UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO CURSO DE ESPECIALIZAÇÃO EM ENTOMOLOGIA URBANA: TEORIA E PRÁTICA

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1 unesp UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO CURSO DE ESPECIALIZAÇÃO EM ENTOMOLOGIA URBANA: TEORIA E PRÁTICA INVESTIGAÇÃO DE CARRAPATOS (IXODIDAE) DA VEGETAÇÃO DE ÁREAS PRÓXIMAS AO RIO TIETÊ E DE CÃES DE SANTANA DE PARNAÍBA, SP, ONDE HÁ CASOS SUSPEITOS DE RICKETTSIOSE FABIANA GONZALEZ PONTES Monografia apresentada ao Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Especialista em Entomologia Urbana. Julho de 2013

2 CURSO DE ESPECIALIZAÇÃO EM ENTOMOLOGIA URBANA: TEORIA E PRÁTICA INVESTIGAÇÃO DE CARRAPATOS (IXODIDAE) DA VEGETAÇÃO DE ÁREAS PRÓXIMAS AO RIO TIETÊ E DE CÃES DE SANTANA DE PARNAÍBA, SP, ONDE HÁ CASOS SUSPEITOS DE RICKETTSIOSE FABIANA GONZALEZ PONTES Orientadora: Dra. Darci Moraes Barros Battesti Monografia apresentada ao Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Especialista em Entomologia Urbana. Julho de 2013

3 AGRADECIMENTOS Agradeço profundamente minha orientadora Dra. Darci Moraes Barros Battesti, pesquisadora do Instituto Butantan, pela disposição, aprendizado, confiança, paciência e apoio no planejamento desta monografia. À coordenação e professores do curso de Especialização de Entomologia Urbana da Universidade Estadual Paulista (UNESP) campus Rio Claro e Instituto Biológico. À minha chefe Dra. Carolina Oliveira e também minha ex-chefe Mariangela P. R. Pessuto por me apoiarem na realização desta pós-graduação permitindo minha ausência nos dias de aula, de coletas, identificação, análise do meu material, e também para o planejamento da monografia. Ao Pericles Silva por todo apoio, paciência e ajuda na realização das coletas de carrapatos. Agradeço por ser meu parceiro em todos os momentos. À todos os funcionários e estudantes do laboratório Especial de Coleções Zoológicas do Instituto Butantan, em especial, Renata K. Sakai por me ensinar o método de arraste na vegetação e me acompanhar na primeira coleta, Diego Ramirez pela disposição em ajudar na coloração das lâminas, Fernando de Castro Jacinavicius pela ajuda na identificação e nas fotos dos carrapatos e Gabriel Alves Landulfo pela atenção e disposição em ajudar nos cálculos estatísticos. Agradeço também ao Thiago Martins pela ajuda na identificação das larvas e ninfas e ao Francisco Borges pela disposição em corar e analisar as lâminas, ambos do laboratório de Doenças Parasitárias do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal da Universidade de São Paulo (USP), pela disposição e colaboração na identificação dos carrapatos, fotos e análise das lâminas. Aos meus colegas de curso pelas trocas de experiências e bons momentos que passamos juntos durante o período em que estivemos nesta pós-graduação. À administração do Condomínio Vila Velha por permitir a coleta de carrapatos. Agradeço especialmente aos meus pais José Pontes e Ivanir Gonçalves, por me apoiarem em absolutamente todos os momentos da minha vida.

4 RESUMO Considerando que houve suspeita de casos de Febre Maculosa em Santana de Parnaíba, SP, o objetivo do presente estudo foi identificar a situação atual da presença de carrapatos na vegetação e em cães do município e também investigar se os carrapatos coletados estavam infectados. A Febre Maculosa Brasileira (FMB) é uma doença causada pela bactéria Rickettsia rickettsii transmitida por carrapatos. As coletas foram realizadas no período seco e chuvoso de 2012 a 2013, por meio de arraste na vegetação às margens do rio Tietê e em um condomínio fechado. As seguintes espécies de carrapatos, em fase ninfal e adulta, foram encontradas: Amblyomma dubitatum, Amblyomma cajennense e Haemaphysalis juxtakochi. Os espécimes em fase larval foram identificados somente até gênero. Não houve diferença significativa entre os locais investigados quanto ao número de carrapatos coletados e nem entre os períodos seco e chuvoso. Os cães trazidos voluntariamente pelos seus proprietários ao Centro de Controle de Zoonoses do município, no mesmo período acima, foram também examinados. As seguintes espécies de carrapatos (em fase adulta) foram obtidas: Amblyomma aureolatum, Amblyomma ovale e Rhipicephalus sanguineus. Houve diferença significativa pelo teste t (p=0,05) e Qui-Quadrado (p<0,05; p=0,03), sendo maior o número de carrapatos coletados de cães na estação chuvosa e R. sanguineus foi a espécie mais representativa. O bairro mais infestado foi Suru, com índice médio de infestação em torno de 7,0 carrapatos por animal e a porcentagem de infestação foi de 43,7%. Testes de hemolinfa para detecção de Rickettsia no material investigado foram inconclusivos, tanto para os carrapatos coletados nos cães quanto da vegetação. Porém, três amostras de ninfas de A. cajennense provenientes da vegetação do condomínio residencial evidenciaram suspeitas da presença da bactéria. Os resultados obtidos neste estudo sugerem que há necessidade de elaboração de medidas profiláticas e que possam servir para orientação da população do município, já que tanto os principais vetores e reservatórios estão presentes nas áreas estudadas. Palavras chave: carrapatos, vetores, Febre Maculosa Brasileira, Santana de Parnaíba

5 ABSTRACT Because of the suspected cases of Spotted Fever in Santana de Parnaíba, SP, the aim of this study was to identify the current situation of ticks on vegetation and in dogs of the municipality, and also investigate if the collected ticks were infected. Brazilian Spotted Fever (BSF) is a disease caused by the bacterium Rickettsia rickettsii transmitted by ticks. Samples were obtained during the dry and rainy seasons from 2012 to 2013, through cloth of dragging on vegetation of the margins of the river Tietê and within a residential condominium. The nymphs and adults collected from these areas were identified as Amblyomma dubitatum, Amblyomma cajennense and Haemaphysalis juxtakochi. The larval specimens were identified as Amblyomma sp. There was no significant difference between the investigated areas and the number of ticks nor between the dry and rainy seasons. The dogs brought voluntarily by their owners to the Center of Zoonosis Control of the municipality, during the same period, were also examined. Were obtained adult ticks only and they were identified as: Amblyomma aureolatum, Rhipicephalus sanguineus and Amblyomma ovale. The greater number of ticks from dogs was collected in the rainy season, and R. sanguineus was the most representative species. These differences were significant by the test t and chi-square, respectively (p = 0.05) and (p <0.05, p = 0.03). The more infested neighborhood was Suru, with 7.0 ticks per animal and the percentage of infestation was 43,7%. Tests for detecting Rickettsia of the hemolymph of the investigated material were inconclusive for ticks from the dogs and from the vegetation. However, the hemolymph obtained of three nymphs of A. cajennense from vegetation of the residential condominium showed suspicion of the presence of bacteria. The results of this study suggest that there is need prophylactic measures and can serve to orientate the local population, because the main vectors and reservoirs are present in the studied areas. Keywords: ticks, vectors, spotted fever, Santana de Parnaíba

6 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO JUSTIFICATIVA OBJETIVOS MATERIAL E MÉTODOS Áreas de estudo Áreas 1 a 3 Carrapatos obtidos na vegetação Coleta de carrapatos nos cães trazidos ao CCZ RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 24

7 7 1. INTRODUÇÃO No mundo são conhecidas mais de 890 espécies de carrapatos classificadas em 3 famílias: Argasidae, Ixodidae e Nuttalliellidae (GUGLIELMONE et al., 2010). As duas primeiras possuem ampla distribuição geográfica enquanto que a última está restrita à África do Sul e Tanzânia. Na região Neotropical ocorrem aproximadamente 200 espécies (BARROS- BATTESTI et al., 2006). Nessa região os carrapatos estão representados por aproximadamente 80 espécies de argasídeos, incluídas em cinco gêneros: Antricola, Argas, Nothoaspis, Ornithodoros e Otobius; e 118 espécies de ixodideos, também incluídas em cinco gêneros: Amblyomma, Dermacentor, Haemaphysalis, Ixodes e Rhipicephalus (BARROS-BATTESTI et al., 2006). No Brasil, o número de espécies de carrapatos está em torno de 64, mas esse número deve aumentar, porque novas espécies estão sendo descritas (DANTAS-TORRES et al., 2012). Segundo dados da Coleção Acarológica do Instituto Butantan (IBSP), para o município de Santana de Parnaíba há 4 espécies catalogadas nessa coleção, Dermacentor nitens, Haemaphysalis juxtakochi, Ixodes aragaoi, e Rhipicephalus microplus. Ainda segundo a coleção IBSP, para o Estado de São Paulo, há 1492 lotes de carrapatos tombados, perfazendo 34 espécies distribuídas em 8 gêneros, sendo Amblyomma o mais representativo com 20 espécies. Duas delas têm grande importância epidemiológica do ponto de vista em Saúde Pública, A. cajennense e A. aureolatum (PINTER et al., 2004). A espécie A. cajennense possui ampla distribuição geográfica no território brasileiro, além de ser o principal vetor de FMB. Em São Paulo é encontrada na região Centro-Leste do Estado, ocorrendo em áreas com média à densa cobertura vegetal, tais como pastos "sujos", capoeiras e matas, em especial, matas ciliares. Seus hospedeiros primários são cavalos e capivaras. A espécie A. aureolatum é comum nas áreas de mata Atlântica das regiões Sul e Sudeste do Brasil, predominante na Região Metropolitana de São Paulo. É reconhecidamente um vetor de Rickettsia dentro desta região. O estágio adulto tem preferência em parasitar carnívoros em geral que são seus hospedeiros primários assim como as aves e pequenos roedores que são hospedeiros para

8 8 os estágios imaturos. A primeira espécie é extremamente antropofílica e pouco específica, parasitando diferentes classes animais, enquanto que a segunda é mais específica, ocorrendo principalmente em cães, e o parasitismo em humanos é acidental (LABRUNA, 2009). Outra espécie que passou recentemente a ter importância epidemiológica é R. sanguineus. Em um trabalho realizado em Juiz de Fora (PACHECO et al., 2011), os autores verificaram uma alta taxa de carrapatos infectados e 9% das fêmeas naturalmente infectadas foram eficientes para transmitir a bactéria aos ovos. A Febre Maculosa Brasileira, doença causada pela bactéria Rickettsia rickettsii transmitida por carrapatos foi identificada no estado de São Paulo em 1929 (DIAS & MARTINS, 1939). Entre 1988 a 1997, foram confirmados 25 casos da doença em 6 municípios do Estado (SOUZA et al., 2009). Segundo esses autores, de 1998 a 2007, foram registrados 255 casos distribuídos em 54 cidades. Uma hipótese para o crescente do número de casos se refere ao aumento do número de reservatórios naturais da rickettsia, como as capivaras, por exemplo, contribuindo para a disseminação dos carrapatos infectados. Consequentemente há uma expansão da doença em locais onde se encontram animais domésticos e população humana (LIMA et al., 1995). Por outro lado, o acréscimo de registros de casos se deve também a uma maior eficiência no diagnóstico, especialmente após 2001, quando a doença se tornou de notificação compulsória. Acredita-se que as ninfas sejam mais responsáveis pela infecção em humanos do que as larvas de A. cajennense, embora adultos também possam transmitir a bactéria (LABRUNA, 2009). Devido à distribuição sazonal da doença há correlação das fases de ninfa e adulto do carrapato entre os meses de julho e novembro com maior carga parasitária (VARICELA, 2003). No caso de A. aureolatum, a transmissão da bactéria para humanos ocorre principalmente por adultos, já que os estágios imaturos são específicos de aves e roedores silvestres (PINTER, 2007). O patógeno é transmitido pela saliva do carrapato, depois de 4 a 6 horas do parasitismo. E pode ocorrer através da escoriação na pele, após a retirada do mesmo. Também por acidente com agulhas e outros instrumentos contaminados. O período de incubação da

9 9 doença é de 2 a 14 dias (frequentemente 7). Ocorrem manifestações clínicas como febre alta, cefaleia, dor nas articulações, náuseas, com regressão da doença se tratada rapidamente no início da doença. À medida que a doença progride, as manifestações ser tornam mais intensas com o surgimento de manchas na pele que se espalham nas mãos e pés (GUIMARÃES et al., 2001). Com esse quadro, os casos são extremamente graves levando a óbito. As taxas de letalidade chegam entre 40% a 70%. Inquéritos soroepidemiológicos em áreas endêmicas sugerem que podem acontecer formas assintomáticas (VARICELA, 2003). Nos municípios de Pedreira (SP) e Novo Cruzeiro (MG), em indivíduos sadios, houve soropositividade para riquétsias do grupo FM. Isso significa que tais achados não são necessariamente quadros assintomáticos, mas pode ser infecções por riquétsias não patogênicas. Segundo o Centro de Vigilância Epidemiológica (2011) nos últimos sete anos mais casos desta doença foram notificados como Campinas, Piracicaba, Salto, Mogi das Cruzes, Santo André, São Bernardo do Campo, Diadema, Ribeirão Pires, Mauá, Ourinhos, Chavantes, Canitar, Maracai, Paraguaçu, Cosmopólis, Jaguariuna, Pedreira, Valinhos, Vinhedo, Sorocaba, Porto Feliz, Ubatuba, Salto, entre outros. A letalidade em São Paulo vem se mostrando muito elevada, se comparada com Minas Gerais e Santa Catarina que são estados onde a FMB é endêmica (MEDEIROS et al., 2011). Vacina para FMB foi produzida no Instituto Butantan nos anos 50 e existiu até a década de 70. Mas era ineficaz e se tornou obsoleta. Portanto, a melhor medida é evitar a exposição ao carrapato, em áreas de risco ou não. É necessário o auto exame pelo menos a cada 4 horas e a retirada do carrapato deve ser feita cuidadosamente, evitando o esmagamento. Em casos suspeitos a confirmação se faz pela sorologia (IFI), isolamento de riquétsias em cultura ou ainda por exame imunohistoquímico. Em caso de picadas, se houver febre alta, procurar o médico imediatamente e avisar que foi picado por carrapatos. Uma vez a doença confirmada, ações devem ser iniciadas no sentido de identificar e investigar o local provável de contaminação. Medidas preventivas devem ser adotadas incluindo ações educativas e ambientais (VARICELA, 2003).

10 10 Santana de Parnaiba é um município localizado às margens do Rio Tietê onde há fluxo contínuo de animais domésticos e silvestres, além dos condomínios residenciais e de outras moradias próximas às matas ciliares. Dessa forma, o conhecimento das espécies de carrapatos nessas áreas poderá ser útil para auxiliar ações futuras de educação ambiental na prevenção de FMB, já que são áreas de risco por onde circulam reservatórios da bactéria JUSTIFICATIVA Considerando que houve suspeita de casos de Febre Maculosa no município de Santana de Parnaíba e que há reservatórios e vetores com potencial para transmissão desta bactéria, o presente estudo se mostra relevante por possibilitar um mapeamento da situação atual de espécies de carrapatos que ocorrem nesses locais e em cães que chegam ao Centro de Controle de Zoonoses local. Além disso, possibilitará a elaboração de estratégias como medidas profiláticas que possam servir para orientação da população OBJETIVOS Geral: Investigar carrapatos presentes na vegetação de áreas às margens do Rio Tietê e de cães do município de Santana de Parnaíba, SP, visando detectar a presença do agente etiológico da Febre Maculosa Brasileira. Específicos: 1) Identificar os carrapatos coletados por meio de arrasto na vegetação às margens do Rio Tietê e de um condomínio residencial; 2) Identificar carrapatos de cães trazidos ao Setor de Zoonoses do município de Santana de Parnaíba, SP para atendimento clínico; 3) Investigar a presença de Rickettsia na hemolinfa dos carrapatos coletados.

11 11 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Áreas de estudo O município de Santana de Parnaíba está à 696 m altitude e se localiza a oeste da grande São Paulo, a 38 km da capital, entre as rodovias Castelo Branco e Anhanguera. Estabelece divisa com seis municípios: Araçariguama, Barueri, Cajamar, Itapevi, Pirapora do Bom Jesus e São Paulo (PREFEITURA SANTANA DE PARNAÍBA, 2012). Compreende uma parte do rio Tietê e abrange 180,982 km² de extensão (46º55 04 O e 23º26 39 S), contendo em média habitantes (IBGE, 2010). O clima é temperado com temperaturas médias de 18ºC. As coletas de carrapatos da vegetação e dos cães do município foram conduzidas no período de Agosto de 2012 a Maio de 2013, conforme detalhado abaixo Áreas 1 a 3 Carrapatos obtidos na vegetação As áreas 1 (23 26'24,64" S 46 54'23,32" W) e 2 (23 26'23,63" S 46 54'21.08"W) (Figura 1) estão localizadas próximas a uma das margens do rio Tietê, habitada por animais silvestres como: capivaras, quatis, répteis, garças, urubus, passeriformes em geral, e eventualmente animais domésticos, como, bovinos, equinos e cães. A área 1 compreende um trecho do rio onde há mais lixo que nas outras áreas e está sujeita aos alagamentos nos períodos chuvosos. A área 2, também localizada à margem do rio, tem vegetação arbustiva e árvores de médio porte, porém é menos sujeita aos pontos de alagamento e lixo. A área 3 (23 26'19,68" S 46 53'48,31" W) localiza-se em um condomínio residencial particular, com cobertura vegetal incluindo espaço para lazeres e três lagos onde habitam capivaras entre outros animais silvestres, e eventualmente cães de moradores do condomínio. As coletas de carrapatos da vegetação foram sazonais em todas as áreas, e os arrastes ocorreram em um dia a cada estação, nos meses: Agosto, Novembro (2012), Fevereiro e Maio (2013), compreendendo duas coletas no período seco (de outono e inverno) e duas no período chuvoso (primavera e verão) em cada uma das áreas, totalizando 12 arrastes. Os carrapatos foram

12 12 colhidos na vegetação em locais onde há fezes e vestígio da presença de capivaras. Figura 1. Áreas de coletas de carrapatos (da vegetação e em cães) do município Santana de Parnaíba, SP (marcação em amarelo). Mapa obtido do programa google Earth. O método de arraste (Figura 2) consistiu em passar uma flanela branca (100 cm x 50 cm) por entre a vegetação (OLIVEIRA et al., 2000). A cada 10m o

13 13 tecido foi inspecionado para verificar se houve a presença de carrapatos presos. Figura 2. Arraste na vegetação às margens do Rio Tietê, no município de Santana de Paranaíba, SP para coleta de carrapatos em vida livre. Ao fundo há uma população de capivaras. Após a coleta, as larvas foram colocadas diretamente em álcool absoluto enquanto que adultos e ninfas foram submetidos ao teste de hemolinfa. Para tanto, o tarso de uma das pernas de cada exemplar foi cortado e a gota de hemolinfa foi colhida e depositada sobre uma lâmina etiquetada com um número de lote, correspondente a área e ao mês de coleta. Em seguida os espécimes foram colocados em tubo eppendorf contendo álcool absoluto, aguardando o momento de serem identificados. As lâminas contendo hemolinfa foram coradas conforme Giménez (1964), de acordo com o protocolo abaixo: - Em um frasco colocar 30 ml tampão fosfato + 15 ml de fuccina; - passar o conteúdo por um filtro de papel (2 vezes);

14 14 - pingar a solução sobre a gota de hemolinfa e deixar agir por 2 minutos; - lavar em água corrente para eliminar o excesso da solução e em seguida colocar uma gota de verde malaquita, deixando agir por 10 segundos (repetir a etapa duas vezes) Coleta de carrapatos nos cães trazidos ao CCZ A coleta de carrapatos em cães foi realizada duas vezes por mês durante 10 meses (Agosto de 2012 à Maio de 2013), em cães trazidos voluntariamente pelos proprietários, ao CCZ (23 26'29,86"S 46 54'23,48"W), para atendimento clínico. Os carrapatos colhidos em cada cão receberam um número de lote. Em seguida cada espécime foi submetido ao teste de hemolinfa e as lâminas foram coradas conforme Giménez (1964) pelo protocolo descrito acima. As lâminas preparadas com hemolinfa de carrapatos da vegetação e dos cães foram examinadas ao microscópio óptico da marca Zeiss, modelo Axiolab DRB KT , no Laboratório Especial de Coleções Zoológicas do Instituto Butantan, para investigação da presença de Rickettsia e o aumento utilizado 1200 x. Para identificação dos carrapatos adultos utilizou-se o guia ilustrado de carrapatos da região neotropical, seguindo-se a chave dicotômica de Onofrio et al. (2006). No caso de carrapatos imaturos, todas as ninfas foram identificadas até espécie utilizando-se a chave proposta por Martins et al. (2010). As larvas foram identificadas até gênero, já que para identificação específica é necessário fazer sequenciamento gênico (esta etapa será conduzida posteriormente no mestrado). Após identificação taxonômica todos os carrapatos foram depositados na Coleção Acarológica do Instituto Butantan (IBSP) Tratamento estatístico No caso dos carrapatos coletados na vegetação, aplicou-se o Teste t de Student (teste de hipótese para aceitar ou rejeitar a hipótese nula quando os

15 15 dados seguem uma distribuição t) para verificar se houve diferença significativa entre as estações sazonais (seca e chuvosa) em relação ao total de carrapatos coletados nas áreas investigadas, e também se houve diferença entre as áreas. O teste de Qui-Quadrado também foi aplicado. O programa utilizado para as análises foi Bioestat versão 5.0, No caso dos carrapatos de cães, utilizou-se o mesmo teste para avaliar se houve diferença significativa entre os carrapatos colhidos nos cães do CCZ e os períodos (seco e chuvoso). Foi ainda calculada a porcentagem de cães infestados (CI) em relação aos examinados (CE) para cada bairro, e a prevalência de infestação de carrapatos (PI) nesses cães. O cálculo da prevalência foi obtido dividindo-se o número de carrapatos coletados (n) pelo CI. A prevalência de infestação relativa (PIE) foi calculada dividindo-se o número de carrapatos pelo total de cães examinados. A PIE apesar de não contemplar amostras homogêneas, ela possibilitou verificar a dimensão da infestação em determinado bairro, quando a porcentagem de infestação foi > 20%. 3. RESULTADOS 3.1. Carrapatos da vegetação Na vegetação das três áreas investigadas 164 carrapatos foram obtidos nos 12 arrastes, sendo 146 larvas de Amblyomma sp., 16 ninfas (4 de A. cajennense, 11 de A. dubitatum e 1 de H. juxtakochi) e apenas 2 carrapatos adultos (A. cajennense) (Tabela 1). Considerando cada uma das áreas separadamente, na área 1 foram obtidas 61 larvas do gênero Amblyomma, encontradas durante o período seco (32) e chuvoso (29). Na área 2 foram encontradas 40 larvas também de Amblyomma sp., sendo 25 coletadas no período seco e 15 no chuvoso. Além de 4 ninfas de A. dubitatum no período chuvoso. Na área 3, foram obtidas 45 larvas de Amblyomma ap., sendo 27 no período seco e 18 no período chuvoso. Ainda na área 3 foram coletadas 12 ninfas, sendo 4 A. cajennense, 7 A. dubitatum e 1 H. juxtakochi, e dois adultos (macho e fêmea) de A. cajennense. Quando se analisou a presença de carrapatos coletados desconsiderando as espécies e estágios biológicos, nas áreas investigadas,

16 16 Tabela 1. Espécies de carrapatos, segundo o estágio biológico, colhidas da vegetação das margens do rio Tietê e de um condomínio fechado em Santana de Parnaíba, de agosto de 2012 a maio de Adultos ÁREA 1 ÁREA 2 ÁREA 3 ESPÉCIE Ago Nov Fev Mai Ago Nov Fev Mai Ago Nov Fev Mai Amblyomma cajannense Amblyomma dubitatum Haemaphysalis juxtakochi Subtotal Ninfas ÁREA 1 ÁREA 2 ÁREA 3 ESPÉCIE Ago Nov Fev Mai Ago Nov Fev Mai Ago Nov Fev Mai Amblyomma cajannense Amblyomma dubitatum Haemaphysalis juxtakochi Subtotal Larvas ÁREA 1 ÁREA 2 ÁREA 3 ESPÉCIE Ago Nov Fev Mai Ago Nov Fev Mai Ago Nov Fev Mai Amblyomma sp Subtotal Total* *Total de carrapatos da vegetação = 164 segundo os períodos de seca e chuva, nenhuma significância estatística foi observada (Test-t: p>0,05; p: 0,2437) (Figura 1). Da mesma forma, quando se comparou a abundância de carrapatos coletados, desconsiderando as espécies e estágios biológicos, segundo as áreas investigadas, não houve significância estatística observada (Test-t: p>0,05; p: 0,06204), mesmo juntando as duas

17 17 primeiras áreas (Figura 2). Os dados referentes às figuras estão demonstrados nos Apêndices A e B. Figura 1. Número total de carrapatos coletados da vegetação (eixo y) de 3 áreas investigadas (eixo x) em Santana de Parnaiba, SP, segundo os períodos, seco e chuvoso, de Agosto de 2012 a Maio de a: valores nas colunas, seguidos de letras iguais não diferem entre si pelo teste Test-t: p>0,05 (p:0,2437). Figura 2. Comparação da quantidade de carrapatos (eixo y), segundo as áreas investigadas (margens do rio Tietê e condomínio residencial) (eixo x) do município de Santana de Parnaiba, de Agosto de 2012 a Maio de a: valores nas colunas, seguidos de letras iguais não diferem entre si pelo teste Test-t: p>0,05 (p:0,06204), embora evidencie uma tendência de maior abundância nas margens do rio, desde que duas áreas foram somadas.

18 Carrapatos dos cães Do total de 398 cães examinados, 52 (13%) estavam infestados por 189 carrapatos, sendo 38 (20%) exemplares da espécie A. aureolatum, 1 (0,5%) de Amblyomma ovale e 150 (79%) de R. sanguineus (Tabela 2). Apesar do número de cães examinados ter sido um evento aleatório, ele ainda pode estar condicionado a alguns fatores como meio de transporte, divulgação do atendimento clínico naquele bairro e renda familiar, com algumas exceções, como é o caso do bairro Sitio Tanquinho (bairro pequeno) que está localizado próximo (cerca de 1 km) ao CCZ. Embora exista essa proximidade, somente 7 cães foram levados ao CCZ para atendimento veterinário, durante todo o período do presente estudo, e destes, 2 estavam infestados com PI de 3,0 para R. sanguineus e 1,0 para A. aureolatum e porcentagem de infestação de 28,6%. Por outro lado, o bairro Fazendinha (grande) que é formado por vários sub-bairros, está localizado há aproximadamente 5 km do CCZ, teve o maior número de cães examinados (37), porém com a mais baixa porcentagem de infestação (4,3%). Mas, mesmo assim, somente 1 cão estava infestado com uma prevalência de 5,0 carrapatos. Ambos os bairros são formados por moradores de média a baixa renda. Assim, considerando a prevalência de infestação de carrapatos por cães infestados, o bairro Suru apresentou os maiores índices, respectivamente, para R. sanguineus (7,0) e A. aureolatum (6,0), com uma porcentagem de infestação de 43,7%. Vale ressaltar que um dos cães infestados com A. aureolatum estava também parasitado por A. ovale. Em relação à prevalência de infestação por cão examinado, esse bairro continua sendo o mais infestado. No caso específico do Suru, há uma população com renda variável (de baixa a alta) vivendo em área verde relativamente densa, com chácaras por onde circulam animais domésticos e silvestres. Os cães desse bairro foram trazidos por moradores de baixa a média renda que residem em chácaras. O Centro foi o segundo local com mais alta porcentagem de infestação (29,4%). Entretanto, a prevalência de infestação foi de 3,2 para R. sanguineus e de 2,0 para A. aureolatum para 5 cães infestados, dentre os 17 examinados.

19 19 Tabela 2. Carrapatos, segundo as espécies, coletados em cães trazidos ao CCZ de Santana de Parnaiba, procedentes de diferentes bairros, no período de Agosto de 2012 a Maio de R. sanguineus PI A. aureolatum PI Total BAIRROS CE = 398 CE = 398 CE = 398 CE CI (%) n CI (%) n CI (%) n (PIE) São Pedro 35 2 (5,7) 9 4,5 1 (2,8) 1 1,0 3 (8,6) 10 (0,3) Suru 16 4 (25,0) 28 7,0 3 (18,7) 18* 6,0 7 (43,7) 46 (2,9) Refugio dos Bandeirantes 26 2 (7,7) 8 4,0 1 (3,8) 4 4,0 3 (11,5) 12 (0,5) Jd. Parnaiba (7,7) 3 3,0 1 (7,7) 3 (0,2) Fazendinha 37 1 (4,3) 5 5, (4,3) 5 (0,1) Poupança 19 1 (5,2) 3 3, (5,2) 3 (0,2) Parque Santana I 23 2 (8,7) 4 2,0 1 (4,3) 1 1,0 3 (13,0) 5 (0,2) Jardim Isaura 27 4 (14,8) 8 2,0 1 (3,7) 2 2,0 5 (18,5) 10 (0,4) Chácara das Garças 15 1 (6,7) 4 2,0 3 (20,0) 7 2,3 4 (23,5) 11 (0,7) Centro** 17 4 (23,5) 13 3,2 1 (5,9) 2 2,0 5 (29, 4) 15 (0,9) Sitio do Morro 10 1 (10,0) 5 5, (10,0) 5 (0,5) Pacu 6 1 (16,6) 3 3, (16,6)3 (0,5) Votuparim 12 2 (16,6) 10 5, (16,6) 10 (0,8) Itapuã 15 2 (13,3) 10 5, (13,3) 10 (0,7) Jardim São Luiz 22 2 (9,1) 7 3, (9,1) 7 (0,3) Vila Velha 13 1 (7,7) 2 2, (7,7) 2 (0,2) Bairro Cento e Vinte 20 2 (10,0) 9 4, (10,0) 9 (0,5) Vila Esperança 11 1 (9,1) 3 3, (9,1) 3 (0,3) Sitio Tanquinho** 7 1 (14,0)3 3,0 1 (14,3) 1 1,0 2 (28,6) 4 (0,6) Jaguari 11 1 (9,1) 3 3, (9,1) 3 (0,3) Cururuquara 15 1 (6,7) 2 2, (6,7) 2 (0,1) Parque Sinai 14 2 (14,0) 7 3, (14,3) 7 (0,5) Chácara Solar II 14 1 (7,0) 4 4, (7,1) 4 (0,3) Total (9,8) 150 3,8 13 (3,3) 39 3,0 52 (13,1) 189 (0,5) Em negrito está destacado o bairro com as mais altas prevalências de infestação por cão examinado e infestado. CE, cães examinados; CI (%), cães infestados e entre parênteses é a porcentagem de cães infestados; n, número de carrapatos coletados; PI, prevalência de carrapatos em cães infestados; PIE, prevalência de carrapatos em cães examinados. * Um cão da localidade de Suru estava infestado por A. aureolatum e por 1 exemplar macho de A. ovale; ** parasitismo concomitante de R. sanguineus e A. aureolatum. O terceiro bairro com alta porcentagem de infestação foi Chácara das Garças (23,5%) que está localizado próximo às margens do rio Tietê, mas distante do CCZ cerca de 4 km. As prevalências de infestação foram de 2,0 para R. sanguineus e 2,3 para A. aureolatum. Quanto à sazonalidade, no período chuvoso foram colhidos 124 carrapatos nos cães do CCZ, enquanto que no período seco, o número caiu para 65. Houve diferença significativa pelo teste t (p=0,05) e Qui-Quadrado (p<0,05; p=0,03), sendo maior o número de carrapatos coletados de cães na

20 20 estação chuvosa e R. sanguineus foi a espécie mais representativa, sendo Qui- Quadrado de (grau de liberdade 1) e p = 0,019. Tabela 3. Carrapatos adultos, segundo as espécies, coletados em cães trazidos ao CCZ de Santana de Parnaiba durante as estações, seca (abril a setembro) e chuvosa (outubro a março), de 2012 e 2013*. Estação seca Estação chuvosa Total Amblyomma aureolatum Rhipicephalus sanguineus Total 65 a 124 b 189 CCZ, Centro de Controle de Zoonoses. * Foi encontrado um exemplar macho de A. ovale, excluído da analise. a: valores nas colunas, seguidos de letras minúsculas iguais não diferem entre si p <0,05 (p=0.03) 3.3. Teste da hemolinfa para detecção da presença de Rickettsia O número de carrapatos coletados da vegetação e investigados para a presença de Rickettsia na hemolinfa, excetuando as larvas, foi 18, enquanto que 189 carrapatos colhidos nos cães foram submetidos ao teste. Somente 3 lâminas de hemolinfa de ninfas de A. cajennense provenientes do Condomínio Residencial deram estruturas similares morfologicamente à bactéria, Rickettsia. Quanto ao restante das amostras o resultado não foi conclusivo. Portanto, o material suspeito preservado em álcool absoluto (tombado no IBSP) será submetido ao teste de PCR seguido de sequenciamento de DNA, para a confirmação da presença do agente etiológico da Febre Maculosa nesses carrapatos. Isto será realizado posteriormente durante o Mestrado. 4. DISCUSSÃO As espécies de carrapatos encontradas nas áreas de vegetação são típicas de animais silvestres (presença de veados H. juxtakochi; de quatis, gambás e aves A. aureolatum; e de capivaras A. dubitatum) (BARROS- BATTESTI et al., 2000) e de animais domésticos (cães, cavalos, bovinos entre outros) da grande São Paulo. A espécie A. cajennense é de baixa

21 21 especificidade, e, portanto, pica esses animais sem distinção (SOARES et al., 2012) e é altamente antropofílica (GUGLIELMONE et al., 2006). No entanto, para que essa espécie se mantenha nessas áreas, é imprescindível a presença de capivaras e cavalos que são seus hospedeiros naturais (LABRUNA, 2009). Apesar de terem sido investigadas 3 áreas verdes em Santana de Parnaiba e os arrastes terem sido uma vez a cada 3 meses, ainda assim, ficou evidenciada a presença de carrapatos potenciais vetores de R. rickettsii nos locais estudados (A. cajennense, A. aureolatum e A. dubitatum). A espécie H. juxtakochi também pode estar infectada, mas por Rickettsia rhipicephali outra bactéria do grupo de Febre Maculosa, porém, este carrapato não pica humanos e a riquétsia é considerada não patogênica. A espécie A. cajennense, sem dúvida é a principal vetora do agente etiológico da Febre Maculosa Brasileira (SOUZA et al., 2009). Considerando todos os carrapatos coletados no presente estudo, tanto da vegetação quanto dos cães, a porcentagem de espécimes suspeitos foi de 0,8%. Na natureza, o número de carrapatos infectados desta espécie, sempre é baixo (em torno de 1%) porque a bactéria é letal também para o carrapato (LABRUNA, 2009). Segundo o autor, quando a taxa de infecção no vetor é elevada, caso de A. aureolatum, por exemplo, 80 a 100% em experimento laboratorial, a bactéria não é patogênica para o carrapato. Esta espécie é implicada como vetora de R. rickettsii no estado de São Paulo desde Os carrapatos adultos alimentam-se preferencialmente em carnívoros (GUGLIELMONE et al., 2006; LABRUNA et al., 2005), enquanto que a fase imatura tem preferência por aves Passeriformes e algumas espécies de roedores silvestres (ARZUA et al., 2003; PINTER & LABRUNA, 2006). Embora A. aureolatum seja um carrapato comum em cães da área metropolitana de São Paulo, especialmente em locais altos e próximos aos fragmentos de mata atlântica (acima de 700 m) como é o caso de Santana de Parnaiba, as picadas em humanos são acidentais. Por outro lado, A. aureolatum é excelente reservatório de Rickettsia na natureza, porque quase 100% deles são suscetíveis à infecção (SOARES et al., 2012). Como ele pica

22 22 cães e está presente também nas áreas verdes de entorno das residências, mais um motivo para alertar os moradores dessas áreas. A espécie A. dubitatum, por sua vez, é altamente específica de capivaras, e na natureza, esses carrapatos são naturalmente infectados por Rickettsia bellii que é uma Rickettsia considerada não patogênica (LABRUNA, 2009). Em laboratório, no entanto, estudos recentes (tese de doutorado em andamento) têm demonstrado que este carrapato é suscetível a R. rickettisii e, portanto, também pode ser considerado um bom reservatório do patógeno, apesar de o parasitismo em humano ser acidental. Considerando as infestações de carrapatos nos cães levados ao CCZ, ao todo foram examinados 398 cães provenientes de 23 bairros, e 8 desses bairros tiveram duas espécies de carrapatos nesses animais. O bairro de Suru, além de ter sido o mais representativo quanto aos cães parasitados, um dos cães apresentou parasitismo simultâneo de A. ovale A. aureolatum. Apesar de nenhum carrapato ter sido conclusivo quanto ao teste de hemolinfa, isso não exclui a possibilidade de infecção por Rickettsia, especialmente nos caos de parasitismo concomitante de A. aureolatum com R. sanguineus (2 cães). De fato, o teste de hemolinfa deixou muitos debris e acabou por dificultar a análise. Mas de qualquer forma, a presença de Rickettsia nos carrapatos estudados somente poderá ser confirmada por sequenciamento gênico que será realizado posteriormente. Entretanto, a suspeita de 3 carrapatos positivos (ninfas, A. cajennense) entre o total de 353 coletados durante este trabalho corrobora com os dados da literatura quanto a taxa de infecção para R. rickettsii (PINTER & LABRUNA, 2006; LABRUNA et al., 2008; LABRUNA, 2009). Soares et al. (2012) comentaram que a taxa de infecção de A. cajennense na transmissão vertical (transovariana), em estudo experimental, não ultrapassou 50%, indicando que esse tipo de transmissão não é suficiente para manutenção da Rickettsia na natureza. De fato, Labruna et al. (2011) reportaram que apesar do encontro de 100% de transmissão transovariana de R. rickettsii em A. aureolatum, fêmeas infectadas ingurgitadas desta espécie tiveram alta taxa de mortalidade e baixa performance reprodutiva quando comparadas às do grupo controle. Há portanto, uma tendência de diminuição

23 23 da infecção após sucessivas gerações. Assim, para que a Rickettsia rickettsii se mantenha em determinada área, é preciso haver transmissão transestadial e vertebrados amplificadores para produzir novas linhagens de bactérias patogênicas. Dessa forma, com base nos resultados obtidos no presente estudo deixamos a sugestão da necessidade de se elaborar medidas profiláticas e que possam servir para orientação da população do município, já que os principais vetores e reservatórios estão presentes nas áreas estudadas. 5. CONCLUSÃO 1. Os carrapatos presentes nas áreas investigadas com arraste são potenciais vetores de Rickettsia; 2. A. cajennense e A. dubitatum nas áreas estudadas evidenciam a presença de hospedeiros amplificadores da Rickettsia; 3. Não houve diferença significativa entre os locais investigados e número de carrapatos coletados e nem entre os períodos seco e chuvoso do ano de 2012 e 2013; 4. Nos cães levados ao CCZ o número de carrapatos coletados foi maior significativamente na estação chuvosa e R. sanguineus foi a espécie mais representativa do que A. aureolatum; 5. O bairro mais infestado foi Suru, com índice médio de infestação em torno de 7,0 carrapatos por animal e a porcentagem de infestação foi de 43,7%; 6. A hemolinfa de 3 ninfas de A. cajennense coletadas por arraste no condomínio residencial evidenciou estruturas semelhantes morfologicamente à Rickettsia; 7. O município de Santana de Parnaiba reúne todas as condições para o surgimento de casos de Febre Maculosa Brasileira.

24 24 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ARZUA, M.; SILVA, M. A N.; FAMADAS, K. M.; BEATI, L.; BARROS- BATTESTI, D.M. Amblyomma aureolatum and Ixodes auritulus (Acari: Ixodidae) on birds in southern Brazil, with notes on their ecology. Experimental and Applied Acarology, 31, , BARROS-BATTESTI, D. M.; YOSHINARI, N. H.; BONOLDI, V. L. N.; GOMEZ, A. C. Parasitism of Ixodes didelphidis and I. loricatus (Acari: Ixodidae) on small wild mammals from an Atlantic Forest in the State of São Paulo, Brazil. Journal of Medical Entomology, 37(6), , CENTRO DE VIGILÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA - CVE, Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo. Febre maculosa brasileira. Informe Técnico II.Vigilância epidemiológica. São Paulo; 2004 em: ftp://ftp.cve.saude.sp.gov.br/doc_tec/zoo/if_fmb2.pdf. Acessado em: 26 abr DANTAS-TORRES, F., VENZAL, J.M., BERNARDI, L.F.O., FERREIRA, R.L., ONOFRIO, V.C., MARCILI, A., BERMÚDEZ, S.E., RIBEIRO, A.F., BARROS- BATTESTI, D.M., LABRUNA, M.B. Description of a new species of batassociated argasid tick (Acari: Argasidae) from Brazil. The Journal of Parasitology, 98, 36-45, DIAS E.; MARTINS A. V. Spotted fever in Brazil. A summary. Journal of Tropical Medicine and Hygiene,19:103-8; 1939 GIMÉNEZ, D. F. Staining rickettsiae in youk-sac cultures. Stain Technology, v. 39, p , GUGLIELMONE, A. A.; BEATI, L.; BARROS-BATTESTI, D. M.; LABRUNA, M. B.; NAVA, S.; VENZAL, J. M.; MANGOLD, A. J.; SZABÓ, M. P. J.; MARTINS, J. R.; GONZÁLEZ-ACUÑA, D.; ESTRADA-PEÑA, A. A. Ticks (Ixodidae) on humans in South America. Experimental and Applied Acarology, 40, , GUGLIELMONE, A. A.; ROBINS, R. G., APANASKEVICH, D. A., PETNEY, T.N., Estrada-Peña, A., Horak, I.G., Shao, R., Barker, S.C. The Argasidae, Ixodidae and Nuttalliellidae (Acari: Ixodida) of the world: a list of valid species names. Zootaxa, 2528, 1-28, GUIMARÃES JH, TUCCI EC, BARROS-BATTESTI DM. Ectoparasitos de importância veterinária. Plêiade/FAPESP, HELMICK C. G.; BERNARD K. W.; D'ANGELO L. J.; Rocky Mountain spotted fever: clinical, laboratory, and epidemiological features of 262 cases. Journal Infectious Diseases, 150, , 1984.

25 25 IBGE. Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. Disponível em: Acessado em: 02 jun LABRUNA, M. B. Ecology of Rickettsia in South America. Rickettsiology and rickettsial diseases-fifth international conference, Annals of New York Academy of Sciences, 1166, , LABRUNA, M. B.; JORGE, R. S P.; SANA, D. A. et al. Ticks (Acari: Ixodidae) on wild carnivores in Brazil. Experimental and Applied Acarology, 36, , LABRUNA, M. B.; OGRZEWALSKA, M.; MARTINS, T. F.; PINTER, A.; HORTA, M. C. Comparative susceptibility of the larval stage of Amblyomma aureolatum, Amblyomma cajennense, and Rhipicephalus sanguineus to the infection by Rickettsia rickettsii. Journal of Medical Entomology, 45, , LABRUNA, M. B.; OGRZEWALSKA, M.; SOARES, J. F. et al. Experimental infection of Amblyomma aureolatum ticks with Rickettsia rickettsii. Emerging Infectious Diseases, 17, , LIMA, V. L.; FIGUEIREDO, A. C.; PIGNATTI, M. G.; MODOLO, M.Febre maculosa no município de Pedreira Estado de São Paulo, Brasil. Relação entre a ocorrência de casos e parasitismo humano por ixodídeos. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 28(2), , MARTINS, T. F.; LABRUNA, M. B. Nymphs of the genus Amblyomma (Acari: Ixodidae) of Brazil: descriptions, redescriptions, and identification key. Ticks and Tick-borne Diseases, 1(2), 75-99, MINISTÉRIO DA SAÚDE. Secretaria de Vigilância em Saúde. Guia de vigilância epidemiológica. 6 ed. Brasília; OLIVEIRA, P. R., BORGES, L. M. F.; LOPES, C. M. L.; LEITE, R. C. Population dynamics of the free-living stages of Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787) (Acari Ixodidae) on pastures of Pedro Leopoldo, Minas Gerais State, Brazil. Veterinary Parasitology and Systematics, 20, , ONOFRIO, V.C., LABRUNA, M.B., PINTER, A., GIACOMIN, F.G. & BARROS- BATTESTI, D.M. (2006). Comentários e chaves para as espécies do gênero Amblyomma. In: Barros-Battesti, D.M., Arzua, M. & Bechara, G.H. (Eds.) Carrapatos de importância médico-veterinária da Região Neotropical: um guia ilustrado para identificação de espécies. São Paulo, Brasil, Vox/ICTTD- 3/Butantan. pp PINTER, A. Aspectos ecológicos da febre maculosa brasileira em um foco endêmico no Estado de São Paulo. Tese, Universidade de São Paulo, Brasil, 2007.

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27 27 APÊNDICES Apêndice A. Número total de carrapatos coletados da vegetação de Santana de Parnaíba, SP, segundo os períodos, seco e chuvoso, de Agosto de 2012 a Maio de Nº carrapatos Área 1 Área 2 Área 3 Total Período Seco ª Período Chuvoso ª a: valores nas colunas, seguidos de letras iguais não diferem entre si pelo teste Test-t: p>0,05 (p:0,2437) Apêndice B. Número total de carrapatos coletados da vegetação de Santana de Parnaiba, SP, segundo as áreas investigadas, nos períodos seco e chuvoso, de Agosto de 2012 a Maio de Nº carrapatos Período Seco Período Chuvoso Total Margem (Áreas 1 + 2) ª Condomínio (Área 3) ª a: valores nas colunas, seguidos de letras iguais não diferem entre si pelo teste Test-t: p>0,05 (p:0,06204)