ÍNDICE 1. INTRODUÇÃO MANIPULAÇÃO CROMOSSÔMICA EM PEIXES Triplóides Puros e Híbridos Haplóides e Tetraplóides

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1 ÍNDICE 1. INTRODUÇÃO MANIPULAÇÃO CROMOSSÔMICA EM PEIXES Triplóides Puros e Híbridos Haplóides e Tetraplóides Ginogenéticos Androgenéticos REVERSAO SEXUAL EM PEIXES Linhagens Revertidas Monossexuais Produção de Supermachos Produção de Superfêmeas MARCADORES MOLECULARES EM PROJETOS DE ICTIOGENÉTICA, ENGENHARIA GENÉTICA EM PEIXES Produção de Transgênicos Contribuição dos Transgênicos em Projetos de Piscicultura RISCOS BIOLOGICOS POTENCIAIS DE LINHAGENS DE PEIXES GENETICAMENTE MANIPULADOS Riscos Potenciais de Linhagens Cromossomicamente Manipuladas Riscos Potenciais de Linhagens Sexualmente Revertidas Riscos Potenciais dos Transgênicos REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS...27

2 1. INTRODUÇÃO No decorrer da última década, a contribuição da genética para a piscicultura moderna tem abrangido o emprego das técnicas mais recentes usadas em biotecnologia e engenharia genética. Algumas dessas biotecnologias genéticas, como as que possibilitam a manipulação cromossômica, podem ser usadas também em plantas, porém não ainda em aves e mamíferos. Outras, como as que permitem a transferência de genes, vêm sendo aplicadas tanto em peixes e outros organismos, como em plantas. No presente trabalho são apresentadas e comentadas as principais biotecnologias genéticas atualmente aplicadas à piscicultura. Inicialmente é discutida a produção de peixes triplóides, tetraplóides, haplóides, ginogenéticos e androgenéticos. A seguir, são resenhados vários procedimentos para a obtenção de linhagens de neomachos, neofêmeas, supermachos e superfêmeas. Os principais objetivos teóricos dos tópicos 2 e 3 deste trabalho são a produção de linhagens de peixes estéreis, monossexuais e com altos níveis de consangüinidade. Sob o aspecto prático, as linhagens manipuladas cromossômica e hormonalmente podem ser usadas para evitar maturação precoce, para possibilitar a produção de peixes maiores, para a obtenção de exemplares que apresentem somente o sexo de maior valor comercial e para permitir o uso de peixes exóticos artificialmente estéreis no cultivo ou para introdução na natureza. As biotecnologias de manipulação cromossômica e reversão sexual precisam ser bem conhecidas e compreendidas por todos os que trabalham atualmente em piscicultura porque vêm sendo gradativamente incorporadas às rotinas dos programas desenvolvidos em nível mundial e, há alguns anos, começaram a ser experimentadas também em nosso país, A seguir, no item 4, são apresentados os principais tipos de marcadores moleculares, em nível de DNA, que vêm sendo usados em projetos de ictiogenética aplicada à piscicultura. 0 tópico 5 diz respeito à aplicação da engenharia genética à piscicultura e trata da transferência de genes entre diferentes organismos e peixes. Como a engenharia genética apresenta alto grau de sofisticação técnica, dificilmente deverá ser usada rotineiramente a curto prazo na área ictiológica, devendo, por mais uma década, se restringir apenas a algumas instituições de pesquisa e a grandes empresas agrícolas. 0 último item do trabalho analisa os riscos bioecológicos potenciais de linhagens de peixes geneticamente manipuladas sobre populações selvagens e cultivadas. 0 presente trabalho é baseado em grande parte na experiência adquirida com os projetos que vêm sendo, ou que foram, desenvolvidos em conjunto pelo Laboratório de Genética de Peixes do IB/USP (São Paulo), Laboratório de Biologia e Genética de Peixes do IB/UNESP (Botucatu) e pelo Centro de Pesquisas e Treinamento em Aqüicultura, CEPTA/IBAMA (Pirassununga), Centrais Elétricas de Minas Gerais, CEMIG (Volta Grande), Companhia Energética de São Paulo, CESP (Paraibuna), Instituto de Pesca de São Paulo (Campos do Jordão) e Projeto Pacu (Terenos), e pretende ser de utilidade no planejamento de projetos de biotecnologia genética aplicados à piscicultura, que venham a ser desenvolvidos em nosso país. A maioria dos resultados obtidos, até o momento, já foi resenhada e publicada. 1,2,3,5,9,10,12,24,25,26,27,28,29,30 2. MANIPULAÇÃO CROMOSSÔMICA EM PEIXES As técnicas de manipulação ou engenharia cromossômica podem ser aplicadas com relativa facilidade aos peixes, porque esse grupo de animais geralmente apresenta fecundação externa, o que favorece em muito o manuseio de seus gametas. Numerosas técnicas têm sido descritas na literatura para a produção de peixes haplóides, triplóides, tetraplóides, ou mesmo os que tenham só cromossomos maternos (ginogenéticos) ou só paternos (androgenéticos) (Tabela 1) 7,20,22,23

3 As tecnologias usadas para alterar o número cromossômico dos peixes pertencem a duas categorias principais: choques de temperatura ou térmicos e choques de pressão ou hiperbáricos. Os choques de temperatura geralmente são aplicados aos ovos logo após a fertilização (cerca de 5-10 minutos) e, por isso, são chamados de precoces. Os choques de pressão são aplicados aos ovos decorridos tempos maiores após a fertilização (cerca de minutos) e, por isso, são chamados de tardios. A finalidade do choque precoce é a de atuar na meiose, bloqueando a eliminação do segundo corpúsculo polar do ovócito e o choque tardio, de interferir no início da mitose, impedindo a primeira clivagem do zigoto quando este vai se tornar um embrião com duas células. Na maioria das estações de piscicultura do mundo utilizase o choque térmico em vez do hiperbárico, porque a aparelhagem para manutenção de temperaturas constantes oferece maior segurança para os operadores e possibilita trabalhar com maiores volumes de ovos. Para os choques de pressão usam-se cilindros hidráulicos de aço inoxidável que são bastante caros, comportam volumes reduzidos de ovos, operam por vários minutos com altas pressões entre 7 e 10 mil psi (psi = libra por polegada quadrada), correndo, muitas vezes, riscos de rompimento, principalmente quando o ar dos cilindros não é devidamente removido, ou seja, quando não é feito um "sangramento" adequado. Embora se possa utilizar tanto choques térmicos quentes quanto frios, parece que os quentes produzem melhores resultados em espécies de peixes de águas frias e, ao contrário, os choques frios em espécies de águas quentes. Em geral, a temperatura que produz os melhores resultados é espécie-específica e se situa na proximidade de seu limiar letal. É bastante importante que no decorrer do tratamento térmico os ovos sejam mantidos numa temperatura uniforme sem flutuações; isso pode ser conseguido dispondo-se os ovos em poucas camadas em um recipiente de vidro que, por sua vez, é mergulhado num banho térmico com volume suficiente de água, de modo que a temperatura desejada seja mantida constante. Portanto, o tipo, a intensidade e a duração do tratamento térmico são peculiares para cada espécie. Há várias técnicas que podem ser usadas para verificar o sucesso das manipulações cromossômicas, sendo que um dos métodos mais laboriosos é contar o número de cromossomos. Um segundo método é medir o tamanho dos núcleos dos eritrócitos; isto é feito corando-se esfregaços de sangue com Giemsa e medindo-se ao microscópio o eixo maior do núcleo dos eritrócitos. Um terceiro, é a medida do volume nuclear do eritrócito, rotineiramente realizado nas pisciculturas norteamericanas produtoras de carpas capim triplóides, com o auxílio do aparelho Coulter Counter Channelyzer, que é caro, porém bastante eficiente e rápido. Um quarto método consiste na determinação do conteúdo de DNA do núcleo dos eritrócitos por citofotometria de fluxo. Um quinto método utiliza a coloração pelo nitrato de prata de um esfregaço de sangue e contagem do número máximo de nucléolos existentes nos núcleos dos eritrócitos.' Uma sexta técnica é usar a eletroforese. 2.1 Triplóides Puros e Híbridos A produção de triplóides é o tipo de manipulação cromossômica mais familiar na área de piscicultura. 0 interesse que os triplóides despertam se deve a duas características que potencialmente eles podem apresentar: maior crescimento que os diplóides e esterilidade (Tabela 1). Os dois tipos de triplóides mais usados em piscicultura são os puros e os híbridos. Os triplóides puros, também chamados de autotriplóides e triplóides intraespecíficos, são formados por três conjuntos haplóides de cromossomos provenientes de uma mesma espécie. Os triplóides híbridos, também designados como autotriplóides ou triplóides interespecíficos, são formados por dois lotes haplóides de cromossomos de uma determinada espécie e por um outro lote de outra espécie.

4 Tabela 1 - Tipos de biotecnologias genéticas aplicadas à piscicultura 7.20,22,23 Tipo de Biotecnologia Produtos Obtidos Aplicações em Piscicultura 1. TRIPLOIDIA PURA Linhagens estéreis Controle da reprodução Linhagens com maior sobrevivência e crescimento 2. TRIPLOIDIA HÍBRIDA Linhagens híbridas estéreis Controle da reprodução Linhagens com maior sobrevivência e crescimento e resistência a doenças. 3. TETRAPLOIDIA Gametas diplóides Obtenção de linhagens triplóides interplóides 4. HAPLOIDIA Linhagens haplóides Produção de ginogenéticas e/ou androgenéticas haplóides 5. GINOGÊNESE Linhagens ginogenéticas 6. ANDROGÊNESE Linhagens androgenéticas 7.REVERSÃO 8.DNA RECOMBINANTE Linhagens de neomachos e neofêmeas Linhagens transgênicas Produção de linhagens monossexuais de fêmeas para casos de determinação do sexo tipo XX/XY Produção de linhagens altamente endocruzadas Identificação de sistemas de determinação do sexo Produção de supermachos Produção de linhagens altamente endocruzadas Criopreservação do germoplasma Produção de linhagens revertidas Produção de supermachos e superfêmeas; Identificação de sistemas de determinação do sexo Linhagens com características vantajosas codificadas pelo DNA transplantado 1) Produção de triplóides - Os triplóides são obtidos da seguinte maneira: logo após a fertilização comum, os ovos são submetidos a choque térmico ou hiperbárico (Tabela 2). Lembremos que, por ocasião da desova, os peixes do sexo feminino eliminam o que comumente se costuma chamar de "ovas" ou "óvulos", mas que na realidade são ovócitos de segunda ordem. Doravante, por motivo de simplificação, designaremos de "óvulos" aos ovócitos de segunda ordem, Estes "óvulos" eliminam o segundo corpúsculo polar somente após terem sido fertilizados. Porém, se um "óvulo" recém-fertilizado for submetido a um choque térmico ou hiperbárico, o segundo corpúsculo polar não será eliminado. Como conseqüência, o ovo resultante irá conter três núcleos haplóides: um que é o núcleo feminino do "óvulo", outro que é o núcleo masculino proveniente do espermatozóide, e um outro que é o núcleo do segundo corpúsculo polar. Os três núcleos haplóides se fundem para formar um zigoto triplóide que, por sua vez, produzirá um peixe triplóide. 2) Como otimizara produção de triplóides- A maioria dos pesquisadores e piscicultores usa choques de temperatura ou de pressão. Os choques químicos são pouco usados, porque produzem um grande número de "mosaicos" (peixes que contêm células com vários graus de ploidia). Os choques térmicos são os mais usados em pisciculturas comerciais porque são os operacional mente mais fáceis de aplicação, mais baratos em termos de aparelhagem e produtos químicos usados e mais seguros. A temperatura exata e a duração do choque térmico que são necessários para a produção de triplóides devem ser estabelecidas inicialmente por tentativa e erro. As temperaturas quentes ou frias ótimas são aquelas situadas alguns graus acima ou abaixo das

5 temperaturas letais inferiores ou superiores para uma determinada espécie. Logo, a primeira etapa para se otimizar a produção de triplóides seria a determinação dos limiares letais para as temperaturas quentes e frias. 0 tempo exato em que o choque deve começar e terminar depende do tempo após a fertilização, no decorrer do qual o segundo corpúsculo polar é eliminado. 0 choque deve começar antes do evento da eliminação e continuar por tempo suficiente ate que seja improvável a extrusão do segundo corpúsculo polar. Por exemplo, em ensaios realizados no Brasil para a produção de triplóides puros de carpa comum, cerca de 10 minutos após a fertilização, os ovos foram tratados a O C ± 0,2 durante 30 minutos, resultando na produção de 94,7% de triplóides 12. Estes valores usados para a produção de triplóides já foram otimizados para algumas espécies usadas na piscicultura brasileira (Tabela 2) 3,12,23. Tabela 2 -Valores otimizados para indução de triploidia por choques térmicos em algumas espécies usadas na piscicultura brasileira Espécie Início do choque (minutos) Temperatura do choque (ºC) Duração do choque (minutos) Freqüência de triplóides (%) Taxa de eclosão (%) Bagre africano Bagre do canal Carpa capim Carpa comum , Tambaqui Tilápia do Nilo Truta arco-iris Certos especialistas acreditam que as espécies de peixes que historicamente vivem em águas frias (por exemplo, truta arco-íris e outros salmonídeos) respondem melhor a choques térmicos quentes moderados (entre 26ºC e 29ºC), e, ao contrário, em espécies provenientes de águas quentes (tais como as carpas comum e chinesas, bagres do canal e africano e a maioria das espécies neotropicais), os choques frios fortes (abaixo de 4ºC) ou moderados (entre 5ºC e 15ºC) parecem ser mais efetivos na indução de triploidia. Este tipo de generalização não é aceito por outros especialistas, tendo em vista os excelentes desempenhos obtidos com choques quentes fortes (pouco acima de 40ºC) em espécies de águas quentes (tais como tilápias e carpas) e também o sucesso de choques frios bastante fortes (pouco abaixo de OºC) na indução de triploidia em salmonídeos. 3) Reconhecimento dos triplóides - Em relação à morfologia externa, os triplóides puros e os diplóides geralmente não apresentam diferenças significativas. Em nível celular é que se encontram as diferenças mais marcantes, pois o tamanho dos núcleos e das células dos triplóides é cerca de um terço maior do que os dos diplóides. A maneira mais fácil para identificar triplóides de peixes é através das medidas dos eixos maiores dos eritrócitos em esfregaços de sangue corados por Giemsa. Outro procedimento é a contagem do número máximo de nucléolos nos eritrócitos, evidenciados após coloração com nitrato de prata. 0 método mais direto para identificar os triplóides puros é o exame do número cromossômico. Por exemplo, em trabalho realizado no Brasil 12 foi possível distinguir claramente carpas comuns triplóides (eixo maior dos eritrócitos = 8,23 ± 0,50 µm; número máximo de nucléolos = 3; número de cromossomos 3n = 150) das diplóides (4,76 ± 0,25 µm; número máximo de nucléolos = 2; número de cromossomos 2n = 100). Existem métodos mais sofisticados para a identificação de triplóides, tais como estimativas do conteúdo de DNA nuclear por citofotometria e volume celular dos eritrócitos por sistemas automatizados como o "Coulter Counter Channelyzer", que é bastante eficiente porém de custo elevado, como já mencionado.

6 4) Esterilidade, crescimento e sobrevivência - 0 interesse que os triplóides têm despertado na piscicultura devese a dois tipos de expectativa: a de que apresentem maior crescimento em peso e comprimento e a de que sejam estéreis. Sob o aspecto teórico, espera-se que os triplóides sejam maiores do que os diplóides porque suas células contêm 33% mais informação genética para o crescimento; além disso, por serem estéreis, os triplóides não gastariam energia para a produção de gônadas e gametas, para a corte, reprodução e cuidados à prole. Quanto ao crescimento, tem-se verificado, de u ma maneira geral, que diplóides e triplóides crescem igualmente até o início da idade da primeira maturação. Durante o período de maturação sexual os diplóides de ambos os sexos sofrem uma parada no crescimento, concentrando suas energias no desenvolvimento das gônadas; entretanto, as fêmeas triplóides, não formando gônadas normais, continuam crescendo em peso e comprimento e acabam por superar as fêmeas diplóides em 5% a 20% ao final do período de maturação. De fato, as fêmeas triplóides apresentam somente gônadas residuais e níveis de hormônios sexuais semelhantes aos das diplóides jovens. Os machos triplóides, entretanto, apresentam um considerável desenvolvimento gonadal, níveis de hormônios sexuais semelhantes ao dos diplóides adultos, mostram características sexuais secundárias e apresentam comportamentos de corte. Chegam também a produzir quantidade limitada de sêmen bastante fluido, com poucos espermatozóides móveis que, quando usados experimentalmente em fecundações artificiais, produzem abortos precoces, mostrando ser pouco provável que machos triplóides venham a produzir descendência normal e fértil. Logo, as fêmeas triplóides não são maiores que as diplóides devido a seu grau de ploidia, mas porque apresentam esterilidade gonádica. Conseqüentemente, a produção de linhagens monossexuais de fêmeas triplóides parece ser a mais interessante em programas de piscicultura que tenham por objetivo a obtenção de peixes maiores, cujos tamanhos comerciais ultrapassem a fase de maturação sexual. Os triplóides puros usualmente apresentam uma taxa de sobrevivência menor (entre 40% e 95%) do que a dos diplóides nas etapas iniciais do desenvolvimento 7. As informações até o momento disponíveis não permitem afirmar qual seria a principal causa do aumento da mortalidade dos triplóides. Admite-se que poderiam ser três as possíveis causas: a) efeito deletério dos choques térmicos sobre as proteínas fibrilares constituintes do fuso meiótico e eventualmente também sobre o citoesqueleto celular; b) a consangüinidade parcial, devida ao fato de os triplóides apresentarem em geral dois genomas femininos; c) o efeito da própria triploidia, em especial sobre o tamanho das células. Duas maneiras têm sido usadas com sucesso para atenuar o problema da mortalidade precoce dos triplóides puros. Um caminho, desenvolvido apenas experimentalmente, mas ainda não inserido na rotina das pisciculturas, consiste em se obter linhagens tetraplóides e cruzá-las com diplóides para se obter triplóides, que são chamados de triplóides interplóides 22 ; estes interplóides apresentam taxas de sobrevivência e crescimento semelhantes às dos diplóides 7. Outra maneira que vem sendo usada em piscicultura e a produção de triplóides híbridos, cujas taxas de sobrevivência e resistência a doenças geralmente superam as dos diplóides híbridos. 5) Uso de triplóides em programas de piscicultura - A produção de triplóides constitui um excelente caminho para se utilizar peixes exóticos em programas de piscicultura, minimizando assim possíveis problemas adversos de impacto ambiental. A carpa capim é uma espécie exótica na qual as possibilidades dos triplóides vêm sendo testadas há alguns anos. Esse peixe herbívoro, originário da China, foi introduzido nos EUA em 1963 e, desde então, vem sendo usado no controle biológico da vegetação aquática. Em muitos estados norte-americanos, foi banida a entrada da carpa capim, porque havia o receio de esta espécie escapar dos tanques de cultivo, reproduzir-se na natureza e prejudicar de algum modo as espécies nativas. A primeira possibilidade para

7 se evitar a reprodução da carpa capim surgiu quando, em 1978, se verificou que a progênie híbrida F1 entre fêmeas de carpa capim e machos de carpa cabeça grande era formada por triplóides. Ensaios realizados em 1995 no CEPTA/IBAMA, Pirassununga-SP, com estoques brasileiros dessas duas espécies de carpa, possibilitaram também a obtenção de cerca de 100% de triplóides híbridos. Como os híbridos recebem dois lotes cromossômicos do genoma materno, essas linhagens apresentam a maioria das características de carpa capim e são mais vigorosas do que os diplóides híbridos. Em 1983 conseguiu-se a produção de triplóides puros de carpa capim, com eficiência de 98%. A vantagem apresentada por essas novas linhagens de triplóides puros é a de que consomem biomassa de vegetação aquática igual à dos diplóides normais e de 3 a 4 vezes maior do que os triplóides híbridos. Os triplóides puros, devido à sua maior capacidade de se alimentar de vegetação aquática e pelo fato de apresentarem tipo de esterilidade equivalente à dos triplóides híbridos, têm sido os preferidos ultimamente em projetos de piscicultura voltados para a área de controle da vegetação aquática em lagos e reservatórios. Tabela 3 -Esquemas gerais dos protocolos para a produção de linhagens de peixe poliplóides, ginogenéticos e androgenéticos 1. Produção de Linhagens Poliplóides CTP TRIPLÓIDES ESPERMATOZÓIDES + ÓVULOS OVOS CHT TETRAPLÓIDES 2. Produção de Linhagens Ginogenéticas e Androgenéticas - Espermatozóides + Óvulos OVOS inativados por UV CTP GINOGENÉTICOS MEIÓTICOS CHT GINOGENÉTICOS MITÓTICOS - ESPERMATOZÓIDES + ÓVULOS OVOS inativados por Co CHT ANDROGENÉTICOS CTP = choque térmico precoce; CHT = choque hiperbárico tardio; UV = fonte de ultravioleta; Co = fonte de cobalto Os triplóides de carpa capim tratados hormonalmente para a indução das fases finais da gametogênese mostraram que praticamente todo o esperma produzido é anormal; a probabilidade de que um macho triplóide possa produzir descendência fértil é tão remota que os triplóides de carpa capim podem ser considerados estéreis para propósitos operacionais de manejo em piscicultura. A maioria dos estados norte-americanos somente permite a entrada de linhagens 100% triplóides em seus territórios. Devido a essa exigência, é necessário verificar o nível de ploidia de cada lote de carpa capim a ser usado. Portanto, o controle de qualidade é absolutamente necessário neste tipo de agroindústria, o que aumenta os custos de produção, mas diminui sensivelmente os riscos ecológicos. Por exemplo, para se ter certeza de que todos os exemplares de carpa capim são triplóides, o nível de ploidia de cada exemplar deve ser determinado antes de os mesmos serem legalmente estocados

8 na natureza. Isso aumenta o custo da carpa capim triplóide em cerca de 400% em relação às linhagens diplóides. Muitos pesquisadores gostariam de produzir triplóides de algumas espécies importantes para o cultivo, tal como as tilápias, para eliminar a reprodução precoce que ocorre ainda durante a fase de crescimento destas espécies de peixes. Um pré-requisito importante para que esse tipo de biotecnologia seja efetivo e prático numa escala comercial é que a desova possa ser facilmente induzida e que uma grande quantidade de "óvulos" possa ser facilmente obtida. Algumas espécies, tais como as tilápias, são pouco fecundas e se reproduzem de maneira continuada porém assincrônica. A combinação destes fatores resulta em que dezenas de milhares de animais reprodutores teriam que ser manuseados anualmente para a produção de "óvulos" suficientes para um sistema de larga escala. Portanto, seria impraticável basear a piscicultura comercial da tilápia, ou de espécies de peixes com características reprodutivas semelhantes, na produção continuada de triplóides. A possibilidade de se utilizar triplóides no controle populacional de espécies de peixes "não desejáveis" em determinados ecossistemas abre perspectivas que precisam ser cuidadosamente pré-testadas em condições experimentais. Por exemplo, em princípio, existiria a possibilidade de serem usados machos triplóides do tucunaré no Pantanal Mato-grossense para se tentar o controle populacional desta espécie que é proveniente da Bacia Amazônica, caso ficasse documentado que esses machos triplóides se cruzam com fêmeas.diplóides normais e produzem descendência inviável. Esta proposta aqui apresentada, e por nós anteriormente Já mencionada e discutida em dois encontros técnico-científicos realizados em Pirassununga-SP e em Campo Grande-MS em 1995, deveria ser obrigatoriamente pré-testada em sistemas fechados de estações de piscicultura apropriadas. Em primeiro lugar, seria necessário produzir os triplóides de tucunaré, e a seguir testar o comportamento reprodutivo dos triplóides adultos. Deste modo seria possível responder a uma série de perguntas, tais como: os machos triplóides de tucunaré desenvolvem ou não gônadas maduras? Será que esses machos triplóides irão apresentar comportamento de corte e espermiar" naturalmente? Caso os machos triplóides fertilizem os "óvulos" das fêmeas diplóides normais, serão ou não formados embriões? Estes embriões morrem ou não logo nos primeiros estádios de desenvolvimento? 0 tamanho populacional dos estoques de tucunarés diplóides normais diminui ou não nos tanques-teste, quando neles são introduzidos machos de tucunarés triplóides? 2.2 Haplóides e Tetraplóides 1) Haplóides - São organismos que apresentam somente um lote de cromossomos. Como possuem um único conjunto cromossômico, qualquer gene com efeito detrimental irá se manifestar e, como tal, é pouco provável que a maioria dos haplóides sobreviva durante muito tempo. De fato, dados da literatura têm mostrado que haplóides, produzidos em cerca de sete espécies de peixes para propósitos experimentais, têm mostrado baixa sobrevivência 7. Há dois caminhos para se produzirem haplóides e ambos envolvem a destruição do material genético de um dos parentais. Um dos modos consiste em fertilizar os "óvulos" com espermatozóides que tenham tido seu material genético destruído por raios X, raios gama, produtos químicos ou radiação UV. A radiação UV é provavelmente o melhor método para destruir o DNA dos espermatozóides, porque outras técnicas podem deixar fragmentos cromossômicos viáveis, que podem contribuir para a produção de indivíduos diplóides parciais ou que apresentem redução na taxa de sobrevivência. Além disso, a radiação UV é mais barata e mais segura que os demais tipos. Os espermatozóides tratados com UV ainda permanecem móveis e aptos para fertilizarem e

9 ativarem os "óvulos". Uma vez ativados, os "óvulos" iniciam o desenvolvimento embrionário, mesmo que o espermatozóide fecundante não mais transporte genes funcionais. Como o espermatozóide inativado com UV não contribui com material genético, os alelos contidos no núcleo haplóide do "óvulo" serão os únicos a fazerem parte do núcleo do "zigoto". Os embriões assim produzidos são ginogenéticos haplóides, porque todo o material genético é de proveniência materna. Um segundo modo de produzir haplóides é destruir o material genético dos "óvulos" com raios X ou raios gama e fertilizar esses "óvulos" com espermatozóides normais. Como o núcleo haplóide do espermatozóide será a única contribuição para o genoma do "zigoto", o embrião será haplóide. Nesse caso, o embrião será androgenético haplóide, porque o material genético será proveniente exclusivamente do parental paterno. As linhagens de peixes haplóides são interessantes porque possibilitam aos pesquisadores estudar certos processos genéticos durante a embriogênese. Sob o ponto de vista prático, é bastante importante conhecer como produzir haplóides, porque constituem o primeiro passo para a produção de peixes ginogenéticos e androgenéticos diplóides. 2) Tetraplóides - Os tetraplóides apresentam quatro conjuntos haplóides de cromossomos em lugar dos dois lotes normais. Os tetraplóides podem ser produzidos geralmente por um choque hiperbárico tardio, que bloqueia a primeira divisão mitótica de um zigoto diplóide (Tabela 2). Desse modo, foram produzidos em 1984 salmonídeos tetraplóides de primeira geração, que mostraram taxas de eclosão variando entre 5% e 80%, e taxas de sobrevivência e crescimento bastante baixas 7,23. 0 interesse potencial dos tetraplóides em projetos de piscicultura e que podem ser usados para a produção de triplóides interplóides estéreis; desse modo ficaria eliminada a necessidade de produzir triplóides pelos métodos convencionais de choques térmicos precoces. Assim, cruzando-se linhagens tetraplóides com diplóides, produz-se descendência chamada de triplóide interplóide. 0 tipo de cruzamento mais conveniente seria usar como parentais fêmeas tetraplóides e não machos tetraplóides, porque as micrópilas dos "óvulos" de fêmeas diplóides não apresentam diâmetro suficiente para receber os espermatozóides produzidos pelos machos tetraplóides, uma vez que esses espermatozóides serão diplóides. Uma vez produzidas, as linhagens tetraplóides podem ser autoperpetuadas via intercruzamentos, evitando-se assim terem de ser continuamente produzidas. Em 1986, uma primeira geração de tetraplóides foi intercruzada e obteve-se a segunda geração de tetraplóides, que apresentou taxas de sobrevivência e crescimento apenas satisfatórias 7,23. Os machos tetraplóides também têm mostrado capacidade de fertilização reduzida, em relação aos machos diplóides, aparentemente porque seus espermatozóides maiores apresentam dificuldade de penetração nas micrópilas dos "óvulos" normais. Atualmente, a tecnologia de tetraploidia se encontra restrita apenas ao nível experimental, não tendo sido ainda incluída na rotina de projetos de piscicultura. Somente trabalhos futuros dirão sobre as reais possibilidades dos tetraplóides na área aplicada. 2.3 Ginogenéticos As linhagens ginogenéticas apresentam os dois lotes haplóides de cromossomos provenientes do parental materno. Em espécies de peixes nas quais a determinação do sexo é do tipo XX/XY e as fêmeas são homogaméticas (XX), todos os ginogenéticos serão fêmeas. Os ginogenéticos têm duas grandes aplicações potenciais em piscicultura: a primeira é o controle da proporção sexual pela produção de linhagens monossexuais de fêmeas e a segunda, a rápida produção de linhagens altamente consangüíneas 7,16,23

10 1) Produção de ginogenéticos - Há três maneiras principais de produzir linhagens ginogenéticas. A primeira é ativando os "óvulos" com espermatozóides que tenham tido seu material genético destruído por raios X, raios gama (em geral usando fonte de 60 CO) ou radiação UV. A radiação gama tem a vantagem de possuir excelente poder de penetração, o que facilita o tratamento de grandes'quantidades de esperma. No entanto, fragmentos cromossômicos residuais são freqüentemente encontrados na descendência de ginogenéticos após a fertilização com espermatozóides irradiados com radiação gama; como tais fragmentos podem reduzir a sobrevivência dos ginogenéticos, dá-se preferência à inativação dos espermatozóides por UV. 0 procedimento para o tratamento dos espermatozóides por UV é relativamente simples: inicialmente, o esperma é diluído de modo a que possa ser espalhado numa camada bem fina em uma placa de vidro e exposto a uma fonte de UV de uma lâmpada germicida. Grande número de "óvulos" pode ser fertilizado quando colocados diretamente na placa de vidro na qual foi feita a inativação dos espermatozóides. Normalmente, com exposições apropriadas à radiação UV, nenhum fragmento cromossômico paterno permanece nos espermatozóides. É possível que alguns dos peixes produzidos durante o processo acima descrito sejam diplóides normais, visto que também espermatozóides não-inativados podem fertilizar os "óvulos". Para evitar esse tipo de ocorrência, alguns pesquisadores usam espermatozóides de outras espécies que sabe-se, produzem embriões híbridos não-viáveis. Um segundo modo para se confirmar a não-transmissão do genoma do parental paterno é usar esperma de doadores que sejam homozigotos para genes marcadores dominantes. Por exemplo, espermatozóides de truta arco-íris pigmentada homozigota podem ser usados para ativar "óvulos" de fêmeas albinas; nesse caso, toda a descendência Albina será ginogenética, enquanto a descendência normalmente pigmentada será diplóide normal. Logo após a ativação, os "óvulos" são submetidos a choques precoces para impedir a eliminação do segundo corpúsculo polar (Tabela 3). Os ovos assim produzidos conterão dois núcleos haplóides: o núcleo do "óvulo" e o núcleo do segundo corpúsculo polar; os dois núcleos se fundem para formar um núcleo diplóide contendo os dois conjuntos de cromossomos originários do parental materno. Uma segunda técnica para produzir ginogenéticos começa do mesmo modo que a anterior: numa primeira etapa, os "óvulos" são ativados por espermatozóides que tiveram seu material genético destruído por radiação. Assim, serão produzidos ginogenéticos haplóides. Quando o zigoto haplóide inicia a primeira clivagem, é dado um choque tardio que bloqueia a primeira divisão mitótica. Desse modo, os dois núcleos haplóides se fundem e formam um zigoto diplóide, com dois lotes cromossômicos provenientes do parental materno. Os ginogenéticos produzidos pela supressão da primeira clivagem (chamados de ginogenéticos mitóticos) são homozigotos para todos os seus locos e apresentam 100% de consangüinidade. A maioria desses tipos de ginogenéticos apresenta baixas taxas de sobrevivência (ao redor de 1,5%), devido à expressão dos genes detrimentais recessivos que podem existir em maior ou menor quantidade nessas linhagens. Os ginogenéticos produzidos pelo bloqueio da eliminação do segundo corpúsculo polar (chamados de ginogenéticos meióticos) são, por definição, altamente consangüíneos, porém apresentam certo nível de heterozigose devido à ocorrência de permuta durante a meiose. Na literatura não há uma concordância geral a respeito dos níveis exatos de consangüinidade apresentados pelos ginogenéticos meióticos; segundo certos autores os níveis de consangüinidade seriam ao redor de 45% e 65%, e segundo outros entre 33% e 100%. Uma terceira biotecnologia que pode ser usada para produzir ginogenéticos consiste em fertilizar "óvulos" de fêmeas tetraplóides com espermatozóides cujo DNA tenha sido inativado por radiação. Como as fêmeas tetraplóides produzem "óvulos"

11 diplóides, não há necessidade de os "óvulos" serem submetidos a choques precoces para a produção de complemento cromossômico diplóide. Em 1988, linhagens ginogenéticas de truta arco-íris foram produzidas por meio dessa técnica. Embora esses tipos de ginogenéticos sejam consangüíneos por definição, devem apresentar níveis consideravelmente maiores de heterozigose do que os ginogenéticos produzidos a partir de parentais maternos diplóides. De fato, tem-se verificado na literatura que esse tipo de ginogenético apresenta pouca redução nos níveis de heterozigose. 2) Controle da proporção sexual- Um dos interesses da ginogênese em piscicultura é a possibilidade de produção de linhagens monossexuais de fêmeas. A produção de linhagens ginogenéticas poderia constituir potencialmente um caminho para o controle da reprodução. Entretanto, a ginogênese apresenta várias desvantagens quando proposta em projetos de piscicultura visando ao controle da reprodução. Um dos problemas é que os ginogenéticos são altamente consangüíneos. Se, por um lado, é uma grande vantagem dispor de diferentes linhagens consangüíneas para serem intercruzadas, seguindo-se o mesmo padrão de procedimento genético usado para a obtenção do milho híbrido, por outro lado é desvantajoso no caso em que os peixes ginogenéticos tenham que ser soltos na natureza, pois apresentam taxas de sobrevivência substancialmente menores do que as dos peixes normais. Um segundo problema relativo ao uso da ginogênese para finalidades de controle populacional é que, embora a descendência dos ginogenéticos possa ser unissexual, ainda permanece fértil. Portanto, a introdução acidental ou produção ocasional de machos em um projeto de ginogênese para controle populacional pode levar ao estabelecimento de uma população não desejável. Logo, em projetos para o controle da reprodução, parece ser preferível a utilização da esterilidade por triploidia induzida ou por tratamentos hormonais do que a monossexagem por ginogênese. No entanto, a ginogênese pode ser bastante útil na produção indireta de linhagens monossexuais de fêmeas. Nesses tipos de programas, uma linhagem ginogenética constituída somente por fêmeas pode ser tratada hormonalmente e revertida sexualmente em machos funcionais. Como os peixes resultantes serão geneticamente fêmeas e funcionalmente machos, quando cruzados com fêmeas normais irão produzir descendência constituída somente por fêmeas. Este tópico será retomado em detalhe no item 3- Reversão Sexual em Peixes do presente trabalho. 3) Linhagens consangüíneas - Na área de pesquisa ictiogenética, verifica-se que a aplicação da ginogênese para a produção de linhagens consangüíneas torna-se cada vez mais importante; porém, as possibilidades de aplicação prática da ginogênese no manejo genético em projetos de piscicultura são ainda muito incertas, embora bastante promissoras. Em certas espécies de peixes, tais como a truta arco-íris, os estoques cultivados apresentam uma grande similaridade genética, como sugerem os estudos efetuados com auxílio dos marcadores genético-bioquímicos. Nessas condições é pouco provável que cruzamentos entre estoques muito pouco diferentes sob o aspecto genético dêem lugar a fenômenos de heterose ou vigor híbrido, em que o desempenho das progênies seja superior ao melhor estoque parental. Para casos como estes, uma das idéias dos geneticistas tem sido criar linhagens biologicamente bastante distintas. Um dos caminhos clássicos é o da consangüinidade, que possibilitaria, teoricamente, obterem-se as chamadas linhagens "puras", nas quais os indivíduos seriam, em princípio, geneticamente muito semelhantes entre si. Sob esse aspecto, o ponto mais interessante a se considerar é o de que duas linhagens consangüíneas seriam, em média, bastante mais diversificadas geneticamente do que duas outras não-consangüíneas. Portanto, cruzando-se duas linhagens consangüíneas diferentes, poder-se-ia esperar o aparecimento do fenômeno da heterose. Por este método, obteve-se o milho híbrido, que mais do que triplicou a produção deste cereal nos EUA após 1960.

12 Para se obterem linhagens altamente consangüíneas nos animais, o procedimento clássico consiste em cruzamentos entre irmãs e irmãos inteiros, que são repetidos ao longo de gerações sucessivas. Esta forma de consangüinidade programada tem se mostrado muito eficiente na produção de linhagens "puras" de camundongos usados em laboratório. Ocorre, porém, que o intervalo entre duas gerações sucessivas, sendo bastante maior nos peixes cultivados do que nos camundongos, demandaria um mínimo de vinte anos de trabalho. A saída para tornar este método mais promissor tem sido a obtenção mais rápida de peixes altamente consangüíneos via ginogênese. Na prática, há vários obstáculos para se usar rotineiramente a ginogênese em programas de piscicultura. Um dos principais problemas é que as tecnologias de ginogênese são mais complicadas que os esquemas clássicos de cruzamentos entre irmãos; outro problema sério é que a ginogênese mitótica maximiza tanto os níveis de consangüinidade em 100% em uma única geração, como também maximiza as taxas de mortalidade e de anomalias. Um caminho alternativo que vem sendo adotado é um aumento gradual da consangüinidade das linhagens: para isso usa-se a ginogênese por retenção do segundo corpúsculo polar, que resulta em aproximadamente 45% a 65% de consangüinidade por geração, alternada com cruzamentos entre irmãos, que produz 25% de consangüinidade por geração 7,6,20. Usando-se este esquema alternativo, a produção de linhagens ginogenéticas já começa a fazer parte da rotina de algumas pisciculturas européias, sendo o caso mais conhecido dos brasileiros o das chamadas carpas húngaras 17. 4) Identificação de sistemas de determinação do sexo -A produção de linhagens ginogenéticas auxilia na caracterização e distinção de sistemas de determinação do sexo em espécies de peixes em que a fêmea seja homogamética ou heterogamética. Quando a fêmea for homogamética, a ginogênese irá produzir somente fêmeas; quando a fêmea for heterogamética a ginogênese irá produzir números iguais de machos e fêmeas. Estes tipos de resultados não provam em definitivo qual seria o sistema de determinação do sexo na espécie testada; mas, devido ao fato de os sistemas XX/XY (igual ao de mamíferos) e ZZ/ZW (igual ao de aves) serem os mais comuns dentre os nove mecanismos de determinação do sexo existentes em peixes, a ocorrência de ginogenéticos constituídos somente por fêmeas sugere que a espécie em questão apresente o sistema XX/XY, enquanto que a ocorrência de 50% de machos e 50% de fêmeas sugere que a espécie em teste apresente o sistema ZZ/ZW. 2.4 Androgenéticos Os androgenéticos são linhagens de peixes que apresentam unicamente o genoma paterno. 1) Produção de androgenéticos - As linhagens androgenéticas podem ser produzidas por dois métodos; o mais comumente usado consiste em fecundar um "óvulo", cujo material genético tenha sido destruído por raios X ou raios gama, com um espermatozóide normal. Deste processo resulta um androgenético haplóide. Quando o zigoto androgenético haplóide vai sofrer a primeira clivagem mitótica, é dado um choque hiperbárico tardio para impedir a divisão celular, e os dois núcleos haplóides se fundem para formar um núcleo diplóide (Tabela 3). Todos os cromossomos do peixe androgenético provêm do parental paterno, e os animais assim produzidos são altamente consangüíneos. Como o complemento cromossômico diplóide provém de um único lote que se autoduplicou, os níveis de homozigose e de consangüinidade são ambos da ordem de 100%. Essas linhagens androgenéticas apresentam taxas de sobrevivência ao redor de 5%, devido à expressão dos alelos recessivos detrimentais 7. Uma segunda técnica, que pode ser usada para a produção de androgenéticos, consta em fertilizar os "óvulos", cujo material genético tenha sido destruído por radiação, com espermatozóides de machos tetraplóides. Como se sabe, os machos tetraplóides

13 produzem espermatozóides diplóides e, assim,os zigotos resultantes seriam diplóides. Desse modo, em 1990 foram produzidas nos EUA trutas arco-íris androgenéticas 23. 2) Androgenéticos e supermachos - Nos casos em que os androgenéticos sobrevivem até o período de primeira maturação sexual, é possível usá-los para a produção de supermachos (YY), nas espécies cujos sistemas de determinação do sexo sejam do tipo XX/XY. Nestes casos os machos são heterogaméticos, de modo que metade dos androgenéticos produzidos será de supermachos. 3) Androgênese e conservação genética - Os androgenéticos apresentam uma aplicação potencial bastante interessante na área de manutenção do germoplasma e conservação de espécies de peixes em perigo de extinção. Através da androgênese, pode-se recuperar o material genético de espécies cujas amostras de esperma tenham sido criopreservadas em bancos de germoplasma. Como atualmente a tecnologia para preservação de "óvulos" de peixes ainda não é satisfatória, a única via prática para a estocagem e recuperação genética na área ictiológica é fertilizar "óvulos" recém-obtidos com esperma criopreservado. Usando-se a androgênese, o genoma de espermatozóides criopreservados pode ser recuperado, mesmo que a espécie venha a se extinguir. Este tipo de abordagem não é geneticamente completo, porque o DNA mitocondrial, que é herdado por via materna, não poderá ser recuperado por androgênese 3,6. 3. REVERSAO SEXUAL EM PEIXES A manipulação de gametas, ovos e embriões podem ser realizados com maior facilidade em peixes do que em outros animais, porque esse grupo geralmente apresenta fecundação e desenvolvimento externos. Valendo-se do desenvolvimento externo dos peixes, os geneticistas e piscicultores conseguem controlar o sexo fisiológico desse grupo de animais através da adição de hormônios esteróides anabolizantes no seu alimento ou na água em que vivem. A razão pela qual é possível controlar o sexo fisiológico dos peixes é que, enquanto o sexo genético é determinado por ocasião da fecundação, o sexo fisiológico não é. Durante o início da embriogênese, um embrião de peixe não é nem macho nem fêmea, porque não possui ovários, testículos ou outras características associadas aos sistemas reprodutores. Ao contrário, um embrião de peixe possui precursores embriológicos de ovários e testículos (células germinativas primordiais) e, nesse estádio, um embrião é "totipotente" porque pode se desenvolver em um macho ou em uma fêmea. Em um determinado momento específico durante o desenvolvimento embriológico (momento que é diferente para cada espécie), um sinal químico originado de um gene ou de um conjunto de genes informa" ao tecido totipotente em que direção se desenvolver. Uma vez que isso ocorra e o tecido pré-gonadal complete seu desenvolvimento, o peixe se torna fisiologicamente macho ou fêmea. Após essa etapa, não é mais possível alterar o sexo fisiológico, exceto por técnicas radicais, tais como a cirurgia gonadal, que têm mostrado pouco sucesso. Há um pequeno espaço de tempo, que varia de espécie para espécie, durante o qual o sexo fisiológico pode ser alterado. Se um peixe ingere ou absorve esteróides anabolizantes durante esse período, o esteróide pode interferir diretamente no desenvolvimento das células totipotentes. Esta tecnologia tem sido bastante pesquisada nos últimos vinte anos e vem sendo rotineiramente aplicada em programas de piscicultura envolvendo, por exemplo, tilápias, salmonídeos e ciprinídeos. 3.1 Linhagens Revertidas Monossexuais 1) Produção de linhagens monossexuais em uma etapa - Para se alterar em uma única etapa o sexo fisiológico de peixes, as larvas e alevinos devem ser, ou alimentados com ração contendo andrógenos (hormônios masculinos) ou estrógenos (hormônios

14 femininos), ou mantidos por certo tempo em água contendo concentrações diluídas desses mesmos hormônios. As dosagens exatas de hormônios e os tempos durante os quais 'devem ser administrados são fatores importantes no sucesso dos programas de reversão sexual em peixes 20,31. 0 procedimento de reversão sexual em uma única etapa tem sido bastante usado na piscicultura das tilápias (Tabela 4). Uma das principais metas no cultivo de tilápias tem sido produzir linhagens monossexuais de machos com a finalidade de impedir a reprodução precoce e descartar as fêmeas que crescem mais devagar que do os machos. Para essa finalidade, as larvas de tilápia do Nilo por exemplo, são alimentadas com ração contendo 40 mg de 117-alfa-metiltestosterona/ kg de dieta durante um período de 60 dias. Essa dosagem usualmente reverte 100% das fêmeas em machos. Tabela 4 -Esquema geral do protocolo para a produção direta de linhagens revertidas de machos ou fêmeas em peixes com determinação do sexo tipo XX/XY ETAPA ÚNICA: Produção direta de linhagens revertidas FASE DE VIDA Larvas Indiferenciadas TIPO DE ESTERÓIDE ANDRÓGENOS ESTRÓGENOS SEXO FISIOLÓGICO MACHOS FÊMEAS SEXO GENÉTICO MACHOS REVERTIDOS FÊMEAS REVERTIDAS ou NEOMACHOS (XX) ou NEOFÊMEAS (XY) MACHOS NORMAIS (XY) FÊMEAS NORMAIS (XX) Nas pisciculturas de truta arco-íris, onde uma das finalidades seria produzir populações monossexuais de fêmeas, as larvas indiferenciadas são alimentadas com ração contendo 20 mg de 17-beta-estradiol/kg de dieta durante um período de 40 dias, obtendo-se normalmente 100% de fêmeas revertidas. 0 consumo de peixes revertidos sexualmente por administração de esteróides anabólicos pode levantar uma série de questões na área de saúde pública, conforme deverá ser discutido mais detalhadamente no item 6 - Riscos Potenciais de Linhagens de Peixes Geneticamente Manipulados, do presente trabalho. Este tipo de problema pode ser contornado, em parte, pela incorporação do processo de reversão sexual em programas de piscicultura que possibilitem a produção de linhagens monossexuais de fêmeas para espécies com sistema de determinação do sexo tipo XX/XY e de linhagens monossexuais de machos, para espécies com sistema de determinação do sexo tipo ZZ/ZW. 2) Produção de linhagens monossexuais de fêmeas em duas etapas - É relativamente fácil obter matrizes que sejam capazes de produzir linhagens constituídas somente de fêmeas em espécies de peixes que possuem o sistema de determinação do sexo tipo XX/XY. Nesse caso, são usados andrógenos para produzir neornachos XX (Tabela 5). Numa primeira etapa, as larvas sexualmente indiferenciadas são alimentadas com ração contendo andrógenos ou mantidas em banho de água, também contendo hormônios. Os peixes são criados até que possam ser sexados e, então, são separados em duas categorias: fêmeas, que são descartadas e machos, que são guardados.

15 Tabela 5 - Esquema geral do protocolo para a produção de linhagens monossexuais de fêmeas em espécies de peixes com sistema de determinação do sexo tipo XX/XY 1. Etapa: Produção de linhagens de machos revertidos (XX) - Larvas indiferenciadas Andrógenos Machos revertidos (XX) e Machos normais (XY) 2. Etapa de Progênie para identificação dos machos revertidos (XX) - Fêmeas normais (XX) x Machos revertidos (XX) 100% de Fêmeas normais (XX) - Fêmeas normais (XX) x Machos normais (XY) 50% de Machos normais (XY) % de Fêmeas normais (XX) Guardar Linhagens de Machos Revertidos (XX) É impossível separar os neomachos ou machos revertidos tipo XX dos machos normais XY pelo simples exame de características sexuais externas. Assim, numa 29 etapa é necessário realizar um teste de progênie para identificar os machos revertidos, dos normais. Para esta finalidade, são feitos cruzamentos entre casais de fêmeas normais e machos tratados hormonalmente e cada família é criada separadamente até que a descendência possa ser sexada. Caso a descendência se mostre constituída por 50% de fêmeas e 50% de machos, o macho parental é do tipo XY e deve ser descartado. Se, por outro lado, a descendência for constituída somente de fêmeas, então o macho parental testado é um neomacho tipo XX e deve ser mantido, porque são estes tipos de matrizes que servirão para a produção de linhagens monossexuais de fêmeas. Vários programas em piscicultura têm sido desenvolvidos para a produção de linhagens monossexuais de fêmeas como, por exemplo, em carpa capim, truta arco-íris e salmão do Atlântico. No caso da carpa comum, foram produzidos ginogenéticos revertidos (ginogenéticos em carpa comum são todos fêmeas XX) e criada uma linhagem que produzia somente filhas. Tanto na truta arco-íris como no salmão do Atlântico, não é necessário realizar o teste de progênie, porque os machos revertidos ou neomachos XX apresentam dutos espermáticos incompletos, o que significa que o esperma não pode ser normalmente liberado desses machos, mesmo por compressão abdominal. Devido a isso, o esperma de machos revertidos XX de trutas arco-íris somente pode ser obtido através do sacrifício dos animais. Portanto, os machos de truta arco-íris e de salmão do Atlântico podem ser caracterizados como neomachos (XX) ou como machos normais (XY) pelo exame dos dutos espermáticos. 3) Produção de linhagens monossexuais de machos em duas etapas - Para se obterem matrizes que sejam capazes de produzir linhagens monossexuais de machos em espécies com sistema de determinação do sexo tipo ZZ/ZW, as larvas devem ser revertidas sexualmente com estrógenos. Assim são produzidas linhagens de neofêmeas ZZ. 0 único modo de diferenciar as neofêmeas ZZ de fêmeas normais ZW é através do teste de progênie das fêmeas. As fêmeas normais ZW produzem descendência constituída de 50% de machos e 50% de fêmeas, e devem ser descartadas. Por outro lado, neofêmeas ZZ irão produzir 100% de descendentes machos e serão estas as matrizes que deverão ser guardadas porque são capazes de produzir linhagens monossexuais de machos. Em certos casos, como verificado em tilápias da espécie áurea, algumas fêmeas produzem famílias somente de machos e outras famílias constituídas por machos e hermafroditas. As razoes para o insucesso parcial de programas com esta espécie de tilápia não são completamente conhecidas, mas podem