Função das Membranas Celulares. 2_Difusão e Permeabilidade em Membranas

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1 Licenciatura em Engenharia Biomédica Luís Martinho do Rosário [Depto. de Bioquímica / FCTUC] Função das Membranas Celulares 2_Difusão e Permeabilidade em Membranas

2 FLUXO DE PARTÍCULAS NUM MEIO HOMOGÉNEO Fluxo (J) : quantidade de matéria que flui por unidade de área por unidade de tempo Experimentalmente: J prop. dn/dz N = nº de partículas por unidade de volume Gradiente de concentração (dn/dz) dn/dz < 0, J > 0 J = -D dn/dz Primeira Lei de Difusão de Fick D = constante ou coeficiente de difusão Em fase condensada (solução): J = -D dc/dz C = concentração do soluto [J] = mole.cm -2.s -1 [D] = cm 2.s -1 #07

3 ASPECTOS TEMPORAIS DA DIFUSÃO EM SOLUÇÃO LIVRE x água camada de açúcar (t = 0) Equação de difusão (segunda lei de difusão de Fick) Problema unidimensional (x) C/ t = D 2 C/ x 2 C = C(x,t) Dt = 0.05 CA/n x 1.0 C = n 0 /A (πdt) -1/2 exp(-x 2 /4Dt) A = área da base do vaso n 0 = número total de moléculas de açúcar #08

4 DISTÂNCIA MÉDIA PERCORRIDA POR DIFUSÃO (problema unidireccional) erminal nervoso da áptica lula muscular <x> 10 µm capilar ACh <x> 20 nm D (ACh) = 7.6x10-6 cm 2.s -1 tecido glicose δt 0.3 µs D (gli) = 6.7x10-6 cm 2.s -1 δt 70 ms Difusão nos dois sentidos a partir da origem <x 2 > 2Dδt <x 2 > = distância ao quadrado média percorrida por difusão δt = lapso de tempo difusional δt <x> 2 /2D <x> = distância média percorrida por difusão eurónio??? glicose?? δt 21 horas!! glicose <x> 1 cm #09

5 Exercícios 1 É verdadeira ou falsa a seguinte afirmação? Porquê? O tempo médio que uma molécula demora a percorrer por difusão simples uma distância de 30 µm é três vezes superior ao que demora a percorrer 10 µm 2 Calcule o lapso de tempo difusional para a glicose ao longo de um internodo (segmento entre nodos de Ranvier consecutivos) num axónio mielinizado. Como poderá ocorrer a distribuição de transportadores de glicose nestes axónios e qual a possível consequência desta distribuição? Formule uma hipótese.

6 Cálculo para moléculas com D = 5x10-6 cm 2.s -1 A difusão simples é um processo: rápido à escala microscópica lento à escala macroscópica Mistura por convecção Fluxo sanguíneo à distância Irrigação capilar de tecidos Tamanho das células Recuperação de um episódio isquémico não se efectua por difusão de O 2 e nutrientes #10

7 DIFUSÃO ATRAVÉS DE UMA BARREIRA PERMEÁVEL AO SOLUTO E SOLVENTE δ C 1 Barreira (ex: papel de filtro) C 2 Perfil linear de variação da concentração do soluto na barreira dc/dz = c te J = -D C/δ = D/δ (C 1 C 2 ) P = D/δ: constante ou coeficiente de permeabilidade [P] = cm.s -1 #11

8 Exercícios 1 Derive formalmente a equação de fluxo em #11 Sugestão: aplique condições-fronteira à variação linear da concentração

9 DIFUSÃO SIMPLES ATRAVÉS DE UMA MEMBRANA (BICAMADA LIPÍDICA) δ C 1 k 1 k 1 (3) (1) k -1 k -1 C 2 (2) (1) Partição entre a fase aquosa (comp.1) e lipídica K = k 1 /k -1 : coeficiente de partição (2) Difusão através da membrana D m : coeficiente de difusão membranar (3) Partição entre a fase lipídica e aquosa (comp.2) Considerando (2) como o passo determinante, J = D m K/δ (C 1 C 2 ) P m = D m K/δ : coeficiente de permeabilidade da membrana [P m ] = cm.s -1 #12

10 RELAÇÃO ENTRE A PERMEABILIDADE DA MEMBRANA E O COEFICIENTE DE PARTIÇÃO P m = D m K/δ P m radioisótopos K e D m simulação utilizando outros lípidos K = (conc. soluto em lípido)/(conc. soluto em água) δ microscopia electrónica ou medição da capacidade eléctrica da membrana Equação de Stokes-Einstein D m = kt/6πηa Glicerol C 3 H 8 O 3 MW=92 muito polar (ε=42.5*) Uretano NH 2 COOC 2 H 5 MW=89 pouco polar (ε=3.2**) viscosidade raio da partícula hidratada * Fonte: Merck Index ** Fonte: #13

11 Exercícios 1 Proponha um método para determinar experimentalmente o coeficiente de partição 2 Demonstre que o influxo inicial de uma molécula que atravessa a membrana celular por difusão simples é directamente proporcional à sua concentração extracelular, assumindo que esta se mantém constante ao longo da experiência C o > C i C i C o = 0 influxo C i = C 0 J (influxo inicial) C i C o Tempo

12 TRANSPORTE MEDIADO Transportadores Moléculas ou iões transportados Factores que determinam a magnitude do fluxo: - Concentração, afinidade - Número de transportadores - Velocidade da alteração conformacional difusão simples Transporte mediado transporte mediado Difusão facilitada: transporte de acordo com o gradiente electroquímico Transporte activo: transporte contra o gradiente electroquímico (fonte de energia) #14

13 DIFUSÃO FACILITADA Transportadores de monossacarídeos, aminoácidos, ácidos gordos, água, iões, etc Transportadores de glicose [glicose] i < [glicose] o (metabolismo) Substratos (GLUT-1): hexoses (ex: D-glicose, D-manose, D-galactose); pentoses (ex: D-xilose, L-arabinose, D-ribose) Não-substratos: L-glicose, L-galactose, L-xilose Inibidores: competitivos (substratos); não-competitivos (citocalasina B, floretina) Isoformas: GLUT-1, 2, 3, 4, 5, etc Diferem em (i) k m (afinidade); (ii) V max (capacidade); (iii) regulação GLUT-1: tr, basal (cérebro, eritrócitos, etc) GLUT-2: tr. vs. homeostasia (hepatócitos, célula β) GLUT-4: tr. vs. homeostasia, dep. insulina (adipócitos, músculo esquelético) #15

14 REGULAÇÃO DE GLUT-4 POR INSULINA Regulação por recrutamento de transportadores para a membrana Rápida (ocorre em minutos) Não requer síntese de novos transportadores Essencial para a homeostasia da glicose Esquema de sinalização: Artigs de revisão recentes: Watson & Pessin (2006) Trends Biochem. Sci. 31: Chang et al. (2004) Mol. Medicine 10: 7-12 (acessíveis para download na página WOC) #16

15 TRANSLOCAÇÃO DE GLUT-4 E ACTIVAÇÃO DO RECEPTOR DE INSULINA Adipócito Myc: an engineered epitope tag EGFP: enhanced green fluorescent protein via TC10 via PPIn 3-cinase IRS: insulin receptor substrate PDK1: phosphoinositide-dependent kinase 1 Watson & Pessin (2006) Bridging the gap between insulin signaling and GLUT4 translocation. Trends Biochem. Sci. 31: #17

16 TRANSPORTE DE ÁCIDOS GORDOS fatia int. delgado enterócitos, íleo fatia fígado anti-fatp4 anti-fatp4 anti-fatp2 Transporte transmembranar de LCFAs Difusão passiva ( flip-flop ) Transporte mediado >> Proteínas de transporte de FAs (FATP1-6) >> Translocases de FAs (FAT/CD36) >> Proteínas ligantes de FAs associadas à membrana (FABPpm) #18

17 Stahl et al. (2001) TRENDS Endocrinol. Metabol. 12: Bonen et al. (2007) Am. J. Physiol. 292: E1740-E1749 FAT/CD36 FABPc Proteínas ligantes de FAs citoplasmáticas Proteínas ligantes de acil-coa #19

18 DIFUSÃO FACILITADA DE IÕES P = DK/δ D = urt/zf u = mobilidade do ião (m 2.s -1.V -1 ) Para a bicamada lipídica u 0 e K 0 ε (H 2 O) 80 >> ε (lípidos) 2-5 K e u podem ser aumentados: s = ue velocidade do ião em solução campo eléctrico fisiologicamente (canais iónicos nativos) artificialmente (ionóforos) Ionóforos difusíveis Ex: valinomicina (antibiótico macrocíclico polipeptídico) K + Cavidade hidrofílica Exterior hidrofóbico Altamente selectivo para K + (K + >> Na + > H + ) Outros exemplos: desacopladores mitocondriais (FCCP, DNP) #20