PARTE A - Utilização do método de Utermohl (Hasle, 1978) para análise da abundância e composição específica do microplâncton

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1 BIOLOGIA MICROBIANA II MÓDULO PROTISTAS AULA PRÁTICA 1 PARTE A - Utilização do método de Utermohl (Hasle, 1978) para análise da abundância e composição específica do microplâncton 1. Colher a amostra com um dispositivo adequado 2. Homogeneizar a amostra e fixar a amostra com uma solução de lugol (0,3 ml/100ml amostra) 3. Transportar a amostra no frio e no escuro 4. Adaptar a amostra à temperatura do laboratório 5. Sedimentar sub-amostras fixadas em colunas de sedimentação adequadas (capacidade 50 ml), montadas directamente sobre lâminas para o microscópio de inversão, durante um período de 72 h. A deposição das células deve decorrer em superfície horizontal e sob temperatura constante 6. Após o período de sedimentação/deposição, remover cuidadosamente o sobrenadante evitando ressuspender ou alterar a distribuição do material acumulado no fundo da câmara 7. Colocar a câmara no microscópio óptico de inversão e esperar cerca de 15 minutos para permitir a completa deposição das células na câmara 8. Percorrer todo a câmara com a objectiva de menor ampliação (6,3 x) de modo a avaliar a abundância e distribuição de fitoplanctontes e protistoplanctontes fagotróficos na câmara e a ocorrência de espécies raras na amostra 9. Considerar um campo microscópico como a área rectangular definida pelos quatro vértices do gratículo instalado na ocular. Enumerar e identificar os fitoplanctontes e protistoplanctontes fagotróficos num conjunto de campos microscópicos seleccionados ao acaso, utilizando a objectiva de 25x. Utilizar os Manuais de Identificação e fotografias disponibilizados pelo docente para identificar os unicelulares planctónicos enumerados. Se necessário, aumentar a ampliação para clarificar a identificação 10. No caso de organismos colocados entre as linhas do rectângulo seleccionar apenas os colocados sobre uma das linhas horizontal e vertical (ex.: linha direita, linha inferior) 11. Não enumerar frústulas ou tecas vazias 12. No caso de organismos organizados em colónia, enumerar todas as células que a compõem

2 13. Para a enumeração de células relativamente menos abundantes e/ou de dimensões superiores utilizar uma objectiva de menor ampliação 14. O número de campos observado depende da concentração de células na câmara e do tempo de observação disponível para cada grupo de trabalho. Se necessário, observar toda a área da câmara. Recomenda-se a enumeração de pelo menos 50 células da espécie mais abundante e 400 células no total ( erro máximo de 10%). A enumeração de 16, 50, 75 e 100 unidades de contagem está associada a erros máximos de 50%, 28%, 24% e 20%, respectivamente. 15. Calcular a abundância de cada grupo/espécie de fitoplâncton e protistoplâncton fagotrófico e a abundância total das duas comunidades com base na equação: Abundância (nº células.l -1 ) = X x A x d V x n x a com: X - nº total de células enumeradas V - volume de amostra fixada sedimentado (50 ml) n - nº de campos microscópicos analisado d - factor de correcção relativo à diluição da amostra induzida pela adição do fixador (volume amostra fixada /volume amostra ) A - área total da câmara de sedimentação (A= r 2 ; = 511 mm 2 ) a - área do campo microscópico (objectiva 25 x: mm 2 )

3 PARTE B - Utilização do método de epifluorescênica de Haas (1982) para análise da abundância e composição específica do picoplâncton e nanoplâncton 1. Colher a amostra com um dispositivo adequado 2. Homogeneizar a amostra e fixar a amostra com uma solução de gluteraldeído de modo a obter uma concentração final de 2 % (0,8 ml/9,2 ml amostra) 3. Transportar a amostra no frio e no escuro e armazená-la nestas condições até ao seu processamento. O processamento deverá decorrer, no máximo, 24 h após a colheita da amostra 4. Para a execução das preparações, montar o funil e suporte de filtração e lavá-los com água destilada. 5. Com o auxílio de uma pinça, colocar um filtro de suporte (membrana de celulose com diâmetro de poro 0.45 µm) sobre o suporte de filtração previamente humedecido com uma gota de água destilada. Colocar sobre o filtro de suporte um filtro de membrana de policarbonato não fluorescente (diâmetro de poro de 0.40 µm) escuro ou previamente corado com negro de Irgalão. Colocar a face brilhante do filtro virada para cima, evitar a formação de rugosidades no filtro e centrar o filtro correctamente. 6. Colocar a chaminé de filtração e ajustá-la com a mola. 7. Homogeneizar a amostra fixada e refrigerada. Com uma pipeta automática, transferir para o funil de filtração um volume adequado de amostra. O volume de amostra filtrado (7 20 ml) depende da concentração de organismos unicelulares planctónicos na amostra. 8. Com o auxílio de uma pipeta automática adicionar a solução do fluorocromo proflavina (concentração final XX %). Proteger o funil de filtração + amostra com papel de alumínio e esperar 3 minutos. Atenção, a proflavina é um composto potencialmente carcinogénico pelo que é obrigatória a utilização de luvas. 9. Durante este período de espera, identificar uma lâmina com a referência da amostra e/ou grupo de trabalho. Colocar uma gota de óleo não fluorescente (ex.: Cargile A) sobre a lâmina e, com o auxílio de uma lamela, espalhá-la de modo a formar uma camada fina e homogénea. 10. Após 3 minutos da adição do corante ligar a bomba de vácuo e filtrar a amostra corada. Filtrar a amostra utilizando uma pressão de vácuo inferior a 50 mm Hg. 11. Retirar o filtro do suporte de filtração com a bomba de vácuo ainda em funcionamento e colocá-lo sobre a lâmina previamente coberta com óleo de imersão. Evitar a formação de bolhas de ar.

4 12. Colocar uma gota de óleo não fluorescente sobre o filtro e uma lamela sobre este. Com o auxílio de um fragmento de papel absorvente, comprimir a preparação cuidadosamente de forma a remover o excesso de óleo. 13. Armazenar a preparação numa caixa apropriada e mantê-la no escuro e no congelador (-20ºC) até ao momento da sua análise microscópica. 14. Para a análise microscópica da preparação, colocar uma gota de óleo não fluorescente sobre a lamela. Interpôr o filtro azul (excitação nm) no microscópio de epifluorescência e observar a preparação utilizando uma ampliação de 1250x. 15. Definir a área do campo microscópico para cada amostra com o auxílio de um gratículo (tipo New Porton G12) instalado na ocular, previamente calibrado. 16. Para cada amostra enumerar, no mínimo, as células existentes em 50 campos microscópicos seleccionados ao acaso ou os campos necessários até perfazer um total de 400 células (erro 10%), utilizando uma ampliação total de 1250 x. Recomendase a enumeração de pelo menos 50 células da espécie mais abundante. Observar a preparação com uma ampliação menor para analisar quantitativamente a concentração e composição de organismos menos abundantes e/ou de maiores dimensões (exs.: diatomáceas, ciliados, dinoflagelados). 17. A coloração com proflavina confere uma coloração verde clara à região do citoplasma e uma coloração verde forte ao núcleo (organismos eucariotas). A diferenciação microscópica entre protistas plastídicos (fitoplâncton) e aplastídicos (protistas fagotróficos) baseia-se na autofluorescência de côr vermelha (clorofila a) ou alaranjada (ficobiliproteínas) associada aos pigmentos fotossintéticos do fitoplâncton quando excitados com luz azul. Atenção, os protistas aplastídicos podem apresentar fluorescência avermelhada nos vacúolos digestivos. Contudo, estas estruturas não se localizam geralmente na superfície da célula e apresentam um aspecto mais irregular e granuloso quando comparado com o aspecto dos cloroplastos. 18. De entre o picofitoplâncton ( µm), as cianobactérias (tipo Synechococcus) são reconhecidas pela auto-fluorescência alaranjada após excitação com luz azul, característica da presença de ficobilinas, e pela inexistência de uma zona nuclear definida. A excitação com luz verde permitirá a emissão em vermelho. O picofitoplancton eucariótico é reconhecido pela existência de uma região nuclear bem definida associada a auto-fluorescência vermelha. Devido às suas dimensões e características de fluorescência, Prochlorococcus sp. (cianobactéria) pode não ser avaliada de forma rigorosa com a técnica utilizada. 19. Os flagelados aplastídicos são reconhecidos pela existência de flagelos e núcleo. Os flagelados plastídicos são reconhecidos pela existência de flagelos, núcleo e cloroplastos. Dividir as células observadas em classes morfológicas com base nas seguintes características: (i) forma e dimensão celulares; (ii) número de flagelos e comprimento relativo; (iii) número e disposição dos cloroplastos; (iv) existência de estruturas externas tais como loricas, espículas, placas tecais, pseudópodes, pedúnculo ou haptonema; (v) natureza dos pigmentos (auto-fluorescência laranja ou vermelha).

5 20. Os dinoflagelados aplastídicos são reconhecidos pelo aspecto granuloso do núcleo, morfologia celular (epicone, hipocone e sulco) e existência de flagelos. Os dinoflagelados plastídicos são reconhecidos pelos aspectos anteriores e pela presença de cloroplastos. Dividir as células observadas em formas com e sem armadura. 21. As nano-diatomáceas são reconhecidas pela morfologia externa. Todavia, muitas das características externas, em particular as associadas à ornamentação das valvas, podem não ser observáveis com esta técnica. 22. Os ciliados são reconhecidos pela presença de cílios e núcleos múltiplos. Dividir as células observadas em ciliados com lórica (aloricados) e sem lórica (tintinídeos). Dividir as células observadas em indivíduos autotróficos obrigatórios (Mesodinium rubrum), heterotróficos ou mixotróficos. 23. Calcular a abundância de cada espécie/grupo de fitoplâncton e protistoplâncton aplastídico e a abundância total das duas comunidades com base na equação: com: Abundância (Nº células.l -1 ) = (X * A * d) / (a * n * V) X - número total de células enumeradas A - área útil de filtração do filtro de policarbonato (212,5 mm 2 ) d - factor de correcção relativo à diluição da amostra induzida pela adição do fixador (volume amostra fixada /volume amostra ) a - área do campo de observação (variável) n - número de campos microscópicos observados V - volume de amostra fixada filtrado (variável, em L)