Classificação, distribuição geográfica, ciclo biológico e importância econômica das principais espécies de carrapatos no Brasil

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1 1 Classificação, distribuição geográfica, ciclo biológico e importância econômica das principais espécies de carrapatos no Brasil Jaqueline Matias Wilson Werner Koller Marcos Valério Garcia

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3 Capítulo 1 Classificação, distribuição geográfica, ciclo biológico e importância econômica das principais espécies de carrapatos no Brasil 3 Atualmente são catalogadas 896 espécies de carrapatos no mundo, divididas em três famílias: Argasidae ou carrapatos moles (193 espécies); Ixodidae ou carrapatos duros (702 espécies) e, Nuttalliellidae, com somente uma espécie (GUGLIEL- MONE et al., 2010). A fauna brasileira ixodídica conhecida até o momento é composta por 65 espécies segundo Martins et al. (2013). As espécies de carrapatos que parasitam animais domésticos são as mais estudadas sendo a sua biologia, capacidade vetorial e formas de controle, alvos de inúmeras pesquisas no Brasil (VERONEZ, 2009). As espécies que apresentam maior incidência são: Rhipicephalus (Boophilus) microplus, R. sanguineus, Amblyomma cajennense, Dermacentor nitens, Argas miniatus e Ornithodoros brasiliensis. No Brasil, R. sanguineus é a principal espécie de carrapato encontrada em cães em áreas urbanas (SZABÓ et al., 2001) e raramente é visto parasitando outros hospedeiros. O carrapato A. cajennense pode ser também encontrado parasitando cães, nesse caso restrito às áreas rurais (LABRUNA e CAMPOS PEREIRA, 2001), porém esta espécie é mais comum em cavalos e capivaras (LABRUNA et al., 2000). Ambas as espécies de carrapatos representam grupos importantes para a saúde pública. A. miniatus é um carrapato que afeta as aves domésticas causando perdas de produtividade e podendo disseminar agentes patogênicos (LISBOA, 2006). Rhipicephalus microplus Trata-se de um carrapato monoxeno que tem os bovinos como principal hospedeiro podendo ser também encontrado parasitando outros animais, domésticos ou não. Conhecido como carrapato-do-boi e denominado de Boophilus microplus, foi recentemente, em consequência de análises filogenéticas, realocado por Murrell e Barker (2003) no gênero Rhipicephalus passando a se denominar Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Figura 1.1). O antigo gênero nesta espécie é geralmente mantido como subgênero, facilitando a recuperação de publicações em que aparece com o antigo nome. Este carrapato representa grandes perdas na pecuária mundial, além de ser transmissor de diversos agentes patogênicos (GUGLIELMONE et al., 2006). a B FIGURA 1.1. A: Fêmea de Rhipicephalus (Boophilus) microplus ingurgitada (teleógina) ovipondo. B: macho em vista dorsal Museu do carrapato, Embrapa Gado de Corte MS. Fotos: Jaqueline Matias.

4 4 Capítulo 1 Classificação, distribuição geográfica, ciclo biológico e importância econômica das principais espécies de carrapatos no Brasil Classificação Segundo o National Center for Biotechnology Information (NCBI-ID: 6941) dos Estados Unidos da América, a classificação taxonômica do R. Microplus é: Reino Metazoa Filo Arthropoda Classe Arachnida Subclasse Acari Superordem - Parasitiformes Ordem Ixodida Superfamília Ixodoidea Família Ixodidae Subfamília Rhipicephalinae Gênero Rhipicephalus Subgênero Boophilus Espécie Rhipicephalus (Boophilus) microplus Distribuição geográfica Este carrapato é originário da Índia e da Ilha de Java, na Ásia. As expedições exploradoras, conforme registrado na história, incluíam o transporte de mercadorias e animais. Foi por meio da dispersão de animais domésticos que ocorreu a introdução deste parasita nas regiões tropicais e subtropicais: Austrália, México, América Central, América do Sul e África. Posteriormente, veio a estabelecer-se entre os paralelos 32 Norte e 32 Sul, com alguns focos no paralelo 35 Sul (NUÑES et al., 1982). O carrapato R. microplus foi relatado pela primeira vez parasitando bovinos em 1872, na Ilha de Darwin, tendo sido introduzido da Indonésia, espalhando-se, posteriormente por toda a Queensland até New South Wales em 1906, na Austrália (AGRICULTURE HANDBOOK, 1976). Sua introdução no Brasil provavelmente ocorreu no início do século XVIII, sendo atualmente encontrado em todas as regiões, variando de intensidade de acordo com as condições climáticas e raças de bovinos (GONZALES, 1995). Ciclo biológico Trata-se de uma espécie monoxena, ou seja, que necessita de um único hospedeiro para completar seu ciclo de vida (ROCHA, 1984). Possui preferência pelos bovinos, com maior predileção para Bos tauros em relação a B. indicus, entretanto, ovelhas, cavalos, veados, cães, cabras, o homem e outros também podem ser hospedeiros, mas apenas em épocas de grande infestação nas pastagens (GONZALES, 1975). A fase de vida parasitária começa com a fixação da larva no hospedeiro até o estádio de adulto ingurgitado (fêmea) que, ao se desprender do animal, inicia a fase de vida livre dando início à postura, incubação e posterior eclosão das larvas (Figura 1.2).

5 Capítulo 1 Classificação, distribuição geográfica, ciclo biológico e importância econômica das principais espécies de carrapatos no Brasil 5 FIGURA 1.2. Ciclo biológico do carrapato-do-boi, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, mostrando a fase de vida livre e a fase de vida parasitária. Fotos: Jaqueline Matias. Importância O carrapato R. microplus é responsável por um prejuízo estimado em US$ 2 bilhões/ano (GRISI et al., 2002), sendo que o rebanho bovino comercial do Brasil é o maior do mundo e determinante para a economia do país. Este ectoparasito causa considerável redução na produção de leite, redução da natalidade, gastos elevados com carrapaticidas, perdas de peso, gastos com mão-de-obra utilizada para o seu controle, e perda na qualidade do couro (INDICADORES RURAIS, 2001; GOMES, 2004). Além disso, o R. microplus é um importante vetor de agentes patogênicos, muitas vezes letais, aos bovinos. Dentre os agentes destacam-se os da Tristeza Parasitária Bovina - TPB (GUGLIELMONE et al., 2006). A TPB compreende duas enfermidades bem conhecidas a babesiose, determinadas pelos protozoários Babesia bigemina e B. bovis, e a anaplasmose, determinada por Anaplasma marginale (AL- MEIDA et al., 2006; GUEDES JÚNIOR et al., 2008). Rhipicephalus sanguineus Vulgarmente conhecido como o carrapato vermelho do cão, Rhipicephalus sanguineus (Figura 1.3) é um carrapato trioxeno e que se alimenta principalmente em cães e acidentalmente em outros hospedeiros, incluindo os seres humanos (WALKER et al., 2005). É considerado o principal vetor e reservatório da Rickettsia conorii implicada com a Febre Maculosa do Mediterrâneo na Europa, África e Ásia (PAROLA et al., 2005). Classificação Segundo o National Center for Biotechnology Information (NCBI-ID: 34632), dos Estados Unidos da América, a classificação taxonômica do R. sanguineus é: Reino Metazoa

6 6 Capítulo 1 Classificação, distribuição geográfica, ciclo biológico e importância econômica das principais espécies de carrapatos no Brasil a B FIGURA 1.3. Rhipicephalus sanguineus. A: macho dorsal. B: fêmea dorsal ingurgitada. Foto: Jaqueline Matias. Museu do carrapato, Embrapa Gado de Corte MS. Filo Arthropoda Classe Arachnida Subclasse Acari Superordem - Parasitiformes Ordem Ixodida Superfamília Ixodoidea Família Ixodidae Subfamília Rhipicephalinae Gênero Rhipicephalus Espécie Rhipicephalus sanguineus Distribuição geográfica Originário do continente africano, onde existem aproximadamente 79 espécies do gênero Rhipicephalus, incluindo cinco espécies que foram do gênero Boophilus e que estão agora no subgenero Rhipicephalus (Boophilus) (BOWMAN; NUTTALL, 2008), o carrapato R. sanguineus é uma espécie cosmopolita e, provavelmente, a de maior distribuição geográfica (LABRUNA, 2004; WALKER; KEIRANS; HORAK, 2005). Ciclo biológico Este gênero de carrapatos possui ciclo trioxeno, ou seja, que necessita de três hospedeiros para completar seu ciclo de vida (Figura 1.4). Os únicos hospedeiros primários conhecidos para os estágios parasitários do carrapato R. sanguineus são os cães, (SZABÓ et al., 1995). Há relatos de parasitismo em outras espécies de animais, incluindo alguns representantes da fauna silvestre brasileira, mas esse parasitismo acontece com pouca frequência e, quando ocorre, esse fato está estreitamente relacionado com o contato desses hospedeiros com o cão (LABRUNA et al., 2001). Importância R. sanguineus pode transmitir patógenos como Babesia canis, para cães; Rickettsia conorii, para seres humanos (MAROLI et al., 1996) e Ehrlichia canis, para cães e

7 Capítulo 1 Classificação, distribuição geográfica, ciclo biológico e importância econômica das principais espécies de carrapatos no Brasil 7 FIGURA 1.4. Ciclo biológico do Rhipicephalus sanguineus. Fotos: Jaqueline Matias. humanos, já que a Erliquiose Monocítica Canina (EMC) é considerada uma doença de importância zoonótica desde 1992 (BENENSON, 1992). Esse ectoparasito também serve de vetor para Citauxzoon felis, responsável pela citauxzoonose em felinos (HOSKINS, 1991). No continente americano, o R. sanguineus está incriminado na transmissão de outras doenças, como a Febre Maculosa, e no Brasil é o principal transmissor de Hepatozoon canis (O DWYER; MASSARD, 2001). Amblyomma cajennense Popularmente conhecido como carrapato-estrela ou carrapato do cavalo (Figura 1.5), possui um ciclo trioxeno e apesenta uma baixa especificidade parasitária, podendo ser visto parasitando várias espécies de animais domésticos e silvestres (LOPES et al., 1998). Classificação Segundo o National Center for Biotechnology Information (NCBI-ID: 34607), dos Estados Unidos da América, a classificação taxonômica do A. cajennense é: Reino Metazoa Filo Arthropoda Classe Arachnida Subclasse Acari Superordem - Parasitiformes Ordem Ixodida Superfamília Ixodoidea

8 8 Capítulo 1 Classificação, distribuição geográfica, ciclo biológico e importância econômica das principais espécies de carrapatos no Brasil FIGURA 1.5. Amblyomma cajennense. Foto: Jaqueline Matias. Família Ixodidae Subfamília Amblyomminae Gênero Amblyomma Espécie Amblyomma cajennense Distribuição Primeiramente relatado em Cayenna (Guiana Francesa) e descrito por Fabricius em 1787 (OLIVER, 1989) é um carrapato amplamente distribuído na região neotropical, desde o sul dos Estados Unidos até norte da Argentina, incluindo as Ilhas do Caribe (ARAGÃO, 1936; WALKER e OLWAGE, 1987). Estudos em andamento especulam a existência de pelo menos seis prováveis subespécies de Amblyomma cajennense. Ciclo Biológico Possui um ciclo trioxeno (Figura 1.6) e supõe-se que, na América do Sul, antas (Tapirus terrestris L.) e capivaras (Hydrochoerus hydrochaeris) sejam os principais hospedeiros primários para A. cajennense (LABRUNA et al., 2001). Após a introdução de cavalos na América Latina durante a colonização europeia, A. cajennense se tornou uma praga séria a estes animais, que também atuam como hospedeiros primários para todos os estágios do ectoparasita (LABRUNA et al., 2002). Importância Este carrapato ocasiona importantes perdas econômicas em consequência da queda de produtividade dos animais e dos gastos com o uso de carrapaticidas (PRATA et al., 1996). Além do que é a principal espécie que parasita os seres humanos na América Central e no Brasil (ARAGÃO, 1936; LABRUNA et al., 2001), sendo o principal vetor da Rickettsia rickettsii, o agente causador da Febre Maculosa Brasileira (FMB) em humanos (DIAS; MARTINS; RIBEIRO, 1937; LEMOS, 1997). A. cajennense também demonstrou ser um vetor competente do vírus venezuelano de encefalomielite equina em condições laboratoriais (LIN- THICUM et al., 1991).

9 Capítulo 1 Classificação, distribuição geográfica, ciclo biológico e importância econômica das principais espécies de carrapatos no Brasil 9 FIGURA 1.6. Ciclo do Amblyomma cajennense. Foto: Jaqueline Matias. Argas miniatus Argas miniatus Kock (1844) (Figura 1.7) é a única espécie do gênero que ocorre no Brasil, e tem como hospedeiro as aves domésticas. Na natureza é encontrado em pequenas criações de Gallus gallus provocando perdas na produtividade (MAR- CHOUX e SALIMBENI, 1903). Classificação Segundo lista atualizada por Horak, Camicas e Keirans (2002), a classificação taxonômica do A. miniatus é: Reino Metazoa Filo Arthropoda Classe Arachnida Subclasse Acari a B FIGURA 1.7. Argas miniatus. A: vista dorsal. B: parasitando uma ave. Foto: Jaqueline Matias. Museu do carrapato, Embrapa Gado de Corte MS.

10 10 Capítulo 1 Classificação, distribuição geográfica, ciclo biológico e importância econômica das principais espécies de carrapatos no Brasil Superordem - Parasitiformes Ordem Ixodida Superfamília Ixodoidea Família Argasidae Subfamilia Argasinae Gênero Argas Subgênero - Persicargas Espécie Argas miniatus Distribuição geográfica Todas as espécies do gênero Argas Latreille, 1796 são consideradas hematófagas nos estágios de larva, ninfas e adulto, parasitando aves domésticas e silvestres. A espécie A. (Persicargas) miniatus pode ser encontrada na América do Norte, Central e principalmente na América do Sul, apresentando, portanto, distribuição neotropical. Nessa região existem pelo menos 10 espécies classificadas no gênero Argas, sendo destas, sete pertencentes ao subgênero Argas e três ao subgênero Persicargas (BARROS-BATTESTI et al., 2006). Ciclo Biológico É um carrapato heteroxeno, ou seja, necessita de mais de um hospedeiro para completar seu ciclo de vida. No caso desta espécie utiliza-se de dois hospedeiros. Seu ciclo de vida, em condições de temperatura e umidade relativa controladas, pode durar até 201 dias, enquanto que, em condições naturais, pode chegar até 317 dias (SCHUMAKER e OBA, 1988). Possui hábito de repasto noturno e, durante este processo, a larva permanece parasitando o hospedeiro durante dias, enquanto que ninfas e adultos realizam seus repastos sanguíneos em poucos minutos. Estes carrapatos, durante a fase de vida livre, são encontrados em abrigos e ninhos de seus hospedeiros, locais nos quais ocorrem a muda e a cópula (ROHR, 1909). Importância São conhecidas 60 espécies como pertencentes ao gênero Argas Latreille, 1796 (GUGLIELMONE et al., 2003; VENZAL et al., 2006). A espécie A. miniatus tem importância econômica na criação de aves nas Américas, acarretando prejuízos tais como, perdas na produtividade, anemia, espoliação e transmissão de patógenos. Entre os patógenos transmitidos destaca-se a Borrelia anserina (MARCHOUX e SALIMBENI, 1903). As larvas, em consequência do seu hematofagismo, podem causar paralisia induzida em aves jovens, paralisia esta que é conhecida como Tick Paralysis (MAGALHÃES et al., 1987). A paralisia é causada por uma neurotoxina liberada ao final do ingurgitamento, provocando paralisia flácida ascendente, levando rapidamente à morte geralmente por parada respiratória; sete espécies do gênero Argas podem produzir esta toxina (MANS et al., 2004).

11 Capítulo 1 Classificação, distribuição geográfica, ciclo biológico e importância econômica das principais espécies de carrapatos no Brasil 11 No continente americano, a ocorrência desta espécie é conhecida em diversos países, entre outros, no México (HOFFMAN e LOPEZ-CAMPOS, 2000); nos Estados Unidos e Peru (CRUZ, 2001); no Brasil, Colômbia, Cuba, Guyana, Panamá, Porto Rico, Venezuela (GUGLIELMONE et al., 2003); e Chile (GONZÁLEZ- ACUÑA e GUGLIELMONE, 2005). Segundo Santos (2009), em função dos erros cometidos na classificação taxonômica, A. (P.) miniatus já foi registrado na Argentina, Barbuda, Brasil, Colômbia, Cuba, Guiana, Jamaica, Martinica, México, Panamá, Porto Rico, Trinidad e Tobago, e Venezuela. Considera-se ainda que a maioria dos registros de A. (P.) persicus da Argentina, Bolívia, Chile, Guiana Francesa, Paraguai, Peru e Uruguai, assim como diversas descrições no Brasil e México são de fato de A. (P.) miniatus. R EFER ÊNCIAS GONZÁLEZ-ACUÑA, D.; GUGLIELMONE, A. A. Ticks (Acari: Ixodoidea: Argasidae, Ixodidae) of Chile. Experimental and Applied Acarology, v. 35, p , AGRICULTURE HANDBOOK Animal and plant heath inspection. United States Departament of agriculture, p. ALMEIDA, M. B.; TORTELLI, F. P.; RIET-CORREA, B.; FERREIRA, J. L. M.; SOARES, M. P.; FARIAS, N. A. R.; RIET-CORREA, F.; SCHILD, A. L. Tristeza parasitária bovina na região sul do Rio Grande do Sul: estudo retrospectivo de Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 26, n. 4, p , ARAGÃO, H. B. Ixodidas brasileiros e de alguns países limítrofes. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 31, n. 4, p , BARROS-BATTESTI, D. M.; ARZUA, M.; BECHARA, G. H. Carrapatos de importância médicoveterinária da região neotropical: um guia ilustrado para identificação de espécies. São Paulo: Vox : ICTTD-3 : Butantan, p. BENENSON, A. S. Ehrlichiosis. In: El control de las enfermedades transmisibles en el hombre. 15 ed. Washington D.C: Organizacion Mundial de Salud, p , BOWMAN, A. S.; NUTTALL, P. A. Ticks: biology, disease and control. 1ª ed. New York: Cambridge, p. CRUZ, J. O. Patterns in the Biogeography of West Indian Ticks [Internet] - In: Woods C. A. and Sergile F. E. (Eds). Biogeography of West Indies. CRC Press Disponível em: crcnetbase.com/doi/abs/ / ch7. Acessado em: 12.nov DIAS, E.; MARTINS, A.; RIBEIRO, D. J. Thypho exanthematico no Oeste de Minas Gerais. Brasil Médico, v. 51, n. 24, p , GOMES, A. Carrapato-de-boi: prejuízos e controle. Divulgação CNPGC EMBRAPA, Campo Grande, MS, dez. 2000, n. 42. Disponível em: Acesso em: 23 abr GONZALES, J. C. O controle dos carrapatos dos bovinos. Porto Alegre: Sulina, p. GONZALES, J. C. O controle do carrapato do boi. 2. ed. Porto Alegre: Edição do Autor, p. GRISI, L.; MASSARD, C. L.; MOYA-BORJA, G. E Impacto econômico das principais ectoparasitoses em bovinos no Brasil. A Hora Veterinária, v. 125, n. 21, p. 8-10, GUEDES JUNIOR, D. S.; ARAÚJO, F. R.; SILVA, F. J. M.; RANGEL, C. P.; BARBOSA NETO, J. D.; FONSECA, A. H. Frequency of antibodies to Babesia bigemina, B. bovis, Anaplasma marginale, Trypanosoma vivax and Borrelia burdgorferi in cattle from the northeastern region of the state of Pará, Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v. 17, n. 2, p , GUGLIELMONE, A. A.; ESTRADA-PENA, A.; KEIRANS, J. E.; ROBBINS, R. G. Ticks (Acari. Ixodida) of the Neotropical Zoogeographic region. Special Publication of the International Consortium on Ticks and Tick-borne Diseases, Atlanta, Houten, The Netherlands, p. GUGLIELMONE, A. A.; BEATI, L.; BARROS-BATTESTI, D. M. Ticks (Ixodidae) on humans in South America. Experimental and Applied Acarology, v. 40, n. 2, p , 2006.

12 12 Capítulo 1 Classificação, distribuição geográfica, ciclo biológico e importância econômica das principais espécies de carrapatos no Brasil GUGLIELMONE, A. A.; ROBBINS, G. R.; APANASKEVICH, A. D.; PETNEY, N. T.; ESTRADA- PEÑA, A.; HORAK, G. I.; SHAO, R.; BARKER, C. S. The Argasidae, Ixodidae and Nuttalliellidae (Acari: Ixodida) of the world: a list of valid species names. Zootaxa, n. 2528, p. 1-28, HOFFMAN, A.; LOPEZ-CAMPOS, G. Biodiversidad de los ácaros en México. Jiménez Editores e Impresores, México, 2000, 230p. HOSKINS, J. D. Ehrlichial diseases of dogs: diagnosis and treatment. Canine Practice, v.16, n. 3, p.13-21, HORAK, I. G.; CAMICAS, J-L; KEIRANS J. E. the Argaside, Ixodidae and Nuttalliellidae (Acari: Ixodida): a world list of valid tick names. Experimental and Applied Acarology, v. 28, n. 1, p INDICADORES RURAIS. Brasília: CNA, v. 5, n. 29, p. LABRUNA, M. B.; PEREIRA M. C. Carrapato em cães no Brasil. Clínica Veterinária, v. 30, n. 1, p , LABRUNA M. B. Carta Acarológica. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, Ouro Preto, v. 23, suplemento. 1, p , LABRUNA, M. B.; HOME, V. S. F.; HEINEMANN, M. B.; NETO, J. S. F. Ticks (Acari: Ixodidae) associated with rural dogs in Urará Eastern Amazon, Brazil. Journal of Medical Entomology, v. 37, n. 5, p , LABRUNA, M. B.; KERBER, C. E.; FERREIRA, F.; FACCINI, J. L. H.; De WAAL, D. T.; GEN- NARI, S. M. Risk factors to tick infestations and their occurrence on horses in the state of São Paulo, Brazil. Veterinary Parasitology, v. 97, n. 1, p. 1-14, LABRUNA, M. B.; DE PAULA, C. D.; LIMA, T. F. Ticks (Acari: Ixodidae) on wild animals from the Porto-Primavera Hydroelectric Power Station Area, Brazil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 97, n. 8, p , LEMOS, E. R. S. Febre maculosa brasileira em uma área endêmica no município de Pedreira, São Paulo, Brasil. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 30, n. 3, p. 261, Linthicum, K. J.; Gordon, S. W.; Monath, T. P. Comparative infections of epizootic and enzootic strains of Venezuelan equine encephalomyelitis virus in Amblyomma cajennense (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology, v. 29, n. 5, p , LISBOA, R. S. Estudo da transmissão experimental de Borrelia anserina (Sakharoff, 1891) por Argas (Persicargas) miniatus Kock, 1844 e avaliação comparativa de parâmetros clínicos e hematológicos em Gallus gallus Linnaeus, f. Dissertação (Mestrado em Parasitologia Veterinária) - Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, LOPES, C. M. L.; LEITE, R. C.; LABRUNA, M. B.; OLIVEIRA, P. R.; BORGES, L. M. F.; RO- DRIGUES, Z. B.; CARVALHO, H. A.; FREITAS, C. M. V.; VIEIRA JÚNIOR, C. R. Host specificity of Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787) (Acari: Ixodidae) with comments on the dropoff rhythm. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 93, n. 3, p , MAGALHÃES, F. E. P.; MASSARD, C. L.; SERRA-FREIRE, N. M. Paralysis in Gallus gallus and Carina moschata induced by larvae of Argas (Persicargas) miniatus. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 7, n. 2, p , MANS, B. J.; GOTHE, R.; NEITZ, W. H. Biochemical perspectives on paralysis and other forms of toxicoses caused by ticks. Parasitology, London, v. 129, n. 2, p , MARCHOUX, E. ; SALIMBENI, A. La spirillose des poules. Annales de Institut Pasteur Lille, Paris, v. 17, n. 1, p , MARTINS, T. F.; VENZAL, J. M.; TERASSINI, F. A.; COSTA, F. B.; MARCILI, A.; CAMARGO, L. M. A.; BARROS-BATTESTI, D. M.; LABRUNA, M. B. New tick records from the state of Rondônia, western Amazon, Brazil. Experimental and Applied Acarology. DOI /s , MAROLI, M.; KHOURY, C.; FRUSTERI, L. Diffusione della zeca del cane (Rhipicephalus sanguineus Latreille, 1806) in Italia: un problema di salute pubblica. Annali dell Istituto Superiore di Sanità, v. 32, n. 3, p , MURRELL, A.; BARKER, S. C. Synonymy of Boophilus Curtice, 1891 with Rhipicephalus Koch, 1844 (Acari: Ixodidae). Systematic Parasitology, v. 56, n. 1, p , NUÑES, J. L.; MUÑOZ COBENAS, M. E.; MOLTEDO, H. L. Boophilus microplus, la garrapata comun del ganado vacuno. Buenos Aires: Hemisfério Sur, p.

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15 2 Espécies de carrapatos relatadas no estado de Mato Grosso do Sul Marcos Valério Garcia Jaqueline Matias Dayana Campelo Renato Andreotti

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17 Capítulo 2 Espécies de carrapatos relatadas no estado de Mato Grosso do Sul 17 INTRODUÇÃO Os carrapatos pertencem ao filo Arthropoda, classe Arachnida, ordem Acari e subordem Ixodida. São ectoparasitas hematófagos obrigatórios capazes de infestar a grande maioria dos animais vertebrados (mamíferos, aves, répteis e anfíbios) e apresentam uma ampla distribuição geográfica, sendo encontrados em todos os continentes do mundo. A grande capacidade de adaptação às condições climáticas extremas, bem como à diversidade de hospedeiros em que eles se alimentam, indica que eles são organismos altamente bem sucedidos (WANG; NUTTALL, 1999). Diante de tal fato, um processo de coevolução com êxito implica que uma espécie de vetor parasito geralmente depende da presença de uma ou mais espécies de hospedeiros para a sua manutenção dentro de um ecossistema específico (PIGNATI, 2004). Estima-se que estes artrópodes surgiram a aproximadamente 240 milhões de anos, durante o período Triássico (FACCINI; BARROS-BATTESTI, 2006). Relatos mostram que esses ectoparasitas coabitam a terra desde o final do período paleolítico ou início do mesolítico, em regiões de clima quente e úmido. Notadamente uma figura em uma tumba egípcia, datada de 1500 a.c, representando um animal semelhante à hiena com três protuberâncias no pavilhão auricular interno, é o registro mais antigo da presença do carrapato (ARTHUR, 1965). Sua primeira denominação foi Cynorhaestea, citada por Homero cerca de 800 a.c. Em 355 a.c., Aristóteles, em sua Historia Animalium, referiu-se aos carrapatos, acreditando que sua origem fosse o capim. Na Antiga Grécia era chamado de Croton, semelhante à mamona e, pela mesma razão, foi denominado Ricinus na Antiga Roma. No ano 77 d.c., o carrapato foi citado como hematófago por Plínio, em sua História Natural (ARTHUR, 1961). Mais recentemente o estudo do genoma de uma múmia de anos revelou a presença de material genético da bactéria Borrelia burgdorferi, causadora da borreliose ou doença de Lyme, que é transmitida pela picada de carrapatos. A enfermidade, diagnosticada apenas no século XVIII, provoca desde sintomas leves, como irritação cutânea, até mais graves, como distúrbios neurológicos. Assim, o presente fato se torna o registro mais antigo dessa doença (KELLER et al., 2012). No mundo, aproximadamente 896 espécies de carrapatos já foram catalogadas (GUGLIELMONE et al., 2010), sendo que destas, 65 já foram identificadas no Brasil (MARTINS et al., 2013). Sabe-se que, para a manutenção de uma determinada especie de carrapato, apenas a presença de seu hospedeiro primário não é o suficiente para o estabelecimento da espécie. A distribuição geográfica dos carrapatos varia de acordo com a adaptação das espécies às condições abióticas e bióticas encontradas nas áreas nas quais ocorrem. As condições abióticas, que atuam no ciclo dos carrapatos em suas fases de vida livre, são representadas pela temperatura, fotoperíodo e umidade do ambiente. Já os fatores bióticos, interferem pouco na sazonalidade destes parasitos e estão relacionados aos hospedeiros e às espécies de carrapatos envolvidas (FACCINI; BARROS-BATTESTI, 2006).

18 18 Capítulo 2 Espécies de carrapatos relatadas no estado de Mato Grosso do Sul As interfaces entre o meio urbano e as matas favorecem o intercâmbio parasitário entre os dois ambientes e também permitem a disseminação do próprio vetor silvestre para o meio rural ou urbano, pela adaptação a um novo hospedeiro, animal doméstico ou ainda aqueles de hábito sinantrópico. O crescente interesse mundial na preservação da natureza está intensificando a coexistência de nichos naturais com a civilização, estabelecendo condições para a transmissão de bioagentes veiculados por carrapatos e o surgimento de doenças infecciosas até então pouco conhecidas (FIGUEREDO et al.,1999). Estes artrópodes, por serem obrigatoriamente hematófagos, podem causar relevantes problemas à saúde pública e animal, visto que apresentam potencial aumentado de transmissão de agentes patogênicos para o homem e animais suscetíveis (ESTRADA-PENA; JONGEJAN, 1999; FREIRE, 1972). O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus (R. microplus) é responsável por prejuízos econômicos notáveis na pecuária (CASTRO, 1997). No Brasil estima-se um prejuízo de 2 bilhões de dólares ao ano (GRISI et al., 2002). A maioria das espécies de carrapatos presentes no Brasil, e mesmo aquelas relatadas no Estado de Mato Grosso do Sul, representam uma relevância, ainda não estimada ou quantificada, na possível transmissão de patógenos de importância zoonótica, tais como Amblyomma cajennense que é a espécie de maior população e de maior distribuição geográfica (SZABÓ et al., 2007). Algumas doenças transmitidas aos humanos por picadas de carrapatos são motivo de preocupação, como por exemplo: Febre Maculosa Brasileira (FMB), enfermidade esta causada pela bactéria Rickettsia rickettsii, transmitida por carrapatos, principalmente de hábitat silvestre (GUEDES, 2009). Outro exemplo é a doença de Lyme, que ocorre nos Estados Unidos, também relacionada à presença destes ectoparasitas (LANE; BURGDORFER,1988). No Brasil, os gêneros e espécies de carrapatos que parasitam animais domésticos são mais conhecidos, porque a sua biologia, capacidade vetorial e formas de controle têm sido alvo de inúmeras pesquisas (VERONEZ et al., 2010). As espécies de maior prevalência são: R. microplus, R. sanguineus, Amblyomma cajennense, Dermacentor nitens, Argas miniatus e Ornithodoros brasiliensis (MASSARDI; FONSECA, 2004; RECK et al., 2011). Em contrapartida, a maioria dos carrapatos da fauna silvestre brasileira é pouco conhecida e faltam dados sobre a biologia, a distribuição, os hospedeiros habituais e a capacidade vetorial de bioagente destas espécies (VERONEZ et al., 2010). Não menos preocupante é o fato de que o ambiente silvestre pode sofrer interferências pela introdução de ectoparasitas de animais domésticos e/ou doenças transmitidas por estes vetores, ameaçando a sobrevida de hospedeiros selvagens, como descrito por Szabó et al. (2003). Exemplos deste intercâmbio parasitário e possíveis consequências nocivas foram relatadas em várias partes do mundo (HOOGSTRA- AL, 1981). Assim, considerando a necessidade de compreender a emergência de doenças transmitidas por carrapatos se fazem necessários: a disponibilização de informações sobre a biologia; a ecologia destes ácaros, bem como, sobre possíveis patógenos envolvidos que eles podem veicular. Isso será importante para a compreensão da epidemiologia da doença e para a possibilidade de intervenção efetiva.

19 Capítulo 2 Espécies de carrapatos relatadas no estado de Mato Grosso do Sul 19 CaRRaPaTOS QUE acometem animais DOMÉSTICOS EM MaTO GROSSO DO SUL, BRaSIL Rhipicephalus microplus (CaNESTRINI, 1888) É originário da Ásia, notadamente da Índia e da Ilha de Java. As expedições exploradoras registradas na história, com a movimentação de animais e mercadorias foram responsáveis por sua introdução nas regiões tropicais e subtropicais: Austrália, México, América Central, América do Sul e África. Acabaram por se estabelecer dentro da área demarcada pelos paralelos 32 Norte e 32 Sul, com alguns focos no 35 Sul, área esta que lhes é favorável ao desenvolvimento (NUÑES et al., 1982). A introdução deste ectoparasita no Brasil provavelmente ocorreu no início do século XVIII, sendo atualmente encontrado em todas as regiões, variando de intensidade de acordo com as condições locais do clima e das raças de bovinos explorados (GONZALES, 1995). R. microplus é um carrapato monoxeno. Este ectoparasito causa reduções consideráveis na produção de leite e natalidade, gastos elevados com carrapaticidas e mão-de-obra, perda de peso e queda na qualidade do couro, além disso, o R. microplus é um importante vetor de agentes patogênicos, muitas vezes letais, aos bovinos. Dentre estes agentes destacam-se os da Tristeza Parasitária Bovina - TPB (GU- GLIELMONE et al., 2006) que compreendem duas enfermidades bem conhecidas: a babesiose, determinada pelos protozoários Babesia bigemina e B. bovis, e a anaplasmose, determinada por Anaplasma marginale (ALMEIDA et al., 2006; GUEDES JÚNIOR et al., 2008). Rhipicephalus sanguineus (LaTREILLE, 1806) Originário do continente africano, onde existem aproximadamente 79 espécies do gênero Rhipicephalus (BOWMAN; NUTTALL, 2008). A espécie R. sanguineus, também conhecida como carrapato vermelho do cão, é trioxena, cosmopolita e, provavelmente a de maior distribuição geográfica (LABRUNA, 2004; WALKER et al., 2005). Os únicos hospedeiros primários conhecidos para os estágios parasitários do carrapato R. sanguineus são os cães (SZABÓ et al., 1995). Há relatos deste ixodídeo parasitando secundariamente outras espécies de animais, incluindo alguns representantes da fauna silvestre brasileira, mas isso ocorre com certa raridade. Quando isso acontece esse fato está estreitamente relacionado com o contato desses hospedeiros com o cão (LABRUNA; PEREIRA, 2001). Sabidamente R. sanguineus pode transmitir patógenos como Babesia canis, para cães; Rickettsia conori, para seres humanos (MAROLI et al., 1996); e Ehrlichia canis, para ambos, já que a Erliquiose Monocítica Canina (EMC) é considerada uma zoonose desde 1992 (BENENSON, 1992). Esse ectoparasito também serve de vetor para Citauxzoon felis, responsável pela citauxzoonose em felinos (HOSKINS, 1991). Outras doenças, como a Febre Maculosa Brasileira, causada pela Rickettsia rickettsii, e a borreliose ou doença de Lyme, causada pela Borrelia sp., no continente americano, têm o R. sanguineus como possível vetor (YOSHINARI et al., 1997).

20 20 Capítulo 2 Espécies de carrapatos relatadas no estado de Mato Grosso do Sul No Brasil, o principal transmissor de Hepatozoon canis é a espécie R. sanguineus (O DWYER ; MASSARD, 2001). Amblyomma cajennense (FaBRICIUS, 1787) Carrapato trioxeno que está amplamente distribuído na região neotropical, desde o sul dos Estados Unidos até o norte da Argentina, incluindo Ilhas do Caribe (WALKER; OLWAGEl 1987). Acredita-se que, na América do Sul, antas (Tapirus terrestris L.) e capivaras (Hydrochaeris hydrochaeris Erxleb.) sejam os principais hospedeiros primários para A. cajennense (LABRUNA et al., 2001). Após a introdução de cavalos na América Latina durante a colonização européia, A. cajennense se tornou uma praga séria a estes animais, que também atuam como hospedeiros primários para todos os estágios do ectoparasita (LABRUNA et al., 2002). A. cajennense é o principal carrapato que parasita os seres humanos na Europa Central e no Sul do Brasil (ARAGÃO, 1936; LABRUNA et al., 2001), sendo o principal vetor da Rickettsia rickettsii, causador da Febre Maculosa Brasileira (DIAS et al, 1937; LEMOS, 1997). Além disso, foi observado que, em condições laboratoriais, A. cajenennse se mostrou um vetor competente do virus venezuelano de encefalomielite equina (LINTHICUM et al., 1991). Dermacentor nitens (NEUMaNN, 1897) A distribuição geográfica de D. nitens varia de partes do sul da Flórida e do Texas, nos Estados Unidos, ao norte da Argentina. D. nitens é uma das principais espécies de carrapatos que parasita equídeos (BORGES; LEITE, 1993). Conhecido como carrapato da orelha do cavalo (FLECHTMANN, 1997) é responsável por lesões no pavilhão auricular, e provoca uma predisposição para instalação de larvas de moscas e infecção bacteriana secundária, depreciando os animais em termos zootécnicos e econômicos (MALHEIRO, 1952; BORGES; LEITE, 1998). D. nitens é um carrapato monoxeno que origina diferentes gerações por ano na região Sudeste do Brasil (BORGES et al., 2000; LABRUNA et al., 2001),) cujas fêmeas adultas transmitem o agente Babesia caballi para sua progênie por transmissão transovariana (ROBY; ANTHONY, 1963). Todas as fases do carrapato (larvas, ninfas, e adulto) agem como vetores competentes do mencionado protozoário (STILLER; FRERICHS, 1979). Ornithodoros brasiliensis (aragão, 1923) Na região Neotropical existem 50 espécies de Ornithodoros. No Brasil já foram catalogadas algumas espécies, tais como: O. brasiliensis, O. rostratus, O. lataje e O. nattereri. Entretanto, O. brasiliensis é uma espécie que tem causado preocupação, sendo motivo de muitas pesquisas recentes apesar do seu registro ter sido relatado já há algum tempo, entretanto somente nos últimos anos os estudos foram retomados (ARAGÃO, 1923; RECK et al., 2011). Este carrapato é extremamente agressivo a seres humanos e animais, e possui caráter endêmico do Estado do Rio Grande do Sul,

21 Capítulo 2 Espécies de carrapatos relatadas no estado de Mato Grosso do Sul 21 além de apresentar hábitos semelhantes ao O. rostratus, da qual é considerada espécie próxima (ARAGÃO, 1931). Segundo Di Primio (1934) estes ectoparasitas, podem viver até seis anos em jejum quando adultos. Esta espécie foi encontrada naturalmente infectada por Borrelia brasiliensis, bioagente causador de febre em cobaias de laboratório (DAVIS, 1952). Argas miniatus (KOCH, 1844) É uma espécie de carrapato neotropical encontrada principalmente na América do Sul, mas também ocorre nas Américas do Norte e Central. Esse argasídeo se mantém na natureza principalmente em pequenas criações domésticas de galinhas Gallus gallus. Pode determinar perdas na produtividade, decorrentes do hematofagismo, da transmissão de agentes patogênicos, como Borrelia anserina (MAR- CHOUX; SALIMBENI, 1903) e da paralisia induzida pelas larvas em aves jovens (MAGALHÃES et al., 1987). É um carrapato heteróxeno e com hábito alimentar noturno. Durante o processo de alimentação a larva permanece sobre o hospedeiro durante dias, enquanto ninfas e adultos realizam seus repastos sanguíneos em poucos minutos. Na fase de vida livre, são encontrados em abrigos e ninhos de seus hospedeiros (SANTOS et al., 2008). LISTa DE CaRRaPaTOS (PaRaSITO-HOSPEDEIRO) COM OCORRêNCIa EM MaTO GROSSO DO SUL (acari, IxODIDaE, argasidae) No presente estudo foi realizado uma segunda lista com 21 espécies de carrapatos (Acari: Ixodidae, Argasidae) com ocorrência já registrada no estado de Mato Grosso do Sul. A listagem anterior havia sido elaborada por Aragão (1913), antes do desmembramento do estado de Mato Grosso, em 1977, para criação do estado de Mato Grosso do Sul. Os nomes comuns dos hospedeiros foram incluídos segundo Guglielmone et al. (2010). Gênero: Argas Argas miniatus (Koch, 1844) (Figura 2.1). Hospedeiros: galinha-doméstica (Gallus gallus). Referência: Prette et al. (2012). Gênero: Rhipicephalus Rhipicephalus microplus (Canestrini, 1888) (Figura 2.2). Hospedeiros: gado bovino (Bos indicus e o B. taurus), veado-campeiro (Ozoctoceros bezoarticus), cervo-do-pantanal (Blastocerus dichotomus), veado-catingueiro (Mazama gouazoubira), e onça-pintada (Panthera onca). Referências: Bechara et al. (2000), Pereira et al. (2000), Labruna et al. (2002), Szabó et al. (2003).

22 22 Capítulo 2 Espécies de carrapatos relatadas no estado de Mato Grosso do Sul FIGURA 2.1. Argas miniatus. Foto: Jaqueline Matias. Embrapa Gado de Corte. Museu do carrapato. FIGURA 2.2. Rhipicephalus microplus parasitando bovino. Foto: Jaqueline Matias. Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806) (Figura 2.3). Hospedeiro: cães domésticos (Canis familiaris) Referência: Almeida et al. (2012). No prelo. Gênero: Ixodes Ixodes loricatus (Neumann, 1899) (Figura 2.4). Hospedeiros: gambá-de-orelha-branca (Didelphis albiventris). Referência: Miziara et al. (2008). Gênero: Dermacentor Dermacentor nitens (Neumann, 1897) (Figura 2.5). Hospedeiros: cervo-do-pantanal (Blastocerus dichotomus). Referência: Szabó et al. (2003). Gênero: Amblyomma Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787) (Figura 2.6). Hospedeiros: cervo-do-pantanal (Blastocerus dichotomus), veado-catingueiro (Mazama gouazoubira), quati (Nasua nasua), tamanduá-bandeira (Myrmecophaga

23 Capítulo 2 Espécies de carrapatos relatadas no estado de Mato Grosso do Sul 23 a B FIGURA 2.3. Rhipicephalus sanguineus. A: fêmea vista dorsal. B: macho vista dorsal. Foto: Jaqueline Matias. Embrapa Gado de Corte. Museu do carrapato. a B FIGURA 2.4. Macho de Ixodes loricatus. A: vista dorsal. B: vista ventral. Foto: Jaqueline Matias. Embrapa Gado de Corte. Museu do carrapato. FIGURA 2.5. Macho de Dermacentor nitens. Foto: Jaqueline Matias. Embrapa Gado de Corte. Museu do carrapato. trindactyla), tamanduá-mirim (Tamandua tetradactyla), capivara (Hydrochaeris hydrocharis), gado bovino (Bos indicus; B. taurus), cavalo-pantaneito (Equus caballus), cão doméstico (Canis familiaris), porco-monteiro (Sus scrofa), tatu-amarelo (Euphractus sexcinctus), gambá-de-orelha-branca (Didelphis albiventris), tatu-galinha (Dasypus septemcinctus), cachorro-do-mato (Cerdocyon thous), onça parda (Puma concolor), porcodo-mato (Tayassu tajacu), bugio-preto (Aloutta caraya), macaco-prego (Cebus apella). Referências: Aragão (1913), Bechara et al. (2000), Pereira et al. (2000), Costa et al. (2002), Labruna et al. (2002), Szabó et al. (2003), Medri et al. (2010). Amblyomma rotundatum (Koch, 1844) (Figura 2.7). Hospedeiros: jararaca (Bothrops moojeni), jibóia (Boa constrictor). Refererência: Labruna et al. (2002).

24 24 Capítulo 2 Espécies de carrapatos relatadas no estado de Mato Grosso do Sul a B FIGURA 2.6. Amblyomma cajennense. A: fêmea dorsal. B: macho vista dorsal. Foto: Jaqueline Matias. Embrapa Gado de Corte. Museu do carrapato. FIGURA 2.7. Amblyomma rotundatum. Foto: Jaqueline Matias. Embrapa Gado de Corte. Museu do carrapato. Amblyomma longirostre (Koch, 1844). Hospedeiros: porco-espinho ou ouriço (Coendou prehensilis). Referência: Labruna et al. (2002). Amblyomma coelebs (Neumann, 1899) (Figura 2.8). Hospedeiros: onça-parda (Puma concolor). Referência: Labruna et al. (2002). Amblyomma parvum (Aragão, 1908) (Figura 2.9). Hospedeiros: veado-catingueiro (Mazama gouazoubira), quati (Nasua nasua), porco-monteiro (Sus scrofa), tamanduá-mirim (Tamandua tetradactyla), cervo-do- Pantanal (Blastocerus dichotomus), guaxinim (Procyon cancrivoros), lobinho (Cerdocyon thous), cão doméstico (Canis familiaris), cutia (Dasiprocta asarae), gado bovino (Bos indicus e B. taurus), porco-doméstico (Sus scrofa), porco-monteiro (Sus scrofa), cateto (Tayaçu tajacu), tamanduá-bandeira (Myrmecophaga trindactyla), tamanduámirim (Tamandua tetradactyla), onça-pintada (Panthera onca), onça parda (Puma concolor), veado-monteiro (Mazana Americana), capivara (Hydrochaeris hydrocharis), anta (Tapirus terrestres). Referências: Bechara et al. (2000), Pereira et al. (2000), Martins et al. (2004).

25 Capítulo 2 Espécies de carrapatos relatadas no estado de Mato Grosso do Sul 25 FIGURA 2.8. Amblyomma coelebs. Foto: Jaqueline Matias. Embrapa Gado de Corte. Museu do carrapato. a B FIGURA 2.9. Amblyomma parvum. A: macho dorsal. B: fêmea dorsal. Foto: Jaqueline Matias. Embrapa Gado de Corte. Museu do carrapato. Amblyomma tigrinum (Aragão, 1908). Hospedeiros: veado-catingueiro (Mazama gouazoubira), quati (Nasua nasua), lobinho (Cerdocyon thous), onça-pintada (Panthera onca), cão doméstico (Canis familiaris). Referências: Bechara et al. (2000), Pereira et al. (2000), Onófrio (2007). Amblyomma dissimile (Koch, 1844). Hospedeiro: jabuti (Geochelonia carbonaria), jararaca-boca-de-sapo (Bothrops matogrossense). Referência: Cançado (2008). Amblyomma ovale (Koch, 1844) (Figura 2.10). Hospedeiros: quati (Nasua nasua), porco-monteiro (Sus scrofa), guaxinim (Procyon cancrivoros), lobinho (Cerdocyon thous), cão doméstico (Canis familiaris), quati (Nasua nasua), jaguatirica (Leopardus pardalis). Referências: Bechara et al. (2000), Pereira et al. (2000). Amblyomma triste (Koch, 1844) (Figura 2.11). Hospedeiros: tamanduá-bandeira (Myrmecophaga trindactyla), cervo-do-pantanal (Blastocerus dichotomus). Referências: Labruna et al. (2002), Szabó et al. (2003).

26 26 Capítulo 2 Espécies de carrapatos relatadas no estado de Mato Grosso do Sul FIGURA Amblyomma ovale. Foto: Jaqueline Matias. Embrapa Gado de Corte. Museu do carrapato. a B FIGURA Amblyomma triste. A: fêmea dorsal. B: Macho dorsal. Foto: Jaqueline Matias. Embrapa Gado de Corte. Museu do carrapato. Amblyomma scalpturatum (Neumann, 1906). Hospedeiros: tamanduá-bandeira (Myrmecophaga trindactyla), tatu-galinha (Dasypus septemcinctus). Referências: Bechara et al. (2000), Pereira et al. (2000). Amblyomma naponense (Packard, 1869) (Figura 2.12) Hospedeiros: porco-monteiro (Sus scrofa), queixada (Tayassu pecari), caititu (Tayassu tajacu). Referência: Onófrio (2007). Amblyomma pseudoconcolor (Aragão, 1908). Hospedeiros: tatu-peba (Euphractus sexcinctus). Referências: Bechara et al. (2000), Pereira et al. (2000). Amblyomma nodosum (Neumann, 1899) (Figura 2.13). Hospedeiros: tamanduá-mirim (Tamandua tetradactyla), tamanduá-bandeira (Myrmecophaga trindactyla). Referência: Pereira et al. (2000), Labruna et al. (2002), Martins et al. (2004).

27 Capítulo 2 Espécies de carrapatos relatadas no estado de Mato Grosso do Sul 27 FIGURA Macho de Amblyomma naponense. Foto: Jaqueline Matias. Embrapa Gado de Corte. Museu do carrapato. FIGURA Amblyomma nodosum. Foto: Jaqueline Matias. Embrapa Gado de Corte. Museu do carrapato. FIGURA Amblyomma dubitatum. Foto: Jaqueline Matias. Embrapa Gado de Corte. Museu do carrapato. Amblyomma calcaratum (Neumann, 1899). Hospedeiros: tamanduá-mirim (Tamandua tetradactyla), tamanduá-bandeira (Myrmecophaga trindactyla). Referência: Onófrio (2007). Amblyomma dubitatum (Neumann, 1899) (Figura 2.14). Hospedeiros: capivara (Hydrochaeris hydrocharis). Referências: Labruna et al. (2002), Barros-Battestti et al. (2006), Onófrio (2007).

28 28 Capítulo 2 Espécies de carrapatos relatadas no estado de Mato Grosso do Sul FIGURA Ornithodoros rostratus. Foto: Jaqueline Matias. Embrapa Gado de Corte. Museu do carrapato. Gênero: Ornithodoros Ornithodoros rostratus (Aragão, 1911) (Figura 2.15). Hospedeiros: porco-monteiro (Sus scrofa). Referência: Aragão (1913). Gênero: Carios Carios fonsecai (Labruna, 2009). Hospedeiros: morcegos (Peropteryx macrotis e Desmodus rotundus) Referência: Labruna et al. (2009). REFER ÊNCIAS ALMEIDA, M. B. de, TORTELLI, F. P., RIET-CORREA, B., FERREIRA, J. L. M., SOARES, M. P., FARIAS, N. A. R., RIET-CORREA, F., SCHILD, A. L. Tristeza parasitária bovina na região sul do Rio Grande do Sul: estudo retrospectivo de Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 26, n.4, p , ALMEIDA, R. F. C.; SILVA, E. A.; CUNHA, R. C.; MATIAS, J.; GARCIA, M. V.; ANDREOTTI, R. Estudo de ixodofauna em cães e de agentes zoonoticos em carrapatos no município de Campo Grande no estado de Mato Grosso do Sul, Brasil. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, [2012?] (No prelo). ARAGÂO, H. B. Ornithodoros brasiliensis n. sp. Brazil Medico, v. 37, n.20, ARAGÃO, H. B. Nota sobre algumas coleções de carrapatos brasileiros. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 5, p , ARAGÃO, H. B.. Notas sobre os Ornithodoros rostratus, brasiliensis e turicata. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 25, p ,1931. ARAGÃO, H. B. Ixodidas brasileiros e de alguns países limitrophes. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v.31,n.(4,,p , ARTHUR, D. R. Tick and disease. London: Pergamom Press, ARTHUR, D.R. Feeding in ectoparasitic acari with special reference to tick. Advances in Parasitology, v.3, p , BECHARA, G. H.; SZABÓ, M. P. J.; DUARTE, J. M.; MATUSHIMA, E. R.; PEREIRA, M. C.; RECHAV, Y.; KEIRANS, J. E.; FIELDEN, L. J. Ticks Associated with Wild Animals in the Nhecolândia Pantanal, Brazil. Annals of the New York Academy of Sciences, v.916, p , BENENSON, A. S. Ehrlichiosis. In:----- El control de las enfermedades transmisibles en el hombre. 15 ed. Washington D.C: Organizacion Mundial de Salud p

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30 30 Capítulo 2 Espécies de carrapatos relatadas no estado de Mato Grosso do Sul HOSKINS, J.D. Ehrlichial diseases of dogs: diagnosis and treatment. Canine Practice, v. 16, n. 3, p ,1991. INDICADORES RURAIS. Brasília, DF, CNA, v.5, n.29, 6 p., KELLER, A. Et al. New insights into the Tyrolean Iceman s origin and phenotype as inferred by whole-genome sequencing. Nature Communications,v.3, n.698, LABRUNA, M. B. Biologica-ecologia de Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae). Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v.13,p , LABRUNA, M.B., DE PAULA, C.D., LIMA, T.F. Ticks (Acari: Ixodidae) on wild animals from the Porto-Primavera Hydroelectric Power Station Area, Brazil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 97, p , LABRUNA, M.B., KERBER, C.E., FERREIRA, F.; FACCINI, J.L.H., De WAAL, D.T., GENNARI, S.M. Risk factors to tick infestations and their occurrence on horses in the state of São Paulo, Brazil. Veterinary Parasitology, v.97, p.1-14, LABRUNA, M.B., PEREIRA, M.C. Carrapatos em cães no Brasil. Clínica Veterinária, v. 30, p , LABRUNA, M. B.; VENZAL, J. M. Carios fonsecai sp. nov. (Acari, Argasidae), a bat tick from the central-western region of Brazil. Acta Parasitológica, v. 54, n. 4, p , LANE, R. S. ; BURGDORFER, W. Spirochetes in mammals and ticks (Acari: ixodidae) from a focus of Lyme Borreliosis in California. Journal of Wildlife Diseases, v. 24, n.1, p.1-9, LEMOS, E. R. S. Febre maculosa brasileira em uma área endêmica no município de Pedreira, São Paulo, Brasil. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 30, n. 3, p , LINTHICUM, K. J.; LOGAN, T.M.; BAILEY, C.L.; GORDON, S.W.; PETERS, C.J.; MONATH, T.P.; OSORIO, J.; FRANCY, D.B.; McLEAN, R.G.; LEUC, J.W.; GRAHAM, R.R.; JAHRLING, P.B.; MOULTON, J.R.; DOHM, D.J. Venezuelan Equine Encephalomyelitis virus infection and transmission by the tick Amblyomma cajennense (Arachnida: Ixodidae). Journal of Medical Entomology, v. 28, n. 3, p , MAGALHÃES, F.E.P.; MASSARD, C.L.; SERRA-FREIRE, N.M. Paralysis in Gallus gallus and Carina moschata induced by larvae of Argas (Persicargas) miniatus. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 7, n. 2, p , MALHEIRO, D.M. Sobre a ocorrência de Otocentor nitens (Neumann, 1897) Cooley, 1938, Acari Ixodoidea Ixodidae, em cavalos dos Estados de São Paulo, Minas Gerais e Mato Grosso, Brasil. Revista da Faculdade de Medicina Veterinária de São Paulo, v.4, n.4, p , MAROLI, M.; KHOURY, C.; FRUSTERI, L. Diffusione della zeca del cane (Rhipicephalus sanguineus Latreille, 1806) in Italia: un problema di salute pubblica. Annali dell Istituto superiore di sanità, v.32, n.3, p , MARCHOUX ; SALIMBENI, A. La spirillose des poules. Annales de Institut Pasteur Lille, Paris, v.17, n.1, p , MARTINS, T.F.; VENZAL, J.M.; TERASSINI, F.A.; COSTA, F.B.; MARCILI, A.; CAMARGO, L.M.A.; BARROS-BATTESTI, D.M.; LABRUNA, M.B. New tick records from the state of Rondônia, western Amazon, Brazil. Experimental and Applied Acarology. DOI /s , MARTINS, J.R.M.; MEDRI, I.M.; OLIVEIRA, C.M.; GUGLIELMONE, A.A. Ocorrência de carrapatos em tamanduá-bandeira (Myrmecophaga tridactyla) e tamanduá-mirim (Tamandua tetradactyla) na região do Pantanal sul-mato-grossense, Brasil. Ciência Rural, v. 34, n.1,p , MASSARD, C.L.; FONSECA, A.H. Carrapatos e doenças transmitidas comuns ao homem e aos animais. A Hora Veterinária,v.135, n.1, p , MEDRI, I.M.; MARTINS, J.R.; DOYLE, R.L.; MOURÃO, G.; MARINHO-FILHO, J. Ticks (Acari: Ixodidae) from Yellow Armadillo, Euphractus sexcinctus (Cingulata: Dasypodidae), in Brazil s Pantanal Wetlands. Neotropical Entomology, v. 39, n. 5, p , MIZIARA, S.R.; PAIVA, F.; ANDREOTTI, R.; KOLLER, W.W.; LOPES V.; PONTES, N.T.; BITEN- COURT, K. Ocorrência de Ixodes Loricatus Neumann, 1899 (Acari: Ixodidae) parasitando Didelphis albiventris (Lund, 1841), (Didelphimorphia: Didelphidae), em Campo Grande, MS. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v. 17, n.3, p , NUÑES, J.L.; MUÑOZ COBENAS, M.E.; MOLTEDO, H.L. Boophilus microplus, la garrapata comun del Ganado vacuno. Buenos Aires: Hemisfério Sur, p. O DWYER, L.H.O; MASSARD, C.L. Aspectos gerais da hepatozoonose canina. Clínica Veterinária, ano 6, n.31, p.34-39, 2001.

31 Capítulo 2 Espécies de carrapatos relatadas no estado de Mato Grosso do Sul 31 ONÓFRIO, V.C. Revisão do gênero Amblyomma Koch, 1884 (Acari: Ixodidae) no Brasil f. Tese (Doutorado).- Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ. PEREIRA, M.C.P.; SZABÓ, M.P.J.; BECHARA, G.H.; MATUSHIMA, E.R. DUARTE, J.M.B.; RE- CHAV, Y., FIELDEN, L.; KEIRANS, E. Ticks (Acari: Ixodidae) associated with wild animals in the Pantanal Region of Brazil. Journal of Medical Entomology, v. 37, n.6, p , PIGNATI, M.G. Saúde e ambiente: as doenças emergentes no Brasil. Ambiente e Sociedade, v. 7, n.1, 16 p., jan./jun., PRETTE, N. ; GIROTO, V.D. ; MOCHI, D. A. ; MONTEIRO, A. C. ; GARCIA, M. V. ; AN- DREOTTI, R. Efetividade de isolados de Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae como bioagentes de controle do carrapato Argas miniatus. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE PARA- SITOLOGIA VETERINÁRIA,17., 2012, São Luis, MA. Anais. São Luis: Colegio Brasileiro de Parasitologia Veterinária, v. 1. p RECK, J,; SOARES, C.T.; TERMIGNONI, C.; LABRUNA, M.B.; MARTINS, J.R. Tick toxicosis in a dog bitten by Ornithodoros brasiliensis. Veterinary Clinical Pathology, v. 40, n.3, p , ROBY, T.O.; ANTHONY, D.W. Transmission of equine piroplasmosis by Dermacentor nitens Neumann. Journal of the American Veterinary Medical Association, v.142, n.2, p , SANTOS, H.A.; EVANGELISTA, F.N.; TAJIRI, J.T.; FRANGUE, M.P.; SANTOS, T.M. dos; MAS- SARD, C.L. Biological aspects of Argas (Persicargas) miniatus Kock, 1844, (Ixodidae Argasidae). Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, 1, 45-49, STILLER, D. ; FRERICHS, W.M. Experimental transmission of Babesia caballi to equids by different stages of the tropical horse tick, Anocentor nitens (Neumann) (Acari: Ixodidae), pp In: RODRIGUEZ, J. G. (Ed.). Recent advances in acarology. New York: Academic Press, v. 2, p SZABÓ, M.P.J.; CASTRO, M.B.; RAMOS, H.G.C.; GARCIA, M.V.; CASTAGNOLLI, K.C.; PIN- TER, A.; VERONEZ, V.A.; MAGALHÃES, G.M.; DUARTE, J.M.; LABRUNA, M,B. Species diversity and seasonality of free-living ticks (Acari: Ixodidae) in the natural habitat of wild Marsh deer (Blastocerus dichotomus) in Southeastern Brazil. Veterinary Parasitology, v.143, p , SZABÓ, M.P.J.; LABRUNA, M.B.; PEREIRA, M.C.; DUARTE, J.M.B. Ticks (Acari: Ixodidae) on wild Marsh-Deer (Blastocerus dichtomus) from Southeast Brazil: Infestation before and after habitat loss. Journal of Medical Entomology, v. 40, n.3, p , SZABÓ, M.P.J.; MUKAI, L.S.; ROSA, P.C.S. Differences in the acquired resistance of dogs, hamsters, and guinea pigs to repeated infestations with adult ticks Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae). Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v. 32, n. 1, p , VERONEZ, V.A.; ZANOLLI, B.F.; OLEGARIO, M.M.M.; CARVALHO, W.M.; TOLESANO, G.V.; THORGA, K.; GARCIA, M.V.; SZABO, M.P.J. Ticks (Acari: Ixodidae) within various phytophysiognomies of a Cerrado reserve in Uberlândia, Minas Gerais, Brazil. Experimental Applied Acarology, v. 50, n.2, p , WALKER, J.B.; KEIRANS, J.E.; HORAK, I.G. (Ed.). The genus Rhipicephalus (Acari:Ixodidae): a guide to the brown ticks of the world. Cambridge: Cambridge University Press, p. WALKER, J.B. ; OLWAGE, A. The tick vectors of Cowdria ruminantium (Ixododiea, Ixodidae, genus Amblyomma) and their distribution. Onderstepoort Journal of Veterinary Research, v. 54, p , WANG, H.; NUTTALL, P.A. Immunoglobulin binding proteins in ticks: New target for vaccination development against the bloodfeeding parasite. Cellular and Molecular Life Sciences, v. 56, p , YOSHINARI, N.H; BARROS, P.J.L.; BONOLDI, V.L.N. Perfil da Borreliose de Lyme no Brasil. Revista do Hospital das Clínicas, São Paulo, v.52, p , 1997.

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33 3 Principais doenças transmitidas por carrapatos no Brasil Robson Almeida Ferreira Cavalcante de Almeida Renato Andreotti

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35 Capítulo 3 Principais doenças transmitidas por carrapatos no Brasil 35 INTRODUÇÃO Os carrapatos são cosmopolitas e estão amplamente dispersos no Brasil (BARROS- BATESTI et al., 2006), agindo como vetores de bioagentes (SONENSHINE 1991; ESTRADA-PEÑA; JONGEJAN, 1999), e por si só exercendo diversos efeitos deletérios no organismo do hospedeiro, que vão desde a lesão cutânea, à anemia ocasionada por uma infestação maciça, à inoculação de toxinas neurotrópicas que causam paralisia flácida ascendente (SERRA-FREIRE, 1983), paralisias setoriais, e eventualmente induzir à morte. Obviamente, tais efeitos variam conforme a espécie de carrapato e a área geográfica (SERRA- FREIRE et al., 2011). Para os animais de produção e trabalho os agentes do complexo da tristeza parasitaria (Anaplasma spp. e Babesia spp.) são os que merecem maior atenção. Nos animais de companhia, os carrapatos são considerados os ectoparasitos mais importantes e transmissores da erlichiose e babesiose canina, que são responsáveis por muitos óbitos, principalmente em raças de cães que são sensíveis a ixodidioses e seus agentes patogênicos (ALMEIDA et al., 2012a). Esses ectoparasitas também têm despertado o interesse da comunidade científica e de saúde pública devido à sua participação na transmissão de doenças e esse interesse vem aumentando por causa da emergência e reemergência dessas enfermidades e pela natureza zoonótica, e muitas vezes letal, que algumas exercem sobre os seres humanos. A capacidade desses parasitos de transmitirem os agentes patogênicos de um estágio para o outro (transmissão transestadial: de larvas para ninfa, ou de ninfa para adulto) e/ou entre gerações (transmissão transovariana de uma fêmea para seus ovos), fazem dos carrapatos grandes reservatórios de patógenos na natureza (LA- BRUNA, 2004). Desta forma, o conhecimento desse parasito e de seus patógenos, que participam diretamente na manutenção enzoótica de doenças in loco, também permitem obter informações sobre o diagnóstico rápido e preciso, de estratégias de controle da doenças em animais, e das antrozoonoses emergentes e re-emergentes transmitidas por carrapatos. PRINCIPaIS DOENÇaS TRaSMITIDaS POR CaRRaPaTOS animais de produção e trabalho Bovinos As principais doenças em bovinos transmitidas por carrapatos pertecem ao complexo da tristeza parasitária bovina (TPB). A TPB compreende duas enfermidades bem conhecidas: a babesiose, determinadas pelos protozoários Babesia bigemina (Figura 3.1) e Babesia bovis, e a anaplasmose determinada por Anaplasma marginale (ALMEIDA et al., 2006; GUEDES JÚNIOR et al., 2008). A TPB é responsável por grandes prejuízos econômicos como mortalidade no rebanho, queda na produção de leite, diminuição do ganho de peso, além de gastos com controle e profilaxia (GON- ÇALVES, 2000; GRISI et al., 2002; BARROS et al., 2005).

36 36 Capítulo 3 Principais doenças transmitidas por carrapatos no Brasil Na maioria das regiões do Brasil, o carrapato R. microplus, principal vetor de A. marginale e o único de B. bigemina e B. bovis, ocorre durante o ano inteiro e proporciona condições para que todos bezerros se infectem nos primeiros meses de vida. Neste período os bezerros precisam receber o colostro para obter os anticorpos protetores contra esses agentes para, desta forma estabelecer um quadro de equilíbrio enzoótico entre os parasitos e o hospedeiro. De acordo com trabalhos australianos a população bovina susceptível à babesiose é aquela que não se infecta até 9 meses de idade. Apesar destas circunstâncias tem sido constatada incidência de babesiose e anaplasmose em bezerros, principalmente na faixa etária entre um a quatro meses de idade, nos estados de Mato Grosso do Sul e de Minas Gerais (MADRUGA et al., 1987). Nos bovinos, a manifestação clínica da tristeza parasitária está na dependência da presença do vetor, caracterizando a região para condições de instabilidade e/ou estabilidade enzoótica, do clima, do manejo dos animais, das condições fisiológicas do hospedeiro e da raça (SOUZA et al., 2000). Com relação às babesioses, B. bovis e B. bigemina são as espécies mais comuns que infectam os bovinos (FIGUEROA et al., 1998). De modo geral, a babesiose bovina progride da forma aguda à crônica, dependendo do curso da infecção. O período de incubação é, geralmente, de 14 a 21 dias após o contato com carrapatos infectados. No entanto, esse período pode variar de acordo com as condiçoes fisiológicas e da imunidade do animal. As manifestações clínicas da doença são típicas de doenças com anemia hemolítica, e o quadro observado em bovinos adultos com B. bovis geralmente é mais patogênico do que em B. bigemina. Mais precisamente, quando ocorre a lise dos eritrócitos parasitados, subsequentemente os sinais clínicos aparecem, como anemia, icterícia, hemoglobinúria, incoordenação motora e sintomas de hipertermia, dispnéia e taquicardia. A evolução da doença está intimamente ligada com a idade do hospedeiro, imunidade humoral pelos anticorpos colostrais, quantidade do inócuo, virulência da amostra e do estado nutricional do animal (KUTTLER, 1998). Às vezes em infecções por B. bovis podem existir sinais neurológicos graves, que estão associados com sequestro de eritrócitos infectados em capilares cerebrais. FIGURA 3.1. Babesia bigemina (Foto: Arquivo pessoal).

37 Capítulo 3 Principais doenças transmitidas por carrapatos no Brasil 37 O diagnóstico laboratorial pode ser realizado por meio de esfregaço sanguíneo delgado, principalmente de sangue periférico (ponta de orelha), por reação em cadeia da polimerase e por métodos imunoenzimáticos. Organismos da Familia Anaplasmataceae compreendem um grupo de bactérias gram-negativas, intracelulares obrigatórias, que podem infectar animais e seres humanos (SACCHI et al., 2012). Em bovinos a anaplasmose é considerada uma das hemoparasitoses prevalentes (BARBET et al., 1987; PALMER, 1989). Guglielmone (1995) avalia que, nos Estados Unidos e nos países da América Central e do Sul, excetuando-se a Argentina e o Uruguai, a anaplasmose é um problema mais sério do que a babesiose. A anaplasmose clínica evolui para inapetência, depressão, parada da ruminação, emagrecimento, fezes escuras, taquicardia, taquipneia, constipação intestinal e mucosas ictéricas e pálidas. Como não há destruição dos glóbulos vermelhos na anaplasmose, os eritrócitos infectados são, posteriormente, fagocitados por macrófagos, especialmente no baço, resultando em um quadro de intensa anemia, mas sem ocorrer hemoglobinúria e hemoglobinemia. A transmissão é feita principalmente por carrapatos R. microplus, no entanto, moscas, mosquitos e outros insetos picadores, como os tabanídeos podem trasmitir a doença (ARTECHE, 1992; SCOLES et al., 2005). No entanto, a capacidade de transmissão de A. marginale por insetos hematófagos deve ser objeto de mais pesquisas antes de considerá-los como vetores epidemiologicamente importantes (KESSLER, 2001). A. marginale multiplica-se nas células do epitélio intestinal do carrapato e este pode infectar-se em qualquer estágio. A transmissão para o bovino ocorre de estágio para estágio e os machos, por sua maior longevidade e mobilidade, são considerados mais importantes na transmissão da anaplasmose (KESSLER; SCHENK, 1998) e servem como reservatórios da infecção. Eritrócitos são as células alvo de A. marginale, que sofre um ciclo de desenvolvimento complexo, que se inicia nos carrapatos por infecção de células intestinais, e a transmissão aos hospedeiros susceptíveis ocorre a partir de glândulas salivares durante a alimentação. Proteínas principais de superfície (MSPs) desempenham um papel crucial na interação do agente com células do hospedeiro, e incluem proteínas de adesão e MSPs de famílias multigênicas que sofrem alteração antigênica e seleção em bovinos, contribuindo, assim, para a manutenção de infecções persistentes (KO- CAN et al., 2010). Como a imunidade contra A. marginale pode ser induzida por imunização com MSPs, a identificação dessas proteínas conservadas entre A. marginale stricto sensu podem ser úteis na identificacação de proteínas candidatas a antigenos para diagnósticos e para produção de vacina (ARAUJO et al., 2005; KOCAN et al., 2010). As vacinas têm protegido eficazmente a anaplasmose clínica em bovinos, mas não conseguiram bloquear a infecção por A. marginale. As vacinas são necessárias para prevenir a doença clínica e, simultaneamente, evitar a infecção em animais e carrapatos, eliminando, assim, estes hospedeiros como reservatórios da infecção. Avanços em genômica, proteômica, imunologia e tecnologias bioquímicas e moleculares durante a última década têm sido aplicados à pesquisa de A. marginale e organismos relacionados. O recente desenvolvimento de um sistema de cultura de células para A. marginale tem proporcionado um formato para estudar a relação patógeno/car-

38 38 Capítulo 3 Principais doenças transmitidas por carrapatos no Brasil rapato (HERNDON et al., 2010). Os avanços recentes e novas metodologias de pesquisa devem oferecer oportunidades adicionais para o desenvolvimento de novas estratégias de prevenção e controle da anaplasmose bovina. Mais estudos são necessários para compreender os mecanismos de regulação exercidos por A. marginale sobre o sistema imunológico bovino, para delineamento de estratégias mais eficientes de imunização contra essa riquétsia (RIBEIRO et al., 2006). Equídeos Em equinos as principais enfermidades transmitidas por carrapatos são as babesioses e a erliquiose granulocítica equina. A babesiose tem sido citada como a principal parasitose equina por causa dos danos diretos como as perdas de performance e mortalidade, além de danos indiretos como o impedimento para comercialização e principalmente exportação (FRIE- DHOFF et al., 1990). Pode ser causada por dois hematozoários distintos, Babesia caballi (Figura 3.2) e Babesia equi (sinonímia de Theileria equi) (Figura 3.3), que são transmitidos naturalmente por meio de carrapatos, sendo que os equídeos podem ser parasitados por uma ou ambas as espécies de Babesia spp. Estudos epidemiológicos em criações de equinos na América do Sul revelaram elevada infestação por D. nitens, R. microplus e A. cajennense associada a altos níveis de babesioses em equinos, sendo a primeira espécie associada à B. caballi e as duas últimas à T. equi (RONCATI, 2006). FIGURA 3.3. FIGURA 3.2. Babesia caballi (Foto: PIOTTO, 2009). Theileria equi (Foto: PIOTTO, 2009).

39 Capítulo 3 Principais doenças transmitidas por carrapatos no Brasil 39 Os animais doentes podem apresentar clinicamente febre, anemia, petéquias ou até hemorragias de membranas mucosas, icterícia e hemoglobinúria. Após o período de incubação que é de cerca de 8 a 10 dias, o primeiro sinal evidente é o aumento de temperatura corpórea, que pode se apresentar em picos ao final da tarde. A anemia é causada pela diminuição no número de eritrócitos, havendo hemólise intravascular, resultando em liberação de hemoglobina e deposição de bilirrubina nos tecidos (icterícia). A parasitemia de Babesia caballi pode chegar a 1% das células, da linhagem vermelha e dificilmente o animal morre de anemia, mas principalmente pela formação de microtrombos. No caso de Theileria equi a parasitemia é maior, comumente por volta de 7% dos eritrócitos, mas em animais imunodeprimidos ou sem qualquer contato prévio, a parasitemia pode chegar a 80% e a morte se dá por anemia aguda. O diagnóstico desses hematozoários é realizado, principalmente, por meio de esfregaços sanguíneos corados, entretanto a sensibilidade desta tecnica é baixa, e muitos animais apresentam resultados falso negativos. Outros testes utilizados para diagnóstico são a reação em cadeia da polimerase (PCR) e testes de imunoadsorção enzimática (celisa). Nos ensaios sorológicos, apesar de resultados positivos não diferirem animais portadores daqueles que apresentam apenas anticorpos de memória, essas provas são de grande sensibilidade e confirmam os resultados negativos, diminuindo os riscos de se introduzir animais portadores em áreas onde a doença não é endêmica e os carrapatos vetores estão presentes (PIOTTO, 2009). Outra importante enfermidade dos equideos associada a carrapatos, a erliquiose granulocítica equina é uma doença infecciosa, não contagiosa sazonal, que ocorre principalmente nos EUA, no norte da Califórnia, mas também notificada em vários outros estados, bem como na Europa e América do Sul. O agente causal foi inicialmente denominado Ehrlichia equi, mas com base em relações de sequência de DNA, o organismo é agora referido como Anaplasma phagocytophilum que, além de ser um problema médico-veterinário é, também, de saúde pública, por acometer tanto animais como humanos (DAGNONE et al., 2001). A. phagocytophilum é uma bactéria intracelular de glóbulos brancos e a severidade dos sinais clínicos é variável, com base numa diversidade de fatores incluindo idade, raça e pode ser evidente de 1 a 12 dias pós-inoculação. Após a inoculação da bactéria os cavalos desenvolvem sinais progressivos de febre, depressão, letargia, anorexia parcial, edema de membros, lesões petéquias, icterícia e outras complicações podem ser incluídas, como abortos (STUEN, 2007). A morte dos equinos é considerada um fato raro, no entanto, traumas por ataxia e infecções secundárias agravam o quadro e podem ocorrer abortos (FRANZÉN et al., 2007). Outros animais domésticos também podem ser infectados com esta riquétsia e serem considerados reservatórios do agente (TORINA et al., 2008), ou podem desenvolver doenças subclínicas e atuarem como amplificadores da infecção para os carrapatos. O diagnóstico tem sido confirmado a partir dos sinais clínicos, alterações hematológicas, e principalmente pela visualização dos corpúsculos de inclusão em células do sistema monocítico fagocitário presente nos esfregaços sanguíneos. Também pode ser diagnosticada por meio de ensaio imunoenzimático indireto (i-elisa) e por técnica de biologia molecular (PARRA, 2009).

40 40 Capítulo 3 Principais doenças transmitidas por carrapatos no Brasil Cães As hemoparasitoses babesiose e erlichiose são as doenças infecciosas transmitidas por carrapatos mais comuns em cães. São conhecidas popularmente como doenças de carrapato, pois seu principal vetor e reservatório é o carrapato R. sanguineus conhecido como carrapato marrom ou carrapato vermelho do cão (DANTAS- TORRES et al., 2004). A transmissão de Babesia spp. ocorre por meio da picada de ixodídeos, que inoculam esporozoítos presentes em sua glândula salivar (SOLANO-GALLEGO; BA- NETH, 2011). A propagação de B. canis (Figura 3.4) pelo carrapato ocorre de duas formas distintas: transmissão transestadial ou horizontal e, a transmissão transovariana ou vertical. Na primeira, os carrapatos adquirem Babesia spp. nos estágios de larva e ninfa, e a transmitem no estágio seguinte. Já na segunda, os esporocinetos invadem os ovários da fêmea ingurgitada, e como consequência as larvas eclodem infectadas (O DWYER; MASSARD, 2002). Os agentes etiológicos da babesiose canina são Babesia gibsoni e Babesia canis, sendo que esta última ocorre mundialmente com alta prevalência, nas regiões tropicais e subtropicais, (TABOADA et al., 1992). São conhecidas três subespécies de B. canis: B. canis canis transmitida por Dermacentor reticulatus na Europa; B. canis vogeli, transmitida por R. sanguineus em regiões tropicais e subtropicais e B. canis rossi, transmitida pelo Haemophysalis leachi na África do Sul. Sob a classificação de B. gibsoni provavelmente se encontram espécies diferentes, porque existe uma diversidade genética muito grande entre os isolados da Ásia, Europa e Estados Unidos. Estudos realizados com isolados brasileiros de babésias de cães mostram que no Brasil a babesiose canina é causada predominantemente por B. canis vogeli, com relatos de ocorrência de B. gibsoni no sul do país (JOJIMA et al., 2008). A babesiose monocítica canina é uma doença cosmopolita, com ampla distribuição geográfica e determinada por protozoários intraeritrocitários, responsáveis por manifestações clínicas severas e a morte de canídeos em várias regiões do mundo. As infecções por Babesia spp. têm como principal manifestação a anemia hemolítica severa, sendo que os anticorpos produzidos pelo organismo do próprio indivíduo são responsáveis pelo quadro de anemia hemolítica (FURLANELLO et al., 2005). Nesses casos ocorrem hemólises intra e extravasculares. A primeira acontece quando há FIGURA 3.4. Babesia canis (Foto: Arquivo pessoal).

41 Capítulo 3 Principais doenças transmitidas por carrapatos no Brasil 41 rompimento das hemácias pelo parasita e quando os eritrócitos são destruídos pelo sistema complemento. A hemólise extravascular ocorre por causa dos eritrócitos parasitados presentes na corrente sanguínea que são fagocitados por macrófagos do baço e do fígado (FURLANELLO et al., 2005). A erliquiose monocítica canina (EMC) é uma das mais importantes doenças transmitidas por carrapatos, sendo determinada por uma bactéria intracelular obrigatória, a Ehrlichia canis, com distribuição mundial, especialmente em áreas tropicais e subtropicais. No Brasil foi descrita pela primeira vez em 1973, sendo a espécie mais comum do gênero Ehrlichia spp. (LABRUNA et al., 2007). A EMC geralmente apresenta um período de incubação de 8 a 20 dias. A doença é caracterizada por manifestações clínicas multissistêmicas, que variam na intensidade de acordo com as fases da doença, quais sejam: aguda, assintomática (subclínica) e crônica. Durante a fase aguda, os cães infectados se recuperam espontaneamente, entrando numa fase assintomática ou subclínica, podendo permanecer infectados por longos períodos. Nesta fase, cães imunocompetentes podem eliminar o parasita ou, ocasionalmente, desenvolvem a fase crônica da doença, caracterizada por supressão medular, sangramentos por mucosas e conjuntivas e alta letalidade (HARRUS et al., 1997). O diagnóstico da erliquiose canina é alcançado pela avaliação clínica do animal, associado a apresentações hematológicas, sorologia e por técnica de biologia molecular. Zoonoses No Brasil, os carrapatos sempre foram estudados em Medicina Veterinária pela grande capacidade de transmissão de patógenos aos animais, no entanto, sua importância na Saúde Pública vem aumentando ao longo dos anos, principalmente pela emergência de doenças em humanos associadas a carrapatos. Mesmo que no Brasil, muitas dessas doenças ainda não tenham sido diagnosticadas, estudos devem ser realizados para a observação de anticorpos circulantes em humanos, distribuição e presença dessas enfermidades. A anaplasmose, babesiose, erliquiose e outras doenças têm sido estudadas e reconhecidas pela sua importância em Saúde Pública Veterinária. São zoonoses carrapato associadas, determinadas por agentes intracelulares e com relatos escassos de sua ocorrência. Os sintomas geralmente incluem febre, mialgia, dor de cabeça e, com erupção em casos raros, podendo levar à morte. Essas doenças, em virtude da dificuldade do diagnóstico clínico e a ausência de sinais clínicos patognomônicos do acometimento, podem levar a casos de subnotificação dessas patologia, dificultando a elaboração de medidas de profilaxia e controle. No Brasil, são duas as zoonoses mais estudadas que possuem como vetores carrapato. A Febre Maculosa com vários relatos de ocorrência dessa enfermidade, principalmente no Sudeste, e a Doença de Lyme. Esta última tem por base dados clínicos, sorológicos e epidemiológicos que evidenciam a existência de uma borreliose no Brasil com características semelhantes à Doença de Lyme norte-americana.

42 42 Capítulo 3 Principais doenças transmitidas por carrapatos no Brasil Febre Maculosa A Febre Maculosa no Brasil apresenta-se como doença infecciosa aguda, de gravidade variável, determinada por Rickettsia rickettsii e, pelo que se conhece até o momento, é transmitida por carrapatos do gênero Ambyomma spp., e a ecologia e a distribuição do carrapato vetor determinam os principais aspectos epidemiológicos desta enfermidade (LEMOS et al., 1997). A doença apresenta uma sazonalidade bastante definida, onde o número de casos se concentram de setembro a novembro, fato que pode ser explicado pela maior atividade dos carrapatos nesta época, pois é na primavera e verão que se encontram as melhores condições para a multiplicação desses vetores. Mesmo sendo relatados como hospedeiros acidentais, não sendo considerados reservatórios da doença, e também não colaborarem com a propagação do agente, os seres humanos são acometidos de maneira bastante intensa pelo agente. Após a penetração no corpo, pela picada do carrapato, as riquétsias invadem as células endoteliais da parede vascular e a partir daí disseminam-se pelo organismo por via hematógena ou linfática. A multiplicação bacteriana gera uma vasculite e induz a ativação e do sistema de coagulação, podendo levar a um quadro de trombose. As lesões geradas no endotélio vascular provocam aumento da permeabilidade capilar e, frequentemente, distúrbios hemostáticos podendo levar à formação de petéquias, escaras, úlcera pruriginosas e exantema (BROUQ, 1997). Pelo quadro clínico da Febre Maculosa Brasileira podemos considerá-la uma doença multissistêmica, que apresenta um curso variável, desde quadros clássicos até formas atípicas sem exantema, viscerotrópicas e fulminantes. Inicia-se, geralmente de forma abrupta, com manifestações inespecíficas tais como febre, mal- -estar generalizado, cefaleia, hiperemia conjuntival e mialgias. Os sinais e sintomas clínicos podem variar com comprometimento gastrintestinal com náusea, vômito, dor abdominal, diarreia e, eventualmente, comprometimento hepático com icterícia; manifestações renais com azotemia pré-renal relacionada à hipovolemia e à necrose tubular aguda; comprometimento pulmonar com tosse, edema pulmonar e alterações radiológicas incluindo infiltrado alveolar, pneumonia intersticial, derrame pleural; manifestações neurológicas como déficit neurológico, meningite/ encefalite e vasculite retiniana (DONOHUE, 1980; WALKER, 1989; DOEN- ÇAS..., 2010). O exantema é o sinal mais importante da febre maculosa, e aparece geralmente no terceiro-quinto dia de doença, podendo estar ausente em 15% a 20% dos pacientes, o que dificulta e retarda o diagnóstico, determinando maior número de óbitos. Inicialmente macular, o exantema pode evoluir posteriormente para um padrão maculopapular-petequial. Geralmente, no início da doença atinge as extremidades, disseminando-se a seguir centripetamente para o tronco. Pode envolver as palmas das mãos e solas dos pés, o que auxilia o diagnóstico, embora este comprometimento não seja observado em todos os casos. Podem ser observadas lesões equimóticas ou purpúricas, determinando necrose/gangrena, em decorrência da extensa lesão da microcirculação, requerendo, às vezes, amputação de dedos ou membros (KAPLO- WITZ et al., 1983; HELMICK et al., 1984; DANTAS-TORRES, 2007).

43 Capítulo 3 Principais doenças transmitidas por carrapatos no Brasil 43 Dentre as doenças transmitidas por carrapatos, as riquetsioses têm recebido especial atenção em todo mundo, sendo consideradas doenças de ameaça emergente global (LIM et al., 2012). Todas as espécies de riquétsias do GFM conhecidas até o momento mantêm seu ciclo de vida na natureza entre o carrapato vetor e algumas espécies de mamíferos silvestres, chamados de hospedeiros amplificadores. Desta forma, o efeito amplificador que alguns hospedeiros silvestres desempenham deve existir para assegurar a manutenção da bactéria na natureza (BURGDORFER, 1988). Nesse caso, o hospedeiro amplificador mantém a população bacteriana em níveis altos em sua corrente sanguínea por alguns dias ou semanas, garantindo que novos carrapatos se infectem, amplificando a infecção na população de carrapatos (BURGDORFER, 1988; LABRUNA et al., 2001). No Brasil, os carrapatos do gênero Amblyomma spp. estão distribuídos por todas as regiões (BARROS-BATTESTI et al., 2006), servindo como vetores competentes para a transmissão de Rickettsia spp. Estudos in loco devem ser realizados para identificar a presença de riquétsias na natureza e as relações epidemiológicas desses bioagentes com os hospedeiros locais, especialmente em áreas sem relato de casos, mas que apresentam condições favoráveis à circulação dessas bactérias. A identificação dos hospedeiros amplificadores é um ponto importante no entendimento epidemiológico das riquetsioses, pois muitos deles colonizam áreas urbanas e peridomiciliares, determinando a aproximação dos seres humanos e animais domésticos à ixodofauna silvestre potencialmente infectada, aumentando a probabilidade de novos contágios. No Brasil existem casos registrados de febre maculosa em vários estados, em especial nos estados da região Sudeste. No estado de São Paulo existem vários estudos destacando a ocorrência de riquétsias em vetores e hospedeiros. Na região Centro- Oeste do Brasil, embora existam as condições ideais para circurculação do agente, somente no Estado de Mato Grosso do Sul foram identificadas bactérias do grupo da Febre Maculosa Brasileira infectando carrapatos das espécies Amblyomma calcaratum (OGRZEWALSKA et al., 2012), Amblyomma nodosum (ALMEIDA et al., 2012b). Em ambos os casos foi determinada a presença da Rickettsia parkeri-like, que é patogênica para seres humanos e determina sinais clínicos mais moderados, como linfoadeadenopatia e lesões papulares no local da picada do carrapato (WITHMAN et al., 2007). Doença de Lyme Esta zoonose é causada por espiroquetas pertencentes ao complexo Borrelia burgdorferi sensu lato (sl), que compreende pelo menos 18 genoespécies em todo o mundo (CHU et al., 2008; MARGOS et al., 2010). O complexo Borrelia burgdorferi sl inclui um grupo com grande número de agentes infecciosos causadores de doenças capazes de comprometer vários órgãos, razão pela qual despertam interesse em várias especialidades médicas, como a dermatologia, reumatologia, cardiologia, neurologia e doenças infecciosas (ABELE; ANDER, 1990; YOSHINARI et al., 1995). O espectro de apresentação clínica dessa enfermidade difere conforme as regiões geográficas, associando-se às características antigênicas de Borrelia spp. encontradas no local, assim como a sua interação com o ecossistema e o vetor presente na região (ABELE; ANDER, 1990). Na América do Norte há predomínio de manifestações cutâneas e

44 44 Capítulo 3 Principais doenças transmitidas por carrapatos no Brasil articulares; no continente Europeu, de manifestações cutâneas e neurológicas; e na Ásia a sintomatologia é, basicamente, cutânea (YOSHINARI et al., 1995; SOARES et al., 2000). Em qualquer situação o eritema migratório recidivante (EMR) é o mais relevante achado, permitindo a suspeita clínica (BERGER et al., 1983). As borrélias patogênicas conhecidas determinam cinco grupos de enfermidades distintas: (a) Febre Recorrente Epidêmica Humana (FREH), causada por B. recurrentis, e febre recorrente endêmica, com mais de 20 espécies do gênero Borrelia spp. até recentemente nominadas de acordo com o carrapato transmissor; (b) borreliose aviária, a qual é determinada por uma única espécie, B. anserina, e causa processo anêmico febril, apatia e altas taxas de morbidade nas aves; (c) borreliose bovina, causada pela B. theileri, espécie cosmopolita que pode determinar discreto processo anemiante em ruminantes e eqüinos, sendo considerada pouco patogênica; (d) aborto enzoótico bovino, enfermidade que acomete bovinos e cervídeos, determinada pela B.coriaceae; (e) borreliose de Lyme (ou doença de Lyme) e borreliose de Lyme simile, as quais são causadas pelogrupo da B. burgdorferi sl (SOARES et al., 2000). Considerando as diferenças etiológicas e os aspectos clínicos e laboratoriais, quando comparada com a borreliose de Lyme norte-americana ou europeia, a infecção no Brasil deve ser referida como borreliose de Lyme-símile (YOSHINARI et al., 2003), com os primeiros casos publicados no início da década de 1990 (AZULAY et al., 1991; YOSHINARI et al., 1992), sendo que os prováveis carrapatos responsáveis pelo ciclo silvestre pertencem ao gênero Ixodes, enquanto que gênero Amblyomma spp. estaria implicado na transmissão a animais domésticos e seres humanos (ABEL et al., 2000, SOARES et al., 2000, YOSHINARI et al., 2003). Estudos conduzidos por Ishikawa et al. (1999), indicaram que soros bovinos analisados pelo teste ELISA indireto apresentaram altos títulos de anticorpos IgG contra B. burgdorferi, e em alguns animais soropositivos verificaram a presença de claudicação e aumento de volume da articulação rádio-carpiana. Na mesma região, também foram identificados casos humanos com suspeita clínica e sorologia positiva (ELISA e Western blotting ) para Borreliose de Lyme. Apesar de que várias técnicas de diagnósticos são eficazes, existe ainda a necessidade de desenvolver tecnologia rápida e de baixo custo, que pode ser utilizada em levantamentos de campo, bem como em ambientes de clínicas. Também existe a necessidade de desenvolvimento de técnicas que permitam a identificação eficiente e que sejam capazes de diferenciar as genoespécies de Borrelia spp. em carrapatos (HOUCK et al, 2011). CONSIDERaÇõES FINaIS Carrapatos são eficientes vetores de doenças para seres humanos e responsáveis por transmissão de doenças em animais. Apesar de amplamente estudados esses parasitas estão se mantendo na natureza e nos setores produtivos, transmitindo patógenos e mantendo os agentes no meio ambiente. A utilização de maneira indiscriminada de produtos carrapaticidas tem levado à seleção de populações de carrapatos resistentes a esses compostos que, associados às mudanças ambientais e antrópicas, podem levar a outros fatores de risco epidemiológico.

45 Capítulo 3 Principais doenças transmitidas por carrapatos no Brasil 45 REFER ÊNCIAS ABEL, I. S.; MARZAGÃO, G.; YOSHINARI, N. H.; SCHUMAKER, T. T. S. Borrelia-like spirochetes recovered from ticks and small mammals collected in the Atlantic Forest Reserve, Cotia County, State of São Paulo, Brazil. Memória Instituto Oswaldo Cruz, v. 95, n. 5, p , ABELE, D. C.; ANDER, K. H. The many faces and phases of borreliosis I. Lyme disease. Journal of the American Academy of Dermatology, v. 23, p , ALMEIDA, M. B.; TORTELLI, F. P.; RIET-CORREA, B.; FERREIRA, J. L. M.; SOARES, M. P.; FARIAS, N. A. R.; RIET-CORREA, F.; SCHILD, A. L. Tristeza parasitária bovina na região sul do Rio Grande do Sul: estudo retrospectivo de Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 26, n. 4, p , ALMEIDA, R. F. C.; MATIAS, J.; GARCIA, M. V.; CUNHA, R. C.; ANDREOTTI, R. (2012a). Importância dos carrapatos na transmissão da Febre Maculosa Brasileira [recurso eletrônico] - Brasília, DF (Documentos / Embrapa Gado de Corte, ISSN X; 193). Embrapa, p. ALMEIDA R.F.C.; GARCIA M.V.; CUNHA, R.C.; MATIAS J.; LABRUNA M.B.; ANDREOTTI R (2012b). The first report of Rickettsia spp. in Amblyomma nodosum in the State of Mato Grosso do Sul, Brazil. Ticks and Tick-borne Diseases, v. 4, p , ARAÚJO, F. R.; MELO, E. S. P.; RAMOS, C. A. N.; MADRUGA, C. R.; SOARES, C. O.; KESSLER, R. H.; ALMEIDA, N. F.; ARAÚJO, G. S.; TORRES, R. A. A.; FRAGOSO, S. P.; ARAUCO, P. R. C.; BACANELLI, G.; OLIVEIRA, M. B.; SANTOS, L. R. Development of enzyme-linked immunoadsorbent assays based on recombinant MSP1a and MSP2 of Anaplasma marginale. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 100, n. 7, p , ARAÚJO, F. R.; MADRUGA, C. R.; RAMOS, C. A. N.; MELO, E. S. P.; ALMEIDA, M. C.; FRAGOSO, S. P.; KESSLER, R. H.; SOARES, C. O.; OLIVEIRA, M. B.; VAN ONSELEN, V. J. Imunização de bovinos com MSP1a e MSP2 recombinantes de Anaplasma marginale com CpG ODN 2006 como adjuvante, e desafio com isolado heterólogo. Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento / Embrapa Gado de Corte, ISSN , p. ARTECHE, C.C.P. Imunoprofilaxia da Tristeza Parasitária Bovina (TPB) no Brasil. Uso de cepas atenuadas de Babesia spp e de cepa heteróloga de Anaplasma. A Hora Veterinária, v. 11, n.66, p.39-42, AZULAY, R. D.; ABULAFIA, L.; SODRE, C. S. Lyme disease in Rio de Janeiro, Brazil. International Journal of Dermatology, v. 30, n. 71, p , BARBET, AF, PALMER, GH, MYLER, PJ & MCGUIRE, TC. Characterization of an immunoprotective protein complex of Anaplasma marginale by cloning and expression of the gene coding for polypeptide Am105L. Infection Immunity, v. 55, p , BARROS, S. L.; MADRUGA, C. R.; ARAÚJO, F. R.; MENK, C. F.; ALMEIDA, MAO & KESSLER, R. H. Serological survey of Babesia bovis, Babesia bigemina and Anaplasma marginale antibodies in cattle from the semi-arid state of Bahia, Brazil, by enzyme-linked immunosorbent assays. Memórias Instituto Oswaldo Cruz, v. 100, n. 6, p , BARROS-BATTESTI, D. M.; ARZUA, M.; BECHARA, G. H. Carrapatos de importância médico veterinária da Região Neotropical: Um guia ilustrado para identificação de espécies. São Paulo: Butantan, 2006, 223 p. BERGER, B. W.; CLEMMENSON, O. J.; ACKERMANN, A. B Lyme disease is a spirochetosis: a review of the disease and evidence of its cause. American Journal of Dermatopathology, v. 5, n.24, p. 111, BROUQUI, P. Tropical animal and human rickettsial infections. Medicine Tropicale, n. 57, p , BURGDORFER, W. Ecological and epidemiological considerations of RockY Mountain spotted fever and scrub typhus. In: DH Walker, Biology of Rickettsial Diseases, v. 1, p CRC Inc, Boca Raton, FL CHU, C.Y.; LIU, W.; JIANG, B.G.; WANG, D.-M.; JIANG, W.-J.; et. al. Novel genospecies of Borrelia burgdorferi sensu lato from rodents and ticks in southwestern China. Journal of Clinical Microbiology, v.46. p , DAGNONE, A. S.; MORAIS, H., S., A.; VIDOTTO, O. Erliquiose nos animais e no homem. Semina: Ciências Agrárias, v.22, n.2, p , 2001.

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48 48 Capítulo 3 Principais doenças transmitidas por carrapatos no Brasil SOARES, C. O.; ISHIKAWA, M. M.; FONSECA, A. H.; YOSHINARI, N. H. Borrelioses, Agentes e Vetores. Pesquisa Veterinária Brasileria, v. 20, p. 1-19, SOLANO-GALLEGO, L.; BANETH, G. Babesiosis in dogs and cats. Expanding parasitological and clinical spectra. Veterinary. Parasitology, v.181, p.40-60, SONENSHINE, DE Biology of ticks. ed. 1. New York: Oxford University Press. SOUZA, J.C.P.; SOARES, C. O.; MASSARD, C. L.; SCOFIELD, A.; FONSECA, A. H. Seroprevalence of Anaplasma marginale in cattle in the Norte Fluminense mesoregion. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 20, n. 3, p , STUEN, S. Anaplasma phagocytophilum - the most widespread tick-borne infection in animals in Europe. Veterinary Research Communications, v.31, p , TABOADA, J.; HARVEY, J. W.; LEVY, M. G.; BREITSCHWERDT, E. B. Seroprevalence of babesiosis in Greyhounds in Florida. Journal of the American Veterinary Medical Association, v. 200, n. 1, p , TORINA, A.; ALONGI, A.; NARANJO, V.; SCIMECA, S.; NICOSIA, S.; Di MARCO, V.; CARA- CAPPA, S.; KOCAN, K. M.; De la FUENTE, J. Characterization of Anaplasma Infections in Sicily, Italy. Animal Biodiversity and Emerging diseases: Annals New York Academic Science, v.1149, p , WALKER, D. H. Rocky Mountain Spotted Fever: a disease in need of microbiological concern. Clinical Microbiology Reviews, v.2, n.3, p , WITHMAN, T. J.; RICHARDS, A. L.; PADDOCK, C. D.; TAMMINGA, C. L.; SNIEZEK, P. J, JIANG, J.; BYERS, D. K.; SANDERS, J. W. Rickettsia parkeri infection after ticks bite, Virginia. Emerging Infectious Diseases, v.13, p , YOSHINARI, N. H.; BARROS, P. J. L.; YASSUDA, P.; BAGGIO, D.; STEERE, A. C.; COSSER- MELLE, W. Estudo epidemiologico da doenca de lyme no Brasil. Revista do Hospital das Clínicas, v. 47, n.5, p.71, YOSHINARI, N. H.; BARROS, P. J. L.; FONSECA, A. H.; BONOLDI, V. L. N.; BATTESTI, D. M.; SCHUMAKER, T. S.; COSSERMELLI, W. Borreliose de Lyme - zoonose emergente de interesse multidisciplinar. NewsLab, v.3 n. 12, p , YOSHINARI, N. H.; ABRAO, M. G.; BONOLDI, V. L. N.; SOARES, C. O.; MADRUGA, C. R.; et al. Coexistence of antibodies to tick-borne agents of Babesiosis and Lyme Borreliosis in patients from Cotia County, State of Sao Paulo, Brazil. Memória Instituto Oswaldo Cruz, v. 98, n.8, p. 311, 2003.

49 4 Tristeza parasitária bovina: avanços no controle Lenita Ramires dos Santos Flábio Ribeiro de Araújo Carlos Alberto do Nascimento Ramos Claudia Cristina Gulias Gomes Emanuelle Baldo Gaspar Magda Vieira Benavides

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51 Capítulo 4 Tristeza parasitária bovina: avanços no controle 51 INTRODUÇÃO A Tristeza Parasitária Bovina (TPB) é um complexo infeccioso, causado pelos protozoários Babesia bovis e Babesia bigemina, e a riquétsia Anaplasma marginale. A TPB tem ampla distribuição, envolvendo áreas de clima tropical e subtropical as quais englobam praticamente todo o território nacional. Os prejuízos causados pela TPB são resultantes das perdas diretas com mortalidade e morbidade; e indiretos, com tratamentos ou profilaxia; sendo estimados em 500 milhões de dólares por ano no Brasil (GRISI et al., 2002). Neste capítulo, abordaremos os avanços no controle dos agentes da TPB, estando dividido em parte 1: com uma rápida revisão sobre a epidemiologia e a patogenia da doença, seguido dos aspectos imunológicos e de vacinação, e parte 2: com uma abordagem voltada aos mecanismos de resistência à TPB. Os agentes da TPB são transmitidos biologicamente por carrapatos ixodídeos. No Brasil, B. bovis, B. bigemina e A. marginale têm como hospedeiro intermediário o carrapato Rhipicephalus (B.) microplus. Além da transmissão biológica por esse ixodídeo, A. marginale também é passível de transmissão mecânica de sangue infetado por dípteros hematófagos ou fômites, como agulhas, e instrumentos de castração ou descorna. A transmissão transplacentária também contribui para a epidemiologia da anaplasmose em algumas regiões (AUBRY; GEALE, 2011). EPIDEMIOLOGIa Da TPB NO BRaSIL No Brasil, a TPB é endêmica na maior parte do território. No entanto, diferentes situações epidemiológicas são encontradas, em função das condições climáticas e de manejo dos animais, que definem situações mais favoráveis ou desfavoráveis à transmissão dos agentes etiológicos aos bovinos. Grande parte do território brasileiro é caracterizada por situação de estabilidade endêmica. Nesta há um equilíbrio entre as relações parasito/hospedeiro, de tal forma que a exposição aos agentes da TPB desde os primeiros meses de vida, quando os bezerros apresentam imunidades, passiva e inata, mais acentuadas contra os mesmos, permite que se desenvolva uma resposta específica protetora, na maioria das vezes, sem a ocorrência de casos clínicos (aspectos da imunidade serão tratados, de forma detalhada, mais adiante neste capítulo). Regiões do estado da Bahia (ARAÚJO et al., 1997); mesorregião Norte Fluminense (SOARES et al., 2000); Mato Grosso do Sul (MADRUGA et al., 2001a); mesorregião fluminense do Alto Paraíba (SOUZA et al., 2001); nordeste do Pará (GUEDES et al., 2008); Araguaína, Tocantins (TRINDADE et al., 2010); sudoeste amazônico (BRITO et al., 2013), dentre outras, apresentam altas prevalências de bovinos positivos para anticorpos contra A. marginale e/ou Babesia sp., caracterizando situações de estabilidade endêmica. O clima semiárido, definido por longos períodos de estiagem e baixa umidade, constitui uma limitação ao desenvolvimento do R. microplus, resultando em baixas taxas de transmissão dos agentes da TPB aos bovinos. A pesquisa de anticorpos contra os agentes da TPB em bovinos no semiárido do estado da Paraíba resultou

52 52 Capítulo 4 Tristeza parasitária bovina: avanços no controle em taxas de 15,0% (intervalo: 0-75%) para A. marginale; 9,5% (intervalo: 0-40%) para B. bigemina e 26,9% (intervalo: 0-73,7%) para B. bovis, caracterizando uma situação de instabilidade endêmica, com risco de surtos da enfermidade (COSTA et al., 2013). Da mesma forma, nos municípios de Uauá e Juazeiro, semiárido do estado da Bahia, situações de instabilidade endêmica foram caracterizadas para Babesia sp., uma vez que as soroprevalências foram: B. bovis - 63,7 e 56,4%, e B. bigemina - 53 e 54,8%, respectivamente. As soroprevalências de A. marginale, no entanto, foram superiores a 94,8%, que é uma indicação da condição de estabilidade endêmica para a riquétsia (BARROS et al., 2005). Ao sul do Brasil, o clima mais frio também pode prejudicar o desenvolvimento do R. microplus, determinando também situações de instabilidade enzoótica (MA- RANA et al., 2009), com ocorrências de surtos, já que animais nascidos nas épocas de clima mais adversos ao desenvolvimento dos carrapatos podem não entrar em contato com os agentes da TPB quando a imunidade está mais alta. Ao extremo sul do país (município de Santa Vitória do Palmar, RS) praticamente não há condições climáticas para o desenvolvimento de carrapatos, e os bovinos dessa região são sujeitos a surtos de TPB, pela introdução acidental de carrapatos de outras regiões (SCHILD et al., 2008). PaTOGENIa Da TPB A doença causada por B. bovis é caracterizada por febre, anemia, anorexia, hemoglobinúria e uma síndrome de choque hipotensivo. Em animais com infecções agudas, eritrócitos parasitados são sequestrados nos microcapilares do cérebro e pulmões, resultando em baixos níveis de parasitemia na circulação periférica, doença cerebral e uma síndrome respiratória associada à infiltração de neutrófilos nos capilares pulmonares (CLARK; JACOBSEN, 1998). A patogênese da infecção por B. bovis tem uma contribuição marcante da produção excessiva de citocinas e agentes vasoativos, causando vasodilatação, aumento na permeabilidade capilar, edema, desordens de coagulação, danos aos endotélios e estase circulatória (WRIGHT et al., 1989; AHMED, 2002). O principal ponto da patogenia da babesiose por B. bovis é sem dúvida o comprometimento cerebral causado pela obstrução da microvasculatura por eritrócitos infectados. Essa obstrução ocorre devido a um aumento na rigidez e adesividade dos eritrócitos parasitados, dificultando sua passagem pelos pequenos capilares sanguíneos (HUTCHINGS et al., 2007). Embora as causas exatas da rigidez e adesividade aumentada dos eritrócitos parasitados por B. bovis não sejam conhecidas, estudos com microscopia eletrônica de força atômica tem permitido a observação de rugas (ridges) na superfície dos eritrócitos parasitados por B. bovis em contraste a eritrócitos parasitados por B. bigemina, o que pode estar associado a maior adesividade dos eritrócitos parasitados (HUTCHINGS et al., 2007). A patogênese da infecção por B. bigemina é quase inteiramente relacionada à rápida, às vezes massiva, hemólise intravascular (CALLOW, 1984). Com a maioria

53 Capítulo 4 Tristeza parasitária bovina: avanços no controle 53 das cepas de B. bigemina, os efeitos patogênicos se relacionam mais diretamente à destruição de hemácias. A hemoglobinúria está presente mais cedo e de forma mais consistente do que em infecções por B. bovis. Bovinos com infecção aguda geralmente não são tão severamente afetadas como aqueles com infecção de B. bovis. Não há envolvimento cerebral e a recuperação em casos não fatais é, geralmente, rápida e completa. No entanto, em alguns casos, a doença pode desenvolver-se muito rapidamente, com súbita e grave anemia, icterícia e morte (CALLOW et al., 1993). Após a infecção por A. marginale, o número de eritrócitos infectados aumenta geometricamente. As células parasitadas são subsequentemente fagocitadas por macrófagos, principalmente no baço, resultando em anemia branda a severa e icterícia, sem ocorrência de hemoglobinemia ou hemoglobinúria (KOCAN et al., 2003). No curso da anemia induzida pela anaplasmose não ocorre depressão da medula óssea. Ao contrário, os bovinos apresentam hiperplasia eritroide, que constitui um mecanismo compensatório (JATKAR: KREIER, 1967). Outros sinais clínicos são febre, perda de peso, aborto e letargia. A morte pode ocorrer principalmente em animais acima de dois anos de idade (AJAYI et al., 1978; KOCAN et al., 2003). Os animais que sobrevivem à fase aguda da anaplasmose desenvolvem infecções persistentes, caracterizadas por baixas riquetsemias cíclicas (10 4 a 10 6 eritrócitos infectados por ml de sangue) e tornam-se reservatórios de A. marginale (KIESER et al., 1990; ERIKS et al., 1993). A remoção do baço de bovinos portadores crônicos resulta em recrudescência da riquetsemia e o aparecimento de sintomatologia (YOUNG et al., 1977). A severidade da anemia na anaplasmose parece não estar relacionada diretamente ao número de organismos infectantes (GALE et al., 1996). As alterações necroscópicas na anaplasmose bovina são emaciação, desidratação, fígado com aumento de volume e necrose centro-lobular; pulmões com edema, congestão, acúmulo de fluido seroso e infiltração celular. Os linfonodos apresentam edema, hiperplasia e deposição de hemossiderina. No coração são encontradas hemorragias. O baço apresenta-se aumentado de volume e com deposição de hemossiderina. Os rins apresentam-se congestos, e o sangue, com aspecto aquoso (GA- LHOTRA et al., 1977). IMUNIDaDE CONTRa a TPB A resposta imune na TPB precisa ser considerada em função do tipo de agente invasor, uma vez que a TPB pode ser causada tanto pela riquétsia A. marginale como pelos protozoários B. bovis e B. bigemina, como citado anteriormente. Há situações em que o animal pode estar infectado com apenas um dos agentes, dois ou até mesmo pelos três (ALMEIDA et al., 2006). As particularidades relacionadas a uma resposta imune específica contra microrganismos de diferente natureza devem ser ponderadas, além daquelas próprias da espécie em questão. É interessante que a A. marginale e Babesia spp., se abrigam obrigatoriamente em uma célula que não é capaz de denunciar sua infecção para o sistema de defesa. As hemácias não apresentam em sua superfície moléculas de histocompatibilidade

54 54 Capítulo 4 Tristeza parasitária bovina: avanços no controle (MHC). Ainda assim, é possível a indução de imunidade celular, vista principalmente pela ação de linfócitos T auxiliares específicos (CD4 + ) os quais têm um importante papel em toda a logística de proteção. a resposta imune contra Anaplasma marginale Tanto a estimulação do sistema imune inato quanto a estimulação do sistema imune adaptativo é importante para a resolução das infecções na TPB. No entanto, A. marginale pode ser capaz de evadir do sistema imune de defesa inato e isso ocorre por dois principais fatores: i) o fato de habitar eritrócitos, como mencionado anteriormente; ii) a falta de genes que codificam moléculas padrão associadas ao patógeno (PAMPs), tais como LPS e peptideoglicano, entre outras (como revisto em BROWN et al., 2012), reduzindo de modo significativo a ativação da imunidade inata via receptores Toll-like. Somado a isso, deve-se destacar que na riquetsemia aguda, IFN-gama também pode ter um papel limitado como componente da resposta imune inata (GALE et al., 1997). A resposta imune adaptativa induzida contra A. marginale contempla tanto fatores humorais quanto celulares. Linfócitos B reconhecem diretamente epítopos presentes em antígenos da superfície do patógeno. Sabe-se que a membrana externa de corspúsculos iniciais de A. marginale apresenta um conjunto de polipeptídeos que estão envolvidos em funções celulares importantes (McGAREY et al., 1994 apud MADRUGA et al., 2001). Anticorpos anti-a. marginale providenciam então a especificidade para a fagocitose realizada por macrófagos, atuando como agentes opsonizantes (CANTOR et al., 1993), além da capacidade neutralizante bloqueando a invasão de eritrócitos pela riquétsia (PALMER: McGUIRE, 1984), lise direta dos corpúsculos iniciais por anticorpo e pela via clássica do complemento. Contudo, a presença isolada de anticorpos específicos não é o suficiente para proteção contra infecção aguda. Isto é claramente ilustrado pelo fato de que a transferência passiva de soro de animais imunes em bovinos susceptíveis não é capaz de conferir imunidade protetora contra o desafio com A. marginale (GALE et al., 1992). Anticorpos específicos e células T CD4 + juntos contribuem sobremaneira para o controle da infecção aguda (PALMER et al., 1999), demonstrando um papel extremamente relevante dos mecanismos de ação do sistema imune adaptativo. Todos estes eventos específicos iniciam e finalizam com a participação de macrófagos e ação de seus produtos derivados pós-ativação (CARSON et al., 1976). Na imunidade gerada contra A. marginale, quer seja após infecção aguda ou induzida por vacinação, a ação de IFN-gama, produzido pós-ativação de macrófago, leva às condições necessárias para eliminação do patógeno, sendo elas a indução da troca de isotipos durante a produção de anticorpos específicos para o isotipo IgG2 nos linfócitos B (ESTES et al., 1994), aumento da expressão de receptores Fc, fagocitose, fusão fagolisossomal e produção de óxido nítrico nos macrófagos (GALE et al., 1996; BROWN, 1998a). O desenvolvimento de uma resposta imune primária, após infecção aguda por A. marginale, contribui para a resolução dos altos níveis de riquetsemia, mas, mesmo na presença de resposta imune protetora, o animal permanece persistentemente infectado (KIESER et al., 1990). A persistência caracteriza-se por ciclos sequen-

55 Capítulo 4 Tristeza parasitária bovina: avanços no controle 55 ciais, nos quais os baixos níveis de riquetsemia sobem e descem alternadamente. Mecanismos de evasão de A. marginale frente à resposta imune adaptativa providenciam as condições para o estabelecimento do quadro de persistência. Entre estes mecanismos estão: variação antigênica e supressão e/ou deleção de células T CD4 + (revisto em BROWN et al., 2012). Os antígenos de A. marginale que propiciam o processo de escape por variação antigênica são, principalmente, as proteínas MSP2 e MSP3 (BRAYTON et al., 2003; PALMER et al., 2009). A resposta imune gerada contra estas proteínas é predominantemente direcionada para porções hipervariáveis (FRENCH et al., 1999). Dessa forma, durante os picos cíclicos de riquetsemia, novas variantes antigênicas devem ser apresentadas, as quais não são reconhecidas pelos componentes do sistema imune humoral nem celular, previamente estimulados. Por outro lado, ao invés disso, induzem uma nova resposta primária protetora. Interessantemente, têm sido demonstrado que, seguindo a infecção por A. marginale, células T CD4 + específicas induzidas por imunização prévia rapidamente desaparecem do sangue periférico próximo ao pico de riquetsemia. As questões relacionadas aos possíveis mecanismos de evasão de A. marginale frente ao sistema imune são recentes, mas têm sido cada vez mais abordadas. A compreensão destes mecanismos, aliada às informações já obtidas em função de proteção em animais infectados/imunizados são essenciais para o controle definitivo da anaplasmose em bovinos. a resposta imune contra Babesia spp. A infecção por Babesia em bovinos, assim como por Anaplasma, se resolvida, é capaz de induzir uma resposta imune protetora de longa duração. Estes animais tornam-se persistentemente infectados, porém, resistentes à reinfecção. A destruição/ eliminação de eritrócitos infectados por macrófagos ativados e a ação de anticorpos neutralizantes coparticipam para o controle da infecção. Em se tratando de resposta imune inata, deve ser mencionado que a ativação de macrófagos esplênicos e consequente fagocitose e morte dos microrganismos pode levar à resolução da infecção aguda em animais resistentes. Estas células foram primeiramente implicadas como tendo participação na imunidade contra Babesia em estudos realizados por Rogers (1974), o qual demonstrou fagocitose de eritrócitos infectados. Neste contexto, ocorre a participação de IFN-gama e produção de óxido nítrico, entre outros metabólitos e citocinas, que se constituem como elementos importantes da resposta à infecção. Dentre as citocinas, podemos mencionar além de IFN-gama, a participação de TNF-alfa e IL-12 (EAST et al., 1997; SHODA et al., 2000; GOFF et al., 2003). Outro componente da resposta imune inata que está envolvido na produção de citocinas no contexto da infecção por Babesia é a célula Natural Killer (NK). As células NK foram predominantemente encontradas no baço de animais infectados (GOFF et al., 2003). Assim, em animais que resolvem a infecção, a produção inicial de IL-12 e IFN-gama mediada por células NK podem tanto agir sob macrófagos estimulando a produção de óxido nítrico (que possui efeito babesicidas), como podem atuar para que a resposta imune adaptativa seja então estabelecida (revisto em BROWN et al., 2006).

56 56 Capítulo 4 Tristeza parasitária bovina: avanços no controle A imunidade inata frente à infecção por Babesia pode ser estimulada via receptores de reconhecimento padrão (PRRs), os quais reconhecem PAMPs. Neste contexto, tem sido demonstrado que motivos CpG não metilados no DNA de B. bovis podem interagir com PRRs (Tool-like) resultando na estimulação de linfócitos B (em animais não previamente expostos ao parasito), ativação de macrófagos e produção de IL-12, TNF-alfa e óxido nítrico (BROWN et al., 1998b; SHODA et al., 2001). Além de motivos CpG não metilados do DNA de B. bovis, glicolipídeos derivados de membrana também são conhecidos como moléculas derivadas da superfície do patógeno capazes de ativar macrófagos durante a indução da resposta imune inata (GAZZINELLI et al., 1997), resultando em uma ação inflamatória que é capaz de controlar os níveis de infecção, mas que é incapaz de eliminar completamente o parasito, originando então o quadro de infecção permanente. Com relação à imunidade adquirida, a resposta de células T antígeno-específica em bovinos protegidos, seguindo-se a infecção por Babesia e tratamento, tem revelado que células TCD4+ respondem in vitro ao estímulo com antígenos de B. bovis e B. bigemina (BROWN et al., 1993; RODRIGUEZ et al., 1996). Como parasitas Babesia spp. infectam eritrócitos, a apresentação de antígenos se dá apenas no contexto de moléculas do MHC de classe II de células apresentadoras de antígenos que tenham adquirido/fagocitado o microrganismo ou eritrócitos infectados, as quais necessariamente interagem com células TCD4 +. Como consequência, é possível que eritrócitos infectados possam ser eliminados por macrófagos esplênicos ativados (ocorrido em decorrência da ação do IFN-gama produzido por linfócitos T) seguindo-se a ação de anticorpos opsonizantes específicos contra antígenos na superfície de eritrócitos. Anticorpos específicos, produzidos por linfócitos B, também contribuem pela ação neutralizante e opsonizadora contra antígenos na superfície de merozoítos extracelulares (BROWN et al., 2006). A importância da função dos anticorpos específicos contra Babesia no controle da infecção persistente e na proteção contra infecção homóloga é bem conhecida (pode ser revisto em MADRUGA et al., 2001). Classicamente, tem sido demonstrado o papel protetor de imunoglobulinas da resposta imune humoral pela administração passiva de soro de bovinos hiperimunizados com B. bovis a animais não imunes e esplenectomizados (MAHONEY et al., 1979). De forma semelhante, títulos de anticorpos colostrais elevados também propiciam imunidade passiva e controle da infecção por B. bovis e B. bigemina aos animais expostos nos primeiros meses de vida (MADRUGA et al., 1987). O mecanismo celular da resposta imune adquirida, caracterizado pela presença de células TCD4 + específicas, responde por uma elevada produção de IFN-gama, ainda que algumas células sejam capazes de expressar RNA mensageiro para IL-4 (BRO- WN et al., 1993). Como resultado, nos linfócitos B, ocorre indução da produção de anticorpos específicos de isotipo IgG1 (pela ação de IL-4 em níveis suficientes para indução da troca de classe de isotipo), assim como na indução de anticorpos de isotipo IgG2 por ação da citocina IFN-gama (ESTES et al., 1994). Em bovinos, anticorpos deste último isotipo são caracterizados como os melhores agentes opsonizantes dentre os diferentes isotipos de imunoglobulinas do tipo G (McGUIRE et al., 1979). A participação de células T CD4 + na ativação de macrófagos e sua ação

57 Capítulo 4 Tristeza parasitária bovina: avanços no controle 57 direta na eliminação de B. bovis têm sido demonstrada in vitro. Foi observado que linhagens de células TCD4+ estabelecidas de bovinos imunes a B. bovis secretam IFN-gama e TNF-alfa como resposta após cultura com antígenos de específicos. Interessantemente, estes sobrenandantes são capazes de estimular macrófagos a produzir óxido nítrico e isto ocorre em uma proporção significantemente maior do que pelo uso de altas concentrações de IFN-gama apenas. Assim, é possível que além de IFN-gama outras citocinas ou mesmo produtos do parasita contribuam para a ativação de macrófagos. VaCINaÇÃO CONTRa OS agentes Da TPB As medidas de controle contra a Tristeza Parasitária Bovina têm sido praticamente as mesmas há bastante tempo, e incluem: o controle do vetor, o tratamento com antibióticos e quimioterápicos, a quimioprofilaxia e a vacinação. A antibioticoterapia ou a quimioterapia são medidas caras e de difícil manejo, especialmente em grandes rebanhos. Além disso, existem poucas alternativas terapêuticas e corre-se o risco de o tratamento selecionar cepas resistentes de Anaplasma e Babesia (KOCAN et al., 2003), que poderia agravar o problema. Quimioterápicos derivados da diamina (diazoamino dibenzamidina) e do imidocarb (Dipropionato de imidocarb) são drogas babesicidas, sendo que esta última é também eficaz no tratamento da anaplasmose, embora em uma dose bem maior. A droga de escolha para o tratamento da anaplasmose é o cloridrato de oxitetraciclina (ALVES-BRANCO et al., 1994). O dipropionato de imidocarb pode também ser usado na quimioprofilaxia da TPB, que consiste em aplicar uma dose menor que a recomendada para o tratamento e expor os animais aos carrapatos de forma constante por pelo menos 30 dias. O nível sérico da droga vai caindo de maneira gradual, permitindo a sobrevivência de uma quantidade cada vez maior dos hemoparasitos, permitindo o desenvolvimento da resposta imunológica sem o aparecimento da doença (SACCO, 2002). O método mais eficiente e econômico de controle e prevenção da TPB é a vacinação. Embora na maioria das vezes as vacinas sejam compostas e imunizem contra todos os agentes da TPB, como as vacinas foram estudadas separadamente, para facilitar o entendimento, vacinas contra A. marginale e contra Babesia serão tratadas em subitens distintos. Vacinas contra Anaplasma marginale No início do século XX, Theiler observou que Anaplasma centrale era menos virulento que A. marginale, mas que promovia imunidade cruzada contra este parasito (revisto em KOCAN et al., 2010). Tinha início, desta forma, a vacinação contra anaplasmose. Um século depois, este mesmo patógeno continua sendo utilizado como vacina (DALGLIESH et al., 1990) na África, Austrália, Israel e América do Sul (KOCAN et al., 2003), apesar dos inúmeros esforços na tentativa de produção de uma vacina mais segura e eficaz (PALMER; McELWAIN, 1995; KOCAN et al., 2003; KOCAN et al., 2010; SUAREZ; NOH, 2011).

58 58 Capítulo 4 Tristeza parasitária bovina: avanços no controle A vacina de A. centrale é produzida em bovinos esplenectomizados. Existem epítopos CD4 + conservados entre A. marginale e A. centrale que contribuem para a proteção cruzada entre as duas espécies (SHKAP et al., 2002). Apesar da eficiência da vacina em impedir a doença clínica, esta, em alguns casos, não impede a infecção concomitante com A. marginale (SHKAP et al., 2008) e pode falhar até mesmo em promover imunidade protetora (BRIZUELA et al., 1998). Ademais, apesar da baixa virulência, existem casos de anaplasmose causada por A. centrale (CARELLI et al., 2008). Uma estratégia alternativa para a multiplicação de A. marginale é a propagação desta bactéria em cultura de células, que eliminaria a necessidade do uso de animais em sua produção (KOCAN et al., 2003). Entretanto, vacinas inativadas de A. marginale derivado de cultura de células de carrapato promovem proteção apenas parcial (de la FUENTE et al., 2002) ou são ineficazes em proteger os animais, apesar de promoverem a produção de anticorpos (LASMAR et al., 2012). Já houve também a tentativa de produção de cepas atenuadas de A. marginale por irradiação ou passagens em hospedeiros não usuais, como ovinos ou cervídeos (CARSON et al., 1977; KUTTLER; ZAUGG, 1988), porém, a proteção promovida por estas vacinas não alcançou níveis satisfatórios (KOCAN et al., 2010). Vacinas mortas contra A. marginale compostas por microrganismos inteiros inativados foram desenvolvidas na década de 1960 nos Estados Unidos e foram comercializadas até 1999 naquele país (KOCAN et al., 2010). Estas vacinas mostraram-se capazes de proteger os animais contra o aparecimento da doença clínica, mas são menos eficientes que as vacinas vivas (BROCK et al., 1965; PALMER et al., 1999), exigem revacinações e nem sempre promovem proteção satisfatória em desafios heterólogos (KUTTLER et al., 1984; KOCAN et al., 2010). Vacinas acelulares compostas por fração de membrana externa de A. marginale também já foram testadas e protegem contra o desafio homólogo, mas induzem proteção apenas parcial contra o desafio heterólogo (TEBELE; PALMER, 1991). O fato de a vacina de fração de membrana externa de A. marginale ser imunogênica e induzir proteção abriu novas possibilidades para o uso de vacinas de subunidades, compostas por uma ou mais proteínas da membrana externa de A. marginale. Seis proteínas principais de membrana (MSP, do inglês Major Surface Protein) (MSP1-a, MSP1-b, MSP2, MSP3, MSP4 e MSP-5) foram caracterizadas a partir da década de 1980 (PALMER; McGUIRE, 1984; ORBELE et al., 1993; McGAREY et al., 1994; ALLEMAN et al., 1997) e, tanto as formas nativas, quanto as recombinantes destas proteínas têm sido estudadas quanto a imunogenicidade e proteção, em modelo murino e em bovinos, apresentando graus variáveis de proteção e imunogenicidade (PALMER et al., 1986; McGUIRE et al., 1994; KAWASAKI et al., 2007; ARAÚJO et al., 2006; NOH et al., 2013). Além das MSP, outras proteínas de membrana de A. marginale foram estudadas como imunógenos potenciais (LOPEZ et al., 2005). Entre estas, as proteínas do sistema de secreção do tipo IV (TFSS, do inglês Type Four Secretion System), TFSS, VirB9, Virb10 e CTP (da sigla em inglês Conjugal Transfer Protein)(LOPEZ et al., 2007; ARAÚJO et al., 2008), OMP4 (do inglês Outer Membrane Protein), OMP9, elongation factor-tu, Ana29 e OMA87 (LOPEZ et al., 2008); VirB2, VirB7 putativa, VirB11 e VirD4 (SUTTEN et al., 2010; LOPEZ et al., 2008; MORSE et al., 2012).

59 Capítulo 4 Tristeza parasitária bovina: avanços no controle 59 De acordo com o postulado de Waksman, a escolha de antígenos que não evoquem forte resposta imunológica, isto é, antígenos subdominantes, seria mais racional no desenho de uma vacina (BROWN et al., 2006). Entretanto, o antígeno subdominante de A. marginale, AM779 foi testado como vacina, mas falhou em promover imunidade protetora (ALBARRAK et al., 2012). Mesmo as vacinas mais eficientes contra anaplasmose produzidas até hoje induzem proteção e previnem a doença clínica, porém são incapazes de impedir a infecção. Os animais vacinados podem se tornarem persistentemente infectados, e agirem como reservatórios para a manutenção do patógeno na população (KOCAN et al., 2003). A busca por uma vacina mais eficaz e de menor custo contra anaplasmose bovina continua sendo uma meta para a comunidade científica. Vacinas contra Babesia spp. A história da vacinação contra Babesia remonta o fim do século XIX, quando pesquisadores notaram que os animais naturalmente infectados por estes hemoparasitas desenvolviam imunidade duradoura e que o sangue destes animais, quando inoculado em animais sadios, provocava uma forma mais branda da doença (de WAAL: COMBRINK, 2006). Estas características permitiram o desenvolvimento de cepas imunogênicas e pouco virulentas ou avirulentas de B. bovis e B. bigemina, que são utilizadas até hoje como vacina (CALLOW; MELLORS, 1966; DALGLIESH et al., 1981; de WAAL; COMBRINK, 2006). Assim como a vacina contra anaplasmose ainda em uso, a vacina viva atenuada contra Babesia é produzida em bezerros (CALLOW et al., 1979; SUAREZ; NOH, 2011). As vacinas atenuadas, refrigeradas ou congeladas, têm sido usadas há vários anos na Austrália, América do Sul, África do Sul e Israel (SHKAP et al., 2007). Vacinas vivas atenuadas (cepas atenuadas de B. bovis e B. bigemina e a subespécie A. marginale centrale), com formulações refrigerada e congelada, também foram desenvolvidas no Brasil (ARTECHE, 1992; KESS- LER et al., 1991; KESSLER et al., 1998). Vacinas vivas atenuadas também já foram produzidas por métodos de cultivo in vitro dos parasitas (MANGOLD et al., 1996), entretanto, a produção deste tipo de vacina foi descontinuada, pois a proteção contra o desafio heterólogo era variável (de WAAL; COMBRINK, 2006). A vacina viva atenuada previne o aparecimento de formas clínicas graves da doença, mas nem sempre protege os animais completamente. A imunidade a este tipo de vacina se desenvolve 3 a 4 semanas após a vacinação e persiste por cerca de três anos para B. bovis, enquanto que a imunidade contra B. bigemina é de mais curta duração (cerca de 16 meses) (de WAAL: COMBRINK, 2006). Assim, em áreas endêmicas não é recomendado o controle intenso de carrapatos após a vacinação (de WAAL; COMBRINK, 2006). Recomenda-se vacinar animais de até 9 meses de idade. A vacina e não deve ser aplicada durante a gestação, pois pode causar febre e, consequentemente, abortos (de WAAL; COMBRINK, 2006). O sobrenadante de cultura de B. bovis e B. bigemina contém exoantígenos que, quando usados na imunização dos animais, promovem graus variáveis de proteção (TIMMS et al., 1983; MONTENEGRO-JAMES et al., 1987), indicando que uma vacina morta (inclusive de subunidades), contra estes parasitas seria factível, ao menos

60 60 Capítulo 4 Tristeza parasitária bovina: avanços no controle visando a proteção parcial (PALMER; McELWAIN, 1995). Um dos principais entraves à produção de uma vacina de subunidade contra Babesia é o fato de que, das proteínas de superfície analisadas, poucas são genética e antigenicamente conservadas. Polimorfismos nas proteínas de superfície parecem ser a regra, e não a exceção (PAL- MER; McELWAIN, 1995). Além disso, a complexidade antigênica dos protozoários, a complexidade do ciclo de vida destes parasitas e a falta de conhecimento aprofundado da imunidade efetiva contra estes, assim como das possíveis alterações existentes na relação parasito-hospedeiro, dificulta a produção de uma vacina deste tipo. A imunidade promovida contra vacinas mortas de B. bovis, contendo microrganismos inteiros foi demonstrada ainda na década de 1970 (MAHONEY, 1967; MAHONEY; WRIGHT, 1976). O grau de proteção obtido por estas vacinas foi bom e impulsionou a pesquisa por componentes imunogênicos e protetores deste parasita (WRIGHT et al., 1992). Entre algumas das proteínas de merozoítos selecionadas a partir de fracionamentos e sub-fracionamentos do parasita e que já foram testadas para a imunização contra B. bovis, podemos citar os antígenos designados 12D3 (WRIGHT et al., 1985) 11C5, (GOODGER et al., 1985), T21B4, (COM- MINS et al., 1985) também chamado de Bv60 (SUAREZ et al., 1991) e RAP-1 (do inglês Rhoptry associated protein), Bv80 ou Bb-1 (TRIPP et al., 1989), que agora é designada SBP-1 (do inglês Spherical Body Protein-1). Estas proteínas foram estudadas por não serem nem imunodominantes, nem muito abundantes (WRIGHT et al., 1992; BROWN et al., 2006) e apresentaram graus variáveis de proteção. Outra estratégia de identificação de potenciais antígenos é a identificação de proteínas de superfície de merozoítos (MSP do inglês Merozoite Surface Protein) ou de proteínas do complexo apical que sejam importantes para invasão dos parasitas aos eritrócitos, identificadas frente à reatividade com soro de animais imunizados ou infectados (BROWN et al., 2006). Esta abordagem permitiu a identificação de algumas proteínas em B. bovis, tais como o antígeno de superfície de merozoítos-1 (MSA-1 do inglês Merozoite Surface Antigen)(BROWN et al., 2006), MSA-2, que, na verdade, é uma família de quatro genes (FLORIN-CHRISTENSEN et al., 2002), VMSA (do inglês Variable Merozoite Surface Antigen) (FLORIN-CHRISTENSEN et al., 2007). Outras proteínas de B. bovis identificadas por sua habilidade em induzir a produção de anticorpos são RAP-1, SBP-1 (do inglês Spherical Body Protein), também conhecida como Bb-1 (HINES et al., 1995), SBP-2 (DOWLING et al., 1996) e SBP-3 (RUEF et al., 2000), que são proteínas de corpos esféricos ou expressas nas membranas dos eritrócitos infectados (BROWN et al., 2006). Alguns antígenos de superfície de B. bigemina também foram definidos por sua imunodominância humoral (McELWAIN et al., 1991). Estes antígenos foram definidos como proteínas de 36, 45, 55 e 58 kda (RAP-1)(SUAREZ et al., 1998). Outros antígenos de B. bovis foram identificados por sua imunodominância celular, ou seja, pela capacidade em gerar resposta imunológica em linfócitos T. (BROWN et al., 1995; STICH et al., 1999). Esta metodologia permitiu determinar antígenos que estimulam resposta linfoproliferativa e que já haviam sido descritos como indutores de resposta humoral, como MSA-1, MSA-2, RAP-1 e SBP-1 (Bb-1) (STICH et al., 1999), ou que eram protetoras, como 12D3 (WRIGHT et al., 1992). Além da determinação de outros antígenos T com potencial para

61 Capítulo 4 Tristeza parasitária bovina: avanços no controle 61 vacina, como a proteína de choque térmico (Hsp, do inglês Heat Shock Proteins) 70, Hsp90 (BROWN et al., 2006), Hsp de 20 kda (BROWN et al., 2001), acetil coenzima A sintetase (ACS-1 Acyl Coenzyme A Synthetase) (NORIMINE et al., 2006) e a fosfoproteína P0 (BROWN et al., 2001), que foi recentemente sugerida como uma candidata universal para a vacinação contra babesiose (TERKAWI et al., 2007). P0 de B. bovis é altamente conservada entre diversos isolados brasileiros e também possui considerável nível de homologia com Babesia spp. de outras espécies ou com outros parasitas do filo Apicomplexa (RAMOS et al., 2009), o que a faz um bom candidato à vacinação. A comparação genética de B. bovis com Plasmodium, que é um microrganismo relacionado à Babesia e extensamente estudado, permitiu a identificação de duas proteínas de Babesia homólogas a proteínas de Plasmodium, AMA-1 (do inglês Apical Membrane Antigen 1) e TRAP (Thrombospondin-Related Anonymous Protein), cujo antissoro inibe a invasão celular de B. bovis (GAFFAR et al., 2004a; GAFFAR et al., 2004b). Assim como no caso da vacina contra anaplasmose ainda em uso, a única vacina contra babesiose disponível é a vacina viva atenuada, que deixa a desejar em termo de proteção e segurança, além de ser uma vacina de elevado custo de produção. A busca por novos imunógenos contra babesiose também continua sendo uma importante meta para a comunidade científica. CONSIDERaÇõES GERaIS SOBRE a VaCINa CONTRa TRISTEZa PaRaSITáRIa BOVINa A vacina viva contra babesiose e anaplasmose, única disponível, possui diversos pontos negativos. Em primeiro lugar, não é completamente eficaz. Por não impedirem a infecção, os animais vacinados acabam servindo de reservatório para a circulação destes patógenos na população (KOCAN et al., 2003). Por ser produzida em bovinos, o custo de produção é elevado, pela necessidade em se manter animais livres de carrapato e de doenças que possam ser transmitidas aos receptores. Ainda assim, apresentam o risco de transmissão de outros patógenos, caso o controle dos doadores não seja totalmente eficaz (BOCK et al., 2004). Como ela é, na verdade, composta por sangue infectado de animais doadores, apresenta o risco adicional de imunização contra grupos sanguíneos (WRIGHT; RIDDLES, 1989). Por ser uma vacina atenuada, no caso de Babesia, corre-se o risco de reversão da virulência (TIMMS et al., 1990) e de perda de imunogenicidade após longo tempo de manutenção in vitro (SHKAP et al., 2007; BOCK et al., 2004). Este tipo de vacina tem ainda uma importante implicação ética por requerer a infecção de bovinos susceptíveis para a sua produção. A vacina viva contra TPB pode ser resfriada ou congelada. A vacina resfriada tem a desvantagem adicional de ter vida de prateleira muito curta (7 dias). Já a vacina congelada, apesar de ter vida de prateleira maior (até 18 meses), demanda uma logística mais complexa para a comercialização, já que é dependente de nitrogênio líquido. Além disso, o descongelamento deve ser efetuado de forma adequada, sob pena de não se conseguir o efeito desejado (de WALL; COMBRINK, 2006).

62 62 Capítulo 4 Tristeza parasitária bovina: avanços no controle Relativamente poucos antígenos foram testados até hoje como vacina contra TPB e, mesmo alguns dos antígenos citados acima merecem ser mais bem estudados para a definição do seu real potencial como imunógeno (SUAREZ; NOH, 2011). O sequenciamento completo e anotado de microrganismos dos gêneros Anaplasma e Babesia, o barateamento das técnicas de sequenciamento e o aperfeiçoamento de softwares de bioinformática constituem-se como ferramentas importantíssimas na identificação de antígenos novos e que atendam os pré-requisitos de antígeno ideal, facilitando a escolha de possíveis futuros candidatos que serão testados para confirmação do potencial imunológico. REFER ÊNCIAS AHMED, J. S. The role of cytokines in immunity and immunopathogenesis of piroplasmoses. Parasitology Research, Berlin, v. 88, p , AJAYI, SA, WILSON, AJ, CAMPBELL, RS. Experimental bovine anaplasmosis: clinico-pathological and nutritional studies. Research in Veterinary Science, v. 25, p , ALBARRAK, S. M.; BROWN W. C.; NOH, S. M.; REIF, K. E.; SCOLES, G. A; TURSE, J. E.; NORI- MINE, J.; UETI, M. W.; PALMER, G. H. Subdominant antigens in bacterial vaccines: AM779 is subdominant in the Anaplasma marginale outer membrane vaccine but does not associate with protective immunity. PLoS One, v. 7, n. 9, p. e46372, ALLEMAN, A. R.; PALMER, G. H.; McGUIRE, T. C.; McELWAIN, T. F.; PERRYMAN, L. E.; BARBET, A. F. Anaplasma marginale major surface protein 3 is encoded by a polymorphic, multigene family. Infection and Immunity, v. 65, n. 1, p , ALMEIDA, M. B., TORTELLI, F. P., RIET-CORREA, B., FERREIRA, J. L. M.; SOARES, M. P.; FARIAS, N. A. R.; RIET-CORREA, F.; SCHILD, A. L. Tristeza parasitária bovina na região sul do Rio Grande do Sul: estudo retrospectivo de Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 26, n. 4, p , ALVES-BRANCO, F. P. J., BULCÃO, J. F. R., SAPPER, M. F. M. Algumas normas de orientação para o tratamento da tristeza parasitária bovina. Bagé: Embrapa Pecuária Sul. 14 p. (Embrapa Pecuária Sul. Documentos, 12), ARAÚJO, F.R., LEAL, C.R.B., BASTOS, P.A.S., MADRUGA, C.R., MARQUES, A.P.C. Comparação dos testes de imunoadsorção enzimática, conglutinação rápida e imunofluorescêcia indireta para detecção de anticorpos contra Anaplasma marginale. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v. 6, n. 2, p. 323, ARAÚJO, F. R.; COSTA, C. M.; RAMOS, C. A.; FARIAS, T. A.; SOUZA, I. I.; MELO, E. S.; ELISEI, C.; ROSINHA, G. M.; SOARES, C. O.; FRAGOSO, S. P.; FONSECA, A. H. IgG and IgG2 antibodies from cattle naturally infected with Anaplasma marginale recognize the recombinant vaccine candidate antigens VirB9, VirB10, and elongation factor-tu. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 103, n. 2, p , ARAÚJO, F. R.; MADRUGA, C. R.; RAMOS, C. A. N.; MELO, E. S. P.; ALMEIDA, M. C.; FRA- GOSO, S. P.; KESSLER, R. H.; SOARES, C. O.; OLIVEIRA, M. B. Imunização de bovinos com MSP1a e MSP2 recombinantes de Anaplasma marginale com CpG ODN 2006 como adjuvante, e desafio com isolado heterólogo. Campo Grande: Embrapa Gado de Corte, p. (Embrapa Gado de Corte. Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento, 19). ARTECHE, C. C. P. Imunoprofilaxia da tristeza parasitária bovina (TPB) no Brasil: uso de cepas atenuadas de Babesia spp e de cepa heteróloga da Anaplasma. Hora Veterinária, v. 11, p , AUBRY, P., GEALE, D.W. A review of bovine anaplasmosis. Transboundary and emerging diseases, v.58, n.1, p. 1-30, BARROS, S.L., MADRUGA, C.R., ARAÚJO, F.R., MENK, C.F., de ALMEIDA, M.A., MELO, E.P., KESSLER, R.H. Serological survey of Babesia bovis, Babesia bigemina and Anaplasma marginale antibodies in cattle from the semi-arid region of the state of Bahia, by enzyme linked immunosorbent assays. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v. 100, p , 2005.

63 Capítulo 4 Tristeza parasitária bovina: avanços no controle 63 BOCK, R.; JACKSON, L.; de VOS, A.; JORGENSEN, W. Babesiosis of cattle. Parasitology, v. 129, Suppl:S247-69, BRAYTON, K. A.; MEEUS, P. F. M.; BARBET, A. F.; PALMER, G. H. Simultaneous variation of the Immunodominant Outer Membrane Proteins, MSP2 and MSP3, during Anaplasma marginale persistence in vivo. Infection and Immunity, v. 71, n. 11, p , BRITO, L. G.; ROCHA, R. B.; BARBIERI, F. D. A. S.; RIBEIRO, E. S.; VENDRAMI, F. B.; SOU- ZA, G. C.; GIGLIOTI, R.; REGITANO, L. C.; FALCOSKI, T. O.; TIZIOTO, P. C.; OLIVEIRA, M. C. Babesia bovis infection in cattle in the southwestern Brazilian Amazon. Ticks and Tick Borne Diseases, v. 4, n. 1-2, p , BRIZUELA, C. M.; ORTELLADO, C. A.; SANABRIA, E.; TORRES, O.; ORTIGOSA, D. The safety and efficacy of Australian tick-borne disease vaccine strains in cattle in Paraguay. Veterinary Parasitology, v. 76, n. 1-2, p , BROCK, W. E. Anaplasmosis vaccines and their relation to anaplasmosis control. Journal of the American Veterinary Medical Association, v. 147, n. 12, p , BROWN, W. C.; SHKAP, V.; ZHU, D.; McGUIRE, T. C.; TUO,W.; McELWAIN, T. F.; PALMER, G. H. CD4+ T-Lymphocyte and immunoglobulin G2 responses in calves immunized with Anaplasma marginale outer membranes and protected against homologous challenge. Infection and Immunity, v. 66, n. 11, p , 1998a. BROWN, W. C.; ESTES, D. M.; CHANTLER, S. E.; KEGERREIS, K. A.; SUAREZ, C. E. DNA and a CpG oligonucleotide derived from Babesia bovis are mitogenic for bovine B cells. Infection and Immunity, v. 66, n. 11, p , 1998b. BROWN, W. C.; LOGAN, K. S.; ZHAO, S.; BERGMAN, D. K.; RICE-FICHT, A. C. Identification of Babesia bovis merozoite antigens separated by continuous-flow electrophoresis that stimulate proliferation of helper T-cell clones derived from B. bovis-immune cattle. Infection and Immunity, v. 63, n. 8, p , BROWN, W. C.; NORIMINE, J.; GOFF, W. L.; SUAREZ C. E.; McELWAIN, T. F. Prospects for recombinant vaccines against Babesia bovis and related parasites. Parasite Immunology, v. 28, n. 7, p , BROWN, W. C.; RUEF, B. J.; NORIMINE, J.; KEGERREIS, K. A.; SUAREZ, C.E.; CONLEY, P. G.; STICH, R. W.; CARSON, K. H.; RICE-FICHT, A. C. A novel 20-kilodalton protein conserved in Babesia bovis and B. bigemina stimulates memory CD4(+) T lymphocyte responses in B. bovis-immune cattle. Molecular and Biochemical Parasitolology, v. 118, n. 1, p , BROWN, W. C. Adaptive immunity to Anaplasma pathogens and immune dysregulation: implications for bacterial persistence. Comparative Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, v. 35, n. 3, p , BROWN, W. C.; WOODS, V. M.; DOBBELAERE, D. A.; LOGAN, K. S. Heterogeneity in cytokine profiles of Babesia bovis-specific bovine CD4+ T cells clones activated in vitro. Infection and Immunity, v. 61, n. 8, p , BROWN, W.C. Molecular approaches to elucidating innate and acquired immune responses to Babesia bovis, a protozoan parasite that causes persistent infection. Veterinary Parasitology, v. 101, p , CALLOW, L. L.; MELLORS, L. T.; McGREGOR, W. Reduction in virulence of Babesia bovis due to rapid passage in splenectomized cattle. International Journal of Parasitology, v. 9, n. 4, p , CALLOW, L. L.; MELLORS, L. T. A new vaccine for Babesia argentina infection prepared in splenectomised calves. Australian Veterinary Journal, v. 42, p , CALLOW, L.L.,. Animal health in Australia. Protozoal and Rickettsial Diseases, vol. 5. Australian Bureau of Animal Health, Australian Government Publishing Service, Canberra, pp , CALLOW, L.L., Rogers, R.J., de Vos, A.J. Tick-borne diseases, cattle pathology and serology. In Australian Standard Diagnostic Techniques for Animal Disease. Standing Committee on Agriculture and Resource Management, edited by L.A. Corner and T.J. Bagust, CSIRO information services. East Melbourne Victoria, p. 1-12, 1993.

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69 Capítulo 4 Tristeza parasitária bovina: avanços no controle 69 TRINDADE, H. I.; SILVA, G. R.; TEIXEIRA, M. C.; SOUSA, M. G.; MACHADO, R. Z.; FREITAS, F. L.; ALMEIDA, K. S. Detection of antibodies against Babesia bovis and Babesia bigemina in calves from the region of Araguaína, State of Tocantins, Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v. 19, n. 3, p , TRIPP, C. A.; WAGNER, G. G.; RICE-FICHT, A. C. Babesia bovis: gene isolation and characterization using a mung bean nuclease-derived expression library. Experimental Parasitology, v. 69, n. 3, p , WRIGHT, I.G., GOODGER, B.V., BUFFINGTON, G.D., CLARCK, I.A., PARRODI, F., WAL- TISBUHL, D.J. Immunopathophysiology of babesial infections, Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, London, v, 83, p , WRIGHT, I. G.; CASU, R.; COMMINS, M. A.; DALRYMPLE, B. P.; GALE, K. R.; GOODGER, B. V.; RIDDLES, P. W.; WALTISBUHL, D. J.; ABETZ, I.; BERRIE, D. A.; BOWLES, Y.; DI- MMOCK, C.; HAYES, T.; KALNINS, H.; LEATCH, G.; McCRAE, R.; MONTAGUE, P. E.; NISBET, I. T.; PARRODI, F.; PETERS, J. M.; SCHEIWE, P. C.; SMITH W.; RODE-BRAMAN, I. S.; WHITE, M. A. The development of a recombinant Babesia vaccine. Veterinary Parasitology, v. 44, n. 1-2, p. 3-13, WRIGHT, I. G.; MIRRE, G. B.; RODE-BRAMANIS, K.; CHAMBERLAIN, M.; GOODGER, B. V.; WALTISBUHL, D. J. Protective vaccination against virulent Babesia bovis with a low-molecular-weight antigen. Infection and Immunity, v. 48, n. 1, p , WRIGHT, I.G.; RIDDLES, P.W. Biotechnology in tick-borne diseases: present status, future perspectives. In FAO Expert Consultation of Biotechnology for Livestock Production and Health. FAO, YOUNG, A.S., BROWN, C.G., BURRIDGE, M.J., CUNNINGHAM, M.P., PAYNE, R.C., PUR- NELL, R.E. Establishment of an experimental field population of Theileria lawrencei-infected ticks maintained by African buffalo (Syncerus Caffer). Journal of Parasitology, v. 63, n. 5, p , 1977.

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71 5 Tristeza parasitária bovina: resistência genética Lenita Ramires dos Santos Flábio Ribeiro de Araújo Carlos Alberto do Nascimento Ramos Claudia Cristina Gulias Gomes Emanuelle Baldo Gaspar Magda Vieira Benavides

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73 Capítulo 5 Tristeza parasitária bovina: resistência genética 73 INTRODUÇÃO A resistência de bovinos a TPB é definida pela resposta imunológica do organismo ao parasitismo. Esta resposta pode ser do tipo não específica ou específica. Na primo-infecção, o controle depende fortemente da resposta não específica que culmina com a ativação de macrófagos, resultando na morte do parasito por fagocitose e ação de metabólitos tóxicos. Em animais já imunizados, células antígeno específicas passam a regular a resposta imune adaptativa (ALLISON; CLARK, 1977; BROWN et al., 2006). A infecção aguda por B. bovis, B. bigemina e A. marginale geralmente conduz a um estado de infecção permanente com quadro clínico saudável em animais que sobrevivem à doença (imunidade adaptativa adquirida). Animais com infecção latente ou crônica tendem a permanecer resistentes a reinfecção com cepas homólogas (BROWN et al., 2006) por períodos longos, mesmo após a eliminação da infecção latente (ECKLAD; MAGONIGLE, 1983). A resistência imunológica a estes hemoparasitas será influenciada principalmente por fatores intrínsecos do hospedeiro, como o estado fisiológico determinado pela idade, variação genética entre raças, variação genética individual, estado nutricional e presença de infecções concomitantes nos bovinos. Entre os fatores extrínsecos se destaca a taxa de inoculação dos hemoparasitas no hospedeiro. A relação hospedeiro-parasito sempre foi abordada sob a ótica do parasitismo: o parasito provoca infecção no hospedeiro, desenvolvimento de resposta imune (protetiva ou não), multiplicação do parasito e início de processo inflamatório. Animais sucessivamente expostos a determinados patógenos possuem maior probabilidade de ter um sistema imune mais desenvolvido para combater ou suportar infecções parasitárias. No entanto, nas duas últimas décadas têm sido frequentes relatos da existência de animais refratários a infecções parasitárias, mesmo ao primeiro contato com o patógeno. Estas observações têm levado a uma nova interpretação desta visão clássica hospedeiro-parasito. A identificação de variações (polimorfismos) nos genes que determinam a resistência ou a sensibilidade dos animais a uma determinada doença é de grande importância, pois permite a seleção de animais resistentes e também possibilita uma maior compreensão dos mecanismos que atuam na resistência/susceptibilidade a patógenos. Também abre possibilidades, no longo prazo, do desenvolvimento de imunomoduladores efetivos, ou seja, proteínas do sistema imune que, administradas a animais suscetíveis, podem conferir proteção frente à determinada enfermidade. RESISTêNCIa DE BOVINOS À TPB A resistência de bovinos à TPB varia conforme a raça e o tipo de hemoparasita que causa a infecção. Nas infecções por B. bovis e B. bigemina, animais Bos indicus e suas composições apresentam manifestações clínicas menos severas da doença, se comparado a um bovino de origem europeia. Esta resistência é expressa tanto na primo-infecção (resposta imunológica não específica) quanto em infecções subsequentes (resposta imunológica específica), mas pode variar conforme a suscetibilidade

74 74 Capítulo 5 Tristeza parasitária bovina: resistência genética individual dos bovinos. O grau de resistência será maior conforme a contribuição da genética zebuína na composição racial (CARTER, 2011). Assim, animais B. indicus são significativamente mais resistentes que as composições de B. indicus x Bos taurus (FRANCIS, 1966; BOCK et al., 1997; 1999a; CARTER, 2011), que, por sua vez, são mais resistentes que animais B. taurus (FRANCIS; LITTLE, 1964; BOCK et al., 1997, 1999a; 1999b; CARTER, 2011). Este padrão de resistência é observado tanto em infecções naturais (parasitismo pelo carrapato) quanto nas artificiais (inóculo padronizado de sangue infectado). Variações na virulência de cepas de B. bigemina, associadas à variação na suscetibilidade individual dos bovinos a este hemoparasita, podem, no entanto, resultar em suscetibilidade de B. indicus e B. taurus semelhantes, como foi demonstrado em trabalhos anteriores (ARNOLD, 1948; DALY; HALL, 1955; JOHNSTON et al., 1978). A diferença de suscetibilidade de diferentes raças (Tuli, Senepol, Wagyu e Charolês) pertencentes ao mesmo grupo genético (B. taurus) não foi observada até o momento (CARTER, 2011). Por outro lado, a variação de suscetibilidade individual foi comprovada nas raças Hereford e Angus na infecção por B. bovis (BENAVIDES; SACCO, 2007). Com base na reação à infecção induzida artificialmente, foi possível classificar 240 bovinos em três diferentes fenótipos: animais suscetíveis, intermediários e resistentes. Animais classificados como sensíveis apresentaram sinais clínicos da doença e necessitaram de tratamento, animais intermediários também apresentaram sinais clínicos, mas se recuperaram sem tratamento, enquanto os animais classificados como resistentes apresentaram soro conversão, porém não chegaram a apresentar sinais clínicos da doença. A frequência de cada fenótipo foi de 45,4; 26,7 e 27,9%, respectivamente. Mais de sete estudos já foram conduzidos para determinar a suscetibilidade de diferentes raças à infecção por A. marginale. Jonsson et al. (2008) fazem uma revisão destes relatos. Estes resultados, juntamente com o trabalho recente de Carter (2011), demonstram que o grau de resistência à infecção não difere substancialmente entre bovinos B. indicus, B. taurus e suas composições raciais, todos sendo altamente sensíveis aos efeitos da infecção por A. marginale. A imunidade não específica para TPB é inversa com relação à idade, ou seja, a resistência à primo-infecção por Babesia spp. e A. marginale é maior em animais com até 6-9 meses (GOFF et al., 2001). Evidências demonstram que a infecção primária em animais com menos de sete meses raramente resultam em sinais clínicos e o desenvolvimento da imunidade duradoura não seria dependente de uma reinfecção, ao contrário do que ocorre em animais expostos a primo-infecção tardiamente (MAHONEY et al., 1973,1979; WILSON, 1979; AGUIRRE et al., 1993; GUGLIELMONE, 1995). Essa resistência está relacionada ao efeito protetor de anticorpos maternos, associado a uma resposta imune antecipada e com altos níveis de IL-12, IFN-gama e NO (BROWN et al., 2006). Independente do grau de resistência do hospedeiro à TPB pode-se afirmar que a constante inoculação dos agentes que causam a doença, como ocorre em regiões endêmicas, estimula o desenvolvimento e manutenção da imunidade natural contra a doença, reduzindo o risco de surtos no rebanho. Mahoney et al. (1980) estimaram que a estabilidade imunológica para babesiose é alcançada quando 75% do rebanho

75 Capítulo 5 Tristeza parasitária bovina: resistência genética 75 é exposto aos protozoários até os nove meses de idade. Nestas condições, são raros os casos de doenças clínicas. Portanto, em locais onde a imunização via vacina não se encontra disponível, a infestação dos bovinos por carrapato de forma controlada, principalmente até os nove meses de idade, deve ser adotado como prática para se evitar surtos da doença. O contato com o vetor não é, no entanto, fator suficiente para garantir a infecção contínua, já que nem todos eles se encontram infectados pelos protozoários ou pela riquétsia. Os bovinos portadores sadios de Babesia spp. ou A. marginale são importantes reservatórios para infecção dos vetores. A parasitemia/ riquetsemia nestes animais é baixa e, na maioria das vezes, indetectável por exame de esfregaço sanguíneo, embora fatores como a imunossupressão, estresse ambiental ou nutricional e infecção concorrente com outras doenças possam provocar flutuação nos níveis da parasitemia/riquetsemia e, até mesmo, o retorno da doença (ERIKS et al., 1989). A infecção latente por B. bigemina foi confirmada experimentalmente após 12 anos da ocorrência da infecção clínica na raça Criola (B. taurus) (AGUIRRE et al., 1993). Johnston et al. (1978) também confirmaram permanência de infecção latente por B. bigemina por até dois anos na raça Droughtmaster (3/8 a 5/8 Brahman x Raça Britânica). Por outro lado, registraram perda de continuidade da infecção com menos de um ano na raça Hereford (JOHNSTON et al., 1978). Para A. marginale, a duração máxima de infecção latente registrada até o momento foi de três anos (ERIKS et al., 1989). O equilíbrio mantido na infecção de animais portadores favorece a sobrevivência tanto do parasito quanto do hospedeiro. A contribuição do nível de parasitemia/riquetsemia de bovinos portadores na infecção do carrapato por Babesia spp. e A. marginale é um fator dependente da raça e idade do rebanho. Aguirre et al. (1988; 1990) acompanharam a infecção natural por B. bovis, B. bigemina e A. marginale, por meio de esfregaço de sangue, de bovinos das raças Hereford, Criola e Nelore mantidos sob o mesmo manejo. A quantidade de lâminas positivas foi maior na raça Hereford, seguido da raça Criola e Nelore. O número de esfregaços positivos foi significativamente menor na raça Nelore, quando comparado com a raça Hereford. Mais recentemente, Oliveira et al. (2008) examinaram o esfregaço de sangue de bovinos e hemolinfa de teleóginas desenvolvidas em vacas e animais jovens (8-12 meses idade) de diferentes grupos genéticos (Nelore, Angus + Nelore, Canchim + Nelore, e Simental + Nelore) e encontraram merozoitos de B. bigemina (6/60) e oocinetos de Babesia spp. (9/549) somente nas amostras originadas dos animais jovens, embora todos os animais fossem positivos para B. bigemina confirmado por exame de PCR. De acordo com Mahoney; Ross (1972), a curva de incidência de B. bigemina em situações de estabilidade enzoótica é menor para bezerros e animais velhos, atingindo seu pico máximo na faixa de 6 a 24 meses de idade, o que explicaria os resultados observados. A frequência de infecção dos carrapatos por B. bigemina não diferiu entre os cruzamentos de B. taurus x B. indicus e B. indicus, mas foi maior para carrapatos desenvolvidos em animais B. taurus (OLIVEIRA et al., 2008). A raça e idade dos bovinos são, portanto, fatores interferentes na epizootiologia da babesiose, pois afetam a taxa de inoculação do vetor. Por consequência, sistemas de criação com maior contribuição de raças europeias na genética do rebanho e focados em recria tendem a ter taxas de infecção do carrapato por Babesia spp. mais elevadas e, consequentemente, taxas de inoculação de Babesia

76 76 Capítulo 5 Tristeza parasitária bovina: resistência genética spp. e A. marginale no hospedeiro maiores. De forma contrária, em rebanhos B. indicus e seus cruzamentos, mantidos sob o mesmo manejo que animais B. taurus, a taxa de inoculação dos agentes da TPB tende a ser menor devido a maior resistência destas raças ao Rhipicephalus (Boophilus) microplus o que acarreta menor infestação. Nestes rebanhos, observa-se, ainda, menor taxa de infecção dos carrapatos por Babesia spp. e A. marginale, em consequência a menor parasitemia/riquetsemia nos bovinos (FRANCIS; LITTLE, 1964; JONSSON et al., 2008). Rebanhos B. taurus têm, desta forma, maior probabilidade de desenvolver altos níveis de imunidade contra a anaplasmose ou babesiose do que animais B. indicus, quando mantidos sobre iguais condições de manejo (JONSSON et al., 2008). Além da raça do hospedeiro, a abundância do vetor é regulada pelo clima, microclima e tipo de estratégia de controle parasitário adotada na propriedade. A imunidade adquirida em rebanhos onde ocorre a estabilidade enzoótica 1 não deve, portanto, ser vista como absoluta, pois pode ser descontinuada quando, por qualquer motivo, há alteração na taxa de infecção do vetor por Babesia spp. e A. marginale ou na taxa de inoculação destes agentes no hospedeiro (ARNOLD, 1948). Além da raça, idade e taxa de inoculação do parasita, fatores como a condição nutricional e infecções concomitantes têm demonstrado afetar a patogênese da TPB. Wilson (1979) demonstrou que animais submetidos a um plano de alimentação pobre em nutrientes apresentaram maior resistência a A. marginale do que animais bem nutridos. A maior resistência em animais mal nutridos estaria relacionada a baixa disponibilidade de aminoácidos essenciais para o desenvolvimento de A. marginale. A resistência à infecção por A. marginale é maior também em bovinos adultos portadores crônicos de infecção por Theileria. A percentagem de animais que necessitaram de tratamento para se recuperar dos efeitos clínicos da infecção por A. marginale aumenta de 50 para 91% em bovinos com e sem infecção crônica. A ausência de reatividade cruzada ente estes dois parasitas, sugere que o aumento de resistência à infecção por A. marginale esteja relacionado à imunidade não específica mediada por células (GALE et al., 1997). Ainda em relação a infecções mistas, Bessenger et al. (1983) sugeriram a ocorrência de supressão da reação à infecção por B. bovis, baseado na redução do período pré-patente quando ocorre infecção concomitante com B. bigemina. a RESISTêNCIa GENÉTICa DOS HOSPEDEIROS a HEMOPaRaSITOS E a IDENTIFICaÇÃO DE MaRCaDORES MOLECULaRES PaRa a CaRaCTERíSTICa DE RESISTêNCIa À TPB Trabalhos com babesiose são inexistentes na área de genética animal, porém estudos de QTLs (do inglês Quantitative Trait Loci), ou seja, regiões (marcadores ou genes) do cromossomo que estão associadas a outras hemoparasitoses como tripanossomose e malária podem contribuir para o avanço do conhecimento, no sentido 1 Conceito estabelecido por Mahoney; Ross (1972), que caracteriza situação epidemiológica onde a taxa de transmissão de Babesia spp. é suficiente para infectar a maioria dos bezerros antes da perda da resistência natural que ocorre entre 6 e 9 meses de idade.

77 Capítulo 5 Tristeza parasitária bovina: resistência genética 77 de indicar regiões do genoma com maior probabilidade de afetar o desenvolvimento do sistema imune do hospedeiro frente às hemoparasitoses. Assim como a babesiose provoca perdas produtivas e mortes em bovinos oriundos de regiões marginais para a presença do carrapato R. microplus, a tripanossomose bovina tem grande importância econômica em regiões onde a mosca tsé-tsé (Glossinia sp.), vetor dos hemoprotozoários extracelulares Trypanosoma brucei brucei, T. congolense e T. vivax, é prevalente (África Equatorial) e também em áreas onde outros vetores transmitem esta enfermidade, como na Ásia, Oriente Médio e América Latina (d IETEREN et al., 2000). Ambos hemoparasitos (Babesia e Trypanosoma) causam sintomas como anemia, perda de peso e aborto, porém a tripanossomose também causa linfoadenopatia e caquexia em animais sensíveis, que podem permanecer infectados por meses ou anos. Ambos parasitos são responsáveis pela perda de bilhões de dólares por ano. Algumas raças bovinas como a N Dama e a West African (ROBERTS; GRAY, 1973; ROELANTS, 1986; DOKO et al., 1991) possuem a característica de ser resilientes ou tripanotolerantes, que é a capacidade de um indivíduo manter-se produtivo apesar de estar infectado com o tripanossoma. A inexistência de vacinas e problemas de resistência dos parasitos frente às drogas comercialmente disponíveis no mercado têm levado a um extenso estudo da base genética da tripanotolerância visando sua utilização como alternativa no controle da enfermidade. Como estratégia alternativa de trabalho, experimentos sobre resistência genética à tripanossomose também foram realizados em camundongos. Como esta espécie possui menor intervalo de gerações, maior número de progênies e um mapa genético bastante saturado, comparado com a espécie bovina, é possível identificar as possíveis regiões de interesse nos camundongos e depois, por genômica comparativa, identificá-las nos bovinos. Jennings et al. (1978) e Morrison; Murray (1979) observaram que várias linhagens de camundongos apresentavam variação fenotípica de resposta a tripanossomose quando estes eram infectados experimentalmente com o parasito. Assim, camundongos de linhagens suscetíveis (BALB/c e A/J) foram cruzados com linhagem resistente (C57BL/6J) para formar uma população F2 para o estudo de genes associados à tripanossomose. Os primeiros resultados dos estudos de QTL mostraram três3 QTLs nos cromossomos 1, 5 e 17 na população BALB/c_C57BL/6J e dois QTLs nos cromossomos 5 e 17 da população A/J_C57BL/6J como regiões do cromossomo murinho, que estão associados a uma maior resistência dos camundongos frente ao desafio por T. congolense isolado ILNat3.1 (KEMP et al., 1997). O QTL localizado no cromossomo 17 foi o mais relevante, pois explicou 15% e 9% da variação total encontrada nas populações BALB/c_C57BL/6J e A/J_C57BL/6J, respectivamente. Em trabalhos posteriores, Clapcott et al. (2000) observaram que o QTL do cromossomo murino 17 apresentava uma segregação que dependia do genótipo do pai ( imprinting genômico) uma vez que duas populações com pais F1 e mães BALB/c tiveram uma taxa de sobrevivência mais alta comparada às duas populações com pais BALB/c e mães F1. Usando metodologia similar a dos camundongos, bovinos N Dama ( tripanotolerantes ) foram acasalados com bovinos da raça Boran ( tripanosensíveis ) para formar uma população F2, nos quais as diferentes respostas dos indivíduos foram medidas após inoculação com T. congolense. A população bovina delineada para estu-

78 78 Capítulo 5 Tristeza parasitária bovina: resistência genética dar QTLs em tripanosomose foi originada de 4 famílias F1 N Dama x Boran e gerou 177 animais F2. Aos 12 meses de idade, todos os animais, mais seis animais de cada raça parental, foram expostos a moscas tsé-tsé (Glossinia morsitans centralis) infectadas com T. congolense (mesmo clone usado para o trabalho em camundongos). O monitoramento da infecção foi realizado até que o volume globular (medida indireta do grau de anemia) dos animais atingisse 12% ou até 150 dias pós-inoculação. A população foi caracterizada para 477 marcadores moleculares e as análises mostraram 16 QTLs em 15 cromossomos (dois deles no cromossomo bovino 16). As características associadas com as regiões genômicas foram: volume globular, carga parasitária e peso corporal (HANOTTE et al., 2003). Trabalhos como o de Kemp et al. (1997) e Hanotte et al. (2003) são importantes para mostrar quais regiões genômicas são interessantes de serem testadas na resistência do hospedeiro de outras espécies animais à hemoparasitos. É interessante notar que no segundo trabalho foi possível verificar que além de regiões genômicas relacionadas com a carga parasitária, também haviam regiões relacionadas com características de peso corporal e principalmente de controle de anemia. Os autores discutem a possibilidade de que fatores não-imunológicos, como os de adaptação e de hematopoiese também possam ser igualmente importantes no mecanismo de controle da infecção de hemoparasitos pelos hospedeiros. Um outro fator positivo na pesquisa com Babesia é a sua estreita relação com o gênero Plasmodium. Este gênero causa malária em humanos e em outras espécies animais e ambos Plasmodium e Babesia pertencem ao filo Apicomplexa. Ambos gêneros compartilham aspectos comuns como variação antigênica clonal, cito-aderência e sequestro de hemácias no sistema microvascular (ALLRED, 1998). Considerando a estreita relação filogenética e de patogenicidade entre os hemoparasitos dos gêneros Babesia e Plasmodium, é possível que os conhecimentos acumulados nos estudos em malária possam beneficiar os trabalhos de pesquisa com Babesia spp. Diversas moléculas estão envolvidas na resistência de indivíduos à malária. A mais notória é o antígeno Duffy (DARC) receptor de citocinas, localizado na membrana dos eritrócitos. Hemácias de indivíduos Duffy negativo são refratárias a infecções por Plasmodium vivax (LIVINGSTONE, 1984), pois o antígeno Duffy é um receptor essencial para a entrada do parasita nas hemácias uma vez que interage com a proteína de ligação Duffy (DBP) dos merozoítos de P. vivax (WERTHEIMER; BARNWELL, 1989). Consequentemente, hemácias Duffy negativas não permitem a ligação DBP-Duffy o que dificulta a invasão de merozoítos em eritrócitos. Variação genética de Duffy (Fya e Fyb) também foi observada em eritrócitos bovinos (NAKAMOTO et al., 1998), sendo que há uma alta frequência de indivíduos Duffy negativo (Fya-b-) em Bos indicus (86%), enquanto que somente 14% dos Bos taurus tem este fenótipo. Indivíduos Bos indicus são considerados mais resistentes à babesiose do que Bos taurus (JAMES, 1988). Porém, traçando um paralelo com os resultados obtidos por Nakamoto e os estudos de que indivíduos resistentes à malária causada por P. vivax são Duffy negativo, seria esperado que aproximadamente 14% dos zebuínos fossem afetados pela TPB. No entanto esta baixa porcentagem de infecção em zebuínos não é observada quando estes animais são utilizados em infecções experimentais e também não são raros os casos de surtos de babesiose em

79 Capítulo 5 Tristeza parasitária bovina: resistência genética 79 zebuínos no campo campo quando estes são criados na ausência de Rhipicephalus microplus (Ana Maria Sacco, dados não publicados). Sendo assim, o antígeno Duffy não poderia ser sugerido como o único determinante da resistência à babesiose, nem em zebuínos nem em taurinos, nos quais provavelmente outras proteínas do sistema imune tenham papel de maior importância neste processo. Outros genes também podem ser capazes de reduzir o risco de indivíduos frente à malária. Eritrócitos deficientes em glicose 6 fosfato desidrogenase (G6PD), enzima fundamental no metabolismo da glicose, apresentam um reduzido risco de infecção pelo Plasmodium (BEUTLER, 1994), uma vez que células deficientes para esta enzima inibem o crescimento do parasito nos primeiros ciclos da infecção (RUWEN- DE; HILL, 1991; BEUTLER, 1994). Em humanos existem sete alelos para G6PD, sendo que o alelo G6PD A- está associado com uma atividade enzimática média de 12% (variando entre 0 a 25%) e acredita-se que confira proteção à malária em populações africanas (RUWENDE et al., 1995). Polimorfirmos em genes do complexo de histocompatibilidade principal, tanto de classe I como de classe II, também têm sido associados com o grau de severidade de infecção em indivíduos parasitados por malária. Hill et al. (1991) encontraram que genótipos HLA-B53 e os haplótipos DRB1* DQB1*0501 protegiam indivíduos de malária severa. Dentre as citocinas, o fator de necrose tumoral alfa (TNF- -alfa) tem chamado atenção tanto pelo seu papel na defesa do hospedeiro quanto na patogenia da malária cerebral em humanos. McGuire et al. (1994) encontraram que crianças homozigotas para o alelo TNF308A tinham aumentada susceptibilidade à malária cerebral. A região promotora deste gene apresenta três alelos em humanos e esta variabilidade seria determinante na diferença de expressão do TNF-alfa, uma vez que cada alelo teria diferente nível de transcrição. A associação do TNF308A com malária também foi encontrada por Wattavidanage et al. (1999) e este alelo também foi associado com susceptibilidade a lepra, leishmaniose, tracoma e septicemia meningocócica (ABRAHAM; KROEGER, 1999). Estudos de QTL identificaram que a parasitemia do P. falciparum em humanos era parcialmente controlada por um QTL no cromossomo 5 (RIHET et al., 1998). Em estudo realizado com uma população de 340 camundongos F1 de linhagens A/J (suscetíveis) e C57BL/6J (resistentes) desafiados com P. chabaudi, Hernandez- Valladares et al. (2004) encontraram dois QTLs para resistência a malária nos cromossomos murinos 5 e 17. Comparando estes resultados com os de Kemp et al. (1997), é possível observar que a região do cromossomo 17 é similar para ambas as enfermidades, e até é possível que se trate do mesmo gene. No entanto somente uma maior saturação destas regiões em termos de marcadores e de genes será capaz de mostrar que o mesmo gene esteja atuando na resistência do camundongo à malária e à tripanossomose. Dos trabalhos acima citados é possível sugerir que a resistência do hospedeiro à malária e à tripanossomose deva ser determinada por vários genes uma vez que se tratam de respostas imunes do hospedeiro frente a patógenos, e esta resposta geralmente depende de um sistema complexo e em cascata onde são ativados e produzidos sucessivos processos celulares e proteínas. É, portanto, possível que a resposta imune frente a estes patógenos, e também a Babesia, seja determinada por

80 80 Capítulo 5 Tristeza parasitária bovina: resistência genética vários genes e não por um gene principal que determine grande parte da variação na resposta. De qualquer maneira, o fato da existência de respostas individuais dentro de raças é animador, pois possibilita identificação de marcados genéticos ligados a resistência de hospedeiro e, portanto, passível de seleção. REFER ÊNCIAS ABRAHAM, L. J.; KROEGER, K. M. Impact of the -308 TNF promoter polymorphism on the transcriptional regulation of the TNF gene: relevance to disease. Journal of Leukocyte Biology, v. 66, p , AGUIRRE, D. H.; BERMTIDEZ, A. C.; MANGOLD, A. J.; GUGLIELMONE, A. A. Infeccion natural con Babesia bovis y Babesia bigemina en bovinos de raza Hereford, Criolla y Nelore en Tucumfin, Argentina. Revista de Medicina Veterinaria, v. 71, p , AGUIRRE, D. H.; BERMUDEZ, A. C.; MANGOLD, A. J.; GUGLIELMONE, A. A. Infección natural con Anaplasma marginale en bovines de raza Hereford, Criolla y Nelore en Tucumán, Argentina. Revista Latino Americana de Microbiologia, v. 30, p , AGUIRRE, D. H.; ECHAIDE, S. T.; MANGOLD, A. J.; GUGLIELMONE, A. A. Duración prolongada de la inmunidad contra Babesia bigemina en ausencia de reinfección. Revista de Medicina Veterinaria, v. 74, n. 4, p , ALLISON, A.C.; CLARK, I. A. Specific and non-specific immunity to haemoprotozoa. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, v. 26, n. 6, p , ALLRED, D.R. Antigenic variation in Babesia bovis: How similar is it to that in Plasmodium falciparum? Annals of Tropical Medicine and Parasitology, v. 92, n. 4, p , ARNOLD, R. M. Resistance to Tick-Borne disease. Veterinary Record, v. 35, n. 60, p. 426, BENAVIDES, M. V.; SACCO, A. M. S. Differential Bos taurus cattle response to Babesia bovis infection. Veterinary Parasitology, v. 150, p , BESSENGER, R.; SCHOEMAN, J.H. Serological response of cattle to infection with Babesia bigemina and Babesia bovis in southern Africa. Onderstepoort Journal of Veterinary Research, v. 50, p , BEUTLER, E. G6PD deficiency. Blood, v. 84, n. 11, p , BOCK, R. E.; de VOS, A. J.; KINGSTON, T. G.; McLELLAN, D. J. Effect of breed of cattle on innate resistance to infection with Babesia bovis, Babesia bigemina and Anaplasma marginale. Australian Veterinary Journal, v. 75, p , BOCK, R. E.; KINGSTON, T. G.; de VOS, A. J. Effect of breed of cattle on innate resistance to infection with Babesia bovis and B. bigemina transmitted by Boophilus microplus. Australian Veterinary Journal, v. 77, n. 7, p , 1999a. BOCK, R. E.; KINGSTON, T. G.; STANDFAST, N. F.; de VOS, A. J. Effect of cattle breed on innate resistance to inoculations of Babesia bigemina. Australian Veterinary Journal, v. 77, n. 7, p , 1999b. BROWN W. C.; NORIMINE, J.; KNOWLES, D. P.; GOFF, W. L. Immune control of Babesia bovis infection. Veterinary Parasitology, v. 138, n. 1-2, p , CARTER, P. Innate susceptibility of various cattle breeds to tick fever disease caused by B. bovis and A. marginale. Final Report. Tick Fever Centre, Department of Employment, Economic Development and Innovation. ISBN: , 11 páginas, CLAPPCOTT, S. J.; TEALE, A. J.; KEMP, S. J. Evidence for genomic imprinting of the major QTL controlling susceptibility to trypanosomiasis in mice. Parasite Immunology, v. 22, p , DALY, G.D.; HALL, W.T. K. Note on the susceptibility of British and some zebu-type cattle to tick fever (babesiosis). Australian Veterinary Journal; v. 31, p. 152, D IETEREN, G. M. D.; AUTHIÉ, E.; WISSOCQ, N.; MURRAY, M. Explotation of resistance to trypanosomes and trypanosomosis. In: Breeding for Disease Resistance in Farm Animals. eds. AXFORD, R. F. E.; BISHOP, S. C.; NICHOLAS, F. W.; OWEN, J. B. (eds.). Cap. 9, p CAB International, 2000.

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83 6 Resistência genética de bovinos ao carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus Fabiane Siqueira Fernando Flores Cardoso Cláudia Cristina Gulias Gomes Luciana Correia de Almeida Regitano Marco Antônio Machado

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85 Capítulo 6 Resistência genética de bovinos ao carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus 85 INTRODUÇÃO No ano de 2012, o Brasil produziu um total de 9,4 milhões de toneladas de equivalente carcaça de carne bovina. Desses, 1,5 milhão de toneladas tiveram como destino a exportação, gerando um faturamento de US$ 5,7 bilhões e consolidando a posição de maior exportador mundial de carne bovina (ABIEC, 2013). Entretanto, apesar do grande destaque no mercado mundial, a carne bovina brasileira ainda é produzida em sistemas de criação sujeitos à escassez periódica de forragens e ao controle sanitário insatisfatório. Entre as principais causas de perdas econômicas nos sistemas de produção de bovinos no Brasil, e nos demais países de clima tropical, está o carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus. As perdas provocadas pelo ectoparasita provocam reduções drásticas nas produções de carne e leite e o País deixa de produzir 26 milhões de arrobas de carne/ano e quatro bilhões de litros de leite/ano, refletindo em prejuízos da ordem de R$ 2,24 bilhões (MARTINEZ et al., 2004). Os prejuízos causados pelo R. microplus são decorrentes tanto de sua ação direta sobre o hospedeiro, tais como: perda de peso, baixa conversão alimentar, diminuição na produção de carne e leite, desvalorização do couro pela ocorrência de lesões e miíases, toxicoses, lesões da pele, anemia, bem como de perdas indiretas relacionadas à transmissão de patógenos, responsáveis pela babesiose (Babesia bovis e B. bigemina) e anaplasmose (Anaplasma marginale), hemoparasitoses estas que caracterizam o complexo da Tristeza Parasitária Bovina (TPB). Contribuem também para compor o quadro de agravantes deste parasitismo os altos custos com tratamentos químicos, equipamentos, instalações e mão de obra. Este cenário tem motivado, há anos, pesquisas direcionadas para o desenvolvimento de métodos de controle e diferentes estratégias têm sido propostas. Historicamente, o método de controle para o carrapato que mais tem sido utilizado desde o final do século XIX baseia-se na utilização de produtos químicos, que atuam na fase de vida parasitária do parasita. Os acaricidas que já foram utilizados incluem derivados arsenicais, organoclorados, organofosforados, carbamatos, piretróides sintéticos e amidinas. Porém, a experiência de algumas décadas de uso contínuo desses fármacos demonstra que as expectativas do controle parasitário não podem ser depositadas somente no tratamento químico, pois a alta capacidade de adaptação destes ácaros conduz, invariavelmente, à seleção de indivíduos resistentes, tornando este tipo de controle cada vez menos viável economicamente (FRISCH, 1999). Os custos crescentes para o desenvolvimento de novas drogas e o curto período de vida útil que elas apresentam têm desestimulado a procura de bases químicas com mecanismos de ação diferenciados. O uso de carrapaticidas em grande escala também apresenta como fator limitante a possibilidade de ocorrência de resíduos na carne, leite e meio ambiente, comprometendo a segurança alimentar e contrariando as novas exigências dos mercados consumidores, que apresentam demanda crescente por alimentos mais saudáveis obtidos por meio de uma produção sustentável e ecologicamente correta. Técnicas de manejo dos animais e das pastagens baseadas na epidemiologia e ecologia do R. microplus, como o cultivo de espécies forrageiras com ação repelente ou

86 86 Capítulo 6 Resistência genética de bovinos ao carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus acaricida sobre as larvas; a alternância de pastoreio entre ovinos e bovinos; e a rotação ou o descanso de pastagens dificultam a sobrevivência das fases de vida livre do parasita, podendo, assim, reduzir a frequência do tratamento químico. No entanto, poucas propriedades rurais adotam estas práticas, por falta de acesso ao conhecimento ou por dificuldades logísticas e orçamentárias para implantação. Nesse contexto, diversos métodos de controle estão sendo pesquisados como formas alternativas ou complementares ao controle químico. Entre estes se destacam o uso de micro-organismos patogênicos aos carrapatos, como fungos, bactérias e nematódeos; a utilização de compostos naturais com efeito acaricida ou repelente (fitoterápicos, nutracêuticos e semioquímicos), vacinas multi-antígenos e a seleção genômica para a característica de resistência ao R. microplus. Até o momento, os únicos produtos alternativos ao controle químico disponíveis no mercado são as vacinas TickGard, desenvolvida na Austrália pela Divisão de Ciências Animais Tropicais do CSIRO, e a Gavac, desenvolvida no Centro de Engenharia Genética e Biotecnologia de Cuba, esta última à venda no Brasil. Ambas são baseadas na proteína Bm86, que foi identificada no intestino de fêmeas do carrapato. Embora essas vacinas estejam disponíveis comercialmente, elas não asseguram o grau de proteção necessário para suprimir de imediato o uso de acaricidas, sugerindo a necessidade da identificação de outros antígenos protetores. As limitações apresentadas pelos métodos de controle existentes indicam a necessidade de disponibilizar aos criadores medidas alternativas para complementar os procedimentos de controle tradicionais, mas que ao mesmo tempo não resultem em maiores gastos no processo de obtenção do produto final. A seleção de animais resistentes em programas de melhoramento genético foi indicada por Frisch (1999) como uma das formas mais promissoras de controle parasitário, uma vez que tem como premissa a prevenção, com efeito permanente durante a vida do animal e acumulativo no rebanho ao longo do tempo. Diferentes níveis de resistência dos bovinos ao carrapato foram observados por diversos autores, tanto dentro de raças como entre raças. Estas diferenças podem ser utilizadas para adequar genótipo e ambiente, visando aumentar a eficiência produtiva dos sistemas de produção de carne e leite do País. RESISTêNCIa GENÉTICa DOS BOVINOS ao CaRRaPaTO O mecanismo de resistência dos bovinos ao carrapato R. microplus é um fenômeno complexo e ainda pouco compreendido, sendo que a resistência à infestação ou a capacidade de desenvolver uma resposta imunológica eficaz é geneticamente determinada. Existem dois tipos de mecanismos de resistência: a resistência inata, já presente no animal na primeira infestação e que não depende do contato prévio do bovino com o carrapato e a resistência adquirida, que começa a ser evidenciada após a exposição do animal a algumas infestações. As respostas imunes desenvolvidas pelo bovino contra o carrapato são dirigidas, essencialmente, contra os antígenos presentes na saliva deste ectoparasita, os quais são inoculados no hospedeiro durante o repasto alimentar. Estas respostas podem ser de três tipos: a) alguns antígenos salivares com baixo peso molecular (haptenos)

87 Capítulo 6 Resistência genética de bovinos ao carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus 87 associam-se às proteínas da pele do hospedeiro para estimular uma resposta imune celular e em uma exposição subsequente, estes haptenos estimulam uma reação de hipersensibilidade tardia; b) os antígenos salivares podem se ligar às células de Langerhans presentes na epiderme e induzir uma hipersensibilidade cutânea do tipo basofílica, associada à produção de imunoglobulina da classe G (IgG) e infiltração basofílica; c) os antígenos salivares estimulam a produção de IgE, desencadeando uma reação de hipersensibilidade do tipo I. Esta resposta induz uma severa inflamação na pele, ocorrendo prurido e dor (SOARES et al., 2001). Tais mecanismos imunológicos podem modificar a pele do hospedeiro e, desta forma, o repasto é prejudicado. Entretanto, as respostas imunes contra antígenos são de curta duração. Assim, a resistência imunológica natural aos carrapatos é expressa, principalmente, sobre o estádio larval com participação de células da inflamação e substâncias por elas produzidas (SOARES et al., 2001). A autolimpeza dos bovinos é uma das formas desta expressão. Neste comportamento, os animais tentam se livrar das larvas lambendo o corpo, roçando-o em uma superfície áspera e/ ou lançando a cauda sobre o dorso, em reação à hipersensibilidade provocada pelas secreções salivares das larvas. Quanto maior a intensidade da resposta imunológica maior será a reação edematosa exsudativa e pruriginosa. A comparação de hospedeiros susceptíveis e resistentes mostrou que reações cutâneas diferem significativamente no local da injúria. A resposta imune frequentemente desenvolve-se com influxo de basófilos, neutrófilos e eosinófilos para a derme e a epiderme que cercam o local da picada. De acordo com Allen et al. (1979), este mecanismo promove hipersensibilidade basófila cutânea caracterizada pela degranulação destas células com a liberação de histamina, possivelmente inibindo a salivação e a alimentação do carrapato. Kashino et al. (2005) avaliaram os níveis de anticorpos contra antígenos salivares de carrapatos em bovinos das raças Holandesa (susceptíveis) e Nelore (resistentes) e verificaram que após algumas infestações os níveis de anticorpos IgG1 e IgG2 diminuíram nos animais Holandeses, permanecendo inalterados nos animais Nelore, indicando que as infestações com carrapato suprimem a resposta humoral mediadas por anticorpos IgG em animais susceptíveis. Alguns estudos têm associado os fenótipos resistentes a mecanismos imunológicos adquiridos, após a exposição dos animais a repetidas infestações. Esta resistência é caracterizada pela redução na quantidade e no tempo da alimentação, diminuição do número e viabilidade de ovos, além da morte das fêmeas ingurgitadas (WIKEL; BERGMAN, 1997). Tal fato foi observado por Wagland (1975) em rebanhos australianos das raças Brahman (Bos taurus indicus) e Shorthorn (Bos taurus taurus), sem contato prévio com R. microplus e submetidos a infestações artificiais. Neste estudo, após a primeira exposição, os dois grupos apresentaram resultados similares quanto ao número de fêmeas adultas do parasita presente no corpo dos animais. Entretanto, após quatro infestações sucessivas, bovinos Shorthorn apresentaram-se significativamente mais infestados que os bovinos Brahman. Frisch e O Neill (1998) classificaram os bovinos B. taurus indicus (Zebu africano e indiano) como de elevada resistência ao carrapato; os B. taurus taurus do grupo Sanga como de resistência um pouco mais baixa, e os B. taurus taurus britânicos e continentais como de baixa resistência. De acordo com Frisch (1999), as raças que

88 88 Capítulo 6 Resistência genética de bovinos ao carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus evoluíram na presença de contínuos desafios pelo carrapato apresentam, em média, alta resistência a estes ectoparasitas. Exceto em circunstâncias incomuns, zebuínos e algumas raças taurinas indígenas desenvolveram uma relação relativamente estável com os carrapatos. Assim, os zebuínos asiáticos, zebuínos africanos, sangas, as raças taurinas do Oeste da África e as raças crioulas da América do Sul são ricas fontes de material genético que podem ser utilizadas para identificação de raças específicas que apresentem alta resistência a determinadas espécies de carrapatos. A maior tolerância de animais zebuinos quando comparados com taurinos tem sido amplamente reportada na literatura e estudos envolvendo cruzamentos entre animais destes grupos apontam, inclusive, uma proporcionalidade entre a frequência de genes zebuínos e o grau de resistência dos hospedeiros. Quanto maior a proporção de genética zebuína no mestiço, maior será sua resistência ao carrapato (LEMOS et al., 1985; MORAES et al., 1986; OLIVEIRA; ALENCAR, 1990; WAMBURA et al., 1998; CARDOSO, 2000; SANTOS JR. et al., 2000; SILVA et al., 2006a). No Brasil, Teodoro et al. (1984) analisaram a resistência de touros mestiços 5/8, 3/4 e 7/8 europeu x zebu sob infestação artificial com carrapatos e observaram maior proporção de animais 5/8 resistentes e menor resistência genética para os animais 7/8. O mesmo resultado foi observado por Lemos et al. (1985) em infestações naturais de novilhas de diferentes grupos genéticos, os quais variaram de 1/4 Holandês x zebu a Holandês puro por cruza. Os autores observaram maior carga parasitária à medida que se aumentava a proporção de genes da raça Holandesa. Veríssimo et al. (2002) compararam fêmeas das raças Holandês, Gir e mestiças e atribuíram a menor resistência às vacas Holandês e a maior às vacas Gir. Silva et al. (2007) analisando diferentes grupos genéticos expuseram fêmeas bovinas a quatro infestações artificiais, atribuindo a menor susceptibilidade a novilhas Nelore, resistência intermediária a fêmeas Canchim x Nelore e a maior carga parasitária aos produtos do cruzamento entre Angus x Nelore e Simental x Nelore. Resultados similares também foram observados por Silva et al. (2010) em infestação natural de fêmeas bovinas de corte dos grupos genéticos Nelore, Angus x Nelore, Canchim x Nelore e Simental x Nelore. Foram realizadas de seis a dez contagens em cada animal. Os animais do grupo Simental x Nelore apresentaram grau de infestação semelhante aos Angus x Nelore no inverno e na primavera do ano de 2003 e no verão e outono de 2004, porém apresentaram maior infestação do que os animais Angus x Nelore nos outros anos/épocas do experimento. Os animais do grupo Nelore apresentaram menor grau de infestação do que os cruzados em todos os anos/épocas, com exceção dos Canchim x Nelore na primavera de Estes resultados mostram que, mesmo as fêmeas cruzadas Canchim x Nelore que tem, em média, apenas 31,25% de genética taurina, apresentaram maior infestação de carrapatos do que a raça Nelore. Quando os autores desconsideraram a interação entre grupo genético x ano/época, a tendência foi idêntica à anterior, ou seja, os animais da raça Nelore apresentaram menor infestação, seguidos dos grupos Canchim x Nelore; Angus x Nelore, e Simental x Nelore. Na Austrália, o uso de animais zebuínos resistentes e seus cruzamentos com raças europeias têm sido intensamente praticado ao longo dos anos. Utech et al.

89 Capítulo 6 Resistência genética de bovinos ao carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus 89 (1978) avaliaram, após infestação artificial, a resistência de bovinos em várias raças de corte e leite determinada pela porcentagem de larvas que não conseguiram sobreviver até a maturidade. Em gado de corte, animais da raça Brahman apresentaram maior grau de resistência quando comparados com animais de raças britânicas. Em gado leiteiro, foi relatada na raça Jersey maior grau de resistência do que nas raças Guernsey, Illawarra Australiana, Shorthorn e Friesian. Prayaga (2003) observou diferenças significativas (P < 0,05) nas contagens de carrapatos em grupos genéticos derivados de zebu, principalmente da raça Brahman, e animais derivados do grupo Sanga (Belmont Red-Africander x Hereford-Shorthorn) e/ou do grupo de raças britânicas adaptadas (Belmont Adaptur x Hereford-Shorthorn). Segundo o autor, com o aumento da proporção de genética zebuína nos cruzamentos o número de fêmeas ingurgitadas de carrapato diminuiu. Estes resultados reforçam a vantagem genética das raças da subespécie B. taurus indicus e seus cruzamentos sobre as raças da subespécie B. taurus taurus. Diferentes níveis de susceptibilidade são observados não apenas entre B. taurus indicus e B. taurus taurus, mas também entre raças de mesma origem e entre indivíduos de mesmo grupo racial. Entre as raças europeias, os bovinos Jersey são apontados como mais resistentes quando comparados a outros grupamentos de B. taurus taurus, enquanto que na raça Brahman, considerada uma das mais resistentes entre as zebuínas, cerca de 10% dos animais apresentam apenas resistência intermediária ao carrapato (UTECH et al., 1978). A existência de diferenças entre raças e indivíduos quanto ao grau de infestação por carrapato sugere a possibilidade da utilização do cruzamento para aproveitar as vantagens da heterose e da complementaridade em características produtivas e de adaptação, visando ao aumento da eficiência produtiva dos rebanhos. Vários estudos mostraram que a herdabilidade da característica de resistência ao carrapato é considerada de baixa a alta, variando de 0,09 a 0,44 (ANDRADE et al., 1998; BURROW et al., 2001; FRAGA et al., 2003; HENSHALL, 2004; CARDOSO et al., 2006; REGITANO et al., 2006; SILVA et al., 2006b; MACHADO et al., 2010; TURNER et al., 2010; BIEGELMEYER et al., 2012). Esta grande variação nas estimativas provavelmente existe em decorrência das diferenças nos métodos de infestação (natural e artificial), nos grupos genéticos, nos modelos estatísticos e nos métodos de análise estatística. Apesar disto, diversos trabalhos mostram que existe variação genética aditiva, justificando sua inclusão em programas de seleção (ALENCAR et al., 2005). A obtenção de diferenças esperadas na progênie (DEPs) para resistência a este parasita e sua utilização como critério de seleção juntamente com outras características de importância econômica poderá contribuir para aumentar a eficiência dos sistemas de produção. Dessa forma, para evitar perdas econômicas, quando as condições ambientais são favoráveis ao carrapato, o emprego de genótipos resistentes é de fundamental importância para o sistema produtivo (ALENCAR et al., 2005). O descarte ou tratamento diferenciado de animais sensíveis, para reduzir o nível de infestação geral e a manutenção ou aumento da participação do sangue zebu no rebanho são exemplos de práticas de manejo que também favorecem o controle do carrapato tendo por base a resistência genética do hospedeiro.

90 90 Capítulo 6 Resistência genética de bovinos ao carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus MaRCaDORES MOLECULaRES E a RESISTêNCIa DO HOSPEDEIRO ao CaRRaPaTO Os primeiros estudos sobre herdabilidade e genética molecular visando associar a resistência do hospedeiro às variações biológicas foram realizados a mais de 40 anos. Entretanto, no final da década de 80 ocorreu uma mudança no foco das pesquisas quando este passou da genética para a imunologia, com o intuito de desenvolver uma vacina contra o carrapato. Este fato levou a uma escassez de pesquisas sobre marcadores biológicos para resistência no período de 1990 a 2000 (PORTO NETO et al., 2011a). Devido à necessidade de identificar e disseminar raças bovinas que sejam adaptadas e eficientes em diferentes ambientes, bem como às limitações da vacina contra carrapatos, o interesse em entender os mecanismos fisiológicos envolvidos com a adaptação genética bovina, incluindo a característica de resistência a parasitas, foi retomado e alguns progressos estão sendo feitos na compreensão dos mecanismos de resposta imune a infestação e o controle genético destas expressões fenotípicas. De acordo com Frisch (1999), as raças bovinas que durante o seu período evolutivo estiveram em contato com carrapatos de uma determinada espécie, provavelmente, acumularam grande quantidade de genes de efeitos menores. Este tipo de característica poligênica promove resposta rápida e efetiva à seleção em raças que apresentam de moderada a alta resistência ao carrapato, mas o mesmo não ocorre com raças de baixa resistência. Nestes casos, a melhor estratégia, para sair de um estado onde os animais sofrem com o parasitismo e ocorrem perdas econômicas para uma situação de convivência com os carrapatos, seria explorar genes de efeito maior que estivessem associados com a característica de resistência do hospedeiro. Seguindo este raciocínio, pesquisadores australianos desenvolveram na década de 50 a raça sintética Adaptur, resistente aos carrapatos, a partir do cruzamento de animais Hereford e Shorthorn, que eram as raças usadas para produção de carne no Norte da Austrália antes da introdução da raça Brahman. Em termos evolucionários, a raça Adaptur foi pouco exposta ao parasitismo e, ao contrário das raças tropicais, não teve a oportunidade de acumular, gradualmente, significativa resistência poligênica (FRISCH, 1999). O processo usado para identificar um gene de resistência ao carrapato de efeito maior em animais Adaptur foi descrito por Kerr et al. (1994) e Frisch (1994). Ao longo de mais de 20 anos de seleção, a frequência do gene foi aumentando na população por meio do uso contínuo de animais resistentes como pais das novas gerações. O número médio de carrapatos por animal com 2, 1 ou 0 cópias do gene foi de 7, 36 e 128, respectivamente. Dessa forma, cada cópia do gene reduziu sequencialmente a contagem de carrapatos em 75% e a frequência do gene na raça Adaptur foi estimada em 25%. Embora este gene controle uma proporção significativa da variação genética para a característica de resistência ao carrapato nesta raça, estudos posteriores indicaram que a ação é poligênica (HENSHALL, 2004). A maioria das características quantitativas de importância econômica para a produção animal é influenciada pelo ambiente e controlada por vários genes, cada um deles contribuindo com pequeno efeito na determinação fenotípica. Os genes específicos que controlam essas características são amplamente desconhecidos, quanto a sua localização e o tamanho do efeito que cada um deles exerce sobre a característica.

91 Capítulo 6 Resistência genética de bovinos ao carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus 91 Estudos de QTL (Quantitative Trait Loci) têm como proposta identificar regiões cromossômicas que contêm genes ou blocos de genes responsáveis por uma parte quantificável da variação da característica fenotípica. Um QTL, portanto, é definido como uma região cromossômica que apresenta padrão mendeliano de transmissão genética e que afeta uma característica de interesse. Uma vez localizado o QTL, é possível obter informações quanto ao seu efeito, as quais podem ser utilizadas na seleção assistida por marcadores moleculares (MAS) que, em conjunto com a seleção por métodos quantitativos, poderá trazer ganhos genéticos em menor espaço de tempo. A identificação de QTLs é dependente do desenvolvimento de mapas genéticos de marcadores moleculares altamente polimórficos. Dentre as variações de técnicas usadas na análise de polimorfismos no DNA, a identificação de marcadores do tipo Microssatélites ou repetições de sequências simples (Simple Sequence Repeats SSRs) e Polimorfismos de Base Única (Single Nucleotide Polymorphisms SNPs) têm sido as mais usadas para a característica de resistência ao R. microplus. Apesar da importância econômica dos carrapatos para a pecuária, ainda existem poucos resultados descritos na literatura sobre a identificação de genes ou marcadores moleculares para a característica de resistência a este ectoparasita, o que pode ser explicado pela dificuldade de identificação em larga escala de indivíduos resistentes. Entre os genes mais estudados do sistema imunológico e associados à resistência dos hospedeiros estão os genes do complexo maior de histocompatibilidade (Major Histocompatibility Complex - MHC) ou sistema BoLA (Bovine Lymphocyte Antigen). Localizados no cromossomo 23, estes genes codificam glicoproteínas de superfície celular que atuam como receptores nas células apresentadoras de antígenos, acoplando e apresentando peptídeos antigênicos para os linfócitos T, responsáveis pelo início da resposta imune. Desta forma, variações nos genes de classe I e II deste complexo poderiam influenciar a capacidade imune dos animais, e os mecanismos de resistência e desenvolvimento da resposta imunológica poderiam ser elucidados a partir da compreensão da expressão destes genes (BIEGELMEYER et al., 2012). Associações significativas entre alelos microssatélites ou PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Lenght Polymorphism) e resistência bovina ao carrapato foram observadas nos alelos BoLA-DRB3.2 (MARTINEZ et al., 2006), DRB1 e DRB3 (UNTALAN et al., 2007) e DRB1 e DRBP1 (ACOSTA-RODRÍ- GUES et al., 2005). Estes resultados confirmam que há evidência científica suficiente suportando a função destes locos na resistência bovina. Nos últimos anos, análises de ligação e estudos de associação genômica ampla (Genome-Wide Association Studies - GWAS) com marcadores moleculares do tipo microssatélites foram realizadas para fazer varreduras nos cromossomos bovinos, visando à identificação de efeitos significativos para a característica de resistência ao carrapato. Para estes trabalhos, foi utilizada uma família F2 de referência (Holandês x Gir) desenvolvida na Embrapa Gado de Leite em Minas Gerais no período de 1999 a Esta família de 382 animais F2 foi avaliada para resistência ao carrapato por meio de infestação artificial durante duas estações do ano, conforme descrito por Gasparin et al. (2007). De acordo com Regitano et al. (2008), cinco QTLs localizados nos cromossomos 4, 5, 11, 18 e 23 foram detectados na estação chuvosa e três QTLs nos cromossomos 7, 10 e 14 foram identificados na estação seca, indicando

92 92 Capítulo 6 Resistência genética de bovinos ao carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus interação genótipo X ambiente para esta característica. Peixoto et al. (2008) analisaram esta mesma população F2 e identificaram mais dois QTLs nos cromossomos 15 e 27, explicando 7,1% da variabilidade fenotípica observada durante a estação seca. No total, os QTLs mapeados nesta família explicaram 13,1% da variação fenotípica durante a estação chuvosa e 18,4% na estação seca. Machado et al. (2010) analisaram 376 animais desta mesma população F2 com 180 marcadores microssatélites, que cobriam todos os cromossomos autossômicos. Os autores encontraram seis QTLs que apresentaram efeitos significativos na carga parasitária nas diferentes estações, indicando também a influência ambiental na contagem dos carrapatos. Durante a estação seca QTLs foram identificados nos cromossomos 2 e 10; na estação chuvosa os QTLs foram detectados nos cromossomos 5, 11 e 27 enquanto que no cromossomo 23 foi encontrado um QTL em ambas estações, localizado na região genômica que contém os genes do sistema BoLA. Análise de associação genômica usando SNPs é outra estratégia que tem sido usada para detectar evidências de associação com resistência ao carrapato por todo o genoma. Várias regiões genômicas localizadas em mais de 13 cromossomos foram identificadas usando chips contendo SNPs em seis diferentes raças compostas de gado de leite. A maioria dos marcadores explicou apenas uma pequena proporção, aproximadamente 1%, da variação fenotípica da característica, sugerindo que se SNPs forem usados em programas de seleção deverá ser por meio de um painel de marcadores e não por meio de um marcador individual com efeito maior (BARENDSE, 2007; TURNER et al., 2010). Utilizando os genótipos dos marcadores que foram significativamente associados com a contagem de carrapatos nos trabalhos de Barendse (2007) e Turner et al. (2010), e complementando com marcadores adicionais localizados nas mesmas regiões genômicas, Porto Neto et al. (2010a; 2011b) confirmaram os QTLs identificados nos cromossomos 3 e 10 em bovinos de leite e na raça Brahman. Os intervalos dos QTLs foram reduzidos e genes candidatos foram identificados. Entretanto, análises adicionais mostraram que nenhum dos genes candidatos estudados foram responsáveis pela mutação causativa. Resultados obtidos a partir de padrões de expressão gênica analisados após a infestação artificial de animais resistentes e susceptíveis também são importantes para identificação de genes candidatos para a característica de resistência ao carrapato. Wang et al. (2007) analisaram uma população de animais Hereford x Shorthorn resistentes e susceptíveis ao carrapato. A infestação com as larvas de carrapato resultou em um padrão de expressão gênica que foi comum aos dois grupos. Especificamente, 72 genes apresentaram maior nível de expressão e 76 genes tiveram nível menor de expressão na pele dos dois grupos de animais após a infestação. Dezoito genes foram mais expressos nos bovinos considerados altamente resistentes enquanto 48 genes apresentaram maiores níveis de expressão nos animais de baixa resistência. Entre eles, os genes do colágeno tipo I, III e IV apresentaram expressão mais alta nos animais resistentes quando comparados aos animais susceptíveis. Esses resultados sugerem que parte da variação genética para esta característica pode ser explicada por genes relacionados ao tecido epitelial.

93 Capítulo 6 Resistência genética de bovinos ao carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus 93 Piper et al. (2008) investigaram a expressão diferencial de 44 genes associados com resposta imune, queratina e colágeno na pele de animais das raças Holandês (susceptível) e Brahman (resistente). Não foi detectada nenhuma diferença de expressão gênica para os genes relacionados com queratina e colágeno nas duas raças, contrariando os resultados anteriores de Wang et al. (2007). Entretanto, foram observadas diferenças nos genes relacionados com a inflamação inata, incluindo vários receptores toll-like (TLR: TLR5, TLR7, TLR9), quimiocinas e seus receptores (CCR1, CCl2, CCL26), citocinas e seus fatores associados (IL-1β, IL-10, Traf-6, NFKBp50), os quais apresentaram maiores níveis de expressão no sítio de fixação das larvas de carrapato nos animais de raça holandesa. Segundo Porto Neto et al. (2011b), é possível que os altos níveis de inflamação local em resposta a fixação das larvas nos animais susceptíveis não seja uma característica de defesa do animal contra o carrapato, mas que seja um mecanismo utilizado pelo carrapato para alterar a fisiologia do hospedeiro, visando aumentar o fluxo sanguíneo no local de fixação da larva e, assim, proporcionar uma maior oferta de nutrientes. Porto Neto et al. (2010b) utilizaram metanálise para combinar resultados de GWAS e de estudos de expressão gênica. Em dois trabalhos de GWAS foram analisados SNPs em gado de leite (TURNER et al., 2010) e SNPs em bovinos da raça Brahman. As análises de expressão gênica foram realizadas com sondas gênicas em bovinos das raças Holandês e Brahman por Piper et al. (2008). As regiões de SNPs significativas e genes expressos foram mapeados no genoma bovino e as regiões sobrepostas foram identificadas nos cromossomos 2, 10, 13 e 19 e incluíram 20 genes. SELEÇÃO GENôMICa Grandes avanços em produtividade têm sido obtidos na pecuária oriundos do trabalho realizado por programas de avaliação genética por meios tradicionais, a partir das informações fenotípicas de cada indivíduo e de todos os seus parentes, interligadas por meio de uma matriz de parentesco nas equações de modelos mistos. Este método tradicional para estimar valor genético tem consistentemente gerado ganhos genéticos anuais para a maioria das características produtivas avaliadas pelos programas de melhoramento, não só no Brasil, como no mundo todo. Até recentemente, a incorporação de informações de marcadores moleculares em programas de melhoramento genético, por meio da seleção assistida por marcadores, tem se baseado na utilização de alguns poucos marcadores e, salvo algumas raras exceções, não tem trazido ganhos adicionais significativos aos já obtidos pela seleção tradicional. Isso se deve ao fato de que, geralmente, as características de importância econômica são controladas por muitos genes e, portanto, a informação destes poucos marcadores explica somente uma pequena parcela das diferenças genéticas observadas entre os animais. Por outro lado, inovações nas tecnologias de sequenciamento de DNA e de genotipagem de marcadores moleculares do tipo SNP, difundidas na última década, viabilizaram a implementação de métodos para praticar a seleção assistida por marcadores em escala genômica, a qual é denominada de seleção genômica (MEUWISSEN et al., 2001).

94 94 Capítulo 6 Resistência genética de bovinos ao carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus Em vez do mapeamento de limitado número de QTLs, todo o genoma é dividido em segmentos cromossômicos, definidos por marcadores adjacentes, e todos os QTLs são mapeados. A seleção genômica explora o desequilíbrio de ligação (DL), sob a pressuposição de que os efeitos dos segmentos cromossômicos serão os mesmos em toda a população porque os marcadores estão em DL com o QTL que eles delimitam. Desta forma, a densidade de marcadores deve ser suficientemente alta para assegurar que todos os QTLs estejam em DL com os marcadores ou com os haplótipos dos marcadores, o que só é possível com uso de chips de alta densidade e com cobertura genômica (VAN TASSELL et al., 2007). Atualmente, estão disponíveis no mercado chips de alta densidade para a genotipagem de marcadores do tipo SNP, que podem ter marcadores no caso do Illumina High Density Bovine Bead Chip Array ou SNPs no caso do Affymetrix Axiom Genome Wide BOS 1 Array. Outro chip muito usado é o BovineSNP50K da Illumina que tem a capacidade de genotipar, aproximadamente, SNPs. A utilização destes chips permite investigar todo o genoma em busca das variações que estão associadas com diferenças de desempenho dos animais e, a partir desta informação, estimar valores genéticos em escala genômica (valores genéticos genômicos - VGG), os quais têm proporcionado ganhos em acurácia e redução do intervalo de gerações, entre outras vantagens. De forma análoga ao que acontece no melhoramento tradicional, na seleção genômica não há necessidade de se identificar os genes ou mutações específicas, que tem efeito sobre a(s) característica(s) avaliada(s). São necessários, entretanto, muitos SNPs distribuídos por todo o genoma, para que um ou mais desses marcadores esteja ligado a cada gene afetando as características de interesse, para que a transmissão dos fragmentos do genoma possa ser rastreada dos pais para os filhos. Os métodos de seleção genômica permitem que a identificação dos animais geneticamente superiores seja feita antes da coleta de dados fenotípicos, acelerando o processo de tomada de decisões e diminuindo custos, desde que uma ampla população de referência seja formada com o aporte tanto de dados fenotípicos como genotípicos. Outra vantagem da seleção genômica é que por meio dos marcadores é possível corrigir os eventuais erros nos dados de pedigree, que prejudicam a estimativa dos valores genéticos e diminuem o ganho nas avaliações tradicionais. Além disso, quando se utiliza a matriz de parentesco baseada em pedigree, considera-se apenas uma proporção média de genes compartilhados entre os animais parentes. De posse das informações de marcadores SNPs é possível corrigir a matriz de parentesco e utilizar informações mais precisas da correlação entre parentes no cálculo das DEPG (DEPs Genômicas). O modelo conceitual elementar para a implementação da seleção genômica, ou seja, para estimar os efeitos dos marcadores e valores genômicos, pode ser n representado por: y= µ + xg+ ε, em que, y i = fenótipo observado do animal i; i ij j i j= 1 m = média geral; x ij = variável indicadora que relaciona o efeito do genótipo g j ao fenótipo observado do animal i; e e i é um erro aleatório. O valor genômico ( a ˆi ) de um determinado animal i pode ser predito simplesmente somando-se as estimativas dos efeitos dos marcadores disponíveis: aˆi = xg ˆ ij j.

95 Capítulo 6 Resistência genética de bovinos ao carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus 95 Basicamente, para a implementação da seleção genômica, três etapas principais são necessárias: (1) genotipagem de uma população referência, caracterizada fenotipicamente, com conjuntos de SNPs em média e/ou alta densidade e posterior estimativa dos efeitos dos marcadores; (2) validação dos efeitos estimados em um grupo de animais que não pertence à população referência e, finalmente; (3) a predição dos valores genéticos de indivíduos candidatos à seleção, baseados nos genótipos dos marcadores e nos efeitos estimados. A implantação de práticas de melhoramento genético nos rebanhos depende da identificação do grau de resistência ao carrapato de cada indivíduo. A fenotipagem para a característica de resistência ao carrapato (acompanhamento da carga parasitária) ao sobreano vem sendo utilizada desde 2001 como critério de seleção dos rebanhos da Conexão Delta G, uma associação de criadores das raças Hereford, Braford e Nelore com fazendas em sete estados do País (Bahia, Goiás, Mato Grosso do Sul, Mato Grosso, Paraná, Rio Grande do Sul e São Paulo). Entretanto, observou-se uma estimativa de herdabilidade apenas moderada nos rebanhos desses criadores. Isto é, somente ao redor de 20% da superioridade fenotípica dos animais para a resistência aos carrapatos era de origem genética aditiva (CARDO- SO et al., 2006). Outro fator limitante identificado na seleção fenotípica para o uso de avaliação genética em larga escala foi o custo elevado da coleta de dados, pois além de requerer técnicos capacitados para realizar as contagens, é necessário expor os animais ao desafio por carrapatos, podendo diminuir o desempenho destes em outras características de importância econômica (p.ex., ganho de peso, taxa de prenhez, etc.), aumentar os casos de Tristeza Parasitária Bovina (TPB), contaminar pastagens, além da necessidade de tratamento de animais doentes (CARDOSO et al., 2011). A Embrapa, a Conexão Delta G e a Empresa Gensys Consultores Associados S/S firmaram um convênio em 2009, com apoio da Associação Brasileira de Hereford e Braford, para desenvolver um projeto de pesquisa, visando o avanço do conhecimento dos mecanismos genéticos de resistência aos carrapatos em bovinos e, também, o desenvolvimento de métodos e estratégias para combinar ferramentas de genética quantitativa e molecular para implementar ferramentas de seleção genômica para essa característica. A estratégia adotada envolveu os seguintes passos: 1. Coleta de dados de contagem de carrapatos para caracterização do nível de resistência em animais das raças Hereford e Braford dos rebanhos vinculados à Conexão Delta G no sul do Brasil; 2. Formação de um banco de dados combinando informações de contagens de carrapatos coletadas desde 2001 pelo Gensys nesses rebanhos (3.413 registros), os dados de pedigree (incluindo mais de animais) e as contagens durante a execução do projeto; 3. Extrações de amostras de DNA de animais (1.898 Braford e 262 Hereford), que tinham pelo menos duas contagens de carrapato dentro dos avaliados, para estudo do código genético (genotipagem) com 54,6 mil marcadores SNPs cobrindo todo o genoma bovino (Illumina Bovine SNP50 BeadChip);

96 96 Capítulo 6 Resistência genética de bovinos ao carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus 4. Utilização conjunta das informações de contagens de carrapato, pedigree e dos marcadores moleculares utilizando a metodologia de uma etapa (AGUI- LAR et al., 2010) para predizer a resistência genética de animais das raças Hereford e Braford ao carrapato, por meio do procedimento denominado de seleção genômica. A utilização das informações de marcadores moleculares associados aos genes responsáveis pela resistência à infestação por carrapatos em bovinos Hereford e Braford permitiu aumentar a herança genética estimada desta característica passando dos 20%, tipicamente encontrados quando se usam somente informações de pedigree e os dados de contagens, para 29% no presente estudo. Portanto, os resultados obtidos permitiram explicar quase um terço das diferenças de infestações por carrapatos observadas entre os animais, tendo isso sido possível por meio de fatores genéticos aditivos, quando foram acrescentadas informações dos marcadores moleculares e utilizados conjuntamente os dados de contagens de carrapatos e o pedigree dos animais (CARDOSO et al., 2011). A validação desse resultado foi realizada pela comparação dos valores genéticos dos animais obtidos com base nas informações dos marcadores moleculares e do pedigree, antes da avaliação por meio da exposição aos carrapatos, com os valores genéticos calculados após os animais terem sido desafiados e suas contagens de carrapatos incluídas na avaliação genética. Essa estratégia compara os resultados obtidos pela seleção sem expor o animal ao carrapato, a qual já pode ser feita logo ao nascimento, com aquela realizada após o desafio com carrapatos ao redor de 18 meses de idade que, por sua vez, tem como desvantagens o aumento do custo com tratamentos, a contaminação das pastagens e a ocorrência de casos de TPB (CAR- DOSO et al., 2011). A correlação entre os valores genéticos pelos dois procedimentos (já ao nascimento ou após o desafio e contagens de carrapatos aos 18 meses) foi de 0,71 para a raça Braford (Figura 6.1) e 0,60 para a raça Hereford. Esses valores de correlação, Valor genômico (dados + pedigree + marcadores) -0,4-0,2 0,0 0,2 0,4 avaliação Genômica (r=0,71) -0,4-0,2 0,0 0,2 0,4 Valor genômico (pedigree + marcadores) FIGURA 6.1. Correlação (r) de valores genéticos de animais da raça Braford obtidos a partir de dados de contagens de carrapato, de pedigree e de marcadores moleculares aos 18 meses de idade e pela seleção genômica ao nascimento, usando somente dados de marcadores moleculares e pedigree.

97 Capítulo 6 Resistência genética de bovinos ao carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus 97 relativamente alto para o Braford e moderado para o Hereford, demonstram a viabilidade da utilização da seleção genômica nessas raças. Os valores mais baixos para a raça Hereford eram esperados pelo menor número de animais avaliados. Por outro lado, a correlação entre os valores genéticos estimados com base apenas no pedigree (sem informação de marcadores) antes e depois de obter os dados de contagens em animais jovens foi de apenas 0,27 (Figura 6.2). Utilizando estratégias semelhantes de seleção de animais logo ao nascimento, esses resultados permitiram estimar que os ganhos genéticos com a seleção genômica (que inclui as informações de marcadores) seriam duas vezes maiores do que os previstos com a seleção tradicional, baseada somente em dados de pedigree. É importante destacar também na Figura 6.2, que muitos animais ficam com valor genético estimado pelo pedigree igual a zero, pois de fato não há informação para caracterizar geneticamente os filhos de reprodutores múltiplos e de touros e vacas que não tenham outros filhos ou parentes com fenótipos (contagem de carrapatos). Por outro lado, observa-se na Figura 1 que os marcadores moleculares fornecem informação para cálculo do valor genético de todos os animais, independentemente de seus pedigrees serem mais ou menos completos (CARDOSO et al., 2011). As primeiras avaliações genômicas de touros das raças Hereford e Braford geraram um dos mais relevantes resultados deste trabalho (CARDOSO et al., 2012), tornando disponível aos criadores destas raças, de forma inédita no Brasil, a DEPG, a tecnologia mais moderna de avaliação da qualidade do material genético oferecido aos criadores. A partir desta publicação, os produtores podem praticar a escolha de touros-pais para serem usados no melhoramento dos seus plantéis via inseminação artificial com o auxílio de informações genotípicas associadas às informações fenotípicas e de pedigree obtidas do banco de dados histórico dos criadores participantes do Projeto. Além disso, para a seleção de animais jovens, o modelo proposto para as raças Braford e Hereford prevê que o criador ou sua associação contratem os serviços avaliação Genética Convencional (r=0,27) Valor genético (pedigree + dados) -0,2 0,0 0,2 0,4-0,4-0,4-0,2 0,0 0,2 0,4 Valor genético (somente pedigree) FIGURA 6.2. Correlação (r) de valores genéticos de animais da raça Braford obtidos a partir de dados de contagens de carrapato e de pedigree aos 18 meses de idade e pela seleção ao nascimento pela média dos pais, usando somente dados de pedigree.

98 98 Capítulo 6 Resistência genética de bovinos ao carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus de genotipagem e de predição genômica e recebam a informação dos genótipos de todos os marcadores para os indivíduos testados e dos valores genéticos calculados utilizando a informação desses marcadores. Assim, os produtores, além de selecionar os animais superiores, poderão futuramente incorporar essas informações nos programas de melhoramento que participam e validar a associação desses marcadores com características incluídas nos seus programas de seleção. As ferramentas genômicas desenvolvidas, uma vez incorporadas aos programas de seleção nacionais e internacionais, servirão para desenvolver linhagens de bovinos mais resistentes ao carrapato, as quais serão capazes de produzir carne de qualidade com menor uso de insumos em regiões de prevalência desse ectoparasita. CONCLUSÃO O uso contínuo de tratamentos com acaricidas para controlar o carrapato em populações bovinas tem historicamente levado ao aparecimento de cepas resistentes deste ectoparasita aos princípios ativos utilizados, gerando grandes despesas com tratamentos ineficazes e a necessidade de altos investimentos para descoberta de novas drogas. A incorporação de métodos de controle não químicos pode reduzir o uso de tratamentos carrapaticidas e, consequentemente, os resíduos químicos, evitando problemas comerciais e de saúde ambiental e pública. O entendimento da variação genética e dos mecanismos fisiológicos que levam às diferenças fenotípicas associadas à resistência ao carrapato é de grande auxílio no desenvolvimento de métodos antiparasitários efetivos, como vacinas multiantígeno e/ou aumento da resistência genética do rebanho. Apesar de sua grande importância econômica, a resistência genética à infestação por carrapatos é de difícil medição e o acompanhamento nas fazendas depende da exposição do animal às infestações e do monitoramento constante destas. A seleção genômica para a característica resistência ao R. microplus permitirá a identificação mais precisa destes indivíduos, eliminando a necessidade de exposição dos animais ao parasitismo e possibilitando a classificação destes quando ainda jovens. Os grandes avanços que vem ocorrendo na genotipagem, sequenciamento e quantificação da expressão gênica em larga escala, sugerem que a aplicação destas novas tecnologias, em combinação com os métodos tradicionais de melhoramento genético, poderá contribuir para aumentar a eficiência da seleção para resistência ao carrapato. REFER ÊNCIAS ABIEC - Associação Brasileira das Indústrias Exportadoras de Carnes. Disponível em < abiec.com.br>. Acesso em: 24 mai ACOSTA-RODRÍGUEZ, R.; ALONSO-MORALES, R.; BALLADARES, S.; FLORES-AGUILAR, H.; GARCIA-VAZQUEZ, Z.; GORODEZKY, C. Analysis of BoLA class II microsatellites in cattle infested with Boophilus microplus ticks: class II is probably associated with susceptibility. Veterinary Parasitology, v. 127, p , AGUILAR, I.; MISZTAL, I.; JOHNSON, D. L.; LEGARRA, A.; TSURUTA, S.; LAWLOR, T. J. Hot topic: A unified approach to utilize phenotypic, full pedigree, and genomic information for genetic evaluation of Holstein final score. Journal of Dairy Science, v. 93, n. 2, p , 2010.

99 Capítulo 6 Resistência genética de bovinos ao carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus 99 ALENCAR, M. M.; FRAGA, A. B.; SILVA, A. M. Adaptação de genótipos a ambientes tropicais: resistência à mosca-dos-chifres (Haematobia irritans, Linnaeus) e ao carrapato (Boophilus microplus, Canestrini) em diferentes genótipos bovinos. Agrociência, v. 9, p , ALLEN, J. R.; KHALIL, H. M.; GRAHAM, J. E. The location of tick salivary antigens, complement and immunoglobulin in the skin of guinea-pigs infested with Dermacentor andersoni larvae. Immunology, v. 38, p , ANDRADE, A. B. F.; SILVA, R. G.; COSTA, A. J.; ROCHA, U. F.; LANDIM, V. J. C. Genetic and environmental aspects of the resistance of zebu cattle to the tick Boophilus microplus. In: WORLD CONGRESS ON GENETICS APPLIED TO LIVESTOCK PRODUCTION, 6., 1998, Armidale, Austrália. Proceedings... Austrália, p BARENDSE, W. Assessing tick resistance in a bovine animal for selecting cattle for tick resistance by providing a nucleic acid from the bovine animal and assaying for the occurrence of a single nucleotide polymorphism (SNP). Patent Number: WO A1, BIEGELMEYER, P.; NIZOLI, L. Q.; CARDOSO, F. F.; DIONELLO, N. J. L. Aspectos da resistência de bovinos ao carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Archivos de Zootecnia, v. 61 (R), p. 1-11, BURROW, H. M. Variances and covariances between productive and adaptative traits and temperamento in a composite breed of tropical beef cattle. Livestock Production Science, v. 70, p , CONEXÃO DELTA G. Institucional. Disponível em: < Acesso em: 02 ago CARDOSO, F. F.; YOKOO, M. J. I.; GOMES, C. C. G.; OLIVEIRA, M. M.; TEIXEIRA, B. B. M.;. ROSO, V. M; BRITO, F. V.; CAETANO, A. R.; AGUILAR, I. Avaliação genômica de touros Hereford e Braford. Bagé: Embrapa Pecuária Sul, p. (Documentos/Embrapa Pecuária Sul, ISSN X; 127). CARDOSO, F. F.; GOMES, C. C. G.; OLIVEIRA, M. M.; ROSO, V. M; PICCOLI, M. L.; BRITO, F. V.; HIGA, R. H.; PAIVA, S. R.; SILVA, M. V. G. B.; REGITANO, L. C. A.; CAETANO, A. R.; AGUILAR, I. Predição da resistência genética ao carrapato de bovinos Braford e Hereford a partir de um painel denso de marcadores moleculares. Bagé: Embrapa Pecuária Sul, p. (Circular Técnica/Embrapa Pecuária Sul, ISSN ; 41). CARDOSO, V.; FRIES, L. A.; ROSO, V. M.; BRITO, F. V. Estimates of heritability for resistance to Boophilus microplus tick evaluated by na alternative method in a commercial Polled Hereford x Nelore population in Brazil. In: WORLD CONGRESS ON GENETICS APPLIED TO LIVE- STOCK PRODUCTION, 8., 2006, Belo Horizonte, MG. Proceedings... Belo Horizonte, MG, CARDOSO, V. Avaliação de diferentes métodos de determinação da resistência genética ao carrapato Boophilus microplus em bovinos de corte f. Dissertação (Mestrado em Zootecnia). Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP Jaboticabal, FRAGA, A. B.; ALENCAR, M. M.; FIGUEIREDO, L. A.; RAZOOK, A. G.; CYRILLO, J. N. G. Análise de fatores genéticos e ambientais que afetam a infestação de fêmeas bovinas da raça Caracu por carrapatos (Boophilus microplus). Revista Brasileira de Zootecnia, v. 32, n. 6, p , FRISCH, J. E. Towards a permanent solution for controlling cattle ticks. International Journal for Parasitology, v. 29, p , FRISCH, J. E.; O NEILL, C. J. Comparative evaluation of beef cattle breeds of African, European and Indian origins (ii) Resistance to cattle ticks and gastrointestinal nematodes. Animal Science, v. 67, p , FRISCH J. E. Identification of a major gene for resistance to cattle ticks. In: WORLD CONGRESS ON GENETICS APPLIED TO LIVESTOCK PRODUCTION, 5., 1994, Guelph, Ontario, Canadá. Proceedings... Guelph, Ontario, Canadá, p GASPARIN, G.; MIYATA, M.; COUTINHO, L. L.; MARTINEZ, M. L.; TEODORO, R. L.; FUR- LONG, J.; MACHADO, M. A.; SILVA, M. V. G. B.; SONSTEGARD, T. S.; REGITANO, L. C. A. Mapping of quantitative trait loci controlling tick [Rhipicephalus (Boophilus) microplus] resistance on bovine chromosomes 5, 7 and 14. Animal Genetics, v. 38, p , 2007.

100 100 Capítulo 6 Resistência genética de bovinos ao carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus HENSHALL, J. M. A genetic analysis of parasite resistance traits in a tropically adapted line of Bos taurus. Australian Journal of Agricultural Research, v. 55, p , KASHINO, S. S.; RESENDE, J.; SACCO, A. M.S.; ROCHA, C.; PROENÇA, L.; CARVALHO, W. A.; FIRMINO, A. A.; QUEIROZ, R.; BENAVIDES, M.; GERSHWIN, L. J.; SANTOS, I. K. F. M. Boophilus microplus: the pattern of Bovine immunoglobulin isotype responses to high and low tick infestations. Experimental Parasitology, v. 110, p , KERR, R. J.; FRISCH, J. E.; KINGHORN, B. P. Evidence for a major gene for tick resistance in cattle. In: WORLD CONGRESS ON GENETICS APPLIED TO LIVESTOCK PRODUCTION, 5., 1994, Guelph, Ontario. Proceedings... 5 th WCGALP, Guelph, Ontario, p LEMOS, A. M.; TEODORO, R. L.; OLIVEIRA, G. P.; MADALENA, F. E. Comparative performance of six Holstein-Friesian x Guzera grades in Brazil. 3. Burdens of Boophilus microplus under field conditions. Comparative performance of six Holstein-Friesian x Guzerá grades in Brasil. Animal Production, v. 41, p , MACHADO, M. A.; AZEVEDO, A. L. S.; TEODORO, R. L.; PIRES, M. A.; PEIXOTO, M. G. C. D.; FREITAS, C. DE; PRATA, M. C. A.; FURLONG, J.; SILVA, M. V. G. B.; GUIMARÃES, S. E. F.; REGITANO, L. C. A.; COUTINHO, L. L.; GASPARIN, G.; VERNEQUE, R. S. Genome wide scan for quantitative trait loci affecting tick resistance in cattle (Bos taurus x Bos indicus). BMC Genomics, v. 11, p. 1-11, MARTINEZ, M. L.; MACHADO, M. A.; NASCIMENTO, C. S.; SILVA, M. V.; TEODORO, R. L.; FURLONG, J.; PRATA, M. C.; CAMPOS, A. L.; GUIMARAES, M. F.; AZEVEDO, A. L.; PIRES, M. F.; VERNEQUE, R. S. Association of BoLA-DRB3.2 alleles with tick (Boophilus microplus) resistance in cattle. Genetics Molecular Research, v. 5, p , MARTINEZ, M. L.; SILVA, M. V. G. B.; MACHADO, M. A.; TEODORO, R. L.; VERNEQUE, R. S. A biologia molecular como aliada no combate aos carrapatos. In: SIMPÓSIO DA SOCIE- DADE BRASILEIRA DE MELHORAMENTO ANIMAL, 5., Pirassununga, São Paulo. Anais V SBMA, Pirassununga, São Paulo, MEUWISSEN, T. H. E.; HAYES, B. J.; GODDARD, M. E. Prediction of total genetic value using genome wide dense marker maps. Genetics, v. 157, p , MORAES, F. R.; COSTA, A. J.; WOELZ, C. R. et al. Ecologia de carrapatos. XV: Susceptibilidade natural comparativa entre taurinos e zebuínos a Boophilus microplus (Canestrini) (Acari, Ixodidae). Arquivo Veterinária, v. 2, n. 1, p , OLIVEIRA, G. P.; ALENCAR, M. M. Resistência de bovinos de seis graus de sangue Holandês-Guzerá ao carrapato (Boophilus microplus) e ao berne (Dermatobia hominis). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 42, n. 2, p , PEIXOTO, M. G. C. D.; AZEVEDO, A. L. S.; TEODORO, R. L.; PIRES, M. F. A.; VERNEQUE, R. S.; PRATA, M. C. A.; FURLONG, J.; REGITANO, L. C. A.; MACHADO, M. A. Identification of QTL for tick resistance using a bovine F2 population in tropical area. In: ROWLINSON, P.; STEELE, M.; NEFZAOUI, A. (eds) PROCEEDINGS OF THE LIVESTOCK AND GLOBAL CLIMATE CHANGE CONFERENCE, Cambridge University Press, Hammamet, Tunisia, p PIPER, E. K.; JACKSON, L. A.; BAGNALL, N. H.; KONGSUWAN, K. K.; LEW, A. E.; JONS- SON, N. N. Gene expression in the skin of Bos taurus and Bos indicus cattle infested with the cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Veterinary Immunology Immunopathology, v. 126, p , PORTO NETO, L. R.; JONSSON, N. N.; D OCCHIO, M. J.; BARENDSE, W. Molecular genetic approaches for identifying the basis of variation in resistance to tick infestation in cattle. Veterinary Parasitology, v. 180, p , 2011a. PORTO NETO, L. R.; BUNCH, R.; HARRISON, B. E.; BARENDSE, W. DNA variation in the gene ELTD1 is associated with tick burden in cattle. Animal Genetics, v. 42, p , 2011b. PORTO NETO, L. R.; BUNCH, R. J.; HARRISON, B. E.; PRAYAGA, K. C.; BARENDSE, W. Haplotypes that include the integrin alpha 11 gene are associated with tick burden in cattle. BMC Genetics, v. 11, p. 55, 2010a. PORTO NETO, L. R.; PIPER, E. K.; JONSSON, N. N.; BARENDSE, W.; GONDRO, C. Meta-analysis of genome wide association and gene expression studies to identify candidate genes

101 Capítulo 6 Resistência genética de bovinos ao carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus 101 for tick burden in cattle. In: 9 th WORLD CONGRESS OF GENETICS APPLIED TO LIVE- STOCK PRODUCTION, Leipzig, Germany, August 1 6, 2010, p. 0664, 2010b. PRAYAGA, K. C. Evaluation of beef cattle genotypes and estimation of direct and maternal genetic effects in a tropical environment. 2. Adaptative and temperamento traits. Australian Journal of Agricultural Research, v. 54, p , REGITANO, L. C. A.; IBELLI, A. M. G.; GASPARIN, G.; MIYATA, M.; AZEVEDO, A. L.; COUTINHO, L. L.; TEODORO, R. L.; MACHADO, M. A.; SILVA, M. V. G. B.; NAKATA, L. C.; ZAROS, L. G.; SONSTEGARD, T. S.; SILVA, A. M.; OLIVEIRA, M. C. S. The search for markers of tick resistance in bovines. Developments in Biologicals, v. 132, p , REGITANO, L. C. A.; OLIVEIRA, M. C. S.; ALENCAR, M. M.; CARVALHO, M. E.; ANDRÉO, R.; MOREIRA, I. C.; NÉO, T. A.; BARIONI JR., W.; SILVA, A. M. Avaliação da resistência de bovinos de diferentes grupos genéticos ao carrapato e à babesiose. Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento. Embrapa Pecuária Sudeste. São Carlos, SP, n. 9, 48 p., SANTOS JR., J. C. B.; FURLONG, J.; DAEMON, E. Controle do carrapato Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) em sistemas de produção de leite da microrregião fisiográfica fluminense do grande Rio. Ciência Rural, v. 30, p , SILVA, A. M.; ALENCAR, M. M.; REGITANO, L. C. A.; OLIVEIRA, M. C. S. Infestação natural de fêmeas bovinas de corte por ectoparasitas na região sudeste do Brasil. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 39, n. 7, p , SILVA, A. M.; ALENCAR, M. M.; REGITANO, L. C. A.; OLIVEIRA, M. C. S.; BARIONI JR., W. Artificial infestation of Boophilus microplus in beef cattle heifers of four genetic groups. Genetics and Molecular Biology, v. 30, p , SILVA, A. M., ALENCAR, M. M., REGITANO, L. C. A., OLIVEIRA, M. C. S., BARIONI JR., W. Natural infestations of beef cattle females by external parasites in southern Brazil. In: WORLD CONGRESS ON GENETICS APPLIED TO LIVESTOCK PRODUCTION, 8., 2006, Belo Horizonte, MG. Anais... Belo Horizonte, MG, 2006a. SILVA, A. M.; ALENCAR, M. M.; REGITANO, L. C. A.; OLIVEIRA, M. C. S. Estimativas de herdabilidade e repetibilidade do grau de infestação por ectoparasitos em fêmeas de quatro grupos genéticos de bovinos de corte. In: REUNIÃO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE ZOOTECNIA, 43., 2006, João Pessoa, PB. Anais... João Pessoa, PB, 2006b. SOARES, C. O.; MASSARD, C. L.; HERNADEZ, C. A. M.; FONSECA, A. H. Imunidade contra artrópodes parasitos. In: MADRUGA, C. R.; ARAÚJO, F. R.; SOARES, C. O. (Eds) Imunodiagnóstico em medicina veterinária. Campo Grande: Embrapa Gado de Corte, p TEODORO, R. L.; LEMOS, A. M.; MOREIRA, D. P.; MADALENA, F. E. Resistência genética dos bovinos ao carrapato (Boophilus microplus). VII. Resistência de touros mestiços sob infestação artificial. In: REUNIÃO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE ZOOTECNIA, 21., Anais... Belo Horizonte, MG, p. 54. TURNER, L. B.; HARRISON, B. E.; BUNCH, R. J.; PORTO NETO, L. R.; LI, Y. T.; BARENDSE, W. A genome wide association study of tick burden and milk composition in cattle. Animal Production Science, v. 50, p , UNTALAN, P. M.; PRUETT, J. H.; STEELMAN, C. D. Association of the bovine leukocyte antigen major histocompatibility complex class II DRB3*4401 allele with host resistance to the Lone Star tick, Amblyomma americanum. Veterinary Parasitology, v. 145, p , UTECH, K. B. W.; WHARTON, R. H.; KERR, D. J. Resistance to B. microplus (Canestrini) in different breeds of cattle. Australian Journal of Agricultural Research, v. 29, p , VAN TASSELL, C. P.; MATUKUMALLI, L.; TAYLOR, C.; SMITH, T.; SONSTEGARD, T.; SCHA- NABEL, R.; SILVA, M. V. G. B.; WIGGANS, G.; LIU, G.; MOORE, S.; TAYLOR, J. Construction and application of a bovine high-density SNP assay. American Dairy Science and Society of Animal Science, San Antonio, USA, CD-ROM. VERÍSSIMO, C. J.; NICOLAU, C. V. J.; CARDOSO, V. L.; PINHEIRO, M. G. Haircoat characteristics and tick infestation on Gyr (Zebu) and crossbreed (Holstein x Gyr) cattle. Archivos de Zootecnia, v. 51, p , WAGLAND, B. M. Host resistance to cattle tick (Boophilus microplus) in Brahman (Bos indicus) cattle. I. Response of previously unexposed cattle to four infestations with larvae. Australian Journal of Agricultural Research, v. 26, p , 1975.

102 102 Capítulo 6 Resistência genética de bovinos ao carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus WANG, Y. H.; REVERTER, A.; KEMP, D.; MCWILLIAM, S. M.; INGHAM, A.; DAVIS, C. K.; MOORE, R.J.; LEHNERT, S. A. Gene expression. profiling of Hereford Shorthorn cattle following challenge with Boophilus microplus tick larvae. Australian Journal of Experimental Agriculture, v. 47, p , WAMBURA, P. N.; GWAKISA, P. S.; SILAYO, R. S.; RUGAIMUKAMU, E. A. Breed associated resistance to tick infestation in Bos indicus and their crosses with Bos taurus. Veterinary Parasitology, v. 77, p , WIKEL, S. K.; BERGMAN, D. Tick-host immunology: significant advances and challenging opportunities. Parasitology Today, v. 13, p , 1997.

103 7 Vacinas contra o carrapato-do-boi no Brasil Rodrigo Casquero Cunha Renato Andreotti Fabio Pereira Leivas Leite

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105 Capítulo 7 Vacinas contra o carrapato-do-boi no Brasil 105 Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um dos ectoparasitos que causam maior impacto econômico, levando a grandes perdas para a bovinocultura brasileira. Esses prejuízos acontecem, em parte, de maneira direta, pelo efeito da picada: irritabilidade, perda de sangue, perda de peso, diminuição na produção de leite, predisposição à miíases, danos no couro e transmissão dos agentes parasitários e infecciosos. São ampliados, também, de forma indireta pelo custo do controle químico e os danos causados pelos resíduos tóxicos deixados nos subprodutos e no ambiente (HORN, 1983). Os rebanhos leiteiros no Brasil são, em sua maioria, estabelecidos em raças europeias (Bos taurus) ou mestiças. Os rebanhos de gado de corte, por sua vez, apesar da menor presença de raças européias, têm sofrido um aumento no uso destas nos cruzamentos industriais ao longo do tempo. Desta forma, considerando que a espécie B. taurus é mais susceptível à infestação por carrapato do que Bos indicus, é clara a necessidade do estabelecimento de um método de controle sistemático do carrapato (GOMES, 1995) e, para isso, é imprescindível a busca e proposição de novas ferramentas de controle. Há uma busca mundial por novas alternativas de controle do carrapato, sendo que, o controle por meio de vacinas tem sido o foco principal de muitos pesquisadores. O manejo integrado de pragas para o controle do carrapato, com o uso de vacinas associado à utilização de produtos químicos e a rotação de pastagens pode abrir possibilidades para o controle mais efetivo do carrapato. Espera-se, pois, com o uso de vacinas, reduzir a contaminação ambiental e a seleção de carrapatos resistentes aos princípios ativos químicos. Dentro da perspectiva de encontrar novas estratégias para o controle do carrapato, na Embrapa Gado de Corte tem sido produzidos e avaliados antígenos vacinais recombinantes presentes em um isolado regional de R. microplus. TIPOS DE CONTROLE O controle de R. microplus, que é a principal espécie de carrapato que compromete a produtividade da pecuária bovina, ainda é um grande problema para o sistema produtivo de bovinos no Brasil. Tal constatação é evidente, principalmente, devido ao aumento da pressão para seleção de indivíduos resistentes deste carrapato aos diferentes princípios químicos ativos, limitando o sucesso do seu principal método de controle. Formas de controle alternativo do carrapato vêm sendo estimuladas apesar de resultarem, até o momento, respostas ainda pouco expressivas. Os métodos empregados são os mais variados: seleção de bovinos resistentes aos carrapatos; rotação de pastagens (ELDER et al., 1980); cultivo de pastagens que dificultam a sobrevivência das larvas (SUTHERST et al., 1982); manejo de predadores naturais, como Egretta íbis ou garça-vaqueira (ALVES-BRANCO et al., 1983), formigas (GONZALES, 1995); uso de patógenos como a bactéria Cedecea lapagei (BRUM, 1988); o fungo Beauveria bassiana (CORDOVÉS, 1997), e inúmeros fitoterápicos (ANDREOTTI et al., 2013). O controle químico é, ainda, o mais amplamente utilizado no combate ao carrapato, e a aplicação das formulações feita por diversas formas, tais como: aspersão, imersão (banho em solução aquosa), no dorso (pour on), por injeção ou por inges-

106 106 Capítulo 7 Vacinas contra o carrapato-do-boi no Brasil tão de bolos gástricos (ANDREOTTI et al., 2002). Os princípios ativos mais utilizados têm sido os derivados de piretróides, ivermectinas e benzoilfeniluréia (VAZ JÚNIOR, 1997), sendo que para todos estes já foi registrado populações de carrapatos resistentes (ALVES-BRANCO et al., 1992). O uso de acaricidas de maneira extensiva leva a problemas como o aumento do custo de produção, devido à dificuldade de conduzir o gado ao brete e estresses decorrentes do manejo, ao uso de doses inadequadas (aumento compensatório na busca de eficácia) e diminuição do período de proteção. Além disso, promove a seleção de linhagens de carrapatos geneticamente resistentes, tornando o controle difícil e aumentando o custo do tratamento. Nos últimos anos, a resistência dos carrapatos aos princípios ativos vem aumentando de forma mais intensa comprometendo o uso de certas moléculas no manejo do controle de carrapato em diversas regiões produtoras (CATTO et al., 2010; GOMES et al., 2011). A observação de que o número de carrapatos que se desenvolvem em raças zebuínas é menor do que em raças européias indicou ser possível desenvolver raças bovinas resistentes. Esta resistência está associada ao sistema imunológico dos hospedeiros, já que, em uma primeira infestação, o número de carrapatos que completa o ciclo é semelhante em todas as raças (HEWETSON, 1972; MATTIOLI et al., 1993; GHOSH et al., 1999). A principal dificuldade para estes avanços é a de selecionar animais resistentes sem que haja perda de características de produção, fazendo com que esta abordagem para o controle de R. microplus não seja factível no curto ou médio prazo (FURLONG, 2005). Esta resistência manifesta-se por diminuição do número e do tamanho dos carrapatos e pode ser transmitida pelo soro (ROBERTS; KERR, 1976) e por células de gânglios linfáticos (WIKEL et al., 1996). A demonstração de que drogas imunossupressoras eliminam esta resistência reafirmou a natureza imune desta resposta (BERGMAN et al., 2000). As vacinas surgem neste contexto como uma ferramenta alternativa para o controle do carrapato, podendo ser usadas em associação com o controle químico, diminuindo o número de aplicações dos acaricidas, os custos gerais envolvidos, e os impactos sobre o ambiente e os alimentos produzidos. Naturalmente, os custos de produção serão reduzidos desde que os custos com vacinas associadas aos químicos convencionais sejam menores do que os gastos existentes ao utilizar apenas o controle químico. Em meio à grande procura por formas alternativas de controle do carrapato, o controle por meio de vacinas, com a indução da resposta imune em bovinos, contra os carrapatos, tem mostrado resultados promissores (ANDREOTTI et al., 2002). As principais vantagens de uma vacina sobre os acaricidas são, principalmente, por não serem agentes químicos, por terem um menor custo e porque o desenvolvimento de carrapatos resistentes à vacina é mais lento do que aos produtos químicos (WILLADSEN, 1997). CONTROLE POR MEIO DE VaCINaS Em meados de 1980, na Austrália, pesquisadores começaram a estudar a resposta imune dos bovinos contra os carrapatos R. microplus. Os primeiros estudos cien-

107 Capítulo 7 Vacinas contra o carrapato-do-boi no Brasil 107 tíficos com formulações vacinais contra este ectoparasito a serem publicados são datados de 1986 (AGBEDE; KEMP, 1986; JOHNSTON et al., 1986; KEMP, 1986) e foram encorajados por pesquisa feita na década anterior. Nessa última, os autores testaram duas formulações vacinais: a primeira composta de antígenos derivados de intestino e ovário; e a segunda composta de extrato de todos os órgãos internos ambas de teleóginas semi-ingurgitadas de Dermacentor andersoni. Relataram que a utilização de glândulas salivares como antígeno em bovinos não foi capaz de gerar imunidade ao carrapato, assim como, antígenos derivados de fêmeas adultas não ingurgitadas foram ineficazes como imunógenos, sugerindo uma mudança nos padrões de expressão de antígenos em fêmeas alimentadas em relação às não alimentadas (ALLEN; HUMPHREYS, 1979). Bovinos da raça Hereford (Bos taurus), com 12 meses de idade, e vacinados com extratos de teleóginas de R. microplus, demonstraram um perfil diferente de resistência ao carrapato quando comparado àqueles que adquiriram resistência ao serem expostos a sucessivas infestações. Observou-se que, nesses últimos, os mecanismos da resistência atuavam na fase larval do carrapato, enquanto que nos animais vacinados, eles atuavam na fase adulta, provocando lesões no intestino com consequente extravasamento de hemácias para a linfa ou então a diluição da mesma. Neste mesmo experimento, até 60 % das teleóginas sofreram algum tipo de dano no intestino e, para que as lesões ocorressem, demonstrou-se que a presença das proteínas do sistema complemento era necessária, sugerindo que ocorreria a lise das células intestinais pelo sistema complemento (KEMP et al., 1986). Após a constatação de que a inoculação de extratos de fêmeas adultas (teleóginas) de R. microplus em bovinos produziu uma resposta imune mediada por anticorpos contra o tecido intestinal do carrapato (AGBEDE et al., 1986; KEMP et al., 1986), investigações subsequentes identificaram uma glicoproteína presente no intestino dos carrapatos capaz de induzir imunoproteção (WILLADSEN et al., 1988; RAND et al., 1989). Diferentes protocolos foram utilizados para isolar e purificar este antígeno protetor. Pesquisadores australianos isolaram uma glicoproteína de 89 kda, denominada Bm86 (WILLADSEN et al., 1989), expressa em células do intestino de R. microplus (GOUGH; KEMP, 1993). Esta proteína foi clonada, e expressa em Escherichia coli e utilizada para vacinar bovinos resultando em 77% de proteção (RAND et al., 1989). Este imunógeno proporcionou proteção de 88% quando expresso sistema eucarioto (sistema baculovírus) (RICHARDSON et al., 1993). Níveis distintos de eficácia foram obtidos quando expresso em levedura (RODRI- GUEZ et al., 1994; DELA FUENTE et al., 1995). No Brasil, foi demonstrado que o uso da Bm86, em bovinos submetidos à infestação natural de R. microplus, reduziu entre 45% e 60% o índice de infestação dos bovinos vacinados (ANDREOTTI, 2006). Porém, a eficácia das vacinas que já estiveram disponíveis comercialmente variou entre 51% a 91% dependendo da população de carrapatos e da condição nutricional dos bovinos utilizados nos testes (PARIZI et al., 2009). Foi sugerido que a variação na eficácia observada entre diferentes regiões do mundo era devido às variações nas sequências de aminoácidos das Bm86 entre as diferentes populações de carrapatos (GARCIA-GARCIA et al., 2000). De fato, análises de

108 108 Capítulo 7 Vacinas contra o carrapato-do-boi no Brasil populações de carrapatos da Argentina mostraram polimorfismos no gene da Bm86, que resulta em uma proteína solúvel em vez da proteína ligada à membrana como as detectadas em carrapatos da Austrália e Cuba, o que explicaria porque os carrapatos argentinos são resistentes à vacinação com Bm86. Para superar esta resistência, uma nova vacina recombinante foi produzida a partir do gene da Bm95 (alelo do gene Bm86). Este novo antígeno foi eficiente para proteger bovinos de infestações por carrapatos da Argentina e Cuba (GARCÍA-GARCÍA et al., 2000). Variações nas sequências de aminoácidos superiores a 2,8% seriam suficientes para diminuir a eficiência da vacinação quando antígenos recombinantes são utilizados (GARCÍA-GARCÍA et al., 1999). Cepas de várias regiões do Brasil, Argentina, Uruguai, Venezuela e Colômbia foram analisadas e ficou demostrado que os genes das Bm86 e Bm95 apresentam variações que vão de 3,4% a 6,8% e de 1,14% a 4,56% nas sequências de aminoácidos, respectivamente (SOSSAI et al., 2005). Em estudo de variabilidade da Bm86-CG, uma proteína homóloga a Bm86, isolada de uma cepa de Campo Grande - Mato Grosso do Sul, mostrou variações de 3,5% e 3,7% na sequência de aminoácidos quando comparada às Bm86 e Bm95, respectivamente (ANDREOTTI et al., 2008). Além disso, os bovinos vacinados com Bm86 mostraram níveis variáveis de resistência contra espécies próximas filogeneticamente de R. microplus (FRAGOSO et al., 1998; DE VOS et al., 2001; ODONGO et al., 2007). Estes níveis de proteção refletem não só a variação entre isolados de R. microplus, mas também as relações filogenéticas entre diferentes espécies de carrapatos, indicando que os epítopos imunologicamente importantes são, pelo menos, parcialmente conservados (AN- DREOTTI et al., 2008; SOSSAI et al., 2005; ODONGO et al., 2007). A proteína Bm91 também foi testada como antígeno vacinal, porém em associação com a Bm86 (WILLADSEN et al., 1996), e foi caracterizada como tendo atividades carboxipepitidase (JARMEY et al., 1995). Na Austrália, a vacina baseada na proteína Bm86 foi comercializada com o nome de TickGARD e, em Cuba, com o nome de GAVAC. As vacinas desenvolvidas a partir da Bm86 conferem proteção parcial aos bovinos contra futuras infestações por R. microplus diminuindo o número de carrapatos, a produção de ovos e a fertilidade. Esses resultados, no entanto, não asseguram a proteção desejada na produção bovina, sugerindo a necessidade de mais de um antígeno protetor. Além do antígeno Bm86, que compõem as vacinas já existentes, outras proteínas também conferem algum grau de imunoproteção ou induzem a produção de anticorpos que interferem no sucesso reprodutivo do carrapato, como por exemplo: um precursor de protease aspártica acumulado no ovo (BYC- BoophilusYolk pro- Cathepsin) (LOGULLO et al., 1998) e inibidores de tripsina provenientes de larvas de carrapato, BmTIs (ANDREOTTI et al., 2002). Já foi demonstrado que anticorpos funcionais podem ser encontrados na hemolinfa de carrapatos quando os carrapatos se alimentam em um bovino imunizado (DA SILVA VAZ et al., 1996). Esta observação permitiu a produção de antígenos de outros órgãos do carrapato e não somente do intestino e da saliva. A vacinação de bovinos com a BYC nativa e recombinante foi capaz de estimular uma resposta humoral dos bovinos (DA SILVA VAZ et al., 1998). A capacidade da BYC de induzir uma res-

109 Capítulo 7 Vacinas contra o carrapato-do-boi no Brasil 109 posta imunitária contra R. microplus protetora em bovinos foi testada por ensaios de vacinação e por inoculação de anticorpo monoclonal (MAb) anti-byc em teleóginas totalmente ingurgitadas. Nas experiências de imunização, as medições de vários parâmetros biológicos demonstraram uma proteção parcial contra R. microplus, variando de 14% a 36%. A inoculação do MAb produziu uma diminuição dose dependente na oviposição e sobrevivência do ectoparasita (DA SILVA VAZ et al., 1998). A imunização de bovinos com uma associação de BmTIs, purificadas em coluna de tripsina sepharose, apresentou 72,8% de eficiência na proteção contra o carrapato-do-boi (ANDREOTTI et al., 2002). Um peptídeo sintético foi desenhado com base em uma sequência conservada de aminoácidos dessas BmTIs, porém, quando testado em stall test, apresentou 18,4 % de proteção contra o carrapato (ANDRE- OTTI et al., 2007). Foi demonstrado que um peptídeo quimérico recombinante, desenhado a partir das sequências de BmTI e carrapatin, induziu resposta imune em camundongos Balb/C, mas quando utilizado em bovinos com adjuvante completo de Freud não induziu resposta protetora (SASAKI et al., 2006). Um desses inibidores foi descrito pela Embrapa Gado de Corte em associação com a Escola Paulista de Medicina, denominado BmTI-A (TANAKA et al., 1999). Pesquisadores da Embrapa Gado de corte criaram uma sequência de DNA sintética deste gene e a clonaram em um plasmídeo de expresssão em Pichia pastoris para a expressão do gene sintético. A proteína expressa por este sistema foi denominada RmLTI e, após ser utilizada para a vacinação, conferiu proteção de 32% em bovinos infestados com R. microplus (ANDREOTTI et al., 2012). Glutationa-S-transferases (GSTs) é uma família de enzimas envolvidas na desintoxicação metabólica de xenobióticos e compostos endógenos (AGIANIAN et al., 2003). A imunização de bovinos com essa enzima recombinante de Haemaphysalis longicornis (rgct-hl) induziu uma resposta imunitária parcial em bovinos, indicada pela diminuição do número de teleóginas que sobreviveram nos animais vacinados, chegando a 57% de eficácia média (PARIZI et al., 2011). A enzima VTDCE (Vitellin Degrading Cysteine Endopeptidase) é um tipo de Catepsina L encontrado em ovos de R. microplus (SEIXAS et al., 2003) caracterizada como a proteína mais ativa na hidrólise da vitelina. Utilizada em ensaios de vacinação, animais que receberam quatro doses de 100 µg de VTDCE produziram anticorpos específicos contra VTDCE gerando uma resposta imune com proteção parcial ao desafio com larvas de R. microplus. Os pesos de ovos férteis de teleóginas de animais vacinados diminuíram aproximadamente 17,6% e a eficácia média observada foi de 21% (SEIXAS et al., 2008). Outras proteínas também têm sido isoladas e expressas de forma recombinante, porém, ainda não foram testadas em desafios com R. microplus. A enzima THAP (Tick Heme-binding Aspartic Proteinase), segundo o grupo que a isolou, considerando-se que está envolvida na hidrólise da vitelina pode ser outro alvo promissor em busca de controle imunológico do carrapato (SEIXAS et al., 2012). O gene de uma proteína calreticulin de R. microplus (BmCRT) foi amplificado e expresso em E. coli. A BmCRT é inoculada pelo carrapato em seu hospedeiro junto com a saliva (REF). Conhecida como sendo ligante de cálcio, e por estar presente

110 110 Capítulo 7 Vacinas contra o carrapato-do-boi no Brasil na saliva do carrapato, provavelmente auxilia na alimentação do carrapato, atuando como agente imunossupressor e anticoagulante (REF). Ensaios de inoculação mostraram que a BmCRT é imunogênica, porém, nenhum teste de proteção foi realizado (PARIZI et al., 2009). No Brasil, o uso do peptídeo sintético (SBm7462), desenhado a partir da Bm86, desenvolvido pela Universidade Federal de Viçosa, mostrou resultados positivos em testes preliminares de imunoproteção de bovinos e posterior desafio com larvas, alcançou 81,05% de eficiência (PATARROYO et al., 2002). Além disso, quando o peptídeo SBm7462 foi utilizado para comparar a saponina e microesferas de PGLA 50:50 como adjuvantes, o imunógeno encapsulado, embora viáveis após encapsulação, induziu níveis de anticorpos significativamente mais baixos do que os detectados com o peptídeo emulsionado em saponina (SALAE-JUNIOR et al., 2005). Na tentativa de prolongar o título de anticorpos contra a Bm86 ou, até mesmo, eliminar a necessidade de reforço vacinal periódico, outra estratégia utilizada foi o desenvolvimento de vacinas de DNA. Ovinos, murinos e bovinos foram vacinados com plasmídeo codificando para o gene da Bm86 obtiveram uma resposta imune humoral, com produção de imunoglobulinas, especialmente do tipo IgG, contra o antígeno Bm86 (DE ROSE et al., 1999). Após a vacinação, os ovinos mostraram uma proteção parcial contra uma subsequente infestação de carrapatos, com diminuição do peso de teleóginas recuperadas média de 232 g no grupo controle contra 201 g no vacinado; e do peso de ovos por teleógina média de 1,07g no grupo vacinado contra 0,5 no grupo controle (DE ROSE et al., 1999). Isolamentos de anticorpos foram também utilizados na tentativa de se identificar potenciais antígenos vacinais. MAb s contra membranas intestinais de carrapatos foram utilizados para precipitarem, a partir de extratos de carrapatos, antígenos solúveis a serem utilizados como antígenos vacinais. A vacinação de bovinos com antígenos, obtidos com esta técnica, isolados a partir do MAb QU13 provocou 99% de redução na oviposição, comparado ao grupo vacinado (LEE; OPDEBEECK, 1991). Resultados similares também foram obtidos pela inoculação de MAb produzido contra extratos não purificados de intestino e embrião em teleóginas totalmente ingurgitadas de R. microplus (TORO-ORTIZ et al., 1997). Um anticorpo policlonal purificado anti-n-acetilhexosaminidase (anti-hex), produzido a partir da proteína nativa purificada de extrato de larvas de R. microplus e inoculada em camundongos, foi inoculado em teleóginas totalmente ingurgitadas e, como resultado, observou-se 26% de diminuição da oviposição (DEL PINO et al., 1998). A avaliação sorológica de animais imunizados com diferentes antígenos para o controle do carrapato mostrou que os níveis de anticorpos tendem a decrescer em alguns meses, reduzindo a proteção. Isto indica a necessidade de um reforço de vacinação com os diferentes antígenos disponíveis. Assim, o uso de adjuvantes adequados é um ponto importante no processo do desenvolvimento da vacina contra o carrapato do bovino. Em uma vacina a especificidade da resposta imune é dada pelo antígeno, entretanto os adjuvantes são as substâncias que ampliam e modulam a imunogenicidade do antígeno vacinal. Ao desenvolver uma vacina um aspecto que influencia grandemente o seu desenvolvimento é a interação que ocorre entre o patógeno e o hospedeiro.

111 Capítulo 7 Vacinas contra o carrapato-do-boi no Brasil 111 Esta interação determina o tipo de resposta imune à qual a vacina necessita induzir para proteger o bovino de forma eficiente em um desafio. Entretanto, vacinas contra carrapato apresentam um desfio extra ao compararmos a outros patógenos, pois estes apresentam fase distinta no hospedeiro e fora deste. Além disso, a resposta imune a estes parasitos é muito complexa e a interação imunológica entre hospedeiro-parasito não está totalmente esclarecida. Na montagem da resposta imune há uma ligação entre a resposta inata e a adaptativa, e baseado neste conceito um adjuvante pode amplificar a resposta adaptativa da vacina modulando sinais envolvidos no processo de sinalização da resposta inata. Como as modernas vacinas contra o carrapato bovino são baseadas em antígenos sintéticos purificados os quais em geral não estimulam uma resposta inata, se faz necessário à utilização de adjuvantes que ativem esta em conjunto com a adquirida. Entretanto não há um adjuvante universal que cubra as necessidades vacinais. Porém, este deve cobrir certos itens como: Induzir uma rápida resposta, modular resposta humoral e celular; produzir uma resposta protetora elevada; desenvolver uma resposta duradoura, e ser efetiva em populações mais susceptíveis. Desta forma, o estudo da interação hospedeiro-patógeno (bovino-carrapato) se faz cada vez mais necessário para que no seu conhecimento possamos escolher melhores antígenos e entendermos que respostas imunes precisam ser induzidas, via vacina, para protegermos de forma eficaz o rebanho bovino sensível ao carrapato. CONSIDERaÇõES FINaIS A eficiência da vacinação no controle do carrapato é maior quando seguir uma programação estratégica e/ou ela estiver associada ao controle químico, significando que a resposta vacinal é melhor quando o número de larvas infestando os bovinos é menor; em consequência do que o grau de contaminação das pastagens pelas larvas influencia na resposta vacinal. Há vários relatos de diferentes graus de proteção em relação às linhagens de carrapatos em estudos com o antígeno Bm86 em diversas regiões do mundo. Estudos das populações regionais de carrapatos são importantes para a verificação da eficiência dos antígenos em questão e o seu uso no controle do carrapato por meio de vacina. Uma maneira de aumentar a eficiência no controle e dificultar a pressão de seleção nas populações de carrapato seria o uso de vacina poliantigênica, com antígenos atuando em diferentes fases do ciclo biológico e em situações fisiológicas importantes na vida do carrapato. Acredita-se que a vacina, mesmo com um efeito parcial, seja uma alternativa valiosa para o controle do carrapato. Esta, no entanto, deverá ser usada de forma estratégica como qualquer alternativa de controle. É muito importante, porém, que as vacinas precisam ser reforçadas a cada seis meses já que o título de anticorpos reduz em aproximadamente três meses, e estar ciente, também que a proteção contra futuras infestações por R. microplus é parcial. Uma vacina contendo dois antígenos contra o carrapato bovino mostra vantagem na imunização do rebanho, visto que a resposta imunológica a um antígeno seria compensada pelo outro, ou seja, animais que responderiam mal a um antígeno

112 112 Capítulo 7 Vacinas contra o carrapato-do-boi no Brasil responderiam bem ao outro. Dessa forma, a vacina com dois ou mais antígenos seria economicamente mais viável para os produtores de bovinos e produziria um maior impacto na redução de microrganismos transmitidos pelo carrapato (GUERRERO et al., 2012). Comparadas aos agentes químicos, as vacinas são atóxicas, não poluentes, menos onerosas em relação à produção e, também, reduzem a quantidade de acaricidas aplicada ao ano. No entanto, tendem a ser espécie-específicas, o que as torna comercialmente indicadas para situações problema onde está sendo envolvida apenas uma espécie de carrapato. Ainda, especula-se que uma vacina com 100% de eficácia possa trazer um possível problema de instabilidade enzoótica para a tristeza parasitária bovina, substituindo um problema por outro. Com base nisso, poderia justificar-se que uma vacina com uma eficiência em torno de 70% poderia contribuir no controle estratégico do carrapato evitando assim o impacto na epidemilogia da tristeza parasitária bovina. Torna-se, pois, importante e urgentíssimo que seja criado um programa de governo para orientar políticas de controle do carrapato visando aperfeiçoar a produção e qualidade na cadeia da carne bovina do país. Isso em função da importância social e econômica que o carrapato significa para a produção e a necessidade de se pensar no seu controle com base no manejo da sua população, com vistas a tornar a pecuária do Brasil mundialmente mais e mais competitiva. R EFER ÊNCIAS AGBEDE, R. I.; KEMP, D. H. Immunization of cattle against Boophilus microplus using extracts derived from adult female ticks: histopathology of ticks feeding on vaccinated cattle. International journal for parasitology, v. 16, n. 1, p , fev AGIANIAN, B.; TUCKER, P. A.; SCHOUTEN, A.; LEONARD, K.; BULLARD, B.; GROS, P. Structure of a Drosophila sigma Class Glutathione S-transferase Reveals a Novel Active Site Topography Suited for Lipid Peroxidation Products. Journal of Molecular Biology, v. 326, n. 1, p , fev ALLEN, J.; HUMPHREYS, S. Immunisation of guinea pigs and cattle against ticks. Nature, v. 280, p , ALVES-BRANCO, F. P. J.; ECHEVARRIA, F. A. M.; SIQUEIRA, A. S. Garça vaqueira (Egretta ibis) e o controle biológico do carrapato (Boophilus microplus). EMBRAPA-UEPAE Bagé, Comunicado Técnico 1, 1983, 4 p. ANDREOTTI, R.; GOMES, A.; MALAVAZI-PIZA, K. C.; SASAKI, S. D.; SAMPAIO, C. A.; TA- NAKA, A. S. BmTI antigens induce a bovine protective immune response against Boophilus microplus tick. International immunopharmacology, v. 2, n. 4, p , mar ANDREOTTI, R. Performance of two Bm86 antigen vaccin formulation against tick using crossbreed bovines in stall test. Revista brasileira de parasitologia veterinária, v. 15, n. 3, p , ANDREOTTI, R. A synthetic bmti n-terminal fragment as antigen in bovine immunoprotection against the tick Boophilus microplus in a pen trial. Experimental parasitology, v. 116, n. 1, p , maio ANDREOTTI, R.; PEDROSO, M. S.; CAETANO, A. R.; MARTINS, N. F. Comparison of predicted binders in Rhipicephalus (Boophilus) microplus intestine protein variants Bm86 Campo Grande strain, Bm86 and Bm95. Revista brasileira de parasitologia veterinária, v. 17, n. 2, p. 93 8, ANDREOTTI, R.; CUNHA, R. C.; SOARES, M. A.; GUERRERO, F. D.; LEITE, F. P.; DE LEÓN, A. A. Protective immunity against tick infestation in cattle vaccinated with recombinant trypsin inhibitor of Rhipicephalus microplus. Vaccine, v. 30, n. 47, p , 19 out

113 Capítulo 7 Vacinas contra o carrapato-do-boi no Brasil 113 ANDREOTTI, R.; GARCIA, M. V.; CUNHA, R. C.; BARROS, J. C. Protective action of Tagetes minuta (Asteraceae) essential oil in the control of Rhipicephalus microplus (Canestrini, 1887) (Acari: Ixodidae) in a cattle pen trial. Veterinary parasitology, 25 maio BERGMAN, D. K.; PALMER, M. J.; CAIMANO, M. J.; RADOLF, J. D.; WIKEL, S.K. Isolation and molecular cloning of a secreted immunosuppressant protein from Dermacentor andersoni salivary gland. The Journal of parasitology, v. 86, n. 3, p , 1 jun BRUM, J. G. W. Infecção em teleóginas de Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) por Cedecea lapagei (Grimont et al., 1981): etiopatogenia e sazonalidade f. Tese (Doutorado em Parasitologia) - Instituto de Biologia, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, CANALES, M.; ENRIQUEZ, A.; RAMOS, E.; CABRERA, D.; DANDIE, H.; SOTO, A.; FAL- CÓN, V.; RODRÍGUEZ, M.; DE LA FUENTE, J. Large-scale production in Pichia pastoris of the recombinant vaccine Gavac against cattle tick. Vaccine, v. 15, n. 4, p , mar CORDOVÉS, C. O. Carrapato: controle ou erradicação. 2. ed. Guaíba: Agropecuária, 1997, 177 p. CUNHA, R. C.; ANDREOTTI, R.; LEITE, F. P. L. Rhipicephalus (Boophilus) microplus: expression and characterization of Bm86-CG in Pichia pastoris. Revista brasileira de parasitologia veterinária, v. 20, n. 2, p , DA SILVA VAZ, I.; LOGULLOD, C.; SORGINE, M.; VELLOSO, F. F.; LIMA, M. F. R.; GON- ZALES, J. C.; MASUDA, H.; OLIVEIRA, P. L.; MASUDA, A. Immunization of bovines with an aspartic proteinase precursor isolated from Boophilus microplus eggs. Veterinary immunology and immunopathology, v. 66, n. 3-4, p , 11 dez DE LA FUENTE, J.; RODRÍGUEZ, M.; MONTERO, C.; REDONDO, M.; GARCIA-GARCIA, J. C.; MÉNDEZ, L.; SERRANO, E.; VALDÉS, M.; ENRÍQUEZ, A.; CANALES, M.; RAMOS, E.; BOUÉ, O.; MACHADO, H.; LLEONART, R. Vaccination against ticks (Boophilus spp.): the experience with the Bm86-based vaccine Gavac. Genetic analysis : biomolecular engineering, v. 15, n. 3-5, p , nov DE ROSE, R.; McKENNA, R. V.; COBON, G.; TENNENT, J.; ZAKRZEWSKI, H.; GALE, K.; WOOD, P. R.; SCHEERLINCK, J. P.; WILLADSEN, P. Bm86 antigen induces a protective immune response against Boophilus microplus following DNA and protein vaccination in sheep. Veterinary immunology and immunopathology, v. 71, n. 3-4, p , 30 nov DEL PINO, F. A.; BRANDELLI, A.; GONZALES, J. C.; HENRIQUES, J. A.; DEWES, H. Effect of antibodies against beta-n-acetylhexosaminidase on reproductive efficiency of the bovine tick Boophilus microplus. Veterinary parasitology, v. 79, n. 3, p , 16 nov ELDER, J. K.; KEARNAN, J. F.; WATERS, K. S.; DUNWELL, G. H.; EMMERSON, F. R.; KNOTT, S. G.; MORRIS, R. S. A survey concerning cattle tick control in Queensland. 4. Use of resistant cattle and pasture spelling. Australian veterinary journal, v. 56, n. 5, p , maio FRAGOSO, H.; RADT, P. H.; ORTIZ, M.; RODRIGUEZ, M.; REDONDO, M.; HERRERA, L.; DE LA FUENTE, J. Protection against Boophilus annulatus infestations in cattle vaccinated with the B. microplus BmS6-containing vaccine Gavac. v. 16, n. 20, p , FURLONG, J. Carrapato : problemas e soluções. 1 a. ed. Juiz de Fora: [s.n.]. p. 65. GARCÍA-GARCÍA, J. C.; GONZÁLEZ, I. L.; GONZÁLEZ, D. M.; VALDÉS, M.; MÉNDEZ, L.; LAMBERTI, J.; D AGOSTINO, B.; CITRONI, D.; FRAGOSO, H.; ORTIZ, M.; RODRÍ- GUEZ, M.; DE LA FUENTE, J. Sequence variations in the Boophilus microplus Bm86 locus and implications for immunoprotection in cattle vaccinated with this antigen. Experimental & applied acarology, v. 23, n. 11, p , nov GARCÍA-GARCÍA, J. C.; MONTERO, C.; REDONDO, M.; VARGAS, M.; CANALES, M.; BOUE, O.; RODRÍGUEZ, M.; JOGLAR, M.; MACHADO, H.; GONZÁLEZ, I. L.; VALDÉS, M.; MÉNDEZ, L.; DE LA FUENTE, J. Control of ticks resistant to immunization with Bm86 in cattle vaccinated with the recombinant antigen Bm95 isolated from the cattle tick, Boophilus microplus. Vaccine, v. 18, n. 21, p , 28 abr GHOSH, S.; KHAN, M. H.; AHMED, N. Cross-bred Cattle Protected against Hyalomma anatolicum anatolicum by Larval Antigens Purified by Immunoaffinity Chromatography. Tropical Animal Health and Production, v. 31, n. 5, p , 1 out GOMES, A. Dinâmica populacional de Boophilus microplus (Canestrini, 1987) (Acari: ixodidae) em bovinos nelore (Bos indicus) e cruzamentos em infestações experimentais f. Tese (Doutorado em Parasitologia) Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 1995.

114 114 Capítulo 7 Vacinas contra o carrapato-do-boi no Brasil GOMES, A.; KOLLER, W. W.; BARROS, A. T. M. Suscetibilidade de Rhipicephalus (Boophilus) microplus a carrapaticidas em Mato Grosso do Sul, Brasil. Ciência Rural, Santa Maria, v. 41, n. 8, p , ago GONZALES, J. C. O controle do carrapato do boi. 2. ed. Porto Alegre: Edição do Autor, p. GOUGH, J. M.; KEMP, D. H. Localization of a low abundance membrane protein (Bm86) on the gut cells of the cattle tick Boophilus microplus by immunogold labeling. The Journal of parasitology, v. 79, n. 6, p , dez GUERRERO, F. D.; MILLER, R. J.; PÉREZ DE LEÓN, A. A. Cattle tick vaccines: many candidate antigens, but will a commercially viable product emerge? [s.l.] Australian Society for Parasitology Inc., v. 42p HEWETSON, R. W. THE INHERITANCE OF RESISTANCE BY CATTLE TO CATTLE TICK. Australian Veterinary Journal, v. 48, n. 5, p , maio HORN, S. C. Prováveis Prejuízos Causados pelos Carrapatos, Boletim de Defesa Sanitária Animal, Ministério da Agricultura, Brasília, 2 ed., 79 pp, JARMEY, J. M.; RIDING, G. A.; PEARSON, R. D.; McKENNA, R. V.; WILLADSEN, P. Carboxydipeptidase from Boophilus microplus: A concealed antigen with similarity to angiotensin-converting enzyme. Insect Biochemistry and Molecular Biology, v. 25, n. 9, p , out JOHNSTON, L. A; KEMP, D. H.; PEARSON, R. D. Immunization of cattle against Boophilus microplus using extracts derived from adult female ticks: effects of induced immunity on tick populations. International journal for parasitology, v. 16, n. 1, p , fev KEMP, D. H. Immunisation of cattle against Boophilus microplus using extracts derived from adulti famale ticks: feeding and survival of parasite on vaccinated cattle. International journal for parasitology, v. 16, n. 2, p , KEMP, D. H.; AGBEDE, R. I.; JOHNSTON, L. A.; GOUGH, J. M. Immunization of cattle against Boophilus microplus using extracts derived from adult female ticks: Feeding and survival of the parasite on vaccinated cattle. International Journal for Parasitology, v. 16, n. 2, p , abr LEE, R. P.; OPDEBEECK, J. P. Isolation of protective antigens from the gut of Boophilus microplus using monoclonal antibodies. Immunology, v. 72, n. 1, p , jan LOGULLO, C.; VAZ IDA, S.; SORGINE, M. H.; PAIVA-SILVA, G. O.; FARIA, F. S.; ZINGALI, R. B.; DE LIMA, M. F.; ABREU, L.; OLIVEIRA, E. F.; ALVES, E. W.; MASUDA, H.; GONZALES, J. C.; MASUDA, A.; OLIVEIRA, P. L. Isolation of an aspartic proteinase precursor from the egg of a hard tick, Boophilus microplus. Parasitology, v. 116 ( Pt 6, p , jun MATTIOLI, R. C.; BAH, M.; FAYE, J.; KORA, S.; CASSAMA, M. A comparison of field tick infestation on N Dama, Zebu and N Dama Zebu crossbred cattle. Veterinary Parasitology, v. 47, n. 1-2, p , mar ODONGO, D.; KAMAU, L.; SKILTON, R.; MWAURA, S.; NITSCH, C.; MUSOKE, A.; TARA- CHA, E.; DAUBENBERGER, C.; BISHOP, R. Vaccination of cattle with TickGARD induces cross-reactive antibodies binding to conserved linear peptides of Bm86 homologues in Boophilus decoloratus. Vaccine, v. 25, n. 7, p , 26 jan PARIZI, L. F.; RECH, H.; FERREIRA, C. A.; IMAMURA, S.; OHASHI, K.; ONUMA, M.; MA- SUDA, A.; VAZ IDA, S. Jr. Comparative immunogenicity of Haemaphysalis longicornis and Rhipicephalus (Boophilus) microplus calreticulins. Veterinary parasitology, v. 164, n. 2-4, p , 14 out PARIZI, L. F. et al. Cross immunity with Haemaphysalis longicornis glutathione S-transferase reduces an experimental Rhipicephalus (Boophilus) microplus infestation. Experimental parasitology, v. 127, n. 1, p , jan PATARROYO, J. H.; PORTELA, R. W.; DE CASTRO, R. O.; PIMENTEL, J. C.; GUZMAN, F.; PATARROYO, M. E.; VARGAS, M. I.; PRATES, A. A.; MENDES, M. A. Immunization of cattle with synthetic peptides derived from the Boophilus microplus gut protein (Bm86). Veterinary immunology and immunopathology, v. 88, n. 3-4, p , 25 set RAND, K. N.; MOORE, T.; SRISKANTHA, A.; SPRING, K.; TELLAN, R.; WILLADSEN, P.; CO- BON, G. S. Cloning and expression of a protective antigen from the cattle tick Boophilus microplus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 86, n. 24, p , dez

115 Capítulo 7 Vacinas contra o carrapato-do-boi no Brasil 115 RICHARDSON, M. A.; SMITH, D. R.; KEMP, D. H.; TELLAM, R. L. Native and baculovirus- -expressed forms of the immuno-protective protein BM86 from Boophilus microplus are anchored to the cell membrane by a glycosyl-phosphatidyl inositol linkage. Insect molecular biology, v. 1, n. 3, p , jan ROBERTS, J. A.; KERR, J. D. Boophilus microplus: passive transfer of resistance in cattle. The Journal of parasitology, v. 62, n. 3, p , 1 jun RODRÍGUEZ, M.; RUBIERA, R.; PENICHET, M.; MONTESINOS, R.; CREMATA, J.; FAL- CÓN, V.; SÁNCHEZ, G.; BRINGAS, R.; CORDOVÉS, C.; VALDÉS, M. et al. High level expression of the B. microplus Bm86 antigen in the yeast Pichia pastoris forming highly immunogenic particles for cattle. Journal of Biotechnology, v. 33, n. 2, p , mar RUIZ, L. M.; ORDUZ, S.; LÓPEZ, E. D.; GUZMÁN, F.; PATARROYO, M. E.; ARMENGOL, G. Immune response in mice and cattle after immunization with a Boophilus microplus DNA vaccine containing bm86 gene. Veterinary parasitology, v. 144, n. 1-2, p , 15 mar SALES-JUNIOR, P. A.; GUZMAN, F.; VARGAS, M. I.; SOSSAI, S.; PATARROYO, V. A. M.; GON- ZÁLEZ, C. Z.; PATARROYO, J. H. Use of biodegradable PLGA microspheres as a slow release delivery system for the Boophilus microplus synthetic vaccine SBm7462. Veterinary immunology and immunopathology, v. 107, n. 3-4, p , 15 set SASAKI, S. D.; COTRIN, S. S.; CARMONA, A. K.; TANAKA, A. S. An unexpected inhibitory activity of Kunitz-type serine proteinase inhibitor derived from Boophilus microplus trypsin inhibitor on cathepsin L. Biochemical and biophysical research communications, v. 341, n. 1, p , 3 mar SEIXAS, A.; DOS SANTOS, P. C.; VELLOSO, F. F.; DA SILVA VAZ, I. Jr.; MASUDA, A.; HORN, F.; TERMIGNONI, C. A Boophilus microplus vitellin-degrading cysteine endopeptidase. Parasitology, v. 126, n. Pt 2, p , fev SEIXAS, A.; LEAL, A. T.; NASCIMENTO-SILVA, M. C.; MASUDA, A.; TERMIGNONI, C.; DA SILVA VAZ, I. Jr. Vaccine potential of a tick vitellin-degrading enzyme (VTDCE). Veterinary immunology and immunopathology, v. 124, n. 3-4, p , 15 ago SEIXAS, A.; OLIVEIRA, P.; TERMIGNONI, C.; LOGULLO, C.; MASUDA, A.; DA SILVA VAZ, I. Jr. Rhipicephalus (Boophilus) microplus embryo proteins as target for tick vaccine. Veterinary immunology and immunopathology, v. 148, n. 1-2, p , 15 jul SOSSAI, S.; PECONICK, A. P.; SALES-JUNIOR, P. A.; MARCELINO, F. C.; VARGAS, M. I.; NEVES, E. S.; PATARROYO, J. H. Polymorphism of the bm86 gene in South American strains of the cattle tick Boophilus microplus. Experimental & applied acarology, v. 37, n. 3-4, p , jan SUTHERST, R. W.; JONES, R. J.; SCHNITZERLING, H. J. Tropical legumes of the genus Stylosanthes immobilize and kill cattle ticks. Nature, v. 295, n. 5847, p , 28 jan TANAKA, A. S.; ANDREOTTI, R.; GOMES, A.; TORQUATO, R. J.; SAMPAIO, M. U.; SAM- PAIO, C. A. A double headed serine proteinase inhibitor--human plasma kallikrein and elastase inhibitor--from Boophilus microplus larvae. Immunopharmacology, v. 45, n. 1-3, p , dez TORO-ORTIZ, R. D.; DA SILVA VAZ, I. Jr.; GONZALES, J. C.; MASUDA, A. Monoclonal antibodies against Boophilus microplus and their effects on tick reproductive efficiency. Veterinary parasitology, v. 69, n. 3-4, p , maio VAZ JÚNIOR, I. S..; MARTINEZ, R. H.; OLIVEIRA, A.; HECK, A.; LOGULLO, C.; GONZA- LES, J. C.; DEWES, H.; MASUDA, A. Functional bovine immunoglobulins in Boophilus microplus hemolymph. Veterinary parasitology, v. 62, n. 1-2, p , mar VAZ JÚNIOR, I. da S. Caracterização de proteínas de Boophilus microplus como imunógeno em vacina contra o carrapato f. Tese (Doutorado em Ciências Veterinárias) - Faculdade de Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre. VOS, S.; ZEINSTRA, L.; TAOUFIK, O.; WILLADSEN, P.; JONGEJAN, F. Evidence for the Utility of the Bm86 Antigen from Boophilus microplus in Vaccination Against Other Tick Species. Experimental & Applied Acarology, v. 25, n. 3, p , 1 mar WIKEL, S. K. Host immunity to ticks. Annual review of entomology, v. 41, p. 1 22, 28 jan WILLADSEN, P.; RIDING, G. A.; McKENNA, R. V.; KEMP, D. H.; TELLAM, R. L.; NIELSEN, J. N.; LAHNSTEIN, J.; COBON, G. S.; GOUGH, J. M. Immunologic control of a parasitic ar-

116 116 Capítulo 7 Vacinas contra o carrapato-do-boi no Brasil thropod. Identification of a protective antigen from Boophilus microplus. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950), v. 143, n. 4, p , 15 ago WILLADSEN, P.; SMITH, D.; COBON, G.; McKENNA, R. V. Comparative vaccination of cattle against Boophilus microplus with recombinant antigen Bm86 alone or in combination with recombinant Bm91. Parasite immunology, v. 18, n. 5, p , maio WILLADSEN, P. Novel vaccines for ectoparasites. Veterinary parasitology, v. 71, n. 2-3, p , 31 jul WILLADSEN, P.; McKENNA, R. V; RIDING, G. A. Isolation from the cattle tick, Boophilus microplus, of antigenic material capable of eliciting a protective immunological response in the bovine host. International journal for parasitology, v. 18, n. 2, p , mar

117 8 Potencial acaricida de plantas como componente de sistema integrado para o controle de Rhipicephallus (Boophilus) microplus João Batista Catto

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119 Capítulo 8 Potencial acaricida de plantas como componente de sistema integrado para o controle de Rhipicephallus (Boophilus) microplus 119 Carrapatos são importantes parasitas de animais domésticos e afetam aproximadamente 800 milhões de bovinos em todo o mundo. Prejudicam os hospedeiros danificando o couro, reprimindo o apetite, retardando o crescimento e a produção de leite, e transmitindo doenças ou promovendo infecções secundárias. Em todo o mundo as perdas anuais causadas pelos carrapatos são estimadas em 20 bilhões de dólares (KAYAA, 2000). Desde a sua introdução o emprego de acaricidas sintéticos tem sido o método mais comum no controle de carrapatos levando a problemas como poluição ambiental, presença de resíduos nos alimentos e ação deletéria em organismos benéficos como os inimigos naturais do próprio carrapato e de outros parasitos bovinos. Muitos acaricidas afetam outros organismos provocando mortalidade, redução da população no longo prazo e bioacumulação na cadeia alimentar (FLAMINI, 2003). Mais de uma dezena de princípios ativos foi colocada no mercado desde meados do século passado, e estes, pela praticidade no uso, eficiência elevada e ganhos na produtividade têm sido intensamente e, muitas vezes, erroneamente utilizados levando à emergência da resistência a quase todos os princípios ativos em uso. Por isso, tais fatores negativos têm pressionado para medidas de controle do carrapato mais favoráveis para o ambiente e a saúde humana, aumentando o esforço de pesquisas por novas alternativas que possam ser utilizadas de forma isolada ou integrada, tais como: desenvolvimento de vacina; seleção de animais resistentes; controle biológico e uso de substâncias com propriedade acaricida obtidas de plantas (fitoterápicos). Óleos essenciais obtidos de plantas têm sido utilizados ao longo dos séculos no controle de pragas. As plantas são a mais rica fonte de compostos orgânicos na Terra e muitas das substâncias químicas naturais que elas possuem são dotadas de propriedades pesticidas. No início do século XIX, com o desenvolvimento da química farmacêutica, as plantas passaram a representar a fonte principal de substâncias para o desenvolvimento de medicamentos. Atualmente, apesar do grande desenvolvimento da síntese orgânica e de novos processos biotecnológicos, 25% dos medicamentos prescritos nos países industrializados são originários de plantas (HOSTETTMANN et al., 2003). Mais recentemente renovou-se o interesse pelos produtos que as plantas sintetizam como metabólitos secundários para defesa contra microorganismos, insetos fitófagos e herbívoros. A tecnologia permite agora explorar as propriedades tóxicas desses compostos e usá-los contra organismos aos quais não foram originalmente destinados (PANELLA, 2013). As vantagens do uso de compostos fitoterápicos é a sua obtenção a partir de recursos renováveis; o desenvolvimento mais lento da resistência pela presença de vários agentes com diferentes mecanismos de ação; degradação mais rápida, sem efeito em organismos não alvos; baixa toxicidade para animais e seres humanos, e baixa contaminação ambiental e dos alimentos (OLIVO et al., 2008; BORGES et al., 2011; PANELLA, 2013). Estudos in vitro com extratos e óleos essenciais (OEs) de plantas têm apresentado resultados promissores, mas poucos testes têm sidos realizados em animais. Dificuldades para preparar formulações apropriadas, diferenças na composição química das plantas da mesma espécie devido a fatores intrínsecos e extrínsecos, e informa-

120 120 Capítulo 8 Potencial acaricida de plantas como componente de sistema integrado para o controle de Rhipicephallus (Boophilus) microplus ções esparsas sobre os princípios ativos são entraves que precisam ser solucionados (BORGES et al., 2011). Os estudos de avaliação da atividade acaricida de plantas no carrapato-do-boi Rhipicephalus (Boophilus) microplus têm sido realizados com OEs, principalmente, de frutos e folhas e com extratos de partes aéreas com solventes de diferentes polaridades. Nos últimos anos este parasito tem sido alvo de um aumento expressivo de ensaios in vitro com larvas e fêmeas ingurgitadas, mas poucos trabalhos in vivo em condições de sistemas produtivos. Há também um número crescente de trabalhos com a identificação dos compostos presentes nos OEs e nos extratos avaliados. Borges et al. (2011) estimou que 55 espécies de plantas pertencentes a 26 famílias tinham sido avaliadas contra R. microplus. Em algumas espécies os compostos ativos presentes nos extratos e OEs foram identificados, mas apenas algumas foram provadas como ativas. O Brasil abriga 55 mil espécies de plantas, aproximadamente um quarto de todas as espécies conhecidas. Destas, dez mil podem ser úteis como fontes fornecedoras de produtos farmacêuticos, cosméticos e agroquímicos (BARATA, 1995). A ação das plantas no R. microplus pode ocorrer sem a interveniência direta do homem. O principal habitat do carrapato não é a vegetação, mas as larvas para fazer a transferência para os hospedeiros movem-se para o ápice das plantas. As propriedades de repelência e acaricida de Melinis minutiflora, Andropogon Gayanus e várias espécies de Stylosanthes em larvas de R. microplus têm sido documentadas na América do Sul e Austrália (THOMPSON; ROMERO, 1978; FERNANDEZ- RUVALCABA et al., 2004; AYCARDI et al., 1984). Flamini (2003) em uma revisão da literatura ( ) sobre o efeito acaricida de OEs em R. microplus relacionou seis estudos e, em outra revisão, Borges et al. (2011) relacionaram dez trabalhos. No primeiro Chungsamarnyart; Jiwajinda (1993) observaram alta mortalidade em larvas e teleóginas com OE de folhas verdes de Cymbopogum citratus e C. nardus diluídos em etanol nas concentrações de 1:2 e 1:3, respectivamente. Os mesmos autores, Chungsamarnyart; Jiwajinda (1996) estudaram o OE obtido por prensagem de várias espécies de Citrus (Citrus máxima, C. reticulata, C. suncris, C. sinensis e C. hystrix) e de d-limonene isolado, nas concentrações de 1:5, 1:10 e 1:15 diluídos em etanol. O OE de C. máxima e C. reticulata mostraram alta mortalidade em teleóginas na concentração 1:10 e foi duas vezes mais elevada que a ação isolada de d-limonene. Os OEs das outras espécies mostraram fraca atividade acaricida. Nos primeiros trabalhos realizados no Brasil, o OE de M. minutiflora (capim gordura) matou 100% das larvas após 10 minutos de exposição. A análise do OE identificou os componentes majoritários, que foram: ácido propiônico, ácido butírico, álcool feniletílico, hexanal, 1,8-cineol e 9-E-eicoseno. Dois dos componentes (1,8-cineol e n-hexanal) apresentaram também 100% de mortalidade às larvas de carrapato-do-boi em dez minutos (PRATES et al., 1993; 1998). Os estudos sobre o efeito acaricida de OE de plantas sobre R. microplus foram até agora realizados principalmente in vitro, e com as partes aéreas das plantas (folhas, galhos, casca do tronco e frutos). Os testes realizados com larvas são feitos para estimar somente a mortalidade das mesmas. No entanto, nas fêmeas ingurgitadas o teste de imersão permite avaliar efeitos na mortalidade, na ovipostura e na taxa

121 Capítulo 8 Potencial acaricida de plantas como componente de sistema integrado para o controle de Rhipicephallus (Boophilus) microplus 121 de eclosão. Estes efeitos, em combinação, permitem também avaliar in vitro o efeito acaricida total nas fêmeas ingurgitadas (DRUMMOND et al., 1973). Com menos frequência ensaios in vivo em animais experimentalmente ou naturalmente infestados são realizados para estimar o efeito dos OEs e extratos de plantas no controle das infestações mensurando o efeito na carga parasitária e nos índices reprodutivos. Assim, a menos que seja explicitado no texto, efeito nas larvas significa efeito na mortalidade e efeito acaricida é o efeito total do extrato ou OE em fêmeas ingurgitadas quando submetidas ao teste de imersão. Os óleos essenciais, voláteis ou etéreos, são misturas complexas com dois a 60 componentes, representados por compostos orgânicos voláteis oriundos do metabolismo secundário das plantas, que possuem baixo peso molecular e que são formados principalmente por monoterpenos, sesquiterpenos e fenilpropanóides. Podem constituir ainda os OEs os álcoois, ésteres, éteres, aldeídos, cetonas, lactonas, fenóis e éteres de fenol. Geralmente o efeito carrapaticida é atribuído aos constituintes isolados em maior quantidade, porém, a atividade do componente principal pode ser modulada por outros compostos que estão em menor quantidade (CAMPOS et al., 2012). O metabolismo secundário de plantas pode variar dependendo de vários fatores, tais como: sazonalidade, variabilidade genética, ritmo circadiano, idade e estágio de desenvolvimento, temperatura, disponibilidade de água, qualidade do solo, altitude, composição atmosférica, resposta ao ataque de patógenos, etc (GOBBO-NETO; LOPES, 2007). A toxicidade de uma planta contra artrópodes não a qualifica, necessariamente, como um pesticida. Vários aspectos devem ser levados em consideração, tais como: a forma de extração e conservação dos extratos; a eficácia em baixas concentrações; ausência de toxicidade para mamíferos e animais superiores; fácil obtenção, manipulação e aplicação, e viabilidade econômica (VIEGAS JUNIOR, 2003). No Brasil o registro de fitoterápicos para a medicina veterinária exige todos os requisitos para registro dos medicamentos convencionais. Além disso, os OEs e extratos poderão funcionar como fonte de moléculas para a síntese de novos carrapaticidas, diminuindo a dependência dos pecuaristas aos produtos organossintéticos existentes no mercado (CAMPOS et al., 2012). Dentre as plantas avaliadas para o controle de insetos, destaca-se a planta de origem asiática Azadirachta indica (Nim) por sua propriedade deterrente, inibindo a alimentação, a ovipostura e a eclodibilidade. Azadirachtin, o principal composto com atividade inseticida, é ativo em aproximadamente 550 espécies de insetos (ANURADHA; ANNADURAI, 2008). Apesar do conhecimento secular da propriedade inseticida e acaricida de A. indica somente nos anos 90 do século passado OEs foram experimentados em R. microplus. Bovinos naturalmente infestados mostraram 52,4 e 60% de diminuição na infestação em animais tratados com OE de A. indica (KALAKUMAR et al., 2000; SHRIVASTAVA, 2003). Também em animais naturalmente infestados e pulverizados cinco vezes em intervalos de seis dias com solução na concentração de 1:4 de produto comercial contendo OEs de: Cedrus deodara, Pongamia glabra, A. indica, Eucalyptus globulus e Acorus calamus resultou na eliminação de 65,3; 87,6; 96.5; 99,6 e 100% dos carrapatos, respectivamente. Além disso, os animais permaneceram li-

122 122 Capítulo 8 Potencial acaricida de plantas como componente de sistema integrado para o controle de Rhipicephallus (Boophilus) microplus vres de carrapatos pelos próximos 30 dias (KUMAR; CHAUHAN, 2000). In vitro e em teleóginas Broglio-Michelete et al. (2010) observaram efeito acaricida de 17,6 e 65,6% em dois OEs comerciais de A. indica na concentração de 2%. Com OE de semente de A. indica, de P. glabra e suas misturas 1:1 Bisen et al. (2011), com duas imersões das teleóginas, obtiveram 100% de mortalidade com OE de P. glabra e com uma ou duas imersões a ovipostura das fêmeas tratadas com OE de P. glabra foi significativamente menor que nas tratadas com OE de A. indica e suas misturas. Óleo de nim comercial na concentração de 40% matou 55% das larvas e teve efeito acaricida de 46% nas teleóginas (GARCIA et al., 2012). O gênero Citronella é outro grupo de plantas que tem se destacado com OEs avaliados para o controle de insetos. O óleo de folhas frescas ou parcialmente dessecadas, já é muito usado como repelente e inseticida. Essa propriedade é atribuída à presença de substâncias voláteis em suas folhas, como citronelal, eugenol, geraniol e limoneno, entre outras, denominadas de um modo geral como monoterpenos (SHASANY et al., 2000). Tratamento com OE de Cymbopogum winteranus apresentou LC50 de 6,1 e 4,1% em fêmeas ingurgitadas e larvas, respectivamente, e não houve eclosão de larvas na concentração de 7,14%. Citronellal, geraniol e citronellol foram os três compostos principais e, quando testados isoladamente, citronellal e geraniol mostraram eficácia acaricida maior que citronellol (MARTINS, 2006). Em teleóginas, OE de C. citratus em seis concentrações de um a 100% teve efeito acaricida de 32; 64; 83; 100; 88 e 82% (SANTOS; VOGEL, 2012). Em larvas Torres et al. (2012) com OE fracionado de C. winterianus e Schinus molle, diluídos em etanol verificaram que as frações 4 e 5 de C. winterianus foram as mais ativas com LC50 de 1.20 e 1.34 micro L/mL, respectivamente, enquanto que a LC50 do óleo total foi 3.30 micro L/mL. Diferentemente do encontrado por Martins (2006), quando verificaram maior atividade acaricida do citronellal e geraniol em relação à citronellol, nesse estudo a fração contendo menor concentração de citronellal foi a mais ativa, o que pode ter ocorrido pela alta quantidade de geraniol nessa fração. A maior ação da fração cinco foi atribuída à maior concentração de geraniol e de terpenos, os quais devido ao peso molecular mais elevado podem permanecer mais tempo em contato com as larvas. A fração 3, a menos volátil do OE de S. molle foi a mais ativa com LC50 de 8.80 micro L/mL, indicando que o tempo de contato também influenciou no efeito tóxico. Olivo et al. (2008) testaram OE de folhas frescas de C. nardus em teleóginas que foram submetidas a três imersões com intervalo de 24 horas usando-se concentrações de 0,1; 0,25; 0,5; 1,0; 10, 25; 50; e 100%. A eficácia acaricida observada foi de 0,7; 2,8; 51,6; 79,3; 81,0; 87,1; 86,7; 89,5%, respectivamente. Os compostos predominantes foram citronelal, citronelol e geraniol com 50,07; 7,93 e 13,87%, respectivamente. OEs de semente de Carapa guianensis e de folhas de C. martinii e C. schoenanthus, foram caracterizados pelo ácido oleico (46.8%) como o composto principal em C. guianensis e, geraniol em C. martinii (81.4%) e C. schoenanthus (62.5%). Em teleóginas C. martinii mostrou a melhor eficácia com LC90 de 6.66%. Nas larvas a LC90 para C. martinii e C. schoenanthus foi 0.57% e 0.96%, respectivamente. Os autores inferiram que a maior proporção de gereniol em C. martinii explicou a maior atividade em relação a C. shoenanthus (CHAGAS et al., 2012).

123 Capítulo 8 Potencial acaricida de plantas como componente de sistema integrado para o controle de Rhipicephallus (Boophilus) microplus 123 Bovinos mantidos em pastagem e tratados 20 dias pós-infestação experimental com 40 ml de OE de C. winterianus puro pour on ou com 2 litros por aspersão com OE na concentração de 10% em álcool 95% estavam significativamente menos parasitados do que os animais controles nos dias 22, 24, 26 e 28 pós-infestação. O acompanhamento dos animais por provas bioquímicas também não mostrou alterações no sangue e no fígado dos animais (MARTINS; GONZÁLEZ, 2007). Outro grupo de plantas com resultados promissores pertence à família Pepiraceae. Brown et al. (1998) avaliaram a eficácia de OEs de frutos, casca, folhas e galhos de Pimenta dioica em fêmeas ingurgitadas comparando com eugenol e iso-eugenol. O óleo do fruto foi o mais efetivo na mortalidade (100% com 3 mg/g) e na inibição da ovipostura (100% com 3 mg/g da teleógina). Inferiram que a atividade poderia ser atribuída ao eugenol, um fenilpropanoide que representou 65% do óleo total. A mortalidade de larvas em eugenol puro diluído em diferentes solventes, em várias diluições foi acima de 95% a partir da concentração de 5.0 µl/ml (MONTEIRO et al., 2012). OEs de P. dioica e Cuminum cyminum nas concentrações decrescentes de 20 a 1,25% mataram 100% das larvas em todas as concentrações, exceto OE de P. dioica na concentração de 1,25% e OE de Ocimum basilicum que não mostraram efeito tóxico. Os compostos predominantes foram: P. dioica - methyl eugenol (62.7%) e eugenol (8.3%); C. cyminum - cuminaldehyde (22.03%), γ-terpinene (15.69%), 2-caren-10-al (12.89%), linalool (30.61%) e estragole (20.04%) (MARTINEZ; VE- LASQUEZ et al., 2011). OE de Piper aduncum, coletada na Amazônia, rica em dillapiole (94.84%), acrescida de quantidades menores de sesquiterpenos, matou 100% das larvas na concentração de 0,1 mg/ml (SILVA et al., 2009). Ribeiro et al. (2010) testaram o OE de Hesperozygis ringens constituído principalmente por pulegone (86%) em teleóginas e larvas. Na dose de 50 e 25 microl/ml inibiu a ovipostura e a eclosão em 30 e 95%, respectivamente. Nas larvas a LC99.9 foi micro L/mL. Pulegone isolado e testado separadamente mostrou efeito similar nas fêmeas e nas larvas. Ensaio em larvas com OE da parte aérea de três espécies de Piper (Piper amalago, P. mikanianum e P. xylosteoides) mostrou que somente P. mikanianum e P. xylosteoides, tendo fenilpropanoides como componentes principais (67.9% e 48.5%, respectivamente), demonstraram eficácia de controle, enquanto que P. amalago, rico em monoterpeno e sesquiterpeno (84.9%), foi inativo (FERRAZ et al., 2010). APEL et al. (2009) testaram o OE de partes aéreas de cinco espécies de Cunila em larvas nas concentrações de 2,5; 5 e 10 µl/ml e observaram que C. angustifolia rica em sabinene e C. incana rica em α-pinene e β-pinene causaram 100% de mortalidade das larvas na concentração mais baixa e C. spicata na concentração de 5 µl/ ml. C. microcephala tendo menthofuran como componente principal e C. incisa, 1,8-cineole mostraram efeito acaricida baixo. Diversas outras espécies pertencentes a várias famílias têm tido o OE investigado como acaricida em R. microplus. Martinez et al. (2011) com OEs de Lippia graveolens e Allium sativum, nas concentrações de 20% a 1,25%, observaram mortalidade de 90 a 100% em todas as concentrações. OE de Rosmarinus officinalis foi menos eficaz, com ausência de mortalidade nas concentrações mais baixas. Thymol (24,59%), carvacrol (24,54%), p-cymene (13,6%) e gamma-terpinene (7,43%)

124 124 Capítulo 8 Potencial acaricida de plantas como componente de sistema integrado para o controle de Rhipicephallus (Boophilus) microplus foram os principais compostos identificados em L. graveolens e d diallyl trisulfide (33,57%), diallyl disulfide (30,93%) e methyl allyl trisulfide (11,28%) em OE de A. sativum, enquanto que no OE de R. officinalis predominaram os compostos alpha- -pinene (31.07%), verbenone (15,26%), e 1,8-cineol (14,2%). Lage et al. (2013) testaram OE das partes aéreas de Lippia triplinervis composto principalmente por carvacrol (31,9%), thymol (30,6%), e p-cymene (12,3%), nas concentrações de 2,5, 5, e 20 mg/ml em larvas, e de 10, 20, 30, 40 e 50 mg/ml em fêmeas ingurgitadas. A mortalidade de larvas foi maior do que 95% em todas as concentrações. Nas fêmeas houve declínio na massa de ovos, no índice de produção de ovos e na taxa de eclosão, iniciando nas concentrações de 30, 40 e 20 mg/ml, respectivamente. Também em larvas e teleóginas, OE de L. sidoides, composto por 67,7% de thymol, nas concentrações de 2,5, 5, 10, 15 e 20 micro L/ml, a mortalidade de larvas foi acima de 95% a partir da concentração de 10 micro L/ml, e nas fêmeas ingurgitadas houve redução significativa na ovipostura a partir de 40 micro L/ml (GOMES et al., 2012). Limonene, óxido de limonene e oito derivados sintéticos testados isoladamente nas concentrações de 10 a 2,5 micro g/ml foram altamente letais para larvas (FERRARINI et al., 2008). Citronelall, principal componente em Eucalyptus citriodora e 1,8-cineole em E. globosus, e vários componentes agindo sinergicamente em E. staigeriana foram considerados como os constituintes responsáveis pela ação acaricida observada em larvas e teleóginas. O OE de E. citriodora matou 100% dos carrapatos a uma concentração média de 17,5%, o de E. globulus a 15% e o de E. staigeriana a 12,5% (CHAGAS et al., 2002). Concentrações de 0,5; 1; 2; 5; 10; 20; 50 e 100% de OE de Corymbia citriodora em fêmeas ingurgitadas teve efeito acaricida de 0; 30,5; 75,5; 91; 100; 100; 100; 100 e 100%, respectivamente. Em vacas em lactação naturalmente infestadas o efeito acaricidada foi de 96,4% com um tratamento na concentração de 3,5%. No leite e iogurte não houve efeito nas variáveis físico-químicas e sensoriais (OLIVO et al., 2013). Com aplicações de óleo comercial a 4% de C. nardus ou amitraz, em vacas em lactação, quando as infestações eram superiores a 10 teleóginas, Agnolin et al. (2010) obtiveram uma eficácia de 30,9% na redução das infestações, enquanto que a eficácia de Amitraz a 0,025% foi de 71,8%. No período de 28 dias a relação entre o número de aplicações foi de 1:2,5 para o amitraz e o óleo de citronela, respectivamente Os valores da análise cromatográfica apresentaram como componentes ativos mais importantes o citronelal, o geraniol e o citronelol, correspondendo a 50,07; 13,87; 7,93%, respectivamente. Depositado no dorso de teleóginas, OE de Hyptis verticillata nas doses de 1 a 4 µl/g mostrou efeito dose dependente na mortalidade, na inibição da ovipostura e na taxa de eclosão. Os sesquiterpenoids (30,7%) foram os constituintes mais abundantes (FACEY, 2005). OE de partes aéreas de H. crenata caracterizado por borneol (17,8%), 1,8-cineol (15,6%) e p-cimene (7,9%), na concentração de 2,5%, inibiu em 94,4% a ovipostura (VIOLANTE et al., 2012). Foi observada completa inibição da ovipostura ao utilizar-se concentração de 10%, e 100% de mortalidade de larvas na dose de 6,25 micro L/mL, com OE de Drimys brasiliensis caracterizado por sesquiterpenoids (66%) (RIBEIRO et al., 2008).

125 Capítulo 8 Potencial acaricida de plantas como componente de sistema integrado para o controle de Rhipicephallus (Boophilus) microplus 125 Ensaio de mortalidade de larvas com OE de Calea serrata e precocene II, um benzopyran presente no extrato dessa planta e com efeito inseticida conhecido, mostrou uma LC99 de 3,94 micro L/mL para o óleo total contendo precocene II e sesquiterpenos, e de 4,25 mg/ml para o precoce II isolado indicando sinergismo entre os componentes do OE e o precocene II (RIBEIRO et al., 2011). Gazim et al. (2011) identificaram 31 compostos em OE de folhas de Tetradenia riparia, com predominância dos sesquiterpenes: 14-hydroxy-9-epi-cariophyllene (18,03%), cis-muurolol-5-en-4-α-ol (11,73%), ledol (7,18%), e α-cadinol (4,90%); seguido pelos monoterpenos: limonene (3,69%) e fenchone (12,87%). Testaran 8 concentrações variando de 12,50% a 0,056% w/v e observaram amplitude na mortalidade de 100% a 2,05%; no número total de ovos produzidos de 0 a 90,2; na taxa de eclosão de 0 a 70,3% e na eficácia de 100 a 2,89%. Nas larvas, em 13 concentrações variando de 100%, a 0,014% w/v a mortalidade variou de 100 a 10,6% e foi dose dependente. Na concentração de 20%; 10%; 5%; 2,5% e 1,25% em teleóginas, e de 20%, 10%; 5%; 2,5%; 1,25 e 0,75% em larvas, OE de semente de Carapa guianensis mostrou CL50 de 4,332 e CL50 de 5,228; respectivamente, para a ovipostura e para a mortalidade de larvas. A menor concentração em que se observou eficácia máxima do óleo da semente de C. guianensis foi de 10% (FARIAS et al., 2012). OE de folhas e caule de Tagetes minuta nas concentrações de 2,5 a 40% com predominância de monoterpeno dihydratogetone (54%) mostrou efeito acaricida nas teleóginas de 22% a 100% e mortalidade de 26% a 100% das larvas. OEs da resina e da madeira de cinco espécies de coniferas (Araucaria columnaris, Agathis moorei, A. ovata, Callitris sulcata, e Neocallitropsis pancheri) mostraram efeitos diferentes em larvas. O OE da madeira de C. sulcata e A. columnaris foram os mais ativos com LC50 de 0,65%; 0,55% e 1,62%, respectivamente. O OE da resina de A. columnaris foi caracterizado por níveis altos de sesquiterpenos principalmente por aromadendrene (23,1%) e bicyclogermacrene (16,0%) (LEBOUVIER et al., 2013). Santos et al. (2012) com OE de Syzygium aromaticum na concentração de 2,5% e 5% conseguiram, respectivamente, uma eficácia de 97,1% e 99,4% em teleóginas ingurgitadas. ExTRaTOS Nos últimos anos muitos trabalhos têm sido publicados sobre o efeito acaricida de extratos e suas frações e, em menor número, trabalhos com os componentes isolados. O Brasil é o país que mais tem publicado sobre o tema refletindo a importância do carrapato-do-boi no sistema produtivo nacional; o potencial da nossa diversidade botânica; a emergência crescente da resistência, e os efeitos colaterais dos acaricidas sintéticos. Somente com OEs de A.indica o efeito acaricida em R. microplus foi avaliado em mais de duas dezenas de trabalhos, tendo alguns destes estudos sido feitos in vivo. Assim, como com os OEs, os extratos de A. indica, de Cymbopogom spp. e de Piperáceas têm sido os mais estudados. Extrato etanólico de sementes de A. indica na concentração de 8% em animais experimentalmente infestados promoveu a morte de 92% das teleóginas três dias

126 126 Capítulo 8 Potencial acaricida de plantas como componente de sistema integrado para o controle de Rhipicephallus (Boophilus) microplus pós-tratamento, e nas teleóginas sobreviventes o efeito acaricida foi de 80%, comparável aos resultados obtidos sobre teleóginas em animais tratados com cypermethrin (SRIVASTAVA et al., 2008). Valente et al. (2007) após tratar dois grupos de bovinos naturalmente infestados, sendo um tratado semanalmente durante um mês com extrato aquoso de A. indica, e outro tratado apenas uma vez com abamectina pour on, não observaram diferença nas infestações e concluiram que o extrato aquoso é barato, fácil de preparar e poderia substituir o acaricida sintético. Giglioti et al. (2011) trabalharam com extratos de sementes de A. indica com quantidade conhecida de azadirachitin 2000, 5000, 9000 e ppm diluída em concentrações de 1,25% a 12,8%. Ao submeterem fêmeas ingurgitadas às diferentes diluições observaram que o principal efeito foi sobre os parâmetros reprodutivos, diminuindo os índices de reprodução, principalmente nas concentrações mais elevadas. O efeito acaricida foi maior na solução com ppm, mas não houve mortalidade nas larvas. Extrato oleoso, hexânico, de frutos de Melia azadirachta nas concentrações de 0,25 a 0,0156% teve eficácia acaricida de 100% a 3,6% nas fêmeas ingurgitadas e 100% de mortalidade das larvas nas concentrações maiores (SOUSA et al., 2008). Bezerros experimentalmente infestados e banhados com solução a 0,25% de extrato oleoso hexânico, de M. azadirachta tiveram carga parasitária significativamente menor, mas a ovipostura e a taxa de eclosão não foram afetadas pelo tratamento (BORGES et al., 2005). Testes in vitro com extratos hexânicos de frutos de M. azadirachta resultaram na morte de 100% das larvas e inibição em 100% da ovipostura em fêmeas ingurgitadas (BORGES et al. 2003). Santos et al. (2012) com extratos de folhas frescas de A. indica, em água, a 10% e 50%, e etanol a 10 e 50%, obtiveram em fêmeas ingurgitadas eficácia de 15,4%; 20,0% e 52,9% e 74,3 %, respectivamente. Heimerdinger et al. (2006) trataram bovinos naturalmente infestados com Amitraz e extrato etanólico de C. citratus nas concentrações de 1,36% e 2,72% (150 e 300 gramas da planta total fresca em 11 litros de água). As contagens de teleóginas nos dias 1 a 7 e 14 mostrou redução zero do parasito submetido à diluição de 1,36% e redução de 46% na diluição 2,72%. O Amitraz teve efeito superior a 97%. Trabalhando com formulações com diferentes concentrações de tinturas de C. nardus, Chenopodium ambrosoides e Quassia amara, em teleóginas, Santos et al. (2013) verificaram que aproximadamente 84% das formulações apresentaram eficiência acaricida acima de 95%. A formulação de tintura com C. nardus na concentração de 5% ou mais, independente da concentração das tinturas de C. ambrosoides e Q. amara, mostrou os melhores resultados e a 10% teve eficiência de 100%. Formulações isoladas ou combinadas de extrato de Melia azadirachta a 0,25% e 0,50%, e o fungo Beauveria bassiana conídeos foram aspergidas em animais experimentalmente infestados. As associações dos dois agentes foram mais eficientes que os compostos isolados indicando compatibilidade ou sinergismo entre M. azadirachta e B. bassiana (SOUSA et al., 2011). Outro exemplo do potencial de uso de produtos naturais no controle do R. microplus são os resultados obtidos por Romo-Martinez et al. (2013) quando testaram

127 Capítulo 8 Potencial acaricida de plantas como componente de sistema integrado para o controle de Rhipicephallus (Boophilus) microplus 127 em animais experimentalmente infestados a ação isolada ou conjunta de Metarhizium anisopliae, Bacillus thuringiensis e extrato de Solanum verbascifolium em banhos de aspersão. A percentagem de controle obtida foi acima de 98% sendo similar ao controle obtido com um produto comercial à base de amitraz. As anonáceas, grupo de plantas ricas em acetogeninas, moléculas com atividade antitumoral e pesticida conhecidas, também têm sido avaliadas como acaricida em R. microplus. Com espécies desse grupo Catto et al. (2009) testaram extratos etanólicos de 3 espécies que ocorrem na região do Pantanal sobre fêmeas ingurgitadas. Extratos do lenho da raiz e da casca da raiz de Annona dioica, da raiz e da casca do caule de Simarouba versicolor, da raiz de Annona cornifolia e de Duguetia furfuracea tiveram atividade acaricida entre 50% e 100% e resposta dose-dependente. Extratos de Dimorphandra mollis, Magonia pubescens, Protium heptaphyllum, Hyptis crenata, Sebastiana hispida, Aspidosperma australe, Senna occidentalis e de Elyonurus muticus mostraram atividade acaricida baixa ou ausente (0% a 10%). Magadum et al. (2009) com extrato de sementes de Annona squamosa observaram 70,8% de mortalidade em teleóginas in vitro no intervalo de 24 horas. In vivo, contudo, o extrato de A. indica foi mais eficaz (47,1%) que o extrato de A. squamosa (31,2%). Boglio-Michelette et al. (2009) compararam, em fêmeas ingurgitadas, a eficácia acaricida de extratos etanólicos a 2% obtidos de folhas de C. citratus e A. indica, de sementes de A. indica e A. muricata e flores de Syzygium malaccensis. O extrato de sementes de A. muricata mostrou 100% de eficiência, com 100% na redução da eclosão, seguido dos extratos de flor de S. malaccensis (57,2%), de sementes de A. indica (38,5%), e de folha de A. indica (2,25%). Kalakumar et al. (2000) em bovinos naturalmente infestados e tratados com OE de sementes de A. squamosa observaram 100% de eficácia inibindo completamente a ovipostura. Madhumitha et al. (2012) observaram mortalidade de 100%; 92%; 68%; 45% e 33% em larvas com extrato aquoso de fruto de A. squamosa nas concentrações de 2000, 1500, 1000, 500 e 250 ppm. Constata-se, portanto, que já existem muitas informações sobre a ação acaricida in vitro de OEs e extratos de plantas sobre larvas e teleóginas de R. microplus com compostos ativos identificados. In vivo, em animais experimentalmente ou naturalmente parasitados, alguns dos OEs testados têm origem em plantas que já são cultivadas para a indústria farmacêutica, de cosméticos, e de alimentos, como espécies dos gêneros Cymbopogom, Eucalyptus e Piper. Portanto, não haveria necessidade de construir novos sistemas de produção dessas plantas para a obtenção dos OEs. As informações existentes já permitem testar in vitro e in vivo formulações desses OEs e extratos para uso isolado ou em misturas com os principais compostos ativos quantificados. Uma das características dos compostos orgânicos naturais é a persistência limitada nas condições de campo. Temperatura, luz ultravioleta, PH, chuvas e outros fatores ambientais podem influenciar negativamente nos princípios ativos. Assim, formulações com aditivos que prolonguem sua ação e aumentem o contato com o parasita poderiam aumentar a ação acaricida. Formulações acaricidas com essas características e que atendam os demais requisitos da legislação para seu registro poderiam ter ampla aceitação, especialmente nos sistemas produtivos de leite orgânico e nas propriedades que já convivem com a resistência do parasita a várias classes de acaricidas sintéticos.

128 128 Capítulo 8 Potencial acaricida de plantas como componente de sistema integrado para o controle de Rhipicephallus (Boophilus) microplus Se por um lado é curto o efeito dos OEs e extratos dos inseticidas naturais e, possivelmente, não provoquem mortalidade imediata como os sintéticos, por outro lado podem reduzir substancialmente a fecundidade, diminuindo, também, gradualmente a infestação do ambiente pelas larvas e a carga parasitária nos bovinos. A vida residual relativamente curta dos princípios ativos fitoterápicos pode ser considerada uma desvantagem do ponto de vista puramente econômico, mas não do ponto de vista ecológico e como ferramenta útil na luta para a inibição da emergência da resistência (SCHMUTTER, 1990). Pesticidas baseados em OEs e extratos de plantas, ou seus constituintes, têm demonstrado eficácia contra pragas de cereais estocados, pragas domésticas, parasitas hematófagos, fungos, etc. Eles podem ser aplicados na forma de fumigação, formulação granular ou aspersão apresentando efeito letal, ou de repelência, ou de deterrência sobre os índices reprodutivos (KOUL et al., 2008). A limitação de vida média relativamente curta de fitoterápicos, quando comparada com os pesticidas sintéticos, pode requerer concentração mais elevada do produto ativo e aplicações mais frequentes quando utilizados no ambiente. As necessidades visando à aplicação comercial destes pesticidas incluem disponibilidade de quantidade suficiente, pradonização e aprovação de regulamentos. Pelo fato de sua natureza volátil, há um risco muito menor dos OEs para o meio ambiente. Além disso, a probabilidade de emergência de resistência seria menor devido à mistura complexa de seus constituintes. Assim, a regulamentação do uso desses compostos deveria ser ajustada, como, por exemplo, à exigência de eficiência maior que 95% obrigatória para registro dos produtos sintéticos. Decifrar a presença de efeito sinérgico, aditivo ou supressivo dos componentes dos OEs e extratos será importante para a regulamentação e registro desses compostos. Isso é de fundamental importância porque em muitos dos estudos realizados os compostos ativos isolados foram menos ativos do que os extratos ou OEs dos quais foram isolados. A fitoterapia tem se mostrado como uma alternativa promissora e viável aos produtos sintéticos em uso devido à grande variabilidade de espécies vegetais existentes, do baixo custo para a sua obtenção e fácil disponibilidade natural em certas regiões (AGNOLIN et al., 2010). Nos países tropicais e em desenvolvimento com maior diversidade botânica há uma maior probabilidade de estes acaricidas serem utilizados como um dos componentes em sistemas integrados de controle do R. microplus. REFER ÊNCIAS AGNOLIN, C. A.; OLIVO, C. J.; LEAL, M. L. R.; BECK, R. C. R.; MEINERZ, G. R.; PARRA, C. L. C.; MACHADO, P. R.; FOLETTO, V.; BEM, C. M.; NICOLODI, P. R. S. J. Eficácia do óleo de citronela [Cymbopogon nardus (L.) Rendle] no controle de ectoparasitas de bovinos. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 12, n. 4, p , ANURADHA, A.; ANNADURAI, R. S. Biochemical and molecular evidence of azadirachtin binding to insect actins. Current Science, v. 95, n. 11, p , APEL, M. A.; RIBEIRO, V. L.; BORDIGNON, S. A. L.; HENRIQUES, A. T.; POSER, G. VON. Chemical composition and toxicity of the essential oils from Cunila species (Lamiaceae) on the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Parasitology Research, v. 105, n. 3, p , 2009.

129 Capítulo 8 Potencial acaricida de plantas como componente de sistema integrado para o controle de Rhipicephallus (Boophilus) microplus 129 AYCARDI, E.; BENAVIDES, E.; GARCIA, O.; MATEUS, G.; HENAO, F.; ZULUAGA, F. N. Boophilus Microplus tick burdens on grazing cattle in Colombia. Tropical Animal Health Production, v. 16, p , BARATA, L. E. S.; QUEIROZ, S. R. R. Contribuição efetiva ou potencial do PADCT para o aproveitamento econômico sustentável da biodiversidade. Campinas: [s.n.], BENAVIDES, O. E.; HERNANDEZ, M. G.; ROMERO, N. A,; CASTRO, A. H.; RODRIGUEZ, B. J. L. Preliminary evaluation of neem (Azadirachta indica) extracts as alternative for cattle tick Boophilus microplus control. Revista Colombiana de Entomologia, v. 27, p. 1-8, BISEN, S.; MANDAL, S. C.; SANYAL, P. K.; PAL, S.; GHOSH, R. C.; SINGH, M. Effect of some phytotherapeutic agents on egg production of Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Indian Journal of Animal Research, v. 45, n. 4, p , BORGES L. M. F.; FERRI, P.H.; SILVA W.C.; SILVA, W. J.; MELO, L. S.; SOUZA, L. A. D.; SOARES, F. S.; FARIA, K. A.; GOMES, N. A.; MORI, A.; SILVA, N. F. Ação do extrato hexânico de frutos maduros de Melia azedarach (Meliaceae) sobre Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) em bezerros infestados artificialmente. Revista de Patologia Tropical, v. 34, n. 1, p , BORGES, L. M. F.; FERRI, P. H.; SILVA, W. J.; SILVA, W. C. In vitro efficacy of extracts of Melia azedarach against the tick Boophilus microplus. Medical and Veterinary Entomology, v. 17, n. 2, p , BORGES, L. M. F.; SOUSA, L. A. D.; BARBOSA, C. S. Perspectives for the use of plant extracts to control the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v. 20, n. 2, p , BROGLIO-MICHELETTI, S. M. F.; NEVES-VALENTE, E. C.; SOUZA, L. A.; SILVA-DIAS, N. D. A.; GIRON-PEREZ, K.; PREDES-TRINDADE, R. C. Control of Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae) with vegetable extracts. Revista Colombiana de Entomologia, v. 35, n. 2, p , BROGLIO-MICHELETTI, S. M. F.; DIAS, N. S.; VALENTE, E. C. N.; SOUZA, L. A.; SANTOS, J. M. Extraction of neem extract and oil in the control of Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887) (Acari: Ixodidae) in laboratory. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v. 19, n. 1, p , BROWN, H. A.; MINOTT, D. A.; INGRAM, C. W.; WILLIAMS, L. A. D. Biological activities of the extracts and constituents of pimento, Pimenta dioica L. against the southern cattle tick. Insect Science and its Application, v. 18, n. 1, p. 9-16, CAMPOS, R. N. S.; BACCI, L.; ARAÚJO, A. P. A.; BLANK, A. F.; ARRIGONI-BLANK, M. F.; SANTOS, G. R. A. E; RONER, M. N. B. OEs de plantas medicinais e aromáticas no controle do carrapato Rhipicephalus microplus. Archivos de Zootecnia, v. 61, n. 1, p , CATTO, J. B.; BIANCHIN, I.; SAITO, M. L. Efeito acaricida in vitro de extratos de plantas do Pantanal no carrapato de bovinos, Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Dados Eletrônicos - Campo Grande, MS: Embrapa Gado de Corte, p. (Embrapa Gado de Corte, Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento, 26). CHAGAS, A. C. S.; BARROS, L. D.; COTINGUIBA, F.; FURLAN, M.; GIGLIOTI, R.; OLIVEI- RA, M. C. S.; BIZZO, H. R. In vitro efficacy of plant extracts and synthesized substances on Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae). Parasitology Research, v. 110, n. 1, , CHAGAS, A. C. S.; PASSOS, W. M.; PRATES, H. T.; LEITE, R. C.; FURLONG, J.; FORTES, I. C. P. Acaricide effect of Eucalyptus spp. essential oils and concentrated emulsion on Boophilus microplus. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v. 39, n. 1/6, , CHUNGSAMARNYART, N.; JANSAWAN, W. Acaricidal activity of peel oil of Citrus spp. on Boophilus microplus. Kasetsart Journal (Nat. Sci.), v. 30, p , CHUNGSAMARNYART, N.; JIWAJINDA, S. Acaricidal activity of volatile oil from lemon and citronella grasses on tropical cattle ticks. Kasetsart Journal, v. 26, p , DRUMMOND, R. O.; TREVINO, J. L; GLADNEY, W. J; GRAHAM, O. H. Boophilus annulatus and B. microplus: laboratory tests of insecticides. Journal Economic Entomology, v. 66, n. 1, p , 1973.

130 130 Capítulo 8 Potencial acaricida de plantas como componente de sistema integrado para o controle de Rhipicephallus (Boophilus) microplus FACEY, P. C.; PORTER, R. B. R.; REESE, P. B.; WILLIAMS, L. A. D. Biological activity and chemical composition of the essential oil from Jamaican Hyptis verticillata Jacq. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 53, n. 12, p , FARIAS, M. P. O.; WANDERLEY, A. G.; ALVES, L. C.; FAUSTINO, M. A. G. Calculation of CI50 (average inhibitory concentration) and CL50 (average lethal concentration) of seed oil of Carapa guianensis Aubl on Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887), Anocentor nitens (Neumann, 1897) and Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806) (Acari: Ixodidae). Arquivos do Instituto Biológico, v. 79, n. 2, p , FERNANDEZ-RUVALCABA, M.; DE-LA TORRE, F. P.; CRUZ-VAZQUEZ, C.; GARCIA- VAZQUEZ, Z. Anti-tick effects of Melinis minutiflora and Andropogon gayanus grasses on plots experimentally infested with Boophilus microplus larvae. Experimental and Applied Acarology, v. 32, p , FERRARINI, S. R.; DUARTE, M. O.; ROSA, R. G.; ROLIM, V.; EIFLER-LIMA, V. L.; POSER, G. VON; RIBEIRO, V. L. S. Acaricidal activity of limonene, limonene oxide and beta-amino alcohol derivatives on Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Veterinary Parasitology, v. 157, n. 1/2, , FERRAZ, A. B. F.; BALBINO, J. M.; ZINI, C. A.; RIBEIRO, V. L. S.; BORDIGNON, S. A. L.; POSER, G. VON. Acaricidal activity and chemical composition of the essential oil from three Piper species. Parasitology Research, v. 107, n. 1, p , FLAMINI, G. Acaricides of natural origin, personal experiences and review of literature ( ). Studies in Natural Products Chemistry, v. 28, p , GARCIA, M. V.; MATIAS, J.; BARROS, J. C.; LIMA, D. P.; LOPES, R. S. ANDREOTTI, R. Chemical identification of Tagetes minuta Linnaeus (Asteraceae) essential oil and its acaricidal effect on ticks. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v. 21, n. 4, p , GAZIM, Z. C.; DEMARCHI, I. G.; LONARDONI, M. V. C.; AMORIM, A. C. L.; HOVELL, A. M. C.; REZENDE, C. M.; FERREIRA, G. A.; LIMA, E. L.; COSMO, F. A.; CORTEZ, D. A. G. Acaricidal activity of the essential oil from Tetradenia riparia (Lamiaceae) on the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari; Ixodidae). Experimental Parasitology, v. 129, n. 2, p , GIGLIOTI, R.; FORIM, M. R,; OLIVEIRA, H. N.; CHAGAS, A. C,; FERREZINI, J.; BRITO, L. G.; FALCOSKI, T. O.; ALBUQUERQUE, L. G.; OLIVEIRA, M. C. In vitro acaricidal activity of neem (Azadirachta indica) seed extracts with known azadirachtin concentrations against Rhipicephalus microplus. Veterinary Parasitology, v. 181, n. 2-4, p , GOBBO-NETO, L.; LOPES, N. Plantas medicinais: fatores de influência no conteúdo de metabólitos secundários. Química Nova, v. 30, n. 2, p , GOMES, G. A.; MONTEIRO, C. M. O.; SENRA, T. O. S.; ZERINGOTA, V.; CALMON, F.; MA- TOS, R. S.; DAEMON, E.; GOIS, R. W. S.; SANTIAGO, G. M. P.; CARVALHO, M. G. Chemical composition and acaricidal activity of essential oil from Lippia sidoides and larvae and engorged females of Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae). Parasitology Research, v. 111, n. 6, p , HEIMERDINGER, A.; OLIVO, C.; MOLENTO, M. B.; AGNOLIN, C. A.; ZIECH, M. F.; SCAR- AVELLI, L. F.; SKONIESKI, F. R.; BOTH, J. F.; CHARÃO, P. S. Alcoholic extract of lemongrass (Cymbopogon citratus) on the control of Boophilus microplus in cattle. Revista Brasileira de Medicina Veterinária, v.15, n. 1, p , HOSTETTMANN, K.; QUEIROZ, E. F.; VIEIRA, P. C. Princípios ativos de plantas superiores. São Carlos: EDUFSCAR, p. KALAKUMAR, B.; KUMAR, H. S. A.; KUMAR, B. A.; REDDY, K. S. Evaluation of custard seed oil and neem oil as acaricides. Journal of Veterinary Parasitology, v. 14, n. 2, p , KAYAA, G. P. The potential for antitick plants as components of an integrated tick control strategy. Annals of the New York Academy of Sciences, v. 916, p , KOUL, O.; WALIA, S.; DHALIWAL, G. S. Essential oils as green pesticides: potential and constraints. Biopesticides International, v. 4, n. 1, p , KUMAR R.; CHAUHAN, P. P. S.; AGRAWAL, R. D.; SHANKAR, D. Efficacy of herbal ectoparasiticide AV/EPP/14 against lice and tick infestation on buffalo and cattle. Journal of Veterinary Parasitology, v. 14, n. 1, p , 2000.

131 Capítulo 8 Potencial acaricida de plantas como componente de sistema integrado para o controle de Rhipicephallus (Boophilus) microplus 131 LAGE, T. C.; MONTANARI, R. M.; FERNANDES, S. A.; MONTEIRO, C. M. O.; SENRA, T. O. S.; ZERINGOTA, V.; CALMON, F.; MATOS, R. S.; DAEMON, E. Activity of essential oil of Lippia triplinervis Gardner (Verbenaceae) on Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae). Parasitology Research, v. 112, n. 2, p , LEBOUVIER, N.; HUE, T.; HNAWIA, E.; LESAFFRE, L.; MENUT, C.; NOUR, M. Acaricidal activity of essential oils from five endemic conifers of New Caledonia on the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Parasitology Research, v. 112, n. 4, p , MADHUMITHA, G.; RAJAKUMA G.; ROOPAN, S. M.; RAHUMAN, A. A.; PRIYA, K. M.; SARAL, A. M.; KHAN, F. R. N.; KHANNA, V. G.; VELAYUTHAM, K.; JAYASEELAN, C.; KAMARAJ, C.; ELANG, G. Acaricidal, insecticidal, and larvicidal efficacy of fruit peel aqueous extract of Annona squamosa and its compounds against blood-feeding parasites. Parasitology Research, v. 111, p , MAGADUM, S; MONDAL, D. B.; GHOSH, S. Comparative efficacy of Annona squamosa and Azadirachta indica extracts against Boophilus microplus Izatnagar isolate. Parasitology Research, v.105, n. 4, p , BROGLIO-MICHELETTI, S. M. F.; NEVES-VALENTE, E. C.; SOUZA, L. A.; SILVA-DIAS, N.; GIRON-PEREZ, K.; PREDES-TRINDADE, R. C. Control of Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae) with vegetable extracts. Revista Colombiana de Entomologia, v. 35, n. 2, p , VELAZQUEZ, M. M.; HERRERA, G. A. C.; CRUZ, R. R.; FERNANDEZ, J. M. F.; RAMIREZ, J. L.; GUTIERREZ, R. H.; CERVANTES, E. C. L. Acaricidal effect and chemical composition of essential oils extracted from Cuminum cyminum, Pimenta dioica and Ocimum basilicum against the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae). Parasitology Research, v. 108, n. 2, p , VELAZQUEZ, M. M.; CRUZ, R. R.; HERRERA, G. C.; FERNANDEZ, J. M. F.; ALVAREZ, A. H.; LUGO-CERVANTES, E. Acaricidal effect of essential oils from Lippia graveolens (Lamiales: Verbenaceae), Rosmarinus officinalis (Lamiales: Lamiaceae), and Allium sativum (Liliales: Liliaceae) against Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology, v. 48, n. 4, p , MARTINS, R. M. In vitro study of the acaricidal activity of the essential oil from the Citronella of Java (Cymbopogon winterianus Jowitt) to the tick Rhipicephalus microplus. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 8, n. 2, 71-78, MARTINS, R. M.; GONZALEZ, F. H. D. The use of oil of citronella from Cymbopogon winterianus Jowitt (Panicoidideae) as an acaricide against Rhipicephalus microplus Canestrini (Ixodidae). Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 9, n. 4, p. 1-8, MONTEIRO, C. M.; MATURANO, R.; DAEMON, E.; CATUNDA-JUNIOR, F. E. A.; CALM- ON, F.; SENRA, T. S.; FAZA, A.; CARVALHO, M. G. Acaricidal activity of eugenol on Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae) and Dermacentor nitens (Acari: Ixodidae) larvae. Parasitology Research, v. 111, n. 3, p , OLIVO, C. J.; AGNOLIN, C. A.; PARRA, C. L. C.; VOGEL, F. S. F.; RICHARDS, N. S. P.S.; PEL- LEGRINI, L. G.; WEBE, A.; PIVOTO, F.; ARAUJO, L. Efeito do óleo de eucalipto (Corymbia citriodora) no controle do carrapato bovino. Ciência Rural, v. 43, n. 2, p , OLIVO, C. J.; CARVALHO, N. M.; SILVA, J. H. S.; VOGEL, F. F; MASSARIOL, P.; MEINERZ, G.; AGNOLIN, C.; MOREL, A.F.; VIAU, L.V. Citronella oil on the control of catle ticks. Ciência Rural, v. 38, n. 2, p , PANELLA, N. Recent developments in plant-derived compounds for pest management. Disponível: < htm em GenCatEcology/ / htm>. Acesso em: PRATES, H. T.; LEITE, R. C.; CRAVEIRO, A. A.; OLIVEIARA, A. B. Identification of some chemical components of the essential oil from molasses grass (Melinis minutiflora beauv.) and their activity against cattle-tick Boophilus microplus. Journal Brazilian Chemical Society, v. 9, n 2, p , 1998.

132 132 Capítulo 8 Potencial acaricida de plantas como componente de sistema integrado para o controle de Rhipicephallus (Boophilus) microplus PRATES, H. T.; OLIVEIRA, A. B.; LEITE, R. C.; CRAVEIRO, A. A. Anti-tick activity and chemical composition of Melinis minutiflora essential oil. Pesquisa Agropecuaria Brasileira, v. 28, n. 5, p , RIBEIRO, V. L. S.; ROLIM, V.; BORDIGNON, S.; HENRIQUES, A. T.; DORNELES, G. G.; LIM- BERGER, R. P.; POSER, G. VON. Chemical composition and larvicidal properties of the essential oils from Drimys brasiliensis Miers (Winteraceae) on the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus and the brown dog tick Rhipicephalus sanguineus. Parasitology Research, v. 102, n. 3, p , RIBEIRO, V. L. S.; SANTOS, J. C.; BORDIGNON, S. A. L.; APEL, M. A.; HENRIQUES, A. T.; POSER, G. L. V. Acaricidal properties of the essential oil from Hesperozygis ringens (Lamiaceae) on the cattle tick Riphicephalus (Boophilus) microplus. Bioresource Technology, v. 101, n. 7, p , RIBEIRO, V. L. S.; SANTOS, J. C.; MARTINS, J. R.; SCHRIPSEMA, J.; SIQUEIRA, I. R.; POSER, G. L. V.; APEL, M. A. Acaricidal properties of the essential oil and precocene II obtained from Calea serrata (Asteraceae) on the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae). Veterinary Parasitology, v. 179, n. 1/3, p , MARTÍNEZ, M. R.; RUVALCABA, V. M. F.; VELÁZQUEZ, G. H.; CHORA, L. P. P.; GARCÍA, J. L. Evaluation of natural origin products for the control of Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae) on cattle artificially infested. Basic Research Journal of Agricultural Science and Review, v. 2, n. 3, p , SANTOS, A. V.; OLIVEIRA, R. A.; ALBUQUERQUE, G. R. The in vitro effect of neem extract (Azadirachta indica) and clove essential oil (Syzygium aromaticum) in the Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Revista Brasileira de Medicina Veterinaria, v. 34, n. 2, p , SANTOS, F. C. C.; VOGEL, F. S. F.; ROLL, V. F. B.; MONTEIRO, S. G. In vitro effect of the association of citronella, Santa Maria herb (Chenopodium ambrosioides) and quassia tincture on cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Ciência Animal Brasileira, v. 14, n. 1, p , SANTOS, F. C. C.; VOGEL, F. S. F. In vitro evaluation of the action of lemon grass (Cymbopogon citratus) essential oil on the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 14, n. 4, p , SCHMUTTERER, H. Properties and potential of natural pesticides from the neem tree, Azadirachta indica. Annual Review of Entomology, v. 35, p , SHASANY, A. K.; LAU, L. K.; PATRA, N. K.; DAROKAR, M. P.; GARG, A.; KUMAR, S.; KHA- NUJA, S. P. S. Phenotypic and RAPD diversity among Cymbopogon Winterianus Jowitt accessions in relation to Cymbopogon nardus Rendle. Genetic Resources and Crop Evolution, v. 47, n. 5, p , SHRIVASTAVA, S. K. K. Effectiveness of some plant extracts on tick OE (Canestrini) infestation in cattle. Journal of Applied Zoological Researches, v. 14, n. 2, p , SILVA, W. C.; MARTINS, J. R. S.; SOUZA, H. E. M.; HEINZEN, H.; CESIO, M. V.; MATO, M.; ALBRECHT, F.; AZEVEDO, J. L.; BARROS, N. M. Toxicity of Piper aduncum L. (Piperales: Piperaceae) from the Amazon forest for the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae). Veterinary Parasitology, v. 164, n. 2/4, p , SOUSA, L. A. D.; PIRES JÚNIOR, H. B.; SOARES, S. F.; FERRI, P. R.; RIBAS, P.; LIMA, L. M.; FURLONG, J.; BITTENCOURT, V. R. E. P.; PERINOTTO, W. M. S.; BORGES, L. M. F.; PIN- HEIRO, V. R. E. Potential synergistic effect of Melia azedarach fruit extract and Beauveria bassiana in the control of Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae) in cattle infestations. Veterinary Parasitology, v. 175, n. 3-4, p , SOUSA, L. A. D.; SOARES, S. F.; PIRES JÚNIOR, H. B.; FERRI, P. H.; BORGES, L. M. F. Avaliação da eficácia de extratos oleosos de frutos verdes e maduros de cinamomo (Melia azedarach) sobre Rhipicephalus (Boophilus) microplus (ACARI: IXODIDAE. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v. 17, n. 1, p , SRIVASTAVA, R.; GHOSH, S.; MANDAL, D. B.; ZHAHIANAMBI, P.; SINGHAL, P. S.; PAN- DEY, N. N.; SWARUP, D. Efficacy of Azadirachta indica extracts against Rhipicephalus (Boophilus ) microplus. Parasitology Research, v. 104, n. 1, p , THOMPSON, K. C.; RAO, J.; ROMERO, T. Anti-tick grasses as the basis for developing practical tropical tick control packages. Tropical Animal Health and Production, v. 10, p , 1978.

133 Capítulo 8 Potencial acaricida de plantas como componente de sistema integrado para o controle de Rhipicephallus (Boophilus) microplus 133 TORRES, F. C.; LUCAS, A. M.; RIBEIRO, V. L. S.; MARTINS, J. R.; POSER, G.; GUALA, M. S.; ELDER, H. V.; CASSEL, E. Influence of essential oil fractionation by vacuum distillation on acaricidal activity against the cattle tick. Brazilian Archives of Biology and Technology, v. 55, n. 4, p , VALENTE, M.; BARRANCO, A.; SELLAIVE-VILLAROEL, A. B. Effectiveness of Azadiracta indica aqueous extract on the control of bovine ticks Boophilus microplus. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaria e Zootecnia, v. 59, n. 5, p , VIEGAS JUNIOR, C. Terpenos com atividade inseticida: uma alternativa para o controle químico de insetos. Química Nova, São Paulo, v. 26, n. 3, p , VIOLANTE, I. M. P.; GARCEZ, W. S.; BARBOSA, C. S.; GARCEZ, F. R. Chemical composition and biological activities of essential oil from Hyptis crenata growing in the Brazilian Cerrado. Natural Product Communications, v. 7, n. 10, p , 2012.

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135 9 Controle biológico Marcos Valério Garcia Wilson Werner Koller Jaqueline Matias

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137 Capítulo 9 Controle biológico 137 CONTROLE BIOLóGICO: PREDaDORES, FUNGOS E NEMaTOIDES Denomina-se de controle biológico natural a regulação espontânea de população de animais ou vegetais por outros organismos vivos, predador, parasita ou patógeno conhecidos como inimigos naturais. Este tipo de controle não deve ser subestimado, já que populações de muitos protozoários, artrópodes e helmintos parasitos podem apresentar crescimento descontrolado na ausência de seus respectivos antagonistas naturais (GRONVOLD, 1996). Com base neste comportamento natural, surgiu o conceito de controle biológico, agora com a intervenção humana, para controlar e/ ou combater as chamadas pragas parasitárias, observadas tanto na agricultura quanto em medicina veterinária. PREDaDORES Fêmeas do carrapato-do-boi, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, de todo ou parcialmente ingurgitadas, constituem rica fonte de alimento na dieta de diversas espécies de besouros, formigas, roedores e aves (PEREIRA, 1982). Além de representantes dos grupos acima mencionados, algumas espécies de aranhas, dípteros, dermápteros, anfíbios e ratos também fazem parte da lista de seus inimigos naturais (FALEIROS et al.,1983; ROCHA, 1984; VERISSIMO, 1995). Apesar das denominações dadas às garças Egretta ibis e Bubulcus ibis de garçavaqueira, garça-boiadeira, ou ainda, garça-carrapateira, não há especificidade destas aves em predar apenas carrapatos. Elas são consideradas generalistas quanto às presas, tendo preferência por insetos. Sua associação com o gado se dá em função da facilidade de visualização e captura de insetos que são espantados enquanto os animais pastejam. Contudo, o consumo de carrapatos foi confirmado, entre outros autores, por Alves-Branco et al. (1983) que, para tanto, necropsiaram quatro aves tendo encontrado 132 carrapatos em média por ave. Encontraram ainda, principalmente gafanhotos (67 exemplares por ave), além de grilos e aranhas. A oferta de fêmeas de carrapato ingurgitadas ocorre de modo sazonal e isso é um dos motivos, entre outros, pelo qual os predadores aqui referidos não podem contar com esta fonte de alimento como exclusiva. Em estudo efetuado por Della Bella e Azevedo-Junior (2004) na região do Agreste, em Pernambuco, foi observada grande variação populacional de B. ibis, a qual pode estar relacionada com os deslocamentos característicos da espécie. A atividade de forrageamento ocorre, no geral, associada ao gado conforme verificado, também, para a espécie E. ibis em outras regiões do país. Embora a atividade das garças-vaqueiras deva estar resultando em benefícios para a atividade pecuária existe a preocupação de que possam causar impactos negativos sobre a fauna nativa. Veríssimo (1995), com respeito às aves, cita um grande número de espécies que ingerem carrapatos, tanto aqueles já desprendidos que encontram-se no solo quanto arrancando dos hospedeiros. Em propriedades pequenas até mesmo as galinhas domésticas (Gallus gallus domesticus), e a galinha-d angola (Numida meleagris) auxiliam no controle deste parasita bovino. Somam-se a estas o anu (Crotophaga ani); o

138 138 Capítulo 9 Controle biológico gavião-carrapateiro cara-cará (Milvago chimachima); o gavião-pomba (Leucopternis lacernulatus); o chimango (Milvago chimango); a perdiz (Nothura maculosa); o pássaro vira-bosta (Molontrus bonariensis) e, o quero-quero (Varellus chilensis). Ainda segundo o autor acima, entre as formigas (Hymenoptera: Formicidae), que predam o carrapato-do-boi, destaca-se a espécie Solenopsis saevissima, popularmente conhecida como formiga lava-pé. Estas formigas são mais frequentemente vistas, assim como seus ninhos, em áreas úmidas ou próximas a estas. Entretanto, podem ser encontradas em camadas profundas do solo para ficarem próximas à umidade. Desse modo podem estar presentes na maioria dos ambientes ocupados por pastagens. As formigas lava-pés são, também, importantes predadoras dos carrapatos do cão (Rhipicephalus sanguineus) e do cavalo (Amblyomma cajennense). Há mais de 185 espécies no gênero Solenopsis, sendo também conhecidas como importantes predadoras de carrapatos as espécies S. invicta e S. geminata. Foram ainda identificadas outras espécies de formigas predadoras de carrapatos, entre as quais, Camponotus rengeri, conhecida como formiga sapé, que atuam sobre ovos e teleóginas, e a formiga tesoura ou formiga preta. Ambas as espécies parecem preferir fêmeas de carrapato não totalmente ingurgitadas ou de menor tamanho. Outra formiga encontrada predando ovos e teleóginas é a formiga carpinteira ou formiga amarela caseira (Camponotus spp.). Chagas et al. (2002) registraram como predadora de carrapatos a espécie Pachycondyla striata, formiga esta que ocorre no Uruguai, Paraguai, Argentina e Brasil. No Brasil sua presença foi confirmada nos estados de Goiás, Minas Gerais, Espírito Santo, Rio de Janeiro, São Paulo, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul. Entre os dípteros, cita-se uma pequena mosca da família Phoridae, Megaselia scalaris (VERISSIMO, 1995; ANDREOTTI et al., 2003). Este díptero se alimenta em diferentes substratos orgânicos e é atraído quando estes substratos se encontram em processo de decomposição. Pode ser encontrado em vários ambientes, pois possui a capacidade de explorar uma grande variedade de nichos ecológicos e/ou fontes alimentares. Tal habilidade é resultante da variedade de hábitos alimentares apresentados, o que a caracteriza como uma espécie polífaga, incluindo saprofagia, sarcofagia, necrofagia e parasitismo facultativo. Tais moscas causam transtornos, em especial, em substratos alimentares e/ou colônias de insetos mantidos no laboratório (COS- TA et al., 2007), e atacam colônias enfraquecidas de Apis melífera (ANDREOTTI et al., 2003). No laboratório, observa-se que o início da infestação por estas moscas, em amostras de carrapatos ingurgitados ou de larvas de berne, entre outros, acontece quando há resíduos orgânicos fétidos e/ou indivíduos mortos. Depois de consumirem parcialmente o material em processo de deterioração as larvas de M. scalaris passam a atacar o restante da amostra penetrando nos organismos vivos (MATEUS, 1979; ROCHA et al., 1984). Goulart et al. (1986), verificaram em pastagens de Jaboticabal, SP, grande consumo de ovos de carrapato por insetos conhecidos como tesourinhas, pertencentes à Ordem Dermaptera, família Forficulidae. Na verdade, as tesourinhas reúnem várias espécies em diferentes gêneros, presentes em ambientes diversos e apresentando espécies úteis no controle de várias pragas agrícolas, tais como pulgões, lagartas do milho e algodão, entre outras (PARRA et al., 2002).

139 Capítulo 9 Controle biológico 139 Rocha Woelz e Rocha (1983) citam a aranha tarântula (Lycosa erythognata) como predadora do carrapato-do-boi e, a aranha armadeira Phoneutra nigriventer que, posteriormente, foi criada e se reproduziu normalmente tendo apenas teleóginas por dieta Rocha (1984). Em condições de campo e de estábulo, no Campus da Unesp de Jaboticabal, Faleiros et al. (1983) verificaram que ratos e camundongos domésticos, Rattus rattus e Mus musculus, são ávidos predadores de teleóginas. Em Campo Florido, MG, Rocha (1984) notificou outra espécie de rato, diferente de R. rattus e R. norvegicus, mas provavelmente do mesmo gênero, o qual foi atraído por teleóginas do carrapato bovino usadas como isca em uma ratoeira. Segundo Veríssimo et al. (1995) e Rocha e Vasconcelos (1989), sapos também integram a lista de predadores de R. microplus, especialmente a espécie Bufo paracnemis que, conforme Garcia et al. (1985), consome este parasita em qualquer estágio do seu período de desenvolvimento. FUNGOS ENTOMOPaTOGêNICOS O termo entomopatogênico é a propriedade que alguns organismos possuem de matar ou mesmo causar no hospedeiro uma patogenia, isso geralmente em insetos, fato bastante comum e muito utilizado na biologia para animais que exercem a função de inseticidas por meio da liberação de toxinas e outras substancias. (ALMENARA, 2011) Entre os fungos entomopatogênicos usados no controle biológico de carrapatos ou com potencialidade para tanto, o fungo Metarhizium anisopliae apresenta-se como um agente microbiano de grande relevância no programa de controle biológico. A capacidade que esse micro-organismo apresenta em controlar populações de praga é amplamente conhecida e difundida, desde ambientes de clima temperado até clima tropical. Pertencente à classe Deuteromycetes, ordem Moniliales, família Moniliaceae, a espécie foi descrita pela primeira vez como Entomophtora anisopliae por Metschinikoff em Este pesquisador realizou o primeiro trabalho de controle microbiano, utilizando o fungo para controle de larvas do besouro Anisopliae austriaca. Sendo finalmente classificado por Sorokin em 1883 como Metarhizium anisopliae. A partir de então, a utilização deste vêm sendo estudada sobre muitas espécies de insetos, com grandes potencialidades para o controle biológico (ALVES, 1998). Descrito há muitos anos (BARON, apud SILVA, 1985; LATCH, 1965), o fungo apresenta um corpo de frutificação semelhante a um esporodóquio agregado a hifas intimamente entrelaçadas, contendo uma massa compacta de conidióforos, simples ou ramificados, resultando em células esporogênicas denominadas fiálides, das quais se originaram os fialospóros que não são septados, tem forma cilíndrica, são hialinos ou levemente pigmentados e são produzidos em cadeias. O fungo M. anisopliae tem mostrado ser um promissor agente no controle de algumas espécies de carrapatos como Rhipicephalus sanguineus, Anocentor nitens, Amblyomma variegatum, Amblyomma cajennense e R. (B) microplus (KAAIA et al., 1996; BITTENCOURT et al., 1999; GARCIA et al., 2004; LOPES et al., 2007; GARCIA et al., 2011).

140 140 Capítulo 9 Controle biológico Entretanto, os fungos entomopatogênicos quando aspergidos ou pulverizados no campo estão expostos a fatores bióticos e abióticos que influenciam na sua sobrevivência, propagação e infecção no hospedeiro (GOETTEL et al., 2000; GARCIA et al., 2011). Entre os fatores abióticos, o de maior importância é a radiação solar UV (FAR- GUES et al., 1996; BRAGA et al., 2001, CAGAN & SVERCEL, 2001), que pode inativar o conídio, provocar danos letais ao DNA e mutações (NICHOLSON et al., 2000). Outros fatores de importância vital sobre os fungos são a temperatura e umidade, que são os fatores físicos mais estudados. Altas temperaturas são prejudiciais à sobrevivência do fungo, enquanto que baixas temperaturas aumentam a sua persistência, característica essa desejável (RATH, 1992; MONTEIRO, 1995). Já entre os fatores bióticos, vários trabalhos relatam a ação fungistática de microorganismos presentes na microbiota do solo inibindo a ação ou sobrevivência de fungos entomopatogênicos (GRODEN & LOCKWOOD, 1991). O efeito fungistático sobre a população de fungos no solo pode ser provocado por substâncias fitotóxicas, ou pela elaboração de substâncias inibidoras por bactérias e actinomicetos (OLIVEIRA et al., 1981). Sharapov & Kalvish (1984) relataram o efeito fungistático do solo na germinação, crescimento e desenvolvimento dos fungos entomopatogênicos M. anisopliae, Beauveria bassiana, Paecilomyces farinosus, Paecilomyces fumosoroseus. Os autores verificaram que em todos os solos estudados houve ação fungistática sobre os fungos, sendo que o mais afetado foi o M. anisopliae. Garcia et al.,(2011) em estudo a campo investigaram o efeito do M. anisopliae em larvas de R.(B) microplus na pastagem e observaram que o fungo não exerceu controle sobre larvas e nem permaneceu no solo e na pastagem por um período superior a 24 horas pós pulverização, esses resultados corroboram com a literatura citada que afirma a sensibilidade desses entomopatógenos aos efeitos deletérios do clima sobre o meio ambiente. NEMaTOIDES ENTOMOPaTOGENICOS Nematoides são organismos invertebrados que pertencem ao Filo Nematoda, ordem Rhabditida, são considerados os organismos de maior abundância e apresentam uma grande diversidade de espécies (CARES & HUANG, 2008). Segundo Doucet et al. (1998) e Taylor et al. (1998), nematoides entomopatogênicos vem sendo utilizados no controle de uma grande variedade de insetos que incluem além das pragas de solo, também insetos pragas da parte aérea de plantas, bem como varias ordens de artrópodes, estudos mostram que carrapatos das famílias Argasidae e Ixodidae são sensíveis à infecção por nematoides (SAMISH et al, 2000). Os nematoides Steinernema spp. e Heterorhabditis spp. são os únicos associados a insetos que são largamente utilizados para o controle de pragas (BATISTA FILHO, 1996; GIOMETTI et al., 2011; LEITE et al., 2006). Com cerca de 1 mm de comprimento, esses agentes possuem a habilidade de localizar e invadir o corpo de insetos hospedeiros por suas aberturas naturais ou mesmo através da cutícula. A localização do hospedeiro é possível através de quimiorreceptores localizados na região cefálica, que detecta principalmente o CO 2 liberado pelo inseto. Após invadir o corpo do

141 Capítulo 9 Controle biológico 141 inseto, alcançam o hemoceloma e ali liberam uma bactéria, que provoca septicemia e causa a morte do hospedeiro em aproximadamente 48 horas (POINAR, 1990; JAROSZ et al., 1991; KAYA e GAUGLER, 1993; DOLINSKI, 2006). O ciclo biológico dos NEPs é realizado em três fases: ovo, juvenil e adulto (machos e fêmeas) a fase juvenil composta de quatro estádios - J1, J2, J3 ou Juvenil Infectante (JI) e J4 (DOLINSKI, 2006). O único instar de vida livre dos NEPs é o Juvenil Infectante que é encontrado no solo onde consegue localizar seu hospedeiro, esses NEPs tem preferência por orifícios naturais como boca, anus, órgão genital, espiráculo, já o gênero Heterorhabditis spp possui um dente quitinoso localizado frontalmente na extremidade anterior, que penetra a cutícula do hospedeiro até alcançar a hemocele (KAYA e GAUGLER, 1993; DOLINSKI, 2006). Alguns fatores abióticos podem interferir no ciclo de vida desses organismos como altas temperaturas que afetam os nematoides de diferentes formas, causando a destruição da cutícula, enquanto que as baixas temperaturas podem causar a coagulação do citoplasma. A temperatura ótima para os nematódeos varia de 15 a 30ºC. Além da sobrevivência, a temperatura também afeta o crescimento, a reprodução e a distribuição dos nematoides, sendo um fator crítico no movimento e na infecção do patógeno (VAN GUNDY, 1985; TIHOHOD, 1993). Vale resaltar que esses organismos das familias Steinernematidae e Heterorhabiditidae apresentam simbiose com alguns tipos de bactérias dos gêneros Xenorhabdus spp. ou Photorhabdus spp as quais se encontram alojadas no intestino desses nematoides. As bactérias fazem a bioconversão dos tecidos do hospedeiro que vão servir de alimento para o nematoide e este por sua vez protege a bactéria, sendo que essa não é encontrada isoladamente no ambiente. (WOODRING E KAYA, 1988). Após a infecção pelo nematoide essas bactérias simbióticas são liberadas no interior do hospedeiro produzindo toxinas provocando sua morte num período aproximado de 24 a 72h pós infecção (DOWDS e PETERS, 2002) e também atuam na produção de antibióticos que impedem o surgimento de outros micro-organismos (DOLINSKI, 2006). Essas particularidades tornam os NEPs capazes de matar insetos e também carrapatos, tornando os uma promissora ferramenta no controle desses artrópodes. Segundo Kocan et al. (1998) varias espécies de carrapatos se mostraram susceptíveis aos NEPs, bem como uma significativa redução na postura de ovos das fêmeas ingurgitadas que não morreram quando infectadas. Estudo realizado por Carvalho et al. (2010) mostrou uma eficácia de 90% de mortalidade em fêmeas de R. (B) microplus quando expostas por 24 horas aos nematoides Steinernema glaseri estirpe CCA. Vários estudos já realizados comprovaram que os NEPs e os fungos entomopatogênicos são eficazes no controle de varias espécies de carrapatos em todos seus instares, em condições laboratoriais, tornando os uma alternativa promissora para o uso como carrapaticidas biológicos. REFER ÊNCIAS ALMENARA, D. P.; NEVES, M. R. C.; KAMITANI, F. L.; WINTER, C. E. Entomopathogenic nematodes: two sides of a symbiosis. Revista da Biologia, 6b: 1-6, 2011.

142 142 Capítulo 9 Controle biológico ALVES-BRANCO, F. P. J.; ECHEVARRIA, F. A. M.; SIQUEIRA, A. S. Garça-vaqueira (Egretta ibis) e o controle biológico do carrapato (Boophilus microplus). Bagé, RS: EMBRAPA-UEPAE de Bagé, p. (EMBRAPA- UEPAE de Bagé. Comunicado Técnico, 1). ALVES, S. B. Fungos entomopatogênicos. In: ALVES, S. B. Controle microbiano de insetos. 2. Ed. Piracicaba: FEALQ, p. ANDREOTTI, R.; KOLLER, W. W.; TADEI, W. J.; PRADO, A. P.; BARROS, J. C.; SANTOS, F.; GOMES, A. Occurrence of the Megaselia scalaris (Loew, 1866) (Diptera, Phoridae) as a parasitoid of Boophilus microplus in Campo Grande, MS, Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, São Paulo, v. 12, n. 1, p , BATISTA-FILHO, A. Produção de nematoides entomopatogênicos in vitro. Arquivos do Instituto Biológico, São Paulo, v. 63, n. 1, p , BITTENCOURT, V. R. E. P.; SOUZA, E. J.; PERALVA, S. L. F. S.; REIS, R. C. S. Eficácia do fungo Metarhizium anisopliae (Metschnikoft, 1879) Sorokin, 1883 em teste de campo com bovinos infestados por carrapato Boophilus microplus (Canestrini, 1883) (Acari: Ixodidae). Revista Brasileira de Medicina Veterinária, Rio de Janeiro, v. 20, n. 2, p , BRAGA, G. U. L.; FLINT, S. D.; MILLER, C. D.; ANDERSON, A. J.; ROBERTS, D. W. Variability in response to UV-B among species and strains of Metarhizium isolated from sites at latitudes from 61oN to 54oS. Journal of Invertebrate Pathology, San Diego, v. 78, p , CAGAN, L.; SVERCEL, M. The influence of ultraviolet Light on pathogenicity of entomopathogenic fungus Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin to the european corn borer, Ostrinia nubilalis HBN. (Lepidoptera: Crambidae). Journal of Central European Agriculture, Konossu Saitama, v. 2, n. 3, p , CARES, J. E.; HUANG, S. P. Soil nematodes In: MOREIRA, F. M. S.; HUISING, E. J.; BIGNALL, D. E. A handbook of tropical soil biology: sampling and characterization of below-ground biodiversity. London: Earthscan, p CARVALHO, L. B.; FURLONG, J.; PRATA, M. C. A.; REIS, E. S.; BATISTA, E. S. P.; FAZA, A. P.; LEITE, R. C. Evaluation in vitro of the infection times of engorged females of Rhipicephalus (Boophilus) microplus by the entomopathogenic nematode Steinernema glaseri CCA strain. Ciência Rural, Santa Maria, v. 40, n. 4, p , CHAGAS, A. C. S.; FURLONG, J.; NASCIMENTO, C. B. Predation of Boophilus microplus (Canestrini, 1887) (Acari: Isodidae) tick engorged female by the ant Pachycondyla striata (Smith, 1858) (Hymenoptera: Formicidae) in pastures. Bioscience Journal, v. 18, n. 2, p , COSTA, J.; ALMEIDA, C. E.; ESPERANÇA, G. M.; MORALES, N.; MALLET, J. R. S.; GON- ÇALVES, T. C. M.; PRADO, A. P. First record of Megaselia scalaris (Loew) (Diptera: Phoridae) infesting laboratory colonies of Triatoma brasiliensis Neiva (Hemiptera: Reduviidae). Neotropical Entomology [online], v. 36, n. 6, p , DELLA BELLA, S.; AZEVEDO-JUNIOR, S. M. Considerações sobre a ocorrência da garça-vaqueira, Bubulcus ibis (Linnaeus) (Aves, Ardeidae), em Pernambuco, Brasil. Revista Brasileira de Zoologia, v. 21, n. 1, p , DOLINSKI, C.; DEL VALLE, E.; STUART, R. J. Virulence of entomopathogenic nematodes to larvae of the guava weevil, Conotrachelus psiddi (Coleoptera: Curculionidae), in laboratory and greenhouse experiments. Biological Control, v. 36, p , DOUCET, M. M. A.; MIRANDA, M. B.; BERTOLOTTI, M. A. Infectivity of entomogenous nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae) to Pediculus humanus capitatis De Geer (Anoplura: Pediculidae). Fundamental Applyed Nematology, v. 21, n. 1, p , DOWDS, B. C. A.; PETERS, A. Virulence Mechanisms. In: GAUGLER, R. Entomopathogenic nematology. 1.ed. New York: CABI Publishing, p FALEIROS, R.; ROCHA, U. F.; ROCHA-WOELZ, C. Ecologia de carrapatos II: Predatismo de ratos e camundongos sobre o carrapato comum dos bovinos. In: CONGRESSO DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE PARASITOLOGIA, 8., 1983, São Paulo. Resumos... São Paulo: Unesp, p FARGUES, J.; GOETTEL, M. S.; SMITS, N.; OUEDRAOGO, A.; VIDAL, C.; LACEY, L. A.; LOMER, C. J.; ROUGIER, M. Variability in susceptibility to simulated sunlight of conidia among isolates of entomopathogenic hyphomycetes. Mycopathologia, Amsterdam, v. 135, p , 1996.

143 Capítulo 9 Controle biológico 143 GARCIA, M. C. C.; FERRARI, O.; ROCHA, U. F.; VERISSIMO, C.; HOMEM, E.; MARTUCCI, R.; ALESSI, A. C. Ecologia de carrapatos. XI. Realidade e crendices quanto a carrapatos, larvas de muscóideos e lesmas, na dieta do sapo Bufo paracnemis L. Veterinária e Zootecnia, São Paulo, v. 1, n. 1, p , GARCIA, M. V.; MONTEIRO, A. C.; SZABÓ, M. P. J. Colonização e lesão em fêmeas ingurgitadas do carrapato Rhipicephalus sanguineus causadas pelo fungo Metarhizium anisopliae. Ciência Rural, Santa Maria, v. 34, n. 5, p , GARCIA, M. V.; MONTEIRO, A. C.; SZABO, M. P. J.; MOCHI, D. A.; SIMI, L. D.; CARVALHO, W. M.; TSURUTA, S. A.; BARBOSA, J. C. Effect of Metarhizium anisopliae fungus on off-host Rhipicephalus (Boophilus) microplus from tick-infested pasture under cattle grazing in Brazil. Veterinary Parasitology, v. 181, n. 2/4, p , GIOMETTI, F. H. C.; LEITE, L. G.; TAVARES, F. M.; SCHMIT, F. S.; BATISTA-FILHO, A.; DELL ACQUA, R. Virulência de nematoides entomopatogênicos (Nematoda: Rhabditida) à Sphenophorus levis (Coleoptera: Curculionidae). Bragantia, Campinas, v. 70, n. 1, p , GOETTEL, M. S.; INGLIS, G. D.; WRAIGHT, S. P. Fungi. In: Field manual of techniques in invertebrate pathology. Kluver Academic Publishers. Netherlands. Cap. 4, p , GRODEN, E.; LOCKWOOD, J. L. Effects of soil fungistasis on Beauveria bassiana and its relationship to disease incidence in colorado potato beetle, Lepttinotarsa decemlineata, in Michigan and Rhode Island soils. Journal of Invertebrate Pathology, San Diego, v. 57, n. 1, p. 7-16, GRONVOLD, J.; NANSEN, P.; HENRIKSEN, S. A.; LARSEN, M.; WOLSTRUP, J.; BRESCIANI, J.; RAWAT, H.; FRIBERT, L. Induction of traps by Ostertagia ostertagi larva, chlamydospore prodiction and growth rate in the nematode-trapping fungus Duddingtonia flagrans. Journal of Helminthology, London, v. 70, n. 4, p , GOULART, S.; CHRISTOFORO, M. T.; AMEIXEIRO, A. R.; LAMOUNIER, J. E.; FERREIRA, J. R.; FERRARI, O.; ROCHA, U. F. Ecologia de carrapatos XVII. Predatismo de insetos forficulídeos sobre ovos de Boophilus microplus (Canestrini). Arquivos de Veterinária, Jaboticabal, v. 2, n. 2, p , JAROSZ, J.; BALCERZAK, M. & SKRZYPEK, H. Involvement of larvicidal toxins in pathogenesis of insect parasitism with the Rhabditoid nematodes Steinernema feltiae and Heterorhabditis bacteriophora. Entomophaga, v. 36, n. 3, p , KAAIA, G. P.; MWANGI, E. N.; OUNA, E. A. Prospects for biological control of livestock ticks, Rhipicephalus appendiculatus and Amblyomma variegatum using the entomopathogenous fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Journal of invertebrate pathology, San Diego, v. 67, n. 1, p , KAYA, H. K.; GAUGLER, R. Entomopathogenic nematodes. Annual. Review of Entomology, v. 38, p , KOCAN, K. M.; PIDHERNEY, M. S.; BLOUIN, E. F.; CLAYPOOL, P. L.; SAMISH, M.; GLAZER, I. Interaction of some entomopathogenic nematodes (Steinernematidae) with selected species of ixodid ticks (Acari:Ixodidae). Journal of Medical Entomology, v. 35, n. 4, p , LATCH, G. C. M. Metarhizium anisopliae (Metschikoff) Sorokin, strains in New Zealand and their possible use for controlling pastures-inhabiting insects. Journal of Agricultural Research, New Zealand, v. 8, p , LEITE, L. G.; TAVARES, F. M.; GINARTE, C. M. A.; CARREGARI, L. C.; BATISTA FILHO, A. Nematoides entomopatogênicos no controle de pragas. In: SENE-PINTO, A. Contole Biológico de Pragas na Prática. Piracicaba: FEALQ, p LOPES, R. B.; ALVES, S. B.; PADULLA, L. F. L.; PÉREZ, C. A. Eficiência de formulações de Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae para o controle de ninfas de Amblyomma cajennense (Fabrícius, 1787). Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, São Paulo, v. 16, n. 1, p , MATEUS, V. G. Dermatobiosis. In: SEMINÁRIO NACIONAL SOBRE PARASITOSES DOS BO- VINOS, 1., Campo Grande, Anais... Campo Grande: EMBRAPA/CNPGC, p , MONTEIRO, A. C. Ecologia de fungos entomopatogênicos no solo. In: CICLO DE PALESTRAS SOBRE CONTROLE BIOLÓGICO DE PRAGAS, 4., 1995, Campinas. Anais... p , 1995.

144 144 Capítulo 9 Controle biológico NICHOLSON, W. L.; MUNAKATA, N.; HORNECK, G.; MELOSH, H. J.; SETLOW, P. Resistence of Bacillus endospores to extreme terrestrial and extraterrestrial environments. Microbiology and Molecular Biology Reviews, v. 64, n. 3, p , OLIVEIRA, D. P.; CHAVES, G. M.; LOURES, E. G. Estudo comparativo da sobrevivência de Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin em diferentes tipos de solo. Revista Theobroma, Itabuna, v. 11, n. 4, p , PARRA, J. R. P.; BOTELHO, P. S.; CORRÊA-FERREIRA, B. S.; BENTO, J. M. Controle biológico no Brasil: parasitóides e predadores. São Paulo: Malone, p. PEREIRA, M. C. Boophilus microplus - Revisão taxonômica e morfo-biológica. Rio de Janeiro: Químio Divisão Veterinária, p. POINAR JÚNIOR, G. O. Taxonomy and biology of Steinernematidae and Heterorhabditidae. In: GAUGLER, R.; KAYA, H. K. Entomopathogenic Nematodes in Biological Control. Boca Raton, FL, USA, p , RATH, A. C.; KOEN, T. B.; YIP, H. Y. The influence of abiotic factors on the distribution and abundance of Metarhizium anisopliae in Tasmanian pasture. Mycological Research, Cambridge, v. 96, n. 5, p , ROCHA-WOELZ, C.; ROCHA, U. F. Ecologia de carrapatos. I. Predatismo de formigas sobre carrapatas e seus ovos. In: CONGRESSO DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE PARASITOLOGIA, 8., 1983, São Paulo. Resumos... São Paulo: Sociedade Brasileira de Parasitologia, 1983, p ROCHA, U. F. Biologia e controle biológico do carrapato Boophilus microplus (Canestrini). Jaboticabal: Unesp, p. (Boletim Técnico, 3). ROCHA, U. F.; BELO, M.; MORAIS, J. R.; SOGORB, A.; BARUCH, A. Ecologia de carrapatos. VI. Influência da umidade ambiente sobre a invasão de fêmeas de Boophilus microplus (Canestrini) (Acari, Ixodidae) por larvas de Megaselia scalaris Loew (Díptera, Phoridae) e sobre a prolificidade desses artrópodes. Naturália, São Paulo, v. 9, n. 1, p , ROCHA, U. F.; VASCONCELOS, O. T. Ecologia de carrapatos XXIV. O sapo Bufo paracnemis L., predador do carrapato Boophilus microplus (Canestrini) também no Estado de Goiás, Brasil. In: ENCONTRO DE PESQUISAS VETERINÁRIAS, 13., 1989, Jaboticabal. Resumos... Jaboticabal: FCAV-UNESP, 1989, p SAMISH, M.; ALEKSEEV, E.; GLAZER, I. Biocontrol of ticks by entomopathogenic nematodes: research update. Annals of the New York Academy of Sciences, v. 916, p , SHARAPOV, V. M.; KALVISH, T. K. Effect of soil fungistasis on zoopathogenenic fungi. Mycopathology, v. 85, n. 1-2, p , SILVA, J. C. Virulência de mutantes exoenzimaticos de Metarhizium anisopliae var. Anisopliae e seus revertentes a Rhodnius prolixus p. Tese (Doutorado) - Unicamp, Campinas. TAYLOR, D. B.; SZALANSKI, A. L.; ADAMS, B. J.; PETERSON, R. D. Susceptibility of house fly (Diptera: Muscidae) larvae to entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Heterorhabditidae, Steinernematidae). Biological Control, v. 27, n. 6, p , TIHOHOD, D. Nematodologia agrícola aplicada. Jaboticabal, SP. Funep. 372 p VAN GUNDY, S. D. Ecology of Meloidogyne spp. - emphasis on environmental factors affecting survival and pathogenicity. In: SASSER, J. N.; CARTER, C. C. An advanced treatise on Meloidogyne. Raleigh, North Carolina, v. 1, p , VERISSIMO, C. J. Inimigos naturais do carrapato parasita dos bovinos. Agropecuária Catarinense, v. 8, n. 1, p , WOODRING, J. L.; KAYA, H. K. Steinernematid and heterorhabditid nematodes: A handbook of techniques. Arkansas: Agricultural Experiment Station Southern Cooperative Bulletin, p.

145 10 Resistência do carrapato-do-boi Rhipicephalus (Boophilus) microplus aos acaricidas Renato Andreotti

146

147 Capítulo 10 Resistência do carrapato-do-boi Rhipicephalus (Boophilus) microplus aos acaricidas 147 O carrapato-do-boi, Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887) (Acari: Ixodidae), causa grandes prejuízos econômicos à pecuária brasileira. Estas perdas são representadas por diminuição na produção de leite e carne, bem como por danos no couro e peles. Além de provocar reações inflamatórias nos locais de fixação do carrapato ele pode ainda transmitir doenças como a tristeza parasitária bovina (que é causada por protozoários do gênero Babesia e pela bactéria do gênero Anaplasma). Acarreta, também, outros prejuízos ao produtor que são relacionados à mão-deobra, despesas com instalações, aquisição de carrapaticidas e de equipamentos de suporte para aplicação dos mesmos nos rebanhos. De uma maneira geral, a contaminação da carne e do leite com resíduos químicos, assim como no próprio ambiente, tem sido para a sociedade uma das maiores preocupações quanto ao uso sistemático de pesticidas químicos. A pecuária brasileira movimenta em torno de 185,8 milhões de bovinos (ANUALPEC, 2012), mas a produtividade do setor é minada pelo carrapato R. microplus que, sozinho, é responsável por prejuízos anuais de mais de US$ 2 bilhões (GRISI et al., 2002). Neste cenário, a resistência do carrapato aos acaricidas é um motivo de preocupação permanente entre produtores; indústrias; agências governamentais, assim como de técnicos. O mercado de parasiticidas no Brasil movimenta cerca de US$ 960 milhões por ano e constitui 34% do mercado de produtos veterinários (SINDAN, 2010). Há uma dificuldade crescente para obtenção de novos acaricidas, haja vista que para serem registrados os novos produtos devem apresentar pelo menos 95% de eficácia, segundo critérios do Ministério da Agricultura e Abastecimento (Mapa). Não existe em vigor no país um programa oficial de controle do carrapato e, por esta razão, os critérios para a gestão de infestações são definidos exclusivamente pelos produtores. Em geral, informações sobre a epidemiologia regional do parasita são negligenciadas; acaricidas são escolhidos por critérios que não a sua eficácia, e a aplicação destes é feita inadequadamente, desafiando o sucesso do tratamento. Além disso, efetua-se o controle da mosca-do-chifre (Haematobia irritans) com produtos que também possuem ação acaricida (piretroides e organofosforados), mas estes são aplicados em doses insuficientes para garantir o controle do carrapato, o que contribui indiretamente para o aumento da resistência do carrapato (MARTINS, 2004; BARROS et al., 2007). Em geral, a resistência pode ocorrer por meio de diversos mecanismos no carrapato, os quais podem ser classificados como: mutação local, metabólica ou de penetração reduzida. Neste contexto, a detecção precoce da resistência é essencial para evitar a seleção de carrapatos resistentes em situações de uso contínuo do mesmo princípio ativo, bem como para atrasar a propagação da resistência. CLaSSES DOS acaricidas O uso de acaricidas passou a ser feito de forma sistemática a partir do uso do arsênico no controle de carrapatos em bovinos no ano de 1896 que, a partir de 1910, foi liberado nos Estados Unidos criando um mercado internacional para esse produto.

148 148 Capítulo 10 Resistência do carrapato-do-boi Rhipicephalus (Boophilus) microplus aos acaricidas A evolução da resistência dos carrapatos ao arsênico após 1937 na Austrália, bem como o risco à saúde e as preocupações relacionadas a resíduos, motivaram o desenvolvimento de novos produtos. Por estas razões é que foram gerados os produtos organoclorados em 1946, ciclodienos e toxafeno em 1947, formamidinas em 1975, piretroides em 1977 e as lactonas macrocíclicas em 1981 (GEOR- GE et al., 2008). Os acaricidas também são classificados por sua via de ação em: a) por contato quando o produto é aplicado por meio de pulverização, imersão ou pour on e, b) sistêmicos quando o princípio ativo que atua na circulação sanguínea é metabolizado e distribuído por todo o corpo, aplicado por meio de injeções ou no dorso do animal. Os acaricidas utilizados atualmente no Brasil são classificados em sete grupos distintos, que serão descritos a seguir. Organofosforados É o grupo mais antigo de carrapaticida ainda comercializado para bovinos. Apareceram em torno de 1955 para substituir os organoclorados, como DTT e BHC, por estes apresentarem resistência cruzada a diferentes espécies de carrapatos, gerando preocupações com relação à sua persistência no ambiente e pela acumulação na gordura corporal de animais (GEORGE et al., 2008). Os organofosforados não apresentam poder residual quando aplicados sob a forma de pulverização, sugerindo um intervalo de tratamento de 21 dias. Podem ser encontrados em associação com piretroides ou com bernicidas. São derivados orgânicos do ácido fosfórico, caracterizados por um mesmo mecanismo de ação, e inibem a enzima acetilcolinesterase, ocasionando um aumento de acetilcolina em níveis tóxicos para os carrapatos e causando um aumento das contrações dos músculos até atingir a paralisia. Neste grupo, a resistência do carrapato está relacionada normalmente a um único gene semidominante, ou seja, os indivíduos heterozigotos também apresentam resistência, embora menor do que os homozigotos resistentes. Os mecanismos da resistência aos organofosforados ainda precisam ser convenientemente elucidados, mas sabe-se que existe relação com a insensibilidade da acetilcolinesterase (FOIL et al., 2004), com o aumento do metabolismo das esterases localizadas no integumento de teleóginas resistentes e com a superexpressão dessas enzimas em larvas (VILLA- RINO et al., 2001). Na verdade, mais do que uma acetilcolinesterase pode ser envolvida nas respostas de acaricidas (BAFFI et al., 2008; TEMEYER et al., 2010). Sete contigs com similaridade de sequência significativa com a acetilcolinesterase foram relatados em transcriptoma de R. microplus (BELLGARD et al., 2012). Temeyer et al. (2010) expressaram três acetilcolinesterases transcrições isoladas de duas amostras resistentes a organofosforados e de uma linhagem suscetível de R. microplus e mostrou que existiam alelos variantes entre indivíduos na estirpe apresentando respostas diferentes a organofosforados. Estes autores concluíram que a resistência fenotípica aos organofosforados pode ser complexa multigênica. Infelizmente, nenhuma das mutações específicas

149 Capítulo 10 Resistência do carrapato-do-boi Rhipicephalus (Boophilus) microplus aos acaricidas 149 em acetilcolinesterase foi correlacionada com resistência a organofosforados em populações de campo. amidinas (diamínicos) É um grupo de carrapaticidas que sucedeu aos fosforados sendo lançado em Caracteriza-se por ter poder residual de 14 dias, permitindo intervalos maiores de tratamentos. Após penetrar no carrapato, a amidina é metabolizada em um composto denominado de N 2,4 dimetilfenil N metilformamidina. Possui uma intensa ação sobre a postura de ovos das teleóginas, e é tóxico para as fases do carrapato, em especial para as larvas. A sua ação direta está relacionada com a inibição de algumas enzimas importantes para o metabolismo do carrapato, como as monoaminooxidades. Foi amplamente aceito pelos produtores e continua sendo um dos mais utilizados no mercado, mesmo depois de mais de 20 anos de comercialização. O período de carência para leite é de 24 horas e para carne é de 14 dias. Até o momento, foi encontrado em algumas cepas de R. microplus resistentes um aumento da atividade esterásica e glutationa-s-transferases, podendo isso estar relacionado com a insensibilidade de um sítio de ligação de um receptor de octopamina (LI et al., 2004). Piretroides Este grupo surgiu em Com o aparecimento de resistência aos acaricidas de grupos à base de organofosforados tradicionalmente usados no país na década de 1980, foi estimulado o uso extensivo de piretroides. Existem no mercado produtos originários de pelo menos três subgrupos dessa família (Deltametrina, Cipermetrina e Alfametrina). Esses acaricidas não apresentam poder residual quando aplicados sob a forma de pulverização, devendo obedecer a um intervalo de tratamento sugerido de 21 dias. Com aplicação pour on, o período residual é de sete dias. Não deve ser utilizado para consumo humano o leite de animais tratados antes de decorridas 24 horas da aplicação do produto. Não devem ser abatidos animais tratados antes de decorridos sete dias da aplicação do produto. Para aumentar a eficiência dos piretroides, também foram desenvolvidas novas formulações, nas quais os piretroides passaram a ser associados aos fosforados, aumentando, assim, a eficiência. É importante lembrar que os piretroides apresentam baixa toxicidade aos mamíferos quando comparados aos organofosforados. Foram identificados dois padrões de resistência para este grupo: um é a forma de alteração do sítio de ação das esterases, tornando-os insensíveis por mutações do gene relacionado aos canais de sódio. A proteína codificada por esse gene altera sua estrutura, o que o torna resistente ao piretroide (HE et al., 1999). O segundo mecanismo, menos entendido, envolve detoxificação metabólica mediada pela ação de esterases e de citocromo P450 (MILLER et al., 1999). Porém, podem ser encontradas variações genéticas em diferentes populações para esses mecanismos (GUERRERO et al., 2001).

150 150 Capítulo 10 Resistência do carrapato-do-boi Rhipicephalus (Boophilus) microplus aos acaricidas O canal de sódio dependente da voltagem é o local alvo para a atividade de piretroides. Miller et al. (1999) trabalhando com populações de carrapatos resistentes aos piretroides do México e He et al. (1999) com base em sequenciamento genético verificou substituição específica de aminoácidos no Domínio III (fenilalanina para isoleucina) do R. microplus canal de sódio R nessas populações de carrapatos mexicanos. Um ensaio de PCR de diagnóstico (GUERRERO et al., 2001) foi desenvolvido que permitiu a detecção rápida desta substituição de aminoácidos em indivíduos na fase de larvas. Um grande número de carrapatos foi testado por este método e este mecanismo de resistência foi identificado no México (ROSÁRIO-CRUZ et al., 2005; 2009) e numa estirpe de surto nos Estados Unidos (Miller et al., 2007). A localização desta mutação no canal de sódio é rara, pois nos artrópodes a resistência associada à mutação no canal de sódio em piretroides está localizada mais no Domínio II do que nos outros três domínios (SODERLUND; KNIPPLE, 2003). Em pesquisas em amostras resistentes de R. microplus a piretroides em Mato Grosso do Sul, não foi detectada mutação no canal de sódio (ANDREOTTI et al., 2011). Também não foi encontrada mutação no domínio III do canal de sódio em amostra brasileira e australiana. No entanto, recentemente, Morgan et al. (2009) e Jonsson et al. (2010) relataram diferenças de nucleotídeos na região do Domínio II do canal de sódio em populações resistentes de R. microplus na Austrália. Essas diferenças de nucleotídeos no gene canal de sódio australiano levou a mudanças de aminoácidos que se correlacionaram com a resistência a piretroides. Morgan et al. (2009) relatam a alteração de aminoácidos de leucina a isoleucina, enquanto que nas alterações observadas por Jonsson et al. (2010) foram relatadas uma glicina e a valina. O efeito fenotípico de cada uma das três mutações difere significativamente. A mudança no Domínio III fenilalanina para isoleucina confere um elevado nível de resistência à permetrina, cipermetrina, e flumetrina no estado homozigótico como visto na estirpe Corrales mexicano acaricida-selecionado positivamente (> 1000 vezes, MILLER et al., 1999). As mutações no domínio II são relacionadas com menores níveis de resistência. A mudança de isoleucina para leucina relatada por Morgan et al. (2009) transmite níveis moderados (estimativas dobra) de resistência a permetrina, cipermetrina, e flumetrina, enquanto que mudança da glicina para valina era específico para resistência à flumetrina e sugere proporcionar níveis mais baixos de resistência (JONSSON et al., 2010). Assim, há pelo menos três mecanismos no local alvo para a resistência aos piretroides em R. microplus. Os aspectos moleculares de resistência metabólica ainda não estão bem definidos em R. microplus. Embora a resistência metabólica tenha sido geralmente atribuída ao do citocromo P450, as esterases, e glutathione S-transferases (BELLGARD et al., 2012). Fenilpirazole Sua ação é semelhante às avermectinas, isto é, age sobre o sistema nervoso dos carrapatos, paralisando-os. Não pode ser usado em animais em lactação e é aplicado

151 Capítulo 10 Resistência do carrapato-do-boi Rhipicephalus (Boophilus) microplus aos acaricidas 151 de forma pour on. Denominado de Fipronil, age por bloqueio não-competitivo dos canais de cloreto dos receptores específicos GABA (Ácido gama aminobutírico). Demonstra potencial de bioacumulação (ZHAO et al., 2004). Esta atividade sobre os dois alvos provavelmente desempenha um papel em retardar ou prevenir a acumulação de elevados níveis de resistência. Contudo, um desses alvos é partilhado com a classe de pesticidas ciclodienos, e baixos níveis de resistência ao fipronil podem ser associados com resistência a dieldrina em Drosophila melanogaster (BLOOMQUIST, 1994). Resistência ao Fipronil foi documentada em populações de campo de R. microplus no Uruguai (CUORE et al., 2007; CASTRO-JANER et al., 2010a; 2011), embora estudos sobre os mecanismos não foram relatados. Thiazolina Possui formulação em associação com piretroide, e é utilizado na forma de pulverização ou imersão. Encontra-se liberado para uso em animais em lactação, e exige carência de apenas três dias para a utilização da carne. Ainda não existe relato de resistência do R. microplus à thiazolina. Lactonas macrocíclicas Esses produtos surgiram no início da década de 1980 (1981) e produziram grande revolução no mercado mundial dos antiparasitários. Além de apresentarem maior poder residual que os piretroides, são também eficientes contra vermes e bernes, sendo, por isso, chamados de endectocidas. São derivados de produtos obtidos com a fermentação do fungo Streptomyces avermitiles, e existem quatro subgrupos no mercado (Ivermectin, Moxidectin, Doramectin e Abamectin) (FURLONG; MARTINS, 2000). Esses carrapaticidas agem bloqueando a transmissão dos impulsos nervosos nos carrapatos, que por isso morrem paralisados. O mecanismo de desenvolvimento da resistência ainda não está esclarecido. Não podem ser utilizados em animais em lactação e em gado de corte 30 dias antes do abate. A formulação com nome comercial de Eprinex é a única exceção. Fluazuron (inibidor do crescimento) O fluazuron tem a capacidade de interferir na produção de quitina, uma substância que possibilita o endurecimento da cutícula dos carrapatos. Completamente diferente de todos os carrapaticidas já citados, ele não permite que os carrapatos mudem de fase e cresçam, além de impedir que se reproduzam, controlando a população. De maneira semelhante aos derivados das avermectinas, também não pode ser utilizado nos animais em lactação. É aplicado na forma pour on, sendo metabolizado pelo organismo, atuando de modo sistêmico pela circulação sanguínea. O único representante no mercado até o momento é o Acatak (FURLONG; MARTINS, 2000).

152 152 Capítulo 10 Resistência do carrapato-do-boi Rhipicephalus (Boophilus) microplus aos acaricidas DESENVOLVIMENTO Da RESISTêNCIa Os mecanismos de resistência do R. microplus a cada classe de acaricida ainda não foram completamente elucidados. Com o decorrer do uso de um produto químico, parte da população de carrapatos sobrevive. Às vezes, a resistência está instalada em uma população de carrapatos até mesmo antes de estes entrarem em contato com aquele produto. Isso acontece porque já existem na população alguns indivíduos naturalmente resistentes, cerca de um a cada um milhão ou mais de indivíduos (ROUSH, 1993). Ou então, como é mais comum, o uso frequente do produto causa alterações (mutações) em alguns indivíduos da população, tornando-os resistentes. É o chamado estabelecimento do alelo resistente (FURLONG; MARTINS, 2000). Com o uso contínuo de determinado princípio ativo, há o aumento de indivíduos com essa característica de resistência, uma vez que morrem os sensíveis, não resistentes, e os resistentes acasalam entre si, produzindo descendentes cada vez mais resistentes e em maior número na população. É a chamada propagação do alelo resistente por pressão de seleção (FURLONG; MARTINS, 2000). Ou seja, a pressão de seleção aumenta a proporção da população de carrapatos que carregam os genes para estes fatores de resistência. A taxa na qual um alelo resistente torna-se estabelecido na população e o tempo que leva para o acaricida se tornar ineficaz no controle de carrapatos depende de muitos fatores. Estes incluem: a frequência das mu- tações na população original antes do tratamento; o modo de herança do alelo resistente (dominante e codominante ou recessiva); a frequência do tratamento carrapaticida; o gradiente de concentração do acaricida e, a proporção da população de carrapatos total que não é exposta ao acaricida (denominadas de refúgios) (FAO, 2003). Como ao longo destas últimas cinco décadas têm sido utilizados acaricidas baseados em diferentes princípios químicos (arsenicais, organoclorados, organofosforados, carbamatos, nitroguanidinas, fenilpirazoles, formamidinas, piretroides, lactonas macrocíclicas e fenil ureias), diversos mecanismos de resistência foram sendo desenvolvidos como estratégia de sobrevivência pelo carrapato (FREITAS et al., 2005). A pressão de seleção acarretada pelo uso de acaricidas favorece o surgimento de populações com diferentes características genéticas em diferentes graus. Estas características variam desde a redução do poder de penetração do pesticida ao aumento do poder sequestrante de moléculas tóxicas ou mesmo insensibilidade a compostos tóxicos. Além disso, o aumento da detoxificação celular (OAKESHOTT et al., 2003) torna os pesticidas utilizados defasados em curto espaço de tempo, sendo necessário aumentar a concentração de uso, mudar o princípio ativo ou utilizar outros princípios ativos combinados (SUTHERST et al., 1983). Os mecanismos fisiológicos da resistência estão relacionados, principalmente, com a diminuição de penetração cuticular da droga, a resistência metabólica e a resistência por insensibilidade de sítio de ação.

153 Capítulo 10 Resistência do carrapato-do-boi Rhipicephalus (Boophilus) microplus aos acaricidas 153 A resistência metabólica é caracterizada por um aumento na capacidade que os indivíduos resistentes têm de detoxificar e/ou eliminar os produtos acaricidas utilizados no tratamento. Esse aumento pode ser resultado: a) do aumento de expressão de enzimas responsáveis pelo metabolismo de drogas (por exemplo, citocromo P450 monooxigenases, esterases e glutationa-s-transferases); e b) do aumento da especificidade dessas enzimas pelo substrato (PEREIRA et al., 2008). A resistência por insensibilidade de sítios de ação é o segundo mecanismo mais encontrado. Caracteriza-se, principalmente, por uma mutação de nucleotídeo na região codificadora de um gene. Essa mutação pode conferir uma mudança de aminoácido e, consequentemente, uma alteração tridimensional na proteína formadora do receptor. Essa mudança estrutural pode alterar a habilidade da molécula de se ligar ao sítio de ação, resultando em resistência (PEREIRA et al., 2008). O modo de ação das lactonas macrocíclicas (MLs) em artrópodes é atribuído à sua alta afinidade com os canais de cloreto-glutamato (Glu-Cl) que estão presentes em músculos e nervos. A abertura desses canais causa um lento e irreversível aumento da condutância da membrana, resultando na paralisia da musculatura somática e a consequente morte do parasita (CULLY et al., 1994). Três formas de resistência podem ser explicadas em função das ações moleculares: aquela que resulta do aumento de expressão de genes ou aumento da atividade de enzimas envolvidas em metabolismo de xenobióticos/detoxificadoras; as que surgem por mutações em neurorreceptores; e as que ocorrem por mutações em canais de sódio (MARTIN et al., 2003; OAKESHOTT et al., 2003; RUFINGIER et al., 1999). Três famílias de proteínas são as principais responsáveis pelo metabolismo de acaricidas: os citocromos P450; as esterases (Est), e as glutationa S-transferases (GSTs) (RANSON et al., 2002). As proteínas dessas famílias também estão envolvidas na síntese e na lise de vários metabólitos endógenos, na proteção contra o estresse oxidativo, na transmissão de sinais nervosos, e no transporte celular (HEMINGWAY et al., 2002). DETECÇÃO Da RESISTêNCIa A resistência do carrapato R. microplus aos acaricidas existe nas diferentes regiões do mundo onde é realizado o controle químico. Esse evento faz parte da habilidade da população de carrapatos em buscar alternativas de sobrevivência no ambiente. Em condições de uma forte pressão seletiva, o desenvolvimento da resistência é inevitável. Assim, o seu monitoramento em situações regionais é fundamental para avaliação da situação e propostas de ações para contornar esse problema. TESTES PaRa MONITORaR a RESISTêNCIa DOS CaRRaPaTOS Para realização dos testes de resistência, alguns procedimentos e cuidados na coleta e no transporte de amostras devem ser observados.

154 154 Capítulo 10 Resistência do carrapato-do-boi Rhipicephalus (Boophilus) microplus aos acaricidas Cuidados na coleta e no transporte de carrapatos para os testes Independentemente do tipo de teste a ser utilizado, deve ser providenciada a coleta de teleóginas. Como a maioria das teleóginas cai do hospedeiro no início da manhã, é importante manter os animais infestados contidos em locais durante a noite e realizar a coleta nos animais, e/ou no chão em torno deles, no início da manhã seguinte. É importante lembrar que a coleta da amostra deve ser realizada após um período mínimo do último tratamento realizado em função do efeito residual, e esse tempo depende do acaricida utilizado no manejo da propriedade. As amostras devem ser coletadas e imediatamente identificadas com o nome do produtor (proprietário); a data de coleta, local e tratamento utilizado. O número de carrapatos coletados vai depender do teste a ser aplicado. Para o AIT (Teste de imersão de adultos), em geral, pode ser usado um número mínimo de 10 teleóginas para cada acaricida e o mesmo para o controle. Para LPT (Teste de imersão de larvas), a amostra pode conter de 10 a 50 teleóginas. Neste último teste poucas teleóginas são suficientes para fornecer as larvas a serem utilizadas no ensaio. As teleóginas podem ficar em temperatura de geladeira (4 C) por um período de até 5 dias sem efeitos adversos, se forem imediatamente refrigeradas. Para AIT, podem ser refrigeradas por até dois dias se forem mantidas em temperatura moderada para campo um dia antes da refrigeração. Fatores que influenciam a viabilidade da teleógina vão ter um efeito direto nos resultados do AIT, mas não nos resultados do LPT (FAO, 2003). No transporte das teleóginas, é importante acondicioná-las em caixas protegidas de pressão, com papel toalha umedecido no seu interior. O transporte até ao laboratório deve ser em baixa temperatura dentro de caixa, com gelo, por exemplo, e o mais rápido possível. Condições em laboratório Ao chegar ao laboratório as teleóginas devem ser lavadas em água corrente para remover os ovos provenientes de postura durante o transporte. As teleóginas que começaram a postura não devem ser utilizadas para o AIT. A condição de incubação de teleóginas, ovos e larvas antes e durante o teste deverá ser de 27 a 28 C e 85-95% de umidade relativa (UR) e sem iluminação. A qualidade das teleóginas deve ser observada: utilizar indivíduos acima de 15 mg de peso; que ainda não estiverem realizando postura; sendo que indivíduos que apresentam algum tipo de alteração na coloração e/ou algum dano devem ser descartados. Teste de imersão de adultos (ait) O AIT com dose de discriminação tem sido recomendado como um ensaio preliminar para a resistência porque é relativamente simples. É um bioensaio aplicado em fêmeas ingurgitadas (teleóginas) de carrapatos. A metodologia do teste AIT foi descrita por Drummond et al. (1973) e foi utilizada para determinar a eficácia relativa de acaricidas contra carrapatos.

155 Capítulo 10 Resistência do carrapato-do-boi Rhipicephalus (Boophilus) microplus aos acaricidas 155 Teste de pacote de larvas (LPT) A Organização das Nações Unidas para agricultura e alimentação (FAO) tem escolhido para uso o teste de pacote de larvas (LPT) para estudos de campo sobre resistência acaricida. O Centro Mundial de Referência para a Resistência a Acaricidas (WARRC) apoia os países membros da FAO na determinação dos padrões de resistência, especialmente a organofosforados e piretroides. No entanto, outros métodos continuam sendo utilizados e melhorados. O teste conhecido como LPT baseia-se na utilização do carrapaticida em diferentes concentrações e no índice de sobrevivência de larvas expostas a estas concentrações. Os resultados deste bioensaio de larvas para o diagnóstico de resistência em R. microplus ficam prontos em cerca de seis semanas. Neste teste, as larvas são expostas a papéis de filtro impregnado quimicamente e sua mortalidade subsequente é quantificada após 24 horas do desafio. O kit contém materiais padronizados e processos obtidos a partir de dados que permitem comparar ensaios em diferentes partes do mundo. Porém, um treinamento adequado é essencial para atingir um elevado grau de confiança na técnica. Mais recentemente, os protocolos foram adaptados para lactonas macrocíclicas (LM), porém, existem alguns problemas com a aplicação do LPT padrão, AIT e protocolos para a suscetibilidade ao amitraz, exigindo modificações específicas para esse acaricida. Miller et al. (2002), adaptando tecido de nylon ao LPT, produziram resultados que melhor se adequam ao modelo log probit. É recomendado o uso de larvas de 14 a 21dias de idade (FAO, 2003). Teste de imersão de larvas (LIT) O teste de imersão larval (LIT) foi modificado por Sabatini et al. (2001) e usado para testar cepas de R. microplus com LMs para determinar as concentrações letais DL 50% e 99,9% e definir uma dose de discriminação (DD) que poderia ser usada para diagnosticar a resistência LMs. Esse bioensaio de larvas (SHAW, 1966) não é tão amplamente utilizado para o diagnóstico de resistência e não foi escolhido pela FAO. O método proporciona um resultado em seis semanas, mesmo tempo que o LPT. Estudos comparativos têm indicado que os resultados do LIT podem ser comparados com os resultados LPT. A incapacidade do LPT para diagnosticar a resistência potencial para fluazuron também se aplica ao LIT. O LIT foi utilizado pela primeira vez para detecção de resistência às ivermectinas com sucesso para diferenciar população resistente de população sensível, apesar de ainda não ser recomendado pela FAO (KLAFKE et al., 2006). Detecção de atividade esterásica A relação entre o aumento na atividade da acetylcolinesterase (AChE), com resistência aos organofosforados em linhagens de carrapato foi demonstrado por Baxter; Barker (1998).

156 156 Capítulo 10 Resistência do carrapato-do-boi Rhipicephalus (Boophilus) microplus aos acaricidas Foi desenvolvido um teste para avaliar carrapatos baseado na atividade AChE identificada em singânglio ou cérebro extraído a partir de teleóginas e inibida na presença do propoxur (carbamato). Este ensaio pode ser usado para diagnosticar insensibilidade para organofosforados e segregar os resultados em genótipos resistentes e susceptíveis (BAXTER; BARKER, 1999). Uma otimização do método de extração da AChE em singânglios de machos e fêmeas de carrapatos adultos por meio de sonificação forneceu extração homogênea entre as amostras e aumento da quantidade de AChE para ensaios bioquímicos quantitativos, levando a resultados mais seguros (PRUETT; POUND, 2006). Jamroz et al. (2000) encontraram um aumento na atividade carboxiesterase (CaEs) em cepa mexicana resistente a piretroide. Li et al. (2005) identificaram um acaricida insensível a AChE em uma cepa resistente ao organofosforado do México. Uma análise comparativa feita entre padrões de sensibilidade para esterase em malation e deltametrina em carrapatos sensíveis, revelou quatro bandas de esterases contra acetato anaphthyl, duas das quais foram carboxilesterases e duas foram AchEs sendo que uma delas com grande atividade em carrapatos resistentes ao malation (BAFFI et al., 2008). DIaGNóSTICO MOLECULaR Os ensaios biológicos para a determinação da resistência do carrapato mostram resultados relacionados com o fenótipo, sendo necessária uma média de seis semanas para verificar o seu efeito. Já o diagnóstico molecular, realizado por meio da amplificação do DNA, mostra o genótipo da população em apenas um dia, permitindo identificar mutações específicas. O papel da carboxilesterases (CaES) e acetylcholinesterases (AChEs) na resistência de R. microplus tem sido investigado demonstrando que o fenômeno pode estar relacionado com o número de cópias do gene e mutações pontuais em genes que codificam esterases (VILLARINO et al., 2003; OAKESHOTT et al., 2005). Dois genes codificando AChE foram identificados e sequenciados (AChE1 e AChE2) em cepas resistentes (BAXTER; BARKER, 2002). Hernandez et al. (2000) identificaram um ponto de mutação em um fragmento de DNA com aproximadamente 372 pares de bases de uma carboxiesterase em larvas e hemolinfa de adultos resistentes a piretroides em uma população de carrapatos mexicana. Esta mutação (G A, substituição no nucleotídeo 1120) gera um local de reconhecimento para a enzima de restrição EcoRI (CTTAAG), que foi identificado pela digestão dos produtos amplificados. Hernandez et al. (2002) encontraram uma alta frequência do genótipo homozigoto mutante em uma cepa resistente a permetrina (96% das larvas resistentes e 33% de fêmeas adultas resistentes) e identificaram que a transcrição contendo o ponto de mutação foi mais abundante na cepa resistente. Por meio da técnica de PCR, foram identificadas mutações em linhagens mexicanas de R. microplus que ocorrem por substituição de dois aminoácidos em uma proteína de canal de sódio. Essas mutações, com as substituições de Phe para Ile e Asp

157 Capítulo 10 Resistência do carrapato-do-boi Rhipicephalus (Boophilus) microplus aos acaricidas 157 para Asn, são responsáveis por conferir a estas linhagens de carrapato resistência a piretroides (GUERRERO et al., 2002). Por meio da PCR, foi possível detectar uma mutação específica em genes de canal de sódio associada com resistência a permetrina utilizando um único carrapato em qualquer estágio de desenvolvimento e em poucas horas. Também por PCR, é possível detectar um gene esterase responsável pela metabolização de permetrina, CzEst9 (FOIL et al., 2004). Pontos de mutação em genes codificadores para esterase constituem um dos principais mecanismos de resistência em R. microplus. A reação de polimerase em cadeia/polimorfismo do comprimento de fragmento de restrição (PCR-RFLP) foi usada para investigar a presença de mutações em um fragmento de uma carboxilesterase importante em carrapatos com história de resistência. Digestão de um fragmento com 372 pb utilizando EcoRI revelou diferentes frequências de três genótipos. A comparação de sequências indicou a presença de outras mutações e polimorfismo EcoRI em cepas moderadamente resistentes e resistentes (BAFFI et al., 2007). RESISTêNCIa NO BRaSIL Os primeiros registros de resistência do R. microplus ao arsênio no Brasil datam de 1953 (FREIRE, 1953). A resistência foi confirmada para organoclorados em 1953 (MARTINS et al., 2003), organofosforados em 1963 (FURLONG, 1999), piretroides sintéticos em 1989 (ARANTES et al., 1995), amidinas em 1995 (MARTINS, 1995) e lactonas macrocíclicas em 2001 (MARTINS; FUR- LONG, 2001; MARTINS et al., 2003; KLAFKE et al., 2006). Para fluazurom e spinosad a resistência, no entanto, ainda não foi detectada. Resistência aos organofosforados (OP) A resistência aos organofosforados foi notada inicialmente em 1963, no Rio Grande do Sul, estado mais afetado por carrapatos bovinos devido ao fato de seu rebanho ser composto principalmente de raças europeias (WHARTON; ROULSTON, 1977) e, posteriormente, na década de 1970 (MARTINS, 1995). No primeiro estudo bioquímico de resistência de R. microplus no Brasil, por Mendes et al. (2001), as larvas da cepa susceptível Mozo (MZ) e da cepa de campo Mancilha (MC) foram testadas para atividade de acetilcolinesterase (AChE), corroborando os dados do bioensaio. Acetato de alfa-naftil foi hidrolisado mais rápido na cepa MC do que na cepa MZ, demonstrando resistência a piretroides, mais especificamente, para a deltametrina. A máxima inibição da atividade de AChE foi obtida com propoxur 50 mm. Resistência a piretroides sintéticos A resistência a piretroides foi relatada no final de 1980 no Rio de Janeiro (LEITE, 1988) e no Rio Grande do Sul (LARANJA et al., 1989) e, posterior-

158 158 Capítulo 10 Resistência do carrapato-do-boi Rhipicephalus (Boophilus) microplus aos acaricidas mente, em várias fazendas nos dois Estados (ALVES-BRANCO et al., 1992; 1993; MARTINS et al., 1992; FLAUSINO et al., 1995). Em 1992, 81% dos banheiros carrapaticidas em fazendas no Rio Grande do Sul continham piretroides (MARTINS, 1995). Atualmente, a resistência aos piretoides sintéticos tem ocorrência generalizada também nos estados de São Paulo, Paraná, Mato Grosso do Sul e Minas Gerais (NOLAN, 1994). Com o objetivo de controlar a susceptibilidade de R. microplus aos acaricidas, Fernandes (2001) investigou os efeitos de cipermetrina, deltametrina e permetrina sobre larvas coletadas em Goiânia, no estado de Goiás. As taxas de mortalidade média após 24 horas variaram de 76,3%, para deltametrina 25 ppm, a 100%, para permetrina ppm, mas os carrapatos foram resistentes às concentrações comerciais de deltametrina e cipermetrina. Apenas permetrina a ppm alcançou o nível de eficácia oficialmente recomendado no Brasil. A cepa de R. microplus Santa Luiza, originada no sul do Brasil é resistente a permetrina e amitraz. As investigações sobre a base genética da resistência à permetrina, com experimentos de conjugação cruzada, e os mecanismos de resistência à permetrina, por meio de bioensaios sinérgicos e análise bioquímica da esterase, sugerem a presença de um gene responsável pela resistência à permetrina na cepa Santa Luiza (LI et al., 2008). A seleção de larvas F3 da cepa Santa Luiza para permetrina ou amitraz levou a um significativo aumento de resistência para ambos os acaricidas, indicando uma estreita ligação entre os genes responsáveis pela resistência a permetrina e amitraz. Os resultados sugerem que outros mecanismos, incluindo uma possível mutação no canal de sódio distinto da que atualmente é conhecida, podem ser responsáveis pela resistência à permetrina nesta cepa (LI et al., 2008). Resistência ao amitraz Traços de resistência ao amitraz foram inicialmente detectados no Rio Grande do Sul (NOLAN, 1994) e a confirmação da resistência para R. microplus alguns anos mais tarde (FURLONG, 1999). Na cepa Santa Luiza, a resistência ao amitraz foi até 154 vezes maior do que em uma cepa sensível. Esse foi o nível mais elevado de resistência entre todas as cepas de R. microplus estudadas até o momento com a versão modificada do bioensaio da FAO (MILLER et al., 2002). Em um teste de pacote de larvas da FAO modificado para medir os níveis de susceptibilidade de larvas de cepas parentais, F1, retrocruzadas, F2, e gerações de F3, o uso da cepa Santa Luiza como parental resistente revelou que a resistência ao amitraz deve ser herdada como um recessivo incompleto envolvendo mais de um gene, com forte efeito materno na expressão da resistência amitraz na progênie larval. Taxas de CL50 de 0,0024% para cepa susceptível (Muñoz) homozigoto (SS), 0,45% para carrapatos homozigotos resistentes, 0,022% para os heterozigotos com um macho susceptível e uma fêmea parental resistente, e 0,0089% para os heterozigotos com um macho resistente e uma fêmea sensível (LI et al., 2005).

159 Capítulo 10 Resistência do carrapato-do-boi Rhipicephalus (Boophilus) microplus aos acaricidas 159 Resistência a lactonas macrocíclicas A resistência a lactonas macrocíclicas (MLs) em R. microplus foi primeiramente relatada no Rio Grande do Sul em um estudo com a cepa São Gabriel, que se mostrou resistente à doramectina. Nesse estudo, a cepa foi submetida ao teste de imersão de adultos (AIT), com MLs utilizando o protocolo proposto por Sabatini et al. (2001). A cepa São Gabriel foi capaz de sobreviver e produzir ovos viáveis após o tratamento com imersão ppm de ivermectina e moxidectina, enquanto que a cepa suscetível de Porto Alegre alcançou 100% de mortalidade nas mesmas concentrações (MARTINS; FURLONG, 2001). Uma investigação realizada no Vale do Paraíba, estado de São Paulo, em uma área endêmica de R. microplus com altos níveis de resistência acaricida, levou à primeira detecção in vitro de R. microplus resistentes a ivermectina utilizando o teste de imersão larval (LIT) proposto por Sabatini et al. (2001). Outras investigações permitiram detectar a resistência de R. microplus à ivermectina em condições de laboratório pela primeira vez (KLAFKE et al., 2010). Fipronil A resistência ao Fipronil foi documentada em populações de campo de R. microplus no Brasil (CASTRO-JANER et al, 2010b), embora estudos sobre quais sejam os mecanismos envolvidos não foram relatados. avaliações REGIONaIS Da RESISTêNCIa No Brasil, o carrapato tem sido mais estudado nas seguintes regiões: Sul, por onde passa o paralelo 32 S e onde a pecuária é baseada em animais de origem europeia causando situações de instabilidade enzoótica para doenças transmitidas por carrapatos; no Sudeste, onde o setor é mais tecnificado; e, mais recentemente, na região Centro-Oeste do país, com a grande expansão da pecuária. No Nordeste, há pouca informação a respeito e, na região Norte, não há relatos. Após a detecção inicial de traços de resistência ao amitraz no Rio Grande do Sul (NOLAN, 1994), a sensibilidade/resistência de R. microplus e a dinâmica de utilização de acaricidas foram investigadas no estado na última década por Farias et al. (2008), aplicando o teste de imersão de fêmeas ingurgitadas coletadas em 124 propriedades. O surgimento de resistência aos piretroides foi detectado durante os três primeiros anos estudados, e a resistência ao amitraz nos últimos três anos (eficácia de 79% nos últimos três anos contra 95% nos três primeiros). Outro estudo mostrou uma comparação de médias de desempenho entre regiões topográficas distintas - serra e encosta -, no estado, mostrando eficácia para cipermetrina de 50-58% e deltametrina de 37-54%, respectivamente. Para o amitraz apesar de a média estar em torno de 94%, foram observados valores mínimos de 8-56%, respectivamente (SANTOS et al., 2008). Em outro estudo no mesmo estado, Camillo et al. (2009) revelaram maior eficácia para a associação de amitraz e clorpirifós, com resultados desejáveis em 100% das

160 160 Capítulo 10 Resistência do carrapato-do-boi Rhipicephalus (Boophilus) microplus aos acaricidas propriedades testadas. Associações com cipermethrina-clorpirifós-citronelol foram eficientes nos carrapatos em 61% das propriedades e cipermetrina/ethion, em 37%. A cipermetrina foi eficiente em 20,7% e o amitraz, um dos produtos mais utilizados nas propriedades, foi eficiente em 14,2% das propriedades. Estes resultados demonstram a baixa efetividade da maioria dos medicamentos utilizados regionalmente para o controle de R. microplus, medida in vitro. Também no Rio Grande do Sul, um estudo dos efeitos de acaricidas estratégicos, mais seletiva contra R. microplus, como uma prática com um potencial de criação de refúgios para os carrapatos foi realizado. Um ensaio foi desenvolvido para investigar os efeitos de tratamento estratégico seletivo dentro de um rebanho Bos taurus com o objetivo de reduzir os custos de tratamento e oferecer um refúgio para os carrapatos não submetidos ao tratamento. Um grupo foi tratado estrategicamente com avermectina e projetado para atuar diretamente contra a primeira e terceira gerações de R. microplus. O outro grupo, na mesma área, não foi tratado e a infestação foi monitorada em todo o rebanho. Os bovinos tratados tiveram altas infestações fora do período de tratamento em níveis que seriam inaceitáveis pelos fazendeiros. O grupo não tratado mostrou altas infestações nos dois períodos e as pastagens também se mostraram com altas infestações (MARTINS et al., 2002). Em um estudo no Brasil Central, a sensibilidade do carrapato-do-boi foi monitorada durante 10 anos (1.603 testes de imersão), revelando que apenas as associações entre cipermetrina-clorpirifós e cipermetrina-clorpirifós-citronela-butóxido de piperonila apresentaram eficácia de pelo menos 95%, satisfazendo as exigências do Ministério da Agricultura e Abastecimento (FURLONG et al., 2007). No estado de Minas Gerais, a sensibilidade/resistência do carrapato aos acaricidas foi avaliada de 1997 a Em geral, a eficácia acaricida foi baixa, sendo que os amidínicos apresentaram o melhor desempenho, com apenas 61%, o que pode explicar o contínuo e longo prazo de sucesso de vendas da família de acaricidas (FURLONG; MARTINS, 2000). No Vale do Paraíba (São Paulo), ensaios laboratoriais conduzidos em avaliaram a eficácia de ixodicidas comerciais contra teleóginas de R. microplus utilizando a técnica de imersão. A eficácia foi baixa para os piretroides sintéticos (28,24%), amitraz (47,19%) e a associação de piretroides sintéticos e organofosforados (88,64%) (PEREIRA, 2006). Na mesma região, a resistência de R. microplus à cipermetrina, deltametrina e clorpirifós, bem como práticas de controle de carrapato foi investigada em 12 fazendas. A utilização do teste do pacote de larvas (LPT), aprovado pela FAO, revelou resistência estabelecida a piretroides (cipermetrina e deltametrina) e resistência emergente a organofosforados (clorpirifós). Um questionário aplicado aos agricultores mostrou que as combinações de piretroides e organofosforados foram as preparações mais comuns utilizadas na região para controlar os carrapatos, seguido por amitraz e lactonas macrocíclicas (MENDES et al., 2007). Em Ilhéus, no estado da Bahia, testes de imersão in vitro, utilizando quatro carrapaticidas, foram realizados com fêmeas ingurgitadas de R. microplus

161 Capítulo 10 Resistência do carrapato-do-boi Rhipicephalus (Boophilus) microplus aos acaricidas 161 coletadas em 30 propriedades rurais aleatoriamente selecionadas. Os níveis de eficácia foram de 30,95% para amidina, 65,04% para deltametrina, 75,73% para cipermetrina-diclorvós e 75,13% para triclorfon-coumaphós ciflutrina (CAM- POS JUNIOR; OLIVEIRA, 2005). Na região semiárida do Nordeste, no estado da Paraíba, a resistência foi avaliada utilizando R. microplus ingurgitadas e R. sanguineus. Para ambas as espécies, a eficácia foi maior para amitraz (97,70% e 100%, respectivamente) do que para cipermetrina (70,5% e de 80,5%, respectivamente) (SILVA et al., 2005). No estado do Mato Grosso do Sul, uma avaliação da suscetibilidade de R. microplus a carrapaticidas piretroides mostrou que a eficácia foi geralmente inferior a 70%, tornando-os não recomendados para as fazendas investigadas. Dos 12 produtos avaliados, apenas dois (DDVP-clorfenvinfós e cipermetrina-clorpirifósbutóxido de piperonila-citronela) apresentaram níveis de eficácia superiores a 95% (97,68% e 100%, respectivamente) (KOLLER et al., 2009). Em geral, o diagnóstico da resistência contribui na escolha das bases químicas que compõem os carrapaticidas a serem empregados na população de carrapato de uma determinada propriedade. Além disso, a aplicação correta também é um fator crucial na tentativa de prolongar o período de eficácia de acaricidas existentes, haja vista que é pequena a expectativa, pelo menos em princípio, para que novos ingredientes ativos com novos mecanismos de ação sejam lançados comercialmente no curto prazo em função do custo de desenvolvimento desses novos produtos. Desta forma, as informações disponibilizadas neste texto encorajam o desenvolvimento de novos estudos para ampliar o entendimento desses mecanismos e novas formas de abordagem para buscar soluções para essa questão. REFERÊNCIAS ALVES-BRANCO, F. de P. J.; SAPPER, M. F. M.; ARTILES, J. M. Diagnóstico de resistência de Boophilus microplus a piretroides. In: CONGRESSO ESTADUAL DE MEDICINA VETER- INÁRIA, 11., 1992, Gramado. Anais... Gramado: SOVERGS, p. 44. ALVES-BRANCO, F. de P. J.; SAPPER, M. F. M.; PINHEIRO, A. C. Estirpes de Boophilus microplus resistentes a piretroides. In: SEMINÁRIO BRASILEIRO DE PARASITOLOGIA VETER- INÁRIA, 7., 1993, Londrina. Anais... Londrina: CBPV, p. A4. ANUALPEC São Paulo: AgraFNP, p. ARANTES, G. J.; MARQUES, A. O.; HONER, M. R. O carrapato do bovino, Boophilus microplus, no município de Uberlândia, MG: análise da sua resistência contra carrapaticidas comerciais. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v. 4, n.2, p , BAFFI, M. A.; SOUZA, G. R. L.; VIEIRA, C. U.; SOUZA, C. S.; GOULART, L. R.; BONETTI, A.; M. Identification of point mutations in a putative carboxiesterase and their asso ciation with acaricide resistance in Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae). Veterinary Parasitolology, v.148, p , Sept Issue 3-4. BAFFI, M. A.; SOUZA, G. R. L. de; SOUZA, C. S. de; CERON, C. R.; BONETTI, A. M. Esterase enzymes involved in pyrethroid and organophosphate resistance in a Brazilian population of Riphicephallus (Boophilus) microplus (Acari, Ixodidae). Molecular and Biochemistry Parasitology, v.160, p.70 73, July Issue 1. BARROS, A. T. M.; GOMES, A.; KOLLER, W. W. Insecticide susceptibility of horn flies, Haematobia irritans (Diptera: Muscidae), in the State of Mato Grosso do Sul, Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, São Paulo, v. 16. n. 3, p , jul./set

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163 Capítulo 10 Resistência do carrapato-do-boi Rhipicephalus (Boophilus) microplus aos acaricidas 163 FOIL, L. D.; COLEMAN, P.; EISLER, M.; FRAGOSO-SANCHEZ, H.; GARCIA-VAZQUEZ, Z.; GUERRERO, F. D.; JONSSON, N. N.; LANGSTAFF, I. G.; LI, A. Y.; MACHILA, N.; MILLER, R. J.; MORTON, J.; PRUETT, J. H.; TORR, S. Factors that influence the prevalence of acaricide resistance and tick-borne diseases. Veterinary Parasitology, v. 125, p , Oct Issues 1-2. FREIRE, J. J. Arseno e cloro resistência e emprego de tiofosfato de dietilparanitrofenila (Parathion) na luta anticarrapato Boophilus microplus (Canestrini, 1887). Boletim da Dire- toria de Produção Animal, v.9, n.17, p. 3-21, FREITAS, D. R. J. de; POHL, P. C.; VAZ JR, I. da S. Caracterização da resistência para acaricidas no carrapato Boophilus microplus. Acta Scientiae Veterinariae, v. 33, n.2, p , FURLONG, J. Diagnosis of the susceptibility of the cattle tick, Boophilus microplus, to acaracides in Minas Gerais state, Brazil. In: SEMINARIO INTERNACIONAL DE PARASITO- LOGIA ANIMAL, 4., 1999, Puerto Vallarta, México. Proceedings... Puerto Vallarta : CONA- SAG, p FURLONG, J.; MARTINS, J. R. S. Resistência dos carrapatos aos carrapaticidas. Juiz de Fora, MG: Embrapa Gado de Leite, p. (Embrapa Gado de Leite. Circular técnica, 59). FURLONG, J.; PRATA, M. C. A.; MARTINS, J. R. O carrapato dos bovinos e a resistência: temos o que comemorar? A Hora Veterinária, v.27, n.159, p , set./out GEORGE, J. E.; POUND, J. M.; DAVEY, R. B. Acaricides for controlling ticks on cattle and the problem of acaricide resistance. In: BOWMAN, A. S.; NUTTALL, P. A. Ticks: biology, disease and control. Cambridge, UK: Cambridge. University Press, p GUERRERO, F. D.; DAVEY, R. B.; MILLER, R. J. Use of an allele-specific polimerase chain reaction assay to genotype pyrethroid resistant strains of Boophilus microplus (Acari: Ixadidae). Journal of Medical Entomology, v.38, n.1, p , Jan GUERRERO, F. D.; LI, A.Y.; HERNANDEZ, R. Molecular diagnosis of pyrethroid resis- tance in Mexican strains of Boophilus microplus (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology, v.39, n.5, p , Sept GRISI, L.; MASSARD, C. L.; MOYA-BORJA, G. E.; PEREIRA, J. B. Impacto econômicodas principais ectoparasitoses em bovinos no Brasil. A Hora Veterinária, v.21, n.125, p. 8-10, jan./ fev HE, H.; CHEN, A. C.; DAVEY, R. B.; IVIE, G. W.; WAGNER, G. G.; GEORGE, J. E. Sequence analysis of the knockdown resistance-homologous regions of the para-type sodium channel gene from pyrethroid-resistance Boophilus microplus (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology, v.36, n.5, p , Sept HEMINGWAY, J.; FIELD, L.; VONTAS, J. An overview of insecticide resistance. Science, v. 298, n. 5591, p 96-97, Oct HERNANDEZ, R.; HE, H.; CHEN, A. C.; IVIE, G.W.;WAGHELA, S. D.; GEORGE, J.E.; WAGNER, G. G. Identification of a point mutation in an esterase gene in different populations of the southern cattle tick Boophilus microplus. Insect Biochemistry and Molecular Biology, v. 30, p , Oct HERNANDEZ, R.; GUERRERO, F. D.; GEORGE, J. E.; WAGNER, G. G. Allele frequency and gene expression of a putative carboxylesterase- encoding gene in a pyrethroid resistant strain of the tick Boophilus microplus. Insect Biochemistry and Molecular Biology, v. 32, p , Sept Issue 9. JAMROZ, R. C.; GUERRERO, F. D.; PRUETT, J. H.;OEHLER, D. D.; MILLER, R. J. Molecular and biochemical survey of acaricide resistance mechanisms in larvae from Mexican strains of the southern cattle tick, Boophilus microplus. Journal of Insect Physiology, v. 46, n.5, p , Mar JONSSON, N. N.; CUTULLÉ, C.; CORLEY, S. W.; EDDON, J. M. Identification of a mutation in the para-sodium channel gene of the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus associated with resistance to flumethrin but not to cypermethrin. International Journal of Parasitology, v. 40, n. 14, p , KLAFKE, G. M.; SABATINI, G. A.; ALBUQUERQUE, T. A. de; MARTINS, J. R.; KEMP, D.H.; MILLER, R. J.; SCHUMAKER, T. T. S. Larval Immersion Tests with ivermectin in populations

164 164 Capítulo 10 Resistência do carrapato-do-boi Rhipicephalus (Boophilus) microplus aos acaricidas of the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae) from State of Sao Paulo, Brazil. Veterinary Parasitology, v. 142, p , Dec Issues 3-4. KLAFKE, G. M.; ALBUQUERQUE, T. A. de; MILLER, R. J.; SCHUMAKER, T. T. S. Selection of an ivermectin-resistant strain of Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae) in Brazil. Veterinary Parasitology, v. 168, p , Issues 1-2. KOLLER, W. W.; GOMES, A.; BARROS, A. T. M. de. Diagnóstico da resistência do carrapato-do-boi a carrapaticidas em Mato Grosso do Sul. Campo Grande, MS : Embrapa Gado de Corte, p. il. Color. (Embrapa Gado de Corte. Boletim de pesquisa e desenvolvimento, 25). LARANJA, R. S.; MARTINS, J. R.; CERESER, V. H.; CORRÊA, B. L.; FERRAZ, C. Identificação de uma estirpe de Boophilus microplus resistente a carrapaticidas piretroides, no Estado do Rio Grande do Sul. In: SEMINÁRIO BRASILEIRO DE PARASITOLOGIA VETERINÁRIA, 6., 1989, Bagé. Anais... Bagé: Colégio Brasileiro de Parasitologia Veterinária, p. 83. LEITE, R. C. Boophilus microplus (Canestrini, 1887) susceptibilidade, uso atual e retrospectivo de carrapaticidas em propriedades das regiões fisiográficas da Baixada do Grande Rio e Rio de Janeiro: uma abordagem epidemiológica f. Tese (Doutorado) - Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro. LI, A.Y.; DAVEY, R. B.; MILLER, R. J.; GEORGE, J. E. Detection and characterization of amitraz resistance in the southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology, v. 41, n.2, p , Mar LI, A. Y.; PRUETT, J. H.; DAVEY, R. B.; GEORGE, J. E. Toxicological and biochemical characterization of coumaphos resistance in the San Roman strain of Boophilus microplus (Acari, ixodidae) Pesticide Biochemical and Physiology, v.81, p , Mar Issue 3. LI, A.Y.; DAVEY, R. B.; MILLER, R. J.; GUERRERO, F. D., GEORGE, J. E. Genetics and mechanisms of permethrin resistance in the Santa Luiza Strain of Boophilus microplus (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology, v. 45, n.3, p , May MARTIN, T.; OCHOU, O. G.; VAISSAYRE, M.; FOURNIER, D. Oxidases responsible for resistance to pyrethroids sensitize Helicoverpa armigera (Hubner) to triazophos in West Africa. Insect Biochemistry and Molecular Biology, v. 33, p , Sept Issue 9. MARTINS, J. R. A situation report on resistance to acaricides by the cattle tick Boophilus microplus in the state of Rio Grande do Sul, Southern Brazil. In: SEMINÁRIO INTERNACIONAL DE PARASITOLOGIA ANIMAL, 3., 1995, Acapulco, México. Anais... Acapulco: INIFAP, p.1-8. MARTINS, J. R.; CORREA, B. L.; MALA, J. Z. Resistência de carrapatos a carrapaticidas piretroides no Rio Grande do Sul. In: CONGRESSO ESTADUAL DE MEDICINA VETERINÁRIA, 11, 1992, Gramado. Anais Gramado: SOVERGS, p. 46. MARTINS, J. R.; FURLONG, J. Avermectin resistance of the cattle tick Boophilus microplus in Brazil. Veterinary Record, v. 149, n.2, p. 64, MARTINS, J. R.; EVANS, D. E.; CERESÉR, V. H.; CORRÊA, B. L. Partial strategic control within a herd of European breed cattle in the state of Rio Grande do Sul, southern Brazil. Experimental and Applied Acarology, v.27, n.3, p , MARTINS, J. R.; LEITE, R. C.; FURLONG, J. First evaluation of doramectin against a strain of the cattle tick Boophilus microplus with characteristic of resistance to the macrocyclics lactones in the field. In: INTERNATIONAL SEMINAR OF ANIMAL PARASITO- LOG, 5., 2003, Merida, Yucatan, México, Anais Merida: CONASAG, p MARTINS, J. R. Manejo da resistência aos carrapaticidas. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v.13, Suplemento 1. Edição dos Resumos do 13 Congresso Brasileiro de Parasitologia Veterinária e Simpósio Latino-Americano de Ricketisioses, Ouro Preto, MG, MENDES, M. C.; SILVA, M. X.; BRACCO J. E. Teste bioquímico para determinar a resistência de duas cepas do carrapato Boophilus microplus (Canestrini, 1887) Biochemical test to determine the resistance of two strains of the tick Boophilus micro plus (Canestrini, 1887). Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v. 10, n.2, p , ago MENDES, M. C.; PEREIRA, J. R.; PRADO, A. P. Sensitivity of Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) to pyrethroids and organophosphate in farms in the Vale do Paraíba region, São Paulo, Brazil. Arquivos do Instituto Biológico, v.74, n.2, p.81-85, 2007.

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167 11 Carrapato-dos-bovinos: ações simples permitem convivência em harmonia John Furlong Márcia Cristina de Azevedo Prata