da ovulação, possibilitando o emprego da IATF e eliminando a necessidade de visualização de cios (BÓ, 2003). Esses diferentes métodos variam desde a aplicação isolada de derivados de estrógenos, como por exemplo o valerato de estradiol que inibe a síntese de FSH e estimula a liberação de LH pela hipófise, até o benzoato de estradiol (BÓ, 1994) Prostaglandina (PGF2ɑ) A prostaglandina F2ɑ é um importante agente natural e o principal responsável pelo encerramento da fase luteínica, desta maneira realizando a regressão do corpo lúteo. Por este motivo serve como agente abortivo em casos necessários (BIERNASKI, 2011). A PGF2ɑ é o fármaco mais utilizado para controle do cio em vacas, entretanto o cio pós tratamento pode ser distribuído ao longo de 6 dias e pode ser influenciado

31 30 pela responsividade do corpo lúteo atuante e também da fase em que se encontra o folículo dominante (BARUSELLI, 2004). Em um programa de duas aplicações de PGF2ɑ com intervalo de dias, onde espera-se que todos os animais tenham um corpo lúteo funcional neste período, foi observada uma maior taxa de concepção após 14 dias, tendo em vista que após este intervalo é mais provável que se encontre um folículo dominante (MAPLETOFT, 2005). Corroborando com esta afirmação, Galina (1996), em seu estudo, confirmou que mesmo após confirmação de presença de CL a resposta estral para Bos indicus é de apenas 60%, frente aos 90% encontrado em Bos taurus. Particularidades fisiológicas somadas a dificuldade de detecção de cio em animais zebuínos explicam esta baixa eficácia. Outra evidência é de que fêmeas tratadas com PGF2ɑ em um diestro avançado tem uma resposta de cio maior e taxas de concepção mais elevadas que animais tratados durante o diestro inicial ou médio (MAPLETOFT, 2005). Os análogos sintéticos ( Cloprostenol, Dinoprost e outros) tem se mostrado mais potentes quando comparados com PG's naturais e funcionam como agentes luteolíticos em vacas com corpo lúteo funcional determinando prontamente a queda dos níveis de estrógeno, desenvolvimento folicular e pico de LH em 3 dias. A atividade destas substâncias é demonstrada no 5 dia do ciclo estral e estende-se até o 12 dia mantendo um platô até o 17 dia, quando começa a regressão espontânea pela ação da PGF2ɑ (BALL, 2006) Progestágenos As progestinas alteram a função ovariana suprimindo o estro e impedindo a ovulação. A progesterona, por sua vez reduz a frequência de pulsos de LH, o qual suprime o crescimento do folículo dominante de acordo com a dose utilizada. Outra substância deste mesmo grupo é o Acetato de melengestrol (MGA) que é menos efetivo que a progesterona endógena para inibir o LH (MAPLETOFT, 2005).

32 31 Devido as variedades e doses de progestinas normalmente serem menos eficientes que a progesterona endógena, secretada por um CL, na supressão do LH os pulsos do mesmo LH podem desencadear na formação de folículos persistentes que contem oócitos envelhecidos que podem levar a baixa taxa de fertilidade (SAVIO, 1993) Progesterona (P4) e Estradiol (E2) Os progestágenos são sincronizadores de cio sendo utilizados para prolongar a vida útil do corpo lúteo, porém, quando associado, ao valerato de estradiol permite que os animais apresentem regressão do CL e surgimento de estro em um momento pré-determinado (BIERNASKI, 2011). Nos tratamentos com progesterona ou progestágenos geralmente são empregados acetato de melengestrol pela via oral, a progesterona e a medroxiprogesterona na forma de dispositivos intra vaginais (CIDR-B ) e o nergestomet (CRESTAR ) em implantes auriculares (MADUREIRA, 2004). De maneira geral estes análogos se ligam aos receptores de progesterona, porém não atingem uma resposta biológica idêntica (STANCKZYC, 2003). Outro benefício do estradiol em protocolos breves com progestina é o estímulo da regressão folicular, seguida do surgimento de uma nova onda folicular. Este mecanismo pressupõe a supressão da concentração de FSH (MAPLETOFT, 2005). O protocolo tradicional de utilização de dispositivos intra vaginais impregnados com progesterona, preconiza que o implante permaneça na cavidade vaginal por um período de 8 dias. No primeiro dia de protocolo é aconselhada a aplicação de 2 mg de benzoato de estradiol (BE), visando a sincronização do crescimento folicular. No 9 dia do protocolo a aplicação de 1 mg de BE serve como auxiliar no desencadeamento da ovulação. Após estas etapas a inseminação artificial deve ser realizada, em torno de, 50 horas após a retirada do dispositivo (BÓ, 2004).

33 32 Esse protocolo objetiva sincronizar a emergência da onda folicular, terminar a fase luteínica de forma uniforme e induzir a ovulação sincronizada do folículo dominante ao final do tratamento hormonal (MENGUETTI, 2009) GnRH A utilização do GnRH em protocolos de sincronização de estro induz a emergência de uma nova onda folicular e também a ovulação. Quando associada a prostaglandina F2ɑ sete dias após o tratamento com GnRH o estro induzido não apresenta fertilidade reduzida. Esta prerrogativa tornou-se base para o desenvolvimento de outros protocolos de controle da ovulação (BARUSELLI, 2012). O mecanismo pelo qual o GnRH induz a emergência de uma nova onda folicular é baseado na ovulação do folículo dominante (FD). Portanto sua eficiência está diretamente ligada a presença de um FD com capacidade ovulatória no momento do tratamento. Isso significa que, em Bos indicus, este FD precisa ter pelo menos 8,5 mm de diâmetro (GIMENEZ, 2008). De qualquer maneira a probabilidade de ovulação devido a um tratamento de GnRH é mais baixa em animais em anestro do que em animais cíclicos, uma vez que após adquirirem capacidade ovulatória os folículos rapidamente se tornam atrésicos (WILTBANK, 2002). O primeiro programa de sincronização da ovulação, designado protocolo Ovsynch, desenvolvido por Pursley et. al (1995), consiste em uma aplicação de GnRH seguido por uma aplicação de PGF2ɑ sete dias mais tarde e uma nova aplicação de GnRH após 48 horas. A inseminação deve ser realizada entre 0 e 24 horas, preferencialmente no intervalo de horas (WILTBANK, 2011). Os protocolos de inseminação artificial em tempo fixo baseados em GnRH tem sido associados com resultados inconsistentes em bovinos de corte. Isso se deve, principalmente, as falhas na indução da emergência de uma nova onda folicular no momento do primeiro tratamento de GnRH (BARUSELLI, 2012).

34 33 Somando-se a essa informação Baruselli (2002) afirma que o protocolo Ovsynch apresenta baixa eficiência quando aplicado em animais zebuínos lactantes. Isso se deve as condições de pastejo tropical em que esses animais geralmente são criados e que frequentemente podem ser associados a altas taxas de anestro pós parto Gonadotropinas exógenas A gonadotrofina coriônica equina (ecg) ou gonadotropina do soro de égua gestante (PMSG) é um complexo glicoproteico de alto peso molecular produzido nos cálices endometriais durante a prenhez na égua, notadamente entre os dias de gestação. Em comparação com os outros hormônios gonadotróficos o ecg possui a singularidade de possuir atividade folículo estimulante (FSH) e luteinizante (LH) (ALEIXO, 1995). O fato de esta glicoproteína ser produzida pela égua gestante faz com que seja uma potencial desencadeadora de reação imunológica na fêmea bovina após repetidas aplicações. (DRION, 2001). Uma alternativa perante a este problema é a utilização do manejo de retirada do bezerro, pois o intervalo entre as mamadas estimula a frequência de pulsos de LH que leva ao crescimento folicular e ovulação em vacas no período de 30 dias pós-parto (BARUSELLI, 2012). Neste sentido a retirada do bezerro e a aplicação de ecg tem se mostrado eficientes nos protocolos de IATF não havendo efeito aditivo quando somadas as técnicas (PENTEADO, 2004). O tratamento com gonadotropina coriônica equina tem se mostrado uma eficiente alternativa de incremento na fase final do crescimento folicular, pois além de estimular o folículo promove a luteólise e a ovulação mesmo em animais lactantes ou subnutridos no início do protocolo. (BÓ, 2007). Desta maneira, tanto em animais de corte quanto em animais leiteiros com um padrão pulsátil de LH insuficiente para dar suporte aos estágios finais de crescimento folicular o tratamento com ecg pode produzir uma resposta ovulatória

35 34 satisfatória no protocolo de sincronização levando a posterior prenhez (BARUSELLI, 2012) Programas combinados Sincronização com Nergestomet e Valerato de estradiol Os implantes contendo progestágenos, disponíveis atualmente, apresentam 3 mg de Nergestomet (Crestar, Intervet) e devem ser colocados de maneira subcutânea na orelha dos animais por um período de nove ou dez dias. Neste mesmo momento é aplicada por via intra muscular (IM) uma solução contendo 5 mg de Valerato de estradiol (VE). A exemplo de como ocorre nos demais protocolos, o objetivo da aplicação do VE no início do protocolo é causar a luteólise e induzir o desencadeamento de uma nova onda folicular, de três a oito dias mais tarde (BÓ, 2004). BÓ (2004) afirma que os resultados obtidos com a utilização do protocolo em Bos indicus demonstrou uma taxa de animais em cio no momento da inseminação artificial superior a 90%, porém a taxa de prenhez é muito variável. Em animais sem cria ao pé os resultados são satisfatórios ao contrário do observado em animais com cria ao pé e novilhas Sincronização com Progesterona, Benzoato de Estradiol e Prostaglandina F2ɑ. Neste protocolo que utiliza implantes intra vaginais, usualmente encontrados no mercado contendo progesterona natural, espera-se controlar a onda folicular mantendo-se altos níveis de progesterona e impedindo o pico de LH. Neste caso o implante permanece na cavidade vaginal do animal por sete a doze dias, simulando

36 35 a fase luteínica do ciclo estral. A regressão do CL é obtida quando se aplica estradiol no início do protocolo ou prostaglandina no momento da retirada do implante (BARUSELLI, 2002). A associação de progesterona e estrógeno provoca atresia do folículo dominante e provoca a emergência de uma nova onda folicular. Esta associação também gera luteólise pois aumenta substancialmente os níveis de PGF2ɑ (BÓ, 1994) Sincronização com GnRH e Prostaglandina F2ɑ Este protocolo foi descrito em 1995 por Pursley sob o nome de Ovsynch. É baseado na aplicação sequencial e intervalada de GnRH, PGF2ɑ e novamente GnRH. Após sete dias da primeira aplicação de GnRH é realizada a administração de PGF2ɑ e após 48 horas uma nova aplicação de GnRH (BÓ, 2004). No início do protocolo busca-se a ovulação do ou então a luteinização do folículo dominante que sofrerá atresia mais tarde pelo efeito da aplicação de PGF2ɑ tornando a ovulação sincronizada com a última aplicação de GnRH (BIERNASKI, 2011). Os índices de prenhez observados na aplicação deste protocolo demonstram que sua responsividade é boa apenas em animais com alta taxa de ciclicidade condição esta que normalmente não é encontrada em animais sob regime de produção tropical (BÓ, 2004). A tabela a seguir demonstra os mais variados métodos de controle farmacológico do ciclo estral com seus respectivos modos de ação

37 36 Tabela 1: Controle farmacológico do ciclo estral, hormônios utilizados e ação farmacológica Fonte: MAGALHÃES, 2013

38 37 4. ÍNDICES DE PRENHEZ Apesar da importância da fertilidade como avaliador de desempenho zootécnico, os dados do rebanho bovino Brasileiro demonstram baixa eficiência reprodutiva, com taxas de prenhez que beiram os 60%. Tal condição influencia diretamente no custo de produção, pois os juros do capital imobilizado nas vacas que não conceberam e que ocuparam a terra tem de ser diluídos pelos bezerros produzidos (ANUALPEC, 2004). Dentre as causas de fertilidade baixa na bovinocultura de corte destacam-se as perdas embrionárias de até 40% que ocorrem, de maneira geral, no período crítico de reconhecimento da prenhez. Outro índice a ser observado e que também apresenta resultados insatisfatórios no rabanho nacional é a taxa de desfrute que apresenta valores próximos aos 21% (MACHADO, 2008). Quanto aos resultados observados na aplicação da IATF os resultados variam entre 25 e 67% de acordo com inúmeros fatores de potencial interferência nas taxas observadas em cada programa (BARUSELLI, 2004). Estes valores também são compatíveis com os encontrados por Borges et. al (2008) que apresenta taxas de prenhez entre 25 e 70% no rebanho nacional. No gráfico demonstrado a seguir é possível observar a comparação das taxas de prenhez obtidas em relação aos dias da estação de monta, estabelecendo uma relação entre a aplicação da técnica de IATF com outros manejos reprodutivos convencionais

39 38 Figura 2: Taxa de prenhez acumulada em função dos dias da estação de monta (EM) Fonte: BARUSELLI, 2005 Em cada possibilidade de manejo reprodutivo a ser aplicado nas propriedades de produção de animais para corte existe um custo que deve ser considerado antes da tomada de decisão. Na IATF este custo diz respeito a aquisição dos hormônios, na IA convencional a mão de obra e a estrutura necessária e na monta natural (MN) o valor de aquisição dos touros. É imprescindível considerar todas estas variáveis para não haver perdas de recursos que resultariam em um impacto negativo na eficiência econômica do sistema de produção (AMARAL, 2003). Segundo Silva et. al (2007), na comparação de IA e IATF os resultados mostram que 100% (64/64) das fêmeas submetidas a IATF foram inseminadas enquanto no grupo submetido a detecção de cio para posterior IA foram 78,33% (47/60). O anestro e as falhas na detecção de cio são as principais prováveis causas das 22% (13/60) não inseminadas. As taxas de prenhez alcançadas não diferiram estatisticamente sendo de 62,5% para IATF e 55% para IA com 78% dos animais inseminados.

40 39 A taxa de retorno ao cio foi de 29,69% na IATF e 14,89% na IA, fazendo com que os animais que foram inseminados na IATF tivessem a oportunidade de apresentar cio dentro da estação reprodutiva pré determinada em 35 dias. Esta concentração de retorno ao estro facilita a visualização e, consequentemente, aumenta as taxas de sucesso na IA (SILVA et. al., 2007). Outro fator que interfere na eficiência reprodutiva do rebanho, conforme já citado, é o vínculo entre a vaca e o bezerro que gera um atraso no retorno a ciclicidade pós parto. Durante a amamentação a sucção realizada pelo bezerro tem efeito capaz de aumentar a sensibilidade do centro gerador de pulsos de GnRH ao efeito de retroalimentação negativa do 17 β-estradiol ovariano. Esses fenômenos causam a supressão da liberação de pulsos de LH, falhas no desenvolvimento do folículo dominante e geram o anestro pós parto (VASCONCELOS, 2009). De acordo com os resultados obtidos foi possível afirmar que a remoção dos bezerros antes do primeiro estímulo ovulatório aumentou o diâmetro folicular e a taxa de ovulação em vacas em anestro. Também foi possível concluir que a taxa de prenhez após o protocolo foi maior quando aplicado o manejo de retirada dos bezerros por 48 horas duas vezes, previamente aos estímulos ovulatórios do protocolo, sendo que a retirada dos bezerros parece ser o maior estímulo benéfico para o resultado deste estudo.(vasconcelos, 2009). Outro fator de grande interferência nos resultados de IATF é o estresse causado pelo manejo dos animais no momento de aplicação do programa. Um manejo inadequado pode causar perdas embrionárias e também retardar o momento da ovulação, comprometendo totalmente os resultados a serem obtidos na utilização da inseminação artificial em tempo fixo (COSTA E SILVA, 2005).

41 40 5. RESSINCRONIZAÇÃO A eficiência reprodutiva de um rebanho pode ser incrementada quando as fêmeas são capazes de entrar no início da estação reprodutiva, quando é possível obter altas taxas de prenhez já no primeiro serviço e na detecção e reinseminação dos animais vazios de maneira imediata. Com objetivo de manter ou aumentar a performance reprodutiva de um rebanho as fêmeas que não se apresentaram prenhas no primeiro serviço devem ser identificadas, ressincronizadas e reinseminadas o mais cedo possível (SETVENSON, 2003). As taxas de prenhez na IATF, já citadas, permitem afirmar que entre 30 e 75% das fêmeas não estarão gravídicas no primeiro ciclo de Inseminação artificial. Isto se deve a inúmeros fatores, dentre eles as características fisiológicas particulares de cada animal, o manejo da fazenda, o escore de condição corporal o tempo de pósparto ou período puerperal e os tratamentos hormonais (MARQUES, 2015). A maioria das fêmeas que não conceberam na primeira etapa de IATF irão apresentar cio dentro de 15 a 25 dias sendo necessário um extenso trabalho para aumentar o número de fêmeas gestantes de inseminação artificial. Portanto a utilização da ultrassonografia consiste em uma técnica de diagnóstico precoce de prenhez e de detecção de fêmeas não gestantes (LILES, 2008). Com o objetivo de encurtar ainda mais o intervalo entre diagnóstico e reinseminação, a ressincronização pode ser iniciada antes mesmo da realização do diagnóstico de gestação sem causar quaisquer danos aqueles animais que já estão prenhes e gerando taxas de prenhez aceitáveis (FREITAS, 2007). No intuito de proporcionar uma segunda oportunidade aquelas vacas que não conceberam na primeira inseminação artificial em tempo fixo é que se desenvolveu o conceito e, a partir daí, os estudos sobre a ressincronização pós IATF (FREITAS, 2007). Além de proporcionar esta segunda oportunidade as fêmeas não gestantes a ressincronização também é uma estratégia que serve de alternativa no caso de número insuficiente de touros para repasse após o primeiro ciclo de inseminação artificial (COLAZO, 2007).

42 41 Um dos protocolos mais utilizados para ressincronização associada a retirada temporária dos bezerros em animais Bos indicus está descrito na imagem a seguir (MARQUES, 2015). FIGURA 3: Protocolo utilizado para ressincronização associada ao desmame temporário Fonte: MARQUES, Freitas (2007), descreve o protocolo de ressincronização da seguinte maneira: a reinserção do dispositivo intra vaginal de progesterona deve ser feita no dia 14 ou 15 pós primeira inseminação por um período de 8 dias. A associação com o BE deve ser realizada no dia do implante e um dia após a sua retirada pois, desta maneira, é possível sincronizar uma onda de crescimento folicular e evitar um problema recorrente que é a formação de um folículo dominante persistente (FREITAS, 2007).

43 42 6. ÍNDICES DE PRENHEZ NA RESSINCRONIZAÇÃO Se tratando de eficiência reprodutiva conseguir introduzir o maior número de animais e de categorias em um programa de IATF ou de ressincronização é essencial para obter resultados satisfatórios. Neste sentido Oliveira et. al (2015) delineou um estudo onde compara as taxas de prenhez obtidas de fêmeas Nelore multíparas e nulíparas submetidas a um protocolo precoce de ressincronização para segunda inseminação artificial. Para realização da primeira inseminação foi utilizado o protocolo descrito pela figura a seguir. FIGURA 4: Protocolo utilizado para primeira inseminação artificial em tempo fixo Fonte: OLIVEIRA, A segunda inseminação artificial foi realizada no dia 34, 48 horas após a retirada do implante conforme exemplificado na figura a seguir.

44 43 FIGURA 5: Protocolo utilizado na segunda inseminação artificial em tempo fixo Fonte: OLIVEIRA, Os resultados obtidos demonstraram que nenhuma das variáveis estudadas apresentou efeito sobre as taxas de prenhez para primeira e segunda inseminação. Para a categoria das nulíparas o resultado obtido foi de 63,6%(211/308) e 55,7%(54/97) para primeira e segunda IA respectivamente. Já para a categoria das multíparas o resultado foi de 54,1% (68/142) e 63,5% (47/74) para primeira e segunda IA. Os resultados finais de prenhez foram de 86% para nulíparas e 80,9% para multíparas, permitindo afirmar que não existiu diferença estatística de prenhez entre as categorias. Demonstrando as diferentes capacidades reprodutivas encontradas em cada categoria de um rebanho Guerreiro (2015) realizou uma pesquisa sobre a eficiência reprodutiva em primíparas Nelore que pariram aos 24 meses de idade submetidas á ressincronização após a IATF. Neste estudo foram utilizadas 115 fêmeas Nelore com período de pós-parto variável entre 30 e 60 dias. Para o presente estudo foi utilizado o seguinte protocolo hormonal para inseminação artificial em tempo fixo.

45 44 FIGURA 6: Protocolo hormonal para inseminação artificial em tempo fixo Fonte: GUERREIRO, 2015 Prosseguindo com o manejo de ressincronização foi utilizado seguinte protocolo hormonal e de diagnóstico de gestação FIGURA 7: Protocolo hormonal para segunda inseminação artificial em tempo fixo após ressincronização Fonte: GUERREIRO, 2015 Os resultados obtidos foram de 53% e 38,9% para primeira e segunda IA, sendo que o índice cumulativo de prenhez foi de 71,3%.

46 45 Além da categoria animal a ser trabalhada existem, obviamente, outros fatores a serem levados em consideração para estabelecer a viabilidade e os resultados da ressincronização pós IATF. A exemplo de como ocorre na primeira sincronização da ovulação, o protocolo hormonal utilizado pode interferir nos resultados a serem alcançados. Neste sentido Doroteu et. al (2014) avaliaram a eficiência da utilização do ecg na ressincronização de vacas Nelore multíparas com intervalo de pós-parto de 35 a 75 dias. Para tanto foram utilizadas 449 fêmeas remanescentes de um programa inicial com 775 fêmeas submetidas a IATF. Estas 449 fêmeas foram divididas em 3 grupos homogêneos sendo tratadas com o mesmo protocolo que diferia apenas quanto a dose de ecg (0, 200 ou 300 UI). O objetivo foi avaliar o possível efeito da dose de ecg utilizada e sua interação com a presença ou ausência de estro, presença ou ausência de corpo lúteo e a taxa de prenhez. Para tanto os animais foram avaliados por via ultrassonográfica quanto a presença de estruturas luteais antes da primeira IATF e previamente a ressincronização. No dia 0 os animais receberam um implante intravaginal e uma aplicação intra muscular de BE. No dia 8 os implantes foram retirados e foram aplicados ECP, PGF e as dosagens de ECG pré determinadas para cada grupo. A inseminação artificial foi realizada 48 horas após a retirada dos dispositivos. O diagnóstico gestacional foi realizado através de ultrassonografia transretal 30 dias depois e apresentou os seguintes resultados: 0UI-65,6%; 200UI-71,6%; 300 UI-82% para presença de cio no momento da inseminação. 0UI-75,2%; 200UI62,1%; 300UI-74,8% para índices de prenhez. No caso dos animais que não apresentaram cio no momento da IA os grupos 200UI e 300UI tiveram índices de prenhez satisfatórios (41,9% e 44,4% respectivamente) ao contrário do grupo 0UI que apresentou 19,6% de prenhez apenas. O resultado cumulativo de prenhez após 40 dias de estação de monta foram de 77,5%. Portanto este estudo permite afirmar que as doses de 200 UI e 300UI quando utilizadas em programas de ressincronização nos primeiros 30 dias após a IATF não apresentam variação estatística significativa para o índice de prenhez.

47 46 CAPÍTULO II: RELATÓRIO DE ESTÁGIO

48 47 1. INTRODUÇÃO A cadeia de produção de proteína animal vem acompanhando nos últimos anos uma tendência e uma necessidade de produção de alimentos com maior eficiência e qualidade. Neste sentido a pecuária de corte sofre uma pressão mercadológica por produtividade e eficiência. Para atender a essas necessidades a presença do Médico Veterinário prestando os mais variados serviços juntamente ao produtor é imprescindível. Estes serviços envolvem todas as áreas direta e indiretamente ligadas a produção animal, podendo ser citados brevemente a assessoria e consultoria nos ramos administrativos, nutricionais, reprodutivos e sanitários, entre muitos outros. Neste sentido o estágio permite uma ampla visão sobre as mais diferentes aplicações possíveis do conhecimento adquirido no período de graduação em situações reais encontradas.

49 48 2. LOCAL DO ESTÁGIO O estágio curricular foi realizado na área de reprodução em bovinos de corte. A empresa concedente foi a Geraembryo Consultoria e Assessoria Pecuária situada no município de Cornélio Procópio PR. A empresa em questão iniciou os trabalhos em 1987 com tecnologia em embriões bovinos se tornando o primeiro laboratório particular do estado com essa finalidade. Mais tarde em 1999 se iniciaram os trabalhos em outras áreas da reprodução atendendo principalmente propriedades da região e do estado do Mato Grosso do Sul. O acompanhamento profissional foi realizado pelos três Médicos Veterinários e sócios da empresa Márcio de Oliveira Marques, Mário Ribeiro Júnior e Rubens César Pinto da Silva. E o acompanhamento acadêmico foi realizado pelo Médico Veterinário e professor orientador deste trabalho João Filipi Scheffer Pereira. O período de estágio foi dividido em duas etapas sendo a primeira do dia 01/02/2016 ao dia 01/04/2016 perfazendo um total de 336 horas e a segunda do dia 09/05/2016 ao dia 20/05/2016 que totalizou 80 horas. Quando somadas as etapas a carga horária total foi de 416 horas.

50 49 3. ATIVIDADES REALIZADAS Com o acompanhamento diário dos profissionais foi possível vivenciar todos os trabalhos prestados pela empresa nas mais diferentes áreas de atuação. A maior parte dos trabalhos desenvolvidos consiste em assessoria reprodutiva através da técnica de inseminação artificial em tempo fixo. Também foi possível acompanhar os trabalhos com coleta de oócitos para posterior fertilização in vitro, transferência de embriões, diagnósticos gestacionais via ultrassonografia transretal e exames andrológicos. Além dos trabalhos realizados a campo também foram acompanhados alguns trabalhos laboratoriais como análise de sêmen criopreservado e exame para diagnóstico de brucelose. A tabela a seguir demonstra todas as atividades realizadas durante o estágio curricular além de demostrar a carga horária individual para cada atividade. Tabela 2: Atividades realizadas durante o estágio curricular e suas respectivas cargas horárias 3.1 ANÁLISE DE SÊMEN

51 50 Com uma carga horaria total de 120 horas a análise de sêmen criopreservado foi uma das atividades desenvolvidas durante o estágio. Esta avaliação era realizada em todas as partidas de um touro que viria a ser utilizado na IATF ou então na produção embriões. Para tanto era utilizado um microscópio biológico binocular, uma placa aquecedora um descongelador de sêmen automático e demais materiais laboratoriais tais como pipetas, corante e eppendorfs. A análise seguia um procedimento padrão de descongelamento das doses de sêmen em banho maria a 35 C durante 20 segundos em caso de palheta fina e durante 30 segundos quando se tratava de palheta média. Logo após todo conteúdo era depositado em um eppendorf para facilitar a manipulação do conteúdo. A próxima etapa era confecção de uma lâmina que seria levada ao microscópio para determinação visual de motilidade e vigor. A concentração era determinada através de diluição do sêmen em água numa proporção de 20:1 que era levada à câmara de neubauer para contagem. Como última etapa era realizada a avaliação patológica que consistia em submeter o sêmen a um corante e determinar a percentagem de defeitos maiores e menores encontrados.

52 51 FIGURA 8: Equipamentos utilizados para análise laboratorial de sêmen criopreservado. 3.2 AVALIAÇÃO GINECOLÓGICA Uma das atividades de menor carga horária foi a avaliação ginecológica, somando 8 horas ou 1,92% do total. Este fato se deve a ênfase dada pelos profissionais ao trabalho de assessoria em pecuária de corte. Nesta oportunidade foram realizados 37 exames ultrassonográficos de maneira transretal em vacas da raça Holandesa da Fazenda Tabajara em Apucarana PR.

53 52 Este trabalho foi solicitado pelo proprietário pois os índices reprodutivos que vinham sendo obtidos estavam abaixo dos ideais. Neste sentido a realização do exame ginecológico permitiu delimitar a viabilidade de instauração de um programa de controle reprodutivo mais eficiente. Os baixos índices alcançados nessa propriedade podem ser explicados pelo fato de que o anestro em gado leiteiro é muito recorrente e pode ser explicado por diversos fatores. Dentre esses fatores o balanço energético entre manutenção do metabolismo basal e a alta produção de leite pode ser o principal. Portanto neste ponto se observa uma diferença significativa na busca por índices zootécnicos entre a pecuária leiteira e a pecuária de corte. 3.3 CONFECÇÃO DE PLANILHAS DE CONTROLE REPRODUTIVO Somando 8 horas a confecção de planilhas para o controle reprodutivo também foi uma das atividades realizadas. Nesta ocasião eram repassadas todas as informações coletadas a campo para um programa de gestão (Siga Maxi Corte MSD ). Esta atividade apresenta extrema importância no trabalho realizado pela empresa uma vez que organiza os dados obtidos na ocasião da implantação de programas reprodutivos de larga escala. Deste modo facilitando a detecção de falhas e também otimizando o trabalho dos profissionais.

54 53 FIGURA 9: Modelo de ficha de controle reprodutivo utilizada nas etapas 2 e 3 da IATF. 3.4 DIAGNÓSTICO DE BRUCELOSE E TUBERCULOSE As atividades ligadas ao diagnóstico de brucelose e tuberculose somaram 8 horas. Nesta oportunidade foram realizados 380 exames em animais que seriam transportados até o estado do Mato Grosso do Sul. A realização destes exames obedece a legislação vigente no caso de necessidade de transporte de animais por via rodoviária. O diagnóstico de brucelose foi realizado através da coleta de sangue da veia caudal com agulha e seringa descartáveis. Após o dessoramento as amostras foram equilibradas com o antígeno acidificado tamponado em temperatura ambiente. Prosseguindo foram colocados lado a lado 30 μl de soro e de antígeno na placa de vidro que foram misturados através de um misturador simples formando um círculo de aproximadamente 2 centímetros. Após 4 minutos agitando a placa com movimentos oscilatórios foi realizada a leitura dos resultados na caixa de leitura.

55 54 Seguindo, também, as especificações necessárias foram realizados os exames para tuberculose bovina nos mesmos animais. Esta prova foi realizada através da técnica de tuberculinização cervical simples, ou seja, aplicação intradérmica do antígeno proteico purificado aviário e bovino. Nesta ocasião foi aplicado 0,1 ml do antígeno na região cervical dos animais após demarcação por tricotomia. A leitura do resultado foi realizada 72 horas mais tarde através da aferição da espessura da dobra de pele utilizando um cutímetro apropriado. Nesta oportunidade todos os animais testados se apresentaram negativos para brucelose e tuberculose. FIGURA 10: Caixa de leitura para diagnóstico de brucelose.

56 DIAGNÓSTICO GESTACIONAL O diagnóstico gestacional contabilizou 120 horas e 3640 animais. O método de realização do exame era variável entre ultrassonografia transretal ou palpação retal de acordo com o tempo estimado de prenhez. Nos casos de prenhez acima de 60 dias era realizado através de palpação e nos casos de prenhez com menos de 60 dias era utilizada a ultrassonografia. Esse procedimento é rotineiro na empresa uma vez que é empregado em todas as fêmeas submetidas ao protocolo de IATF, visando descartar ou reinseminar as matrizes não gestantes. A decisão de descartar ou reinserir as fêmeas não gestantes em um programa de reprodução partia de uma decisão prévia que levava em consideração o objetivo do proprietário dos animais, o histórico reprodutivo, o manejo e a localidade da fazenda em questão. Quando o objetivo era iniciar um novo protocolo hormonal para então inseminar as fêmeas vazias o exame era realizado no intervalo entre 28 e 32 dias após a primeira inseminação. Neste mesmo manejo era iniciado o programa de ressincronização destas matrizes. Em apenas uma oportunidade foi realizado o manejo de reinserção do dispositivo intravaginal de progesterona em todos os animais inseminados sem levar em consideração o status reprodutivo. Nesta ocasião o implante intravaginal é inserido de maneira inespecífica 20 dias após a inseminação. No momento da retirada do implante (10 dias mais tarde) era realizado o diagnóstico gestacional e as fêmeas vazias prosseguiam no protocolo. O objetivo desta estratégia é encurtar a estação de monta, uma vez que os animais não gestantes seriam reinseminados, pelo menos, 8 dias mais cedo que os animais submetidos ao processo de ressincronização convencional. Quando não se visava a realização da ressincronização o exame era agendado conforme a disponibilidade dos profissionais e realizado mais tardiamente uma vez que não mais poderia interferir nos índices reprodutivos a serem alcançados.

57 56 FIGURA 11: Imagem ultrassonográfica de uma gestação gemelar. 3.6 EXAME ANDROLÓGICO As atividades relacionadas ao exame andrológico somaram 32 horas e 340 animais. Todos estes exames foram realizados em uma única propriedade (Fazenda Modelo Brasilândia MS).

58 57 O objetivo da realização destes exames era selecionar os animais, que já haviam sido submetidos a avaliação zootécnica da raça, quanto a capacidade reprodutiva. Nesta ocasião foram descartados 15 touros. O exame era iniciado com a contenção adequada dos animais em um tronco de manejo. A primeira etapa correspondia ao exame clínico e medição da circunferência escrotal. Logo após era realizada a coleta de sêmen através do eletroejaculador. O conteúdo coletado era analisado previamente quanto a motilidade e vigor. Neste mesmo momento era preparada a lâmina para avaliação patológica. FIGURA 12: Lote de touros submetidos ao exame andrológico

59 IATF O acompanhamento das atividades ligadas a inseminação artificial em tempo fixo somaram 72 horas e um total de 1600 animais submetidos ao protocolo. A IATF era realizada em três manejos distintos sendo que os dois primeiros visavam a manipulação da ovulação através de aplicações hormonais e o terceiro compreendia a inseminação artificial. No primeiro manejo era aplicado um dispositivo intravaginal de progesterona (FERTILCARE MSD ) e aplicações intramusculares de benzoato de estradiol (FERTILCARE SINCRONIZAÇÃO MSD ) e PGF (CIOSIN MSD ). No segundo manejo era retirado o dispositivo intravaginal de progesterona e aplicados, por via intramuscular, cipionato de estradiol (E.C.P. - ZOETIS ), PGF (CIOSIN MSD ) e gonadotrofina sérica equina (FOLLIGON INTERVET ). A etapa final que compreendia a inseminação artificial era realizada no intervalo preciso de 48 horas após a retirada dos implantes intravaginais. TABELA 3: Hormônios utilizados em cada etapa e suas respectivas dosagens para controle da ovulação na inseminação artificial em tempo fixo

60 59 FIGURA 13: Equipamentos utilizados na inseminação artificial. FIGURA 14: Lote de novilhas oriundas de cruzamento industrial (Nelore x Angus) submetidas ao protocolo de IATF e inseminadas com sêmen de touro Brangus (MC Something Special 129W14).

61 60 FIGURA 15: Bezerros oriundos de vacas submetidas ao protocolo de IATF onde os pretos são fruto de inseminação artificial e os brancos de repasse com touro Nelore.

62 OPU A primeira atividade acompanhada durante o estágio foi a aspiração folicular guiada por ultrassonografia ou OPU, sigla em inglês para ovum pick up. Para esta atividade foi utilizada uma probe transvaginal específica conectada a um aparelho de ultrassonografia Aloka SSD 500. Nesta oportunidade foram obtidos oócitos de três doadoras Nelore PO oriundas da Fazenda Floresta Negra Araruna PR. Esta atividade se repetiu no dia 28/03/2016 na mesma propriedade porém desta vez com 5 doadoras. Os oócitos obtidos foram levados ao laboratório de FIV da Unicesumar Maringá PR onde eram submetidos ao processo de produção de embriões in vitro. Após oito dias os embriões obtidos foram transportados novamente à Fazenda Floresta Negra para que fossem inovulados em receptoras aptas a recebêlos. Na primeira ocasião foram obtidos 14 embriões viáveis e na segunda 24. A carga horária de acompanhamento desta atividade foi de 16 horas. FIGURA 16: Probe transvaginal e equipamento para sucção de oócitos conectado a uma agulha descartável

63 62 FIGURA 17: Bomba de sucção utilizada para obtenção de oócitos. FIGURA 18: Transportador de embriões utilizado no transporte dos embriões obtidos do laboratório até a fazenda.

64 TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES Somando 32 horas as atividades ligadas a transferência de embriões corresponderam a 7,69% do total de trabalhos acompanhados. O objetivo principal da transferência de embriões é aumentar o número de progênies de um animal zootecnicamente superior. Com esta finalidade é possível multiplicar o número de gestações de uma fêmea quando se retira os embriões no início de sua gestação e os deposita em outra fêmea para que termine a gestação. Para aumentar o número de embriões de uma fêmea em um mesmo ciclo estral é utilizada a técnica de superovulação que consiste em manipular o ciclo visando a ovulação de inúmeros oócitos. Isto é possível graças a aplicações sequenciais de FSH no período pré ovulatório. Após a superovulação é utilizado sêmen de touros que além da qualidade genética e zootécnica também possuem índices de prenhez desejáveis. De maneira diferente do que ocorre na inseminação artificial em tempo fixo, na TE são utilizadas duas inseminações com intervalo de 12 horas visando a ocorrência do maior número possível de embriões. Para que os resultados obtidos na TE sejam satisfatórios é necessário que, dentre vários outros fatores, seja dada uma atenção especial as condições das receptoras. Todos os fatores ligados a nutrição, sanidade e condições corporais adequadas devem ser respeitados. Durante o estágio essa atividade foi acompanhada em duas propriedades voltadas para melhoramento da raça Nelore. A primeira propriedade foi a Fazenda Flórida localizada no município de Nova América da Colina PR onde foram coletados embriões de 4 fêmeas que renderam 24 embriões transferidos para as doadoras no mesmo dia. Esses valores são compatíveis com os encontrados por VILELA (2011), onde foram obtidos, em média, 6 embriões por doadora. A segunda propriedade foi a Fazenda Santa Lúcia em Santa Mariana - PR que trabalha com melhoramento de Nelore visando a venda de touros e contratos com centrais de coleta de sêmen. Nesta propriedade foram coletados embriões de 5 doadoras que renderam 30 embriões viáveis.

65 64 Nas duas ocasiões os embriões foram transferidos em doadoras SRD, multíparas, com menos de 5 anos e, conforme já citado, com todo o esquema vacinal em dia. TABELA 4: Protocolo de sincronização de receptoras para transferência de embrião. TABELA 5: Protocolo de sincronização de doadoras para transferência de embrião.

66 65 FIGURA 19: Equipamentos utilizados para manipulação de embriões: estereomicroscópio, placa aquecedora, filtro para embriões, placas e pipeta. FIGURA 20: Equipamentos para coleta de embriões: filtro, sonda de Foley, meio de coleta, seringa e pinças.