5 CARACTERIZAÇÃO DOS ÁCIDOS HÚMICOS

Transcrição

1 CINCO

2 Caracterização dos Ácidos Húmicos 42 5 CARACTERIZAÇÃO DOS ÁCIDOS HÚMICOS 5.1 Extração e Purificação Introdução As substâncias húmicas (SH) são usualmente fracionadas com base nas suas solubilidades, sendo os ácidos húmicos (AH) a fração solúvel em álcalis e insolúvel em meio ácido. O percentual de material húmico extraído varia consideravelmente de um tipo de matriz para outro, e, em geral, é maior quando se aumenta o ph do extrator e a temperatura de extração (Stevenson, 1994). A solubilização dos AH em meio alcalino se deve à conversão dos grupos ácidos (principalmente carboxílicos e fenólicos) em íons. A repulsão eletrostática entre os íons formados e as argilas (também carregadas negativamente) e a repulsão intramolecular, que leva a uma conformação menos enovelada dos AH, facilita sua hidratação. Ressaltase, porém, que sais (humatos) de cátions polivalentes não são solúveis. De acordo com Stevenson (1994), o método de extração ideal seria aquele que permitisse o isolamento dos AH inalterados, livres de contaminantes e representativos de toda a amplitude de massas moleculares, e que fosse aplicável a qualquer tipo de matriz. Entretanto, tal método ainda não fora desenvolvido e, provavelmente, nunca o será, dada a complexidade da matriz. Dentre os vários solventes empregados nos processos de extração dos AH em matrizes sólidas, a solução de NaOH é o mais utilizado e é o sugerido pela Sociedade Internacional de Substâncias Húmicas (IHSS) ( Sua principal vantagem é extrair uma maior

3 Caracterização dos Ácidos Húmicos 43 quantidade de material do que qualquer outro extrator disponível. No entanto, esse extrator tem recebido diversas críticas (Stevenson, 1994), como o fato de dissolver a sílica e tecidos orgânicos frescos que contaminariam o extrato, e promover alterações químicas, como autooxidação de alguns componentes orgânicos e condensação entre aminoácidos e carbonilas de aldeídos aromáticos, decorrentes da absorção de oxigênio da atmosfera. Nesse último caso, esse efeito pode ser minimizado, realizando-se a extração sob atmosfera de N 2, apesar de Tan et al. (1991) não terem verificado nenhum efeito da atmosfera sobre as características físico-químicas de diferentes frações humificadas. Frente a essas considerações, outros extratores mais brandos têm sido utilizados, cada um apresentando vantagens e desvantagens, mas todos com capacidade extratora inferior a do NaOH. Entre os extratores mais utilizados, além do NaOH, estão o Na 2 CO 3, o Na 4 P 2 O 7, o Na 2 B 4 O 7 e o NaF, além de alguns solventes orgânicos, como piridina, dimetilformamida, dimetilsulfóxido e ácido fórmico (Hayes e Clapp, 2001; Piccolo et al., 1990). Reagentes que formam complexos, como EDTA, acetilacetona e hidroxiquinona, também podem ser utilizados, pois evitam a fixação de substâncias orgânicas em componentes inorgânicos. Com a finalidade de aumentar-se a eficiência dos extratores, pode-se submeter a suspensão do solo a um tratamento de dispersão dos colóides com o uso de vibração ultrassônica (Novotny, 2002). Powell e Town (1992) mostraram que a solubilidade das SH aumenta com o ph e diminui com a intensidade iônica do meio, e observaram que o Na 4 P 2 O 7, em ph 9,2, é um bom solvente para AH de solos, pois apresenta eficiência de extração similar ao NaOH, com um índice de degradação oxidativa bem menor (Powell e Fenton, 1996; Gregor e Powell, 1986). Dick et al. (1999) observaram que as SH de solo extraídas com Na 4 P 2 O 7 apresentaram maior caráter aromático e maior proporção de grupos carboxílicos que as SH extraídas com NaOH. A purificação dos AH é feita geralmente com solução mista de HCl e HF (conforme sugestão da IHSS), que promove a quebra das ligações Si O entre a argila e a matéria orgânica, solubilizando dessa forma os argilo-

4 Caracterização dos Ácidos Húmicos 44 minerais. Sánchez-Monedero et al. (2002) verificaram que o tratamento com HCl-HF reduz significativamente o teor de cinzas dos AH sem grande alteração na sua composição química e na sua estrutura. Por outro lado, Piccolo et al. (1990) observaram redução de componentes alifáticos e carboidratos em SH purificadas com essa solução ácida Materiais e Métodos A extração e purificação dos AH foram feitas de acordo com a metodologia convencional sugerida pela Sociedade Internacional de Substâncias Húmicas, com a alternativa de também usar pirofosfato de sódio no lugar de hidróxido de sódio como extrator. Foram utilizados 100 g de vermicomposto (para extração com NaOH e com Na 4 P 2 O 7 ), 80 g de turfa (para extração com Na 4 P 2 O 7 ) e 25 g de turfa (para extração com NaOH). As extrações foram feitas em triplicata. O procedimento está resumido a seguir (para uma quantidade de 100 g de amostra seca ao ar): A amostra (previamente seca a temperatura ambiente e peneirada em malha de 2 mm) foi transferida a um béquer no qual foi adicionado 1,0 L de solução de HCl 0,1 mol L -1. A suspensão foi agitada por 1 hora. Depois de removido o sobrenadante por sifonação, foi adicionado ao resíduo 1,0 L de solução de NaOH 0,1 mol L -1 (ou Na 4 P 2 O 7 0,1 mol L -1 ). A mistura foi agitada por 4 horas e, em seguida, deixada em repouso por 12 horas a temperatura ambiente. A mistura foi então centrifugada a 7500 rpm (5,53 x 10 3 g) por 20 minutos. O sobrenadante foi novamente centrifugado e, depois, acidificado com uma solução de HCl 6 mol L -1 até ph 1,0 (aproximadamente 500 ml) e deixado em repouso por 12 horas. O precipitado (AH) foi separado da fração solúvel, ácido fúlvico (AF), por nova centrifugação a 7500 rpm por 20 minutos. Em um béquer de plástico, foi adicionado ao AH cerca de 250 ml de solução composta de HCl 0,1 mol L -1 e HF 0,3 mol L -1. Deixou-se em agitação por 4 horas e em repouso por, no mínimo, 24 horas.

5 Caracterização dos Ácidos Húmicos 45 A suspensão foi centrifugada (7500 rpm por 20 minutos) e, após se eliminar o sobrenadante, o resíduo foi transferido, com auxílio de água destilada, para uma membrana de diálise da marca Spectrapor (Thomas Scientific), com 65 cm de comprimento por 50 mm de largura, capacidade de 8,0 ml cm -1 e porosidade para moléculas com massa molecular de 6000 a 8000 daltons. Essa membrana ficou em um recipiente plástico com água destilada e desionizada (trocada duas vezes por dia) sob agitação constante por aproximadamente 5 dias. O AH foi então liofilizado e mantido em dessecador. Antes de serem utilizadas na purificação dos AH, as membranas de diálise foram devidamente tratadas para remoção de glicerina, traços de compostos sulfurosos e metais, seguindo o procedimento estabelecido por McPhie: As membranas foram fervidas por 1 hora em 1 litro de etanol 50%. As membranas foram então agitadas por 1 hora a temperatura ambiente em solução de NaHCO 3 0,01 mol L -1 e EDTA dissódico 0,001 mol L -1. Repetiu-se o procedimento com água destilada, depois com nova solução de NaHCO 3 0,01 mol L -1 e EDTA 0,001 mol L -1, e, por fim, com água destilada Resultados e Discussão A tabela 9 mostra as quantidades de AH de turfa extraídas com NaOH e com Na 4 P 2 O 7 (TN e TP, respectivamente) e AH de vermicomposto extraídas com NaOH e com Na 4 P 2 O 7 (VN e VP, respectivamente).

6 Caracterização dos Ácidos Húmicos 46 TABELA 9 - Quantidade extraída (e quantidade extraída em relação ao teor de matéria orgânica) de ácidos húmicos de turfa e vermicomposto (entre parênteses: desvio-padrão; n = 3 determinações). Amostra Quantidade extraída (%) Quantidade extraída/matéria orgânica (%) TN 8,60 (0,50) 16,51 (0,96) TP 7,46 (0,23) 14,32 (0,44) VN 3,55 (0,37) 12,75 (1,33) VP 1,04 (0,09) 3,74 (0,32) Pode ser observado na tabela 9 que a quantidade de ácidos húmicos extraídos de turfa é muito maior que a quantidade extraída de vermicomposto. Normalizando-se pelo teor de matéria orgânica, a quantidade de AH extraídos no vermicomposto ainda assim foi menor que na turfa. Esse resultado era esperado, uma vez que o vermicomposto teve um tempo de humificação consideravelmente menor. Além disso, a solução de NaOH extrai cerca de 3 vezes e meia mais AH de vermicomposto que a solução de pirofosfato de sódio, fato esse que pode ser explicado pela maior alcalinidade do hidróxido de sódio. Entretanto, para turfa, a quantidade de AH extraídos variou muito pouco, alterando-se o extrator. Dados da literatura (Dick et al., 1999) mostram que, dependendo do solo, a diferença na quantidade extraída de AH, variando-se o extrator, pode ser maior ou menor. Além disso, pelo fato de se ter utilizado quantidades iniciais da matriz diferentes, as possíveis perdas durante o processo de extração podem não ter sido proporcionais à massa inicial. 5.2 Teor de Cinzas Introdução O teor de cinzas corresponde à quantidade de matéria inorgânica, especialmente sílica e metais, presentes no ácido húmico. Esse

7 Caracterização dos Ácidos Húmicos 47 valor reflete na eficiência da extração e purificação. Valores altos de cinzas podem comprometer a interpretação da análise elementar e interfere nas análises de NMR e EPR Materiais e Métodos Aproximadamente 50,0 mg da amostra de ácido húmico foram colocados em mufla, a 550 C, por 4 horas, em um cadinho de platina previamente tarado. As determinações foram feitas em triplicata. O teor de cinzas foi calculado seguindo a equação 21: m C = 100 (21) m em que: C = teor de cinzas (em %); m = massa (em miligramas) da amostra calcinada; m 0 = massa (em miligramas) da amostra não calcinada Resultados e Discussão Os resultados de teor de cinzas estão expostos na tabela 10. TABELA 10 - Teor de cinzas das amostras de ácidos húmicos (entre parênteses: desvio-padrão; n = 3 determinações). Amostra Teor de cinzas (%) TN 1,0 (0,3) TP 1,1 (0,5) VN 2,1 (0,5) VP 2,1 (0,1) Como pode ser visto na tabela 10, os teores de cinzas de todas as amostras ficaram abaixo de 3%, o que pode ser considerado satisfatório para as análises subseqüentes.

8 Caracterização dos Ácidos Húmicos Acidez Total, Carboxílica e Fenólica Introdução A determinação de acidez em ácidos húmicos é um importante passo na sua caracterização, pois indica o número de grupos ácidos (essencialmente carboxílicos e fenólicos) presentes na estrutura. Vários métodos foram propostos para determinar esses grupos ácidos, desde titulações potenciométricas diretas (Conte et al., 2003), até métodos espectroscópicos (Cabaniss, 1991; Masini et al., 1998). Porém, o método mais utilizado se baseia em titulação potenciométrica indireta, com hidróxido de bário (para acidez total) e acetato de cálcio (para acidez carboxílica) (Schnitzer e Gupta, 1965; Schnitzer e Khan, 1972). Esse método se mostrou mais reprodutivo que as titulações diretas (Perdue, 1985) e é o mais utilizado para substâncias húmicas (Ayuso et al., 1997; Landgraf et al., 1998b; Poppi e Talamoni, 1992; Rasyid et al., 1992). Bonn e Fish (1991) estudaram a relação da acidez carboxílica com a razão acidez total e quantidade de acetato Materiais e Métodos Acidez Total: Uma amostra de 100 mg de AH foi colocada em um erlenmeyer de 25 ml, juntamente com 10 ml de solução 0,1 mol L -1 de hidróxido de bário (Ba(OH) 2 ). A água utilizada para preparar a solução alcalina foi previamente fervida para retirada de CO 2. Foi também preparado uma solução referência (branco), constituída apenas de 10 ml da solução de Ba(OH) 2. Passou-se um fluxo de nitrogênio nos erlenmeyers, que foram então submetidos à agitação por 24 horas a temperatura ambiente. Em seguida, a suspensão foi filtrada em papel de filtro comum, sendo coletados 5 ml do filtrado, que foi titulado potenciometricamente com uma solução padrão de HCl 0,05 mol L -1. O ponto de equivalência foi determinado em ph 8,4. A acidez total foi calculada pela equação 22.

9 Caracterização dos Ácidos Húmicos 49 ( V V ). C A. V branco a base T = (22) m AH Valíquota em que: A T = acidez total (em mmol c g -1 ); V branco = volume de HCl usado na titulação do branco; V = volume de HCl usado na titulação da amostra; C a = concentração da solução de HCl; m AH = massa de ácido húmico; V base = volume total de Ba(OH) 2 utilizado (10 ml); V alíquota = volume da alíquota utilizado na titulação (5 ml). Acidez Carboxílica: Uma amostra de 50 mg de AH foi colocada em um erlenmeyer de 25 ml, juntamente com 20 ml de solução 0,1 mol L -1 de acetato de cálcio (Ca(CH 3 COO) 2 ). A água utilizada para preparar a solução foi previamente fervida para retirada de CO 2. Foi também preparado um branco, constituído apenas de 20 ml da solução de Ca(CH 3 COO) 2. Passou-se um fluxo de nitrogênio nos erlenmeyers, que foram então submetidos à agitação por 24 horas à temperatura ambiente. Em seguida, a suspensão foi filtrada em papel de filtro comum, sendo coletados 10 ml do filtrado, que foi titulado potenciometricamente com uma solução padrão de NaOH 0,05 mol L -1. O ponto de equivalência foi determinado em ph 9,8. A acidez total foi calculada pela equação 3. ( V V ). C V A. branco b acetato C = (23) mah Valíquota em que: A C = acidez carboxílica (em mmol c g -1 ); V = volume de NaOH usado na titulação da amostra; V branco = volume de NaOH usado na titulação do branco; C b = concentração da solução de NaOH; m AH = massa de ácido húmico; V acetato = volume total de acetato de cálcio utilizado (20 ml); V alíquota = volume da alíquota utilizado na titulação (10 ml).

10 Caracterização dos Ácidos Húmicos 50 Acidez Fenólica: A determinação da acidez fenólica foi feita por diferença entre a acidez total e a acidez carboxílica Resultados e Discussão Os resultados da análise de acidez estão mostrados na tabela 11 e os gráficos titulométricos estão mostrados nas figuras 16 e 17. TABELA 11 - Acidez total, carboxílica e fenólica das amostras de ácidos húmicos (valores em mmol c g -1 ) (n = 6 determinações). Amostra Acidez total Acidez carboxílica Acidez fenólica TN 6,8 ± 0,5 3,9 ± 0,2 2,9 ± 0,5 TP 6,8 ± 0,6 4,3 ± 0,4 2,5 ± 0,7 VN 4,8 ± 0,2 2,3 ± 0,2 2,5 ± 0,3 VP 5,7 ± 0,3 2,8 ± 0,1 2,9 ± 0, turfa/naoh turfa/na 4 P 2 O 7 vermicomposto/naoh vermicomposto/na 4 P 2 O 7 branco ph Volume de HCl (ml) FIGURA 16 - Curva titulométrica de ácidos húmicos (dissolvidos em solução de Ba(OH) 2 ) com HCl 0,05 mol L -1 (acidez total).

11 Caracterização dos Ácidos Húmicos ph turfa/naoh turfa/na 4 P 2 O 7 vermicomposto/naoh vermicomposto/na 4 P 2 O 7 branco Volume de NaOH (ml) FIGURA 17 - Curva titulométrica de ácidos húmicos (dissolvidos em solução de Ca(CH 3 COO) 2 ) com NaOH 0,05 mol L -1 (acidez carboxílica). Esses resultados mostram uma maior acidez carboxílica nas amostras de AH de turfa. Observa-se também uma maior acidez carboxílica nas amostras de vermicomposto extraídas com pirofosfato de sódio em relação às extraídas com hidróxido de sódio, ou seja, o pirofosfato de sódio foi mais seletivo em relação aos grupos funcionais dos AH. 5.4 Titulação Potenciométrica Funções de Gran Introdução Titulações potenciométricas são freqüentemente utilizadas para se estudar as propriedades ácido-base das substâncias húmicas. A presença de grupos fenólicos e carboxílicos com diferentes forças ácidas, aliada a efeitos eletrostáticos, devido à acumulação de cargas na macromolécula, leva a curvas de titulação sem nenhum ponto de inflexão abrupta. Assim, o uso de métodos numéricos tem sido proposto para distinguir grupos ácidos de diferentes forças. Titulações de ácidos húmicos em meio aquoso usando funções de Gran modificadas (baseadas em equações lineares) foram estudadas por alguns pesquisadores (Abate e Masini, 2001; Aleixo et al., 1992; Cabaniss,

12 Caracterização dos Ácidos Húmicos ; Masini, 1994). Masini et al. (1998) utilizaram funções de Gran, com regressão não-linear, para determinação das constantes de ionização dos sítios ionizáveis de amostras de AH da Aldrich e de vermicomposto. Outros modelos potenciométricos também foram utilizados nos estudos das propriedades ácidas das SH (Bonn e Fish, 1991; Falzoni et al., 1998; Fukushima et al., 1996; Kurková et al., 2004; Manusa et al., 1992; Marshall et al., 1995). Métodos baseados em titulações condutimétricas (Van der Hoop e Van Leeuwen, 1990) e por espectroscopia no infravermelho (Cabaniss, 1991) também foram propostos Materiais e Métodos As titulações potenciométricas foram realizadas, utilizando-se um phmetro Metrohm 654, com precisão de 0,1 mv ou 0,001 unidades de ph, uma bomba de pistão do sistema FIALab 3500 (capacidade de 2,5 ml e resolução de 0,1 µl) nas titulações, e uma cela de vidro com capacidade de 50,0 ml provida de uma camisa externa que permite a circulação de água com o objetivo de manter a temperatura constante. Durante todas as titulações, a cela foi termostatizada a 25,0 ± 0,5 C com auxílio do banho termostático Ética 521D, e circulado N 2 livre de CO 2 em seu interior. Nas titulações dos AH, foram preparadas suspensões das amostras (cerca de 12 mg) em 25 ml de solução de KNO 3 0,1 mol L -1 (para se ajustar a concentração iônica do meio). As concentrações de AH e a concentração iônica foram escolhidas como os valores que propiciaram melhores resultados em experimentos realizados por Masini (1999). As suspensões foram tituladas com solução de NaOH 0,1241 mol L -1, e foram obtidos cerca de 80 pontos (volume de NaOH e potencial do eletrodo) para cada amostra. Uma vez por dia, eram realizados experimentos de calibração dos eletrodos (para determinação do produto de ionização da água e conversão de potencial para ph), utilizando-se um volume inicial (Vo) de 27,5 ml (25,0 ml de KNO 3 0,1 mol L -1 e 2,5 ml de HCl) e solução de NaOH 0,1241 mol L -1 como titulante (fluxo de 50 µl s -1 ).

13 Caracterização dos Ácidos Húmicos 53 Para determinação dos parâmetros ácido-base (inclusive pka) das amostras, foram usadas as funções de Gran, com regressão não-linear. Para tanto, foi utilizado o algoritmo MIXAC, suportado em linguagem Q- BASIC. Para a conversão de potencial para ph, utilizou-se o algoritmo CONVERT, também em linguagem Q-BASIC Calibração dos Eletrodos Pela teoria de Debye-Hückel, mantendo-se constante a temperatura e o meio iônico, os coeficientes de atividade do íon H + mantêmse constantes durante a titulação. Com isso, a equação de Nernst pode ser escrita como: E = E +,16 log[ H + ] + E o a 59 (24) em que: E = potencial medido; E o a = termo que engloba o potencial padrão do eletrodo e o coeficiente de atividade do íon H + ; E j = potencial de junção líquida. O potencial de junção líquida pode ser representado por: E j = J.[ H + ] + J.[ OH H OH ] j (25) em que: J H e J OH são característicos do meio iônico. Na região ácida da titulação de calibração, o termo J OH [OH ] pode ser desprezado, e a equação 24 pode ser escrita como: o + E = E + 59,16 log[ H ] + J.[ H a H + ] (26) Colocando-se em um gráfico o termo E 59, 16 log[h + ] em função de [H + ], obtém-se uma reta cujo coeficiente angular é igual a J H e o coeficiente linear igual a E o a. De forma análoga, na região alcalina da titulação, o gráfico de E 59,16 log[oh ] em função de [OH ] fornece J OH e E o b. Os valores de [H + ] e [OH ] podem ser obtidos pelas equações: [ ( V V ) + e H ] =. V o + V C b (27)

14 Caracterização dos Ácidos Húmicos 54 [ = ( V V ) e OH ]. V o + V C b (28) em que: V e = volume de equivalência; V = volume do titulante adicionado; V o = volume inicial do titulado; C b = concentração da base. O volume de equivalência, por sua vez, pode ser determinado pela interseção das funções de Gran F 1 = (V o + V) x 10 E/59,16 (região ácida) e F 2 = (V o + V) x 10 E/59,16 (região alcalina) com o eixo do volume do titulante adicionado (V). Por fim, a constante de ionização da água (K w ), no meio iônico e temperatura usados, pode ser determinado pela expressão: log K w o o Ea Eb = (29) 59,16 Assim, a partir de uma titulação potenciométrica de um ácido forte e uma base forte de concentração conhecida, a temperatura e meio iônico constantes, é possível determinar os valores de E o a, J H e J OH, além do produto iônico da água, K w. Com isso, torna-se possível relacionar o potencial medido com [H + ] (ou com ph), usando-se a equação 24 para a titulação de uma amostra desconhecida, realizada nas mesmas condições de temperatura e concentração iônica Cálculo do pk a dos Ácidos Húmicos Foi utilizado o método não-linear de Gran para determinação do pk a de uma amostra de AH de vermicomposto. O programa de regressão não-linear utiliza a equação geral que descreve a titulação de uma mistura de um ácido forte com N ácidos fracos (sítios ionizáveis): f N ( V H ) = ( V VHA ). Cb + {[ H ] K w [ H ]}(. Vo + V ) { ( VHA VHA ). A } j. C o j j b, 1 (30) em que: V = volume do titulante; V o = volume inicial presente na cela; j= 1

15 Caracterização dos Ácidos Húmicos 55 V HAo e V HAj = volume de equivalência para o ácido forte e para o j- ésimo ácido fraco; K w = produto de ionização da água a 25 C; C b = concentração do titulante (em mol L -1 ). O termo A j é definido por: A j = K HA K j HA j + [ H + ] (31) O ph é adotado como variável dependente e o volume do titulante como variável independente. V HAj e K HAj são os parâmetros ajustáveis no cálculo, que é realizado minimizando-se o erro da soma, S: m ( ) 2 ph j ph ' j S = (32) j= 1 em que: m = total de dados (V, ph) usado na análise de regressão; ph j = ph experimental; ph j = ph calculado. Os valores de ph foram calculados usando-se uma sub-rotina iterativa baseada no método de Newton-Raphson. Inicialmente, os valores de [H + ] são calculados usando os valores iniciais estimados para V HAj e K HAj. As melhores aproximações para os valores de [H + ] calculados no ponto experimental j são obtidos através de sucessivas iterações, k, de acordo com a equação: H + ( V,[ H ] j, k ) '( V,[ H ] ) f = H (33) f + + [ ] j, k + 1 [ ] j, k + em que: f (V, [H + ] j,k ) = primeira derivada da equação A equação 33 é usada repetidamente até que ocorra a convergência a um valor limite, previamente definido por: [ H + ] j, k + 1 [ H + [ H ] j, k + ] j, k j, k < 0,00001 (34)

16 Caracterização dos Ácidos Húmicos Resultados e Discussão A figura 18 mostra as curvas de titulação das amostras de ácidos húmicos, de onde se pode observar que praticamente não há pontos de inflexão bem definidos, indicando a presença de grande quantidade de grupos ácidos com diferentes valores de pk a ph 6 4 turfa/naoh turfa/na 4 P 2 O 7 vermicomposto/naoh vermicomposto/na 4 P 2 O Volume de NaOH (µl) FIGURA 18 - Curvas de titulação experimentais obtidos para os ácidos húmicos de turfa e vermicomposto (ca. 0,5 g L -1 em KNO 3 0,1 mol L -1 ) com NaOH 0,1241 mol L -1. A tabela 12 mostra os valores de pk a obtidos da função de Gran, com regressão não-linear, de uma amostra de ácido húmico de vermicomposto.

17 Caracterização dos Ácidos Húmicos 57 TABELA 12 - Valores de constante de ionização ácida (K a e pk a ) e concentração em mmol por grama de ácido húmico (C HA ) relacionados às espécies ionizáveis HA i (i = 1 a 4) de ácidos húmicos de vermicomposto. Resultados obtidos por função de Gran (regressão não-linear). HA 1 HA 2 HA 3 HA 4 K a 1,61 x ,78 x ,23 x ,93 x 10-9 pk a 3,79 5,56 6,91 8,53 C HA 0,77 1,25 1,12 0,72 As 3 primeiras espécies (HA 1 a HA 3 ) foram tituladas em um intervalo de ph característico de grupos carboxílicos, enquanto HA 4 pode ser atribuído a grupos fenólicos (Masini, 1999). Os valores de pk a obtidos para a amostra de AH foi bem semelhantes aos observados na literatura para AH de vermicomposto (Masini, 1999; Masini et al., 1998). 5.5 Análise Elementar (CHNS) Introdução Os primeiros experimentos para determinação da composição elementar das SH foram feitos por Sprengel e Berzelius entre os anos de 1826 e 1845 (Stevenson, 1994). Segundo eles, as SH eram constituídas essencialmente de carbono (C), hidrogênio (H), nitrogênio (N) e oxigênio (O), sendo C e O os elementos mais abundantes. Os métodos para determinação desses elementos são muito variados, dentre eles os métodos químicos. Assim, carbono e hidrogênio podem ser determinados por combustão completa a seco, nitrogênio pelos métodos de Dumas ou de Kjeldahl, oxigênio por pirólise redutiva e enxofre por combustão (Huffman Jr. e Stuber, 1985) Entretanto, a utilização de analisadores elementares automáticos trouxe avanços consideráveis nesse sentido, permitindo

18 Caracterização dos Ácidos Húmicos 58 análises rápidas e confiáveis. Os analisadores elementares atuais são baseados na oxidação da amostra em alta temperatura, depois da qual os gases resultantes são separados por uma coluna cromatográfica e detectados, geralmente, por condutividade térmica (Skoog et al., 2002). Informações isoladas sobre a composição elementar dessas substâncias não são muito conclusivas, e as razões atômicas (H/C, O/C, C/N) têm sido preferencialmente utilizadas para estabelecer o grau de condensação, as transformações diagenéticas, bem como as condições ambientais sob as quais elas foram formadas. Existem, inclusive, diversos diagramas que relacionam as razões atômicas com o tipo de material húmico (Yonebayashi e Hattori, 1988). A razão H/C é freqüentemente associada ao grau de condensação ou de aromaticidade, e este, por sua vez, ao grau de humificação, sendo que maiores valores de H/C (ou menores valores de C/H) indicam maior quantidade de grupos alifáticos, típicos de materiais menos humificados (Stevenson, 1994). As razões O/C e C/N indicam, respectivamente, o teor de grupos oxigenados presentes na molécula e o grau de incorporação de nitrogênio na estrutura. Apesar de não ter uma relação tão direta, amostras mais humificadas apresentam, em geral, maiores valores de O/C e C/N (Stearman et al., 1989). Em geral, ácidos húmicos apresentam menores valores de H/C e O/C que ácidos fúlvicos (Bravard e Righi, 1991; Rasyid et al., 1992). Veeken et al. (2000) observaram um decréscimo nas razões H/C e C/N e aumento na razão O/C quando se aumentava o tempo de compostagem de resíduos urbanos. Outros parâmetros que podem ser obtidos pela análise elementar são grau de polaridade, correspondente à razão atômica (O + N)/C (Fukushima et al., 1996) e grau de oxidação, correspondente à razão atômica (2O H)/C (Canellas, 1999) Materiais e Métodos Os experimentos foram realizados em um analisador elementar CE Instruments EA 1110 CHNS-O, em que foram utilizados os seguintes

19 Caracterização dos Ácidos Húmicos 59 padrões: L-cistina, sulfanilamida, DL-metionina e BBOT (2,5-bis-(5-tert-butilbenzoxazol-2-il)-tiofeno). Foram pesados, em cada análise, cerca de 2 mg de amostra. Os valores de C, H, N e S (porcentagem em massa) foram corrigidos para base seca e sem cinzas (valor corrigido = valor original x 100 (100 teor de umidade teor de cinzas)), sendo que do teor de H foi subtraído o H originário da umidade, antes da correção para base seca e sem cinzas. O teor de oxigênio foi determinado por diferença a 100% a partir dos valores de C, H, N e S corrigidos. Os parâmetros H/C, O/C, C/N e (O + N)/C foram determinados pelas razões atômicas, ou seja, dividindo-se previamente as porcentagens em massa dos elementos por suas respectivas massas atômicas Resultados e Discussão Os valores de porcentagem em massa de C, H, N, S e O, e as razões atômicas H/C, e O/C e C/N, estão mostrados na tabela 13. TABELA 13 - Teor (em massa) de C, H, N, S e O, e razões elementares H/C, O/C, C/N e (O + N)/C das amostras de ácidos húmicos (entre parênteses: desvio-padrão; n = 3 determinações). TN TP VN VP C (%) 55,82 (0,06) 55,15 (0,25) 53,03 (0,65) 52,81 (0,20) H (%) 4,45 (0,09) 4,20 (0,14) 5,81 (0,17) 5,21 (0,47) N (%) 3,11 (0,04) 2,75 (0,08) 3,67 (0,02) 3,58 (0,09) S (%) nd nd nd nd O (%) 36,63 (0,09) 37,90 (0,32) 37,49 (0,80) 38,40 (0,59) H/C 0,96 (0,02) 0,91 (0,03) 1,31 (0,02) 1,18 (0,10) O/C 0,49 (0,00) 0,52 (0,01) 0,53 (0,02) 0,55 (0,01) C/N 20,96 (0,27) 23,45 (0,58) 16,85 (0,28) 17,20 (0,49) (O + N)/C 0,54 (0,00) 0,56 (0,01) 0,59 (0,02) 0,60 (0,01) nd = não detectado.

20 Caracterização dos Ácidos Húmicos 60 As razões H/C obtidas para as amostras de AH de vermicomposto foram maiores que das amostras de AH de turfa (e próximas às encontradas por Hervas et al., 1989), indicando uma menor proporção de estruturas condensadas no AH de vermicomposto. Esse resultado confirma o esperado, uma vez que o vermicomposto é bem menos humificado (e, conseqüentemente, com menor quantidade de estruturas aromáticas) que a turfa. Com a razões O/C e (O+N)/C acontece o mesmo, apesar da diferença ser bem menor, indicando menor quantidade de grupos oxigenados nas amostras de AH de turfa. Comparando-se as extrações, observa-se valores muito próximos entre AH extraídos com NaOH e com pirofosfato de sódio. As razões H/C são ligeiramente menores para AH extraídos com pirofosfato. Entretanto, as razões O/C são praticamente iguais entre os AH extraídos com NaOH e com pirofosfato. A figura 19 apresenta um diagrama de Van Krevelen que correlaciona as razões atômicas H/C e O/C, discriminando os diferentes tipos de materiais e os mecanismos de reação. Pode ser observado que as amostras estudadas ficaram nas regiões características de turfa e ácidos húmicos (não há no diagrama região característica de materiais compostados). FIGURA 19 - Diagrama de Van Krevelen de correlação entre as razões H/C e O/C e o tipo de matriz. Os pontos coloridos correspondem às amostras de ácidos húmicos (preto: TN; vermelho: TP; verde: VN; azul: VP).

21 Caracterização dos Ácidos Húmicos Análise Termogravimétrica Introdução No estudo de substâncias húmicas e de matéria orgânica do solo em geral, a termogravimetria é bastante utilizada para quantificar teor de umidade e de cinzas (resíduos inorgânicos). Entretanto, alguns autores têm usado essa técnica, juntamente com outras análises térmicas, para caracterizar substâncias húmicas (Esteves e Duarte, 1999; Provenzano et al., 1998; Provenzano e Senesi, 1999) e estudar interações de SH com íons metálicos (Martyniuk et al., 2001; Prado e Airoldi, 2003). Diferenças nas curvas termogravimétricas (TG) e especialmente nas suas primeiras derivadas (DTG), que enfatizam mudanças no sinal, são provavelmente devido a diferentes graus de humificação (Busnot et al., 1995; Pietro e Paola, 2004) e a diferentes mecanismos químicos e biológicos que originaram as substâncias húmicas. Em substâncias húmicas, as curvas TG e DTG apresentam duas perdas de massa correspondente à matéria orgânica: uma perda abaixo de 300 C, referente à decomposição de carboidratos e grupos carboxílicos, metil, metileno e alcoólicos e perda de insaturação, e uma perda a temperaturas mais elevadas (> 300 C) devido à oxidação e policondensação de estruturas aromáticas (Campanella e Tomassetti, 1990; Provenzano et al., 1998). Assim, a razão entre as perdas de massa em temperaturas maiores e as perdas de massa em temperaturas menores, chamada de Índice Termogravimétrico (ITG), pode ser um bom indicativo de quantidade relativa de estruturas aromáticas e, conseqüentemente, do grau de humificação das amostras Materiais e Métodos As análises termogravimétricas (TG) e de calorimetria diferencial exploratória (DSC) foram realizadas em um sistema de análise térmica TGA 2050, da TA Instruments. Foram utilizadas as seguintes condições experimentais nas análises TG: atmosfera oxidante (ar sintético),

22 Caracterização dos Ácidos Húmicos 62 com fluxo de 80 ml min -1, intervalo de temperatura de 25 a 800 C (298 a 1073 K) com razão de aquecimento de 10 C min -1 e massa de amostra em torno de 10 mg, acondicionada em um suporte aberto de platina. Para as análises de DSC, foram utilizados atmosfera oxidante (ar sintético) com fluxo de 80 ml min -1, intervalo de temperatura de 25 a 550 C (298 a 823 K) com razão de aquecimento de 10 C min -1 e massa de amostra em torno de 10 mg, acondicionada em um suporte fechado (mas não hermeticamente) de alumínio. As curvas de termogravimetria derivada (DTG) foram obtidas no software Microcal Origin, a partir das curvas TG. Os índices termogravimétricos (ITG) foram calculados a partir da razão entre as perdas de massa no intervalo C e no intervalo C (nas amostras de AH de turfa) e entre as perdas de massa no intervalo C e no intervalo C (nas amostras de AH de vermicomposto). As análises térmicas diferenciais (DTA) foram realizadas em um sistema de DTA Shimadzu 50H com as seguintes condições: atmosfera oxidante (ar sintético), intervalo de temperatura de 25 a 900 C (298 a 1173 K) com razão de aquecimento de 10 C min -1 e massa de amostra em torno de 10 mg, acondicionada em um suporte aberto de platina. O sistema foi calibrado com relação à linha de base e à temperatura com índio e zinco de alta pureza Resultados e Discussão As figuras 20 a 23 mostram as curvas TG e DTG das amostras de AH. Podem ser observadas três perdas de massa no intervalo C. A primeira perda de massa (no intervalo C) é representativa de reações de desidratação. Nas outras perdas de massa, entre 130 e 600 C, ocorre o processo de decomposição da matéria orgânica: combustão de carboidratos (próximo a 300 C) e degradação térmica de estruturas aromáticas (próximo a 500 C). Observa-se também que nas amostras de AH de turfa (figuras 20 e 21), a perda de massa próxima a 500 C é dividida em duas partes, o que não ocorre nas amostras de AH de vermicomposto

23 Caracterização dos Ácidos Húmicos 63 (figuras 22 e 23). Por sua vez, nessas últimas, verifica-se um ombro na curva DTG próximo a 250 C Massa (%) Temperatura ( o C) FIGURA 20 - Curvas TG (em vermelho) e DTG (em azul) de ácidos húmicos de turfa extraídos com NaOH Massa (%) Temperatura ( o C) FIGURA 21 - Curvas TG (em azul) e DTG (em azul) de ácidos húmicos de turfa extraídos com Na 4 P 2 O 7.

24 Caracterização dos Ácidos Húmicos Massa (%) Temperatura ( o C) FIGURA 22 - Curvas TG (em vermelho) e DTG (em azul) de ácidos húmicos de vermicomposto extraídos com NaOH Massa (%) Temperatura ( o C) FIGURA 23 - Curvas TG (em vermelho) e DTG (em azul) de ácidos húmicos de vermicomposto extraídos com Na 4 P 2 O 7. A tabela 14 apresenta as perdas de massa das amostras (correspondentes aos principais picos mostrados pelas curvas DTG) e os valores de ITG obtidos. As perdas de massa ocorridas no intervalo de 130 a 360 C foram menores para AH de turfa (19,95% e 18,31%) que para AH de vermicomposto (39,74% e 40,06%). Por outro lado, as perdas de massa

25 Caracterização dos Ácidos Húmicos 65 ocorridas entre 360 e 600 C, atribuídas a dissociação e decomposição de estruturas aromáticas e sistemas polinucleares, foram maiores para AH de turfa (69,95% e 70,26%) que para AH de vermicomposto (49,26% e 46,96%). Assim, os valores de ITG calculados para as amostras de AH de turfa foram cerca de 3 vezes maiores que para as amostras de AH de vermicomposto, confirmando a maior quantidade de estruturas aromáticas nas amostras de AH de turfa. Entretanto, não se verificou nenhuma diferença significativa nas perdas de massa e nos valores de ITG entre as amostras extraídas com NaOH e as extraídas com Na 4 P 2 O 7. TABELA 14 - Perdas de massa e índice termogravimétrico (ITG) de amostras de ácidos húmicos (entre parênteses: desvio-padrão; n = 3 determinações). Amostra C C C ITG TN 8,07 (1,73) 19,95 (0,29) 69,86 (1,58) 3,90 (0,13) TP 9,74 (1,90) 18,32 (0,29) 70,26 (1,24) 3,84 (0,12) VN 6,40 (1,58) 39,74 (1,49) 49,26 (0,61) 1,24 (0,06) VP 8,47 (0,77) 40,06 (0,30) 46,86 (0,62) 1,17 (0,01) A figura 24 mostra as curvas DSC das amostras de AH. Pode ser verificado um pico endotérmico bem proeminente, relacionado à perda de água de hidratação. Como os experimentos de DSC foram realizados em suporte fechado, a pressão de vapor da água dificulta sua saída. Assim, a perda de água ocorre em temperaturas maiores e pode ser observada por picos bem agudos. Observa-se também que nas amostras de AH de vermicomposto, a perda de água ocorre em temperaturas maiores (145 C) do que nas amostras de AH de turfa (120 C), indicando que nessas amostras, as moléculas de água estão mais fracamente ligadas do que nas amostras de AH de vermicomposto. Entretanto, os picos relacionados às reações de oxidação da matéria orgânica foram bastante largos e de baixa intensidade, provavelmente devido também ao suporte.

26 Caracterização dos Ácidos Húmicos 66 2 Fluxo de calor (W g -1 ) exotérmico turfa/naoh turfa/na 4 P 2 O 7 vermicomposto/naoh vermicomposto/na 4 P 2 O Temperatura ( o C) FIGURA 24 - Curvas DSC das amostras de ácidos húmicos. As curvas DTA (figura 25) mostram que, ao contrário do que ocorre nas curvas DSC, o pico endotérmico da perda de água é bem largo, abrangendo o intervalo de 25 a 120 C, e praticamente igual para todas as amostras. Ou seja, a perda de água ocorre de maneira bem lenta e gradual. Deve-se lembrar que as análises de DTA foram feitas em suporte aberto. As curvas DTA mostram também dois picos exotérmicos distintos ( e C, sendo que o segundo pico, nas amostras de AH de vermicomposto extraídas com Na 4 P 2 O 7, foi desdobrado em dois) bem proeminentes, típicos da decomposição térmica e oxidação de componentes orgânicos de diferentes estabilidades térmicas (Pietro e Paola, 2004). Nas amostras de AH de turfa, o segundo pico, correspondente a oxidação de estruturas aromáticas, apresentaram intensidade muito maior que o primeiro, correspondente a degradação de carboidratos e estruturas alifáticas. Por outro lado, nas amostras de AH de vermicomposto, o primeiro pico apresentou maior intensidade que o segundo. Os pontos máximos dos picos exotérmicos ocorreram a 320 C e entre 460 e 500 C, próximos aos pontos máximos verificados nas curvas DTG. Esse fato confirma que as perdas de massa relacionadas à matéria orgânica são devidas a reações exotérmicas.

27 Caracterização dos Ácidos Húmicos turfa/naoh turfa/na 4 P 2 O 7 vermicomposto/naoh vermicomposto/na 4 P 2 O exotérmico T ( o C) Temperatura ( o C) FIGURA 25 - Curvas DTA das amostras de ácidos húmicos. 5.7 Espectroscopia de Absorção no Ultravioleta/Visível Introdução Através da espectroscopia de absorção na região do ultravioleta e visível, é possível calcular a razão E 4 /E 6 (razão entre as absorbâncias a 465 e a 665 nm). Essa razão é um primeiro indicativo da proporção de grupos aromáticos. Pelo mesmo propósito, já foram utilizadas (com menor freqüência) razões entre as absorbâncias a 350 e a 450 nm (E 350 /E 450 ) e entre as absorbâncias a 350 e a 550 nm (E 350 /E 550 ) (Dick e Burba, 1999). Quanto maior a aromaticidade, menor a razão E 4 /E 6. Entretanto, deve-se levar em conta que essa relação deve ser interpretada com cuidado, pois a comparação entre amostras bem distintas pode não ser conclusiva. Chen et al. (1977) estudaram a correlação entre E 4 /E 6 de AH e diversos parâmetros, como concentração de AH, viscosidade, ph, massa molecular e quantidade de radicais livres. Trubetskoj et al. (1999) fracionaram AH de 4 solos diferentes por SEC-PAGE e observaram que a razão E 4 /E 6 diminui com o aumento do tamanho molecular. Martin-Neto et al. (1998) estudaram a correlação entre índice pluviométrico anual e E 4 /E 6 e concentração de radicais livres (medida por EPR) de amostras de AH. Verificou-se também boa correlação linear entre aromaticidade e

28 Caracterização dos Ácidos Húmicos 68 absortividade a 272 ou 280 nm (Fukushima et al., 1996; Chin et al., 1994; Traina et al., 1990). A absorbância da maioria dos ácidos húmicos decresce exponencialmente com o comprimento de onda (ou pelo menos parte do espectro possui esse comportamento) (Yonebayashi e Hattori, 1988). Assim, pode-se relacionar a absorbância E e o comprimento de onda λ: E b.λ = a.10 (35) em que: a e b são constantes. Dessa forma, o logaritmo da absorbância é uma função linear do comprimento de onda: log (36) E = log a bλ A inclinação da reta (b) pode ser definida como: d log E b = (37) dλ Utilizando-se comprimentos de onda iguais a 600 e 400 nm e um parâmetro log K, definido como a diferença entre os logaritmos das absorbâncias a 400 nm (log E 400 ou log K 400 ) e a 600 nm (log E 600 ou log K 600 ) (Kumada, 1987), o valor de b pode ser redefinido como: log E400 log E600 log K b = = (38) A equação 36 pode ser então reescrita como: log E = log a ( log K 200. )λ (39) Fixando-se um comprimento de onda, pode-se relacionar log E e log K de diversas amostras de ácidos húmicos, resultando em uma correlação linear com coeficiente angular igual a λ/200 e coeficiente linear igual a log a. Yonebayashi e Hattori (1988) construíram um diagrama de log E 1% 600 (absorbância a 600 nm de uma solução de AH a 1%) versus log K de 41 amostras e encontraram uma correlação de 86,9%, concluindo que o mecanismo fundamental da absorção de luz de todos os ácidos húmicos era similar. Pode-se utilizar, no lugar de E 1% 600, um outro parâmetro, chamado de RF, definido como o valor da absorbância a 600 nm

29 Caracterização dos Ácidos Húmicos 69 normalizado pela massa de carbono orgânico presente na solução (Kumada, 1987; Maie et al., 2002) Materiais e Métodos Cerca de 5,0 mg de AH purificado foram dissolvidos em 50,0 ml de uma solução de bicarbonato de sódio (NaHCO 3 ) 0,025 mol L -1, com ph 8,4. As medidas de absorbância da solução foram obtidas a partir do espectro na região do visível, utilizando um espectrofotômetro de UV-Visível Hitachi U3501 e uma cubeta de quartzo de 1 cm de caminho óptico. Com os valores de absorbância nos comprimentos de onda 465 e 665 nm, calculou-se a razão E 4 /E 6. Os parâmetros log K e RF foram calculados a partir das equações 40 e 41: log K = log E E (40) 400 log RF = ( E 6 c)15. (41) em que: E 400 e E 600 = valores de absorbância em 400 e 600 nm; c = massa (em mg) de C orgânico por volume (em ml) de solução de AH Resultados e Discussão Os espectros de absorbância na região do UV/visível das amostras de AH estão mostrados na figura 26. Pode ser observado um comportamento logarítmico dos espectros, pelo menos entre 400 e 800 nm, o que pode ser verificado pelo gráfico do logaritmo da absorbância em relação ao comprimento de onda (figura 27). As amostras de AH de vermicomposto apresentaram um ombro próximo a 280 nm, característico de grupos cromóforos, como estruturas insaturadas e/ou aromáticas (Prudent et al., 1995). Nos AH de turfa, a absorção nessa região ocorre de forma mais intensa e homogênea.

30 Caracterização dos Ácidos Húmicos 70 5 Absorbância turfa/naoh turfa/na 4 P 2 O 7 vermicomposto/naoh vermicomposto/na 4 P 2 O Comprimento de onda (nm) FIGURA 26 - Espectros de absorbância no UV/visível das amostras de ácidos húmicos. 1 turfa/naoh turfa/na 4 P 2 O 7 vermicomposto/naoh vermicomposto/na 4 P 2 O 7 Absorbância Comprimento de onda (nm) FIGURA 27 - Gráfico de logaritmo de absorbância por logaritmo de comprimento de onda nas amostras de ácidos húmicos. mostrados na tabela 15. Os valores da razão E 4 /E 6 e dos parâmetros log K e RF estão

31 Caracterização dos Ácidos Húmicos 71 TABELA 15 - Valores de E 4 /E 6, log K e RF das amostras de ácidos húmicos (entre parênteses: desvio-padrão; n = 3 determinações). Amostra Razão E 4 /E 6 log K RF TN 3,77 (0,02) 0,58 (0,00) 67,68 (1,61) TP 4,26 (0,01) 0,63 (0,00) 57,65 (2,75) VN 5,23 (0,28) 0,72 (0,02) 9,98 (0,11) VP 5,20 (0,21) 0,72 (0,02) 11,88 (0,86) Pode ser observado na tabela 15 que, em relação as amostras de AH de turfa, as amostras de AH de vermicomposto apresentaram valores de E 4 /E 6 e log K maiores e valores de RF consideravelmente menores. Como os parâmetros E 4 /E 6 e log K diminuem com o grau de humificação, e o parâmetro RF aumenta com a humificação, esses resultados são um primeiro indicativo do menor grau de humificação do AH de vermicomposto. Os valores da razão E 4 /E 6 obtidos pelos AH de vermicomposto estão de acordo com os valores citados na literatura (Hervas et al., 1989; Landgraf et al., 1999). Os valores de log K obtidos foram próximos aos citados na literatura para amostras de solo (Barančiková et al., 1997; Yonebayashi e Hattori, 1988). Já os valores de RF ficaram abaixo dos obtidos por Maie et al. (2002) também para amostras de solo. Ao contrário de log K, o parâmetro RF é bastante afetado pela presença de substâncias não húmicas nas amostras (Kumada, 1987). Também foi verificado um valor de E 4 /E 6 ligeiramente menor para as amostras de AH de turfa extraídas com NaOH, quando comparado com as amostras extraídas com Na 4 P 2 O Espectroscopia de Fluorescência Introdução A utilização da espectroscopia como uma técnica sensível e relativamente simples para estudar a estrutura e os grupos funcionais de ácidos húmicos e demais substâncias húmicas deve-se à presença de várias

32 Caracterização dos Ácidos Húmicos 72 estruturas fluorescentes (fluoróforos) na macromolécula húmica, que inclui desde estruturas aromáticas condensadas a cadeias alifáticas insaturadas. Além disso, as propriedades fluorescentes de ácidos húmicos dependem de diversos parâmetros, incluindo sua origem, massa molecular e sua concentração, ph, intensidade iônica, temperatura e potencial redox do meio, bem como suas interações com íons metálicos e compostos orgânicos. O efeito desses parâmetros em ácidos fúlvicos tem sido estudado por diversos pesquisadores, como relatado por Senesi (1990b). Apesar de ainda não ser possível identificar todos os fluoróforos presentes nas SH, algumas moléculas potencialmente responsáveis por emissão de fluorescência são: salicilato de metila, ácido salicílico, ácido 3-hidroxibenzóico, ácido caféico, ácido felúrico, β-naftóis ionizados, cumarinas não substituídas, derivados de cromonas, xantonas e hidroxixantonas (Giovanela, 2003; Senesi et al., 1991). Pullin e Cabaniss (1995) estudaram o efeito do ph nos espectros de fluorescência de 6 amostras de ácidos húmicos e fúlvicos, e concluíram que os espectros de emissão (com excitação a 340 nm) e os espectros de excitação (com emissão a 450 nm) tiveram pouca variação, nos intervalos de ph de 3,2 a 10,3; entretanto, foi observada grande variação nos espectros no modo síncrono ( λ = 20 nm). Recentemente, a espectroscopia de fluorescência tem sido utilizada na avaliação do grau de humificação de substâncias húmicas. De acordo com Zsolnay et al. (1999), quando os fluoróforos se tornam mais condensados, o espectro de emissão tende-se a deslocar para regiões com maior comprimento de onda. Assim, pode-se estimar o grau de humificação pela razão entre a área da região de maior comprimento de onda do espectro e a área da região de menor comprimento de onda. De acordo com Kalbitz et al. (1999), os espectros no modo síncrono (variando-se simultaneamente a excitação e a emissão) de substâncias húmicas apresentam 2 picos em 360 e 400 nm e um ombro em 470 nm, e o máximo de intensidade tende a se deslocar para regiões de maior comprimento de onda com o aumento do número de anéis aromáticos

33 Caracterização dos Ácidos Húmicos 73 substituídos e/ou cadeias insaturadas conjugadas, com alto grau de ressonância. De acordo com Milori et al. (2002), a absorção de luz azul por AH é mais ressonante com estruturas cuja concentração aumenta com o grau de humificação. Por isso, pode-se estimá-lo pela área total do espectro de emissão com excitação a 465 nm. Milori et al. estudaram 18 amostras de AH de 4 solos brasileiros e comparam os diferentes métodos de se estimar o grau de humificação por fluorescência Materiais e Métodos Os espectros de fluorescência foram obtidos por um espectrômetro de luminescência Perkin Elmer LS 50 B. Os ácidos húmicos foram dissolvidos em uma solução de NaHCO 3 0,05 mol L -1, de modo que a concentração de AH seja de 20 mg L -1 e o ph igual a 8 (Milori et al., 2002). Foram obtidos os seguintes espectros: Emissão (intervalo de 300 a 650 nm; excitação a 240 nm); Emissão (intervalo de 480 a 650 nm; excitação a 465 nm); Síncrono (intervalo de excitação de 220 a 600 nm; λ = 55 nm); Excitação (intervalo de 220 a 480 nm; emissão a 500 nm); Emissão-excitação (3D) (intervalo de emissão de 350 a 650 nm, de 0,5 em 0,5 nm; intervalo de excitação de 220 a 560 nm, de 10 em 10 nm). Em todos os espectros, a velocidade de varredura foi de 200 nm min -1 e, com exceção dos espectros de emissão-excitação (3D), as aquisições dos dados de fluorescência no intervalo de emissão ou excitação selecionado foram de 0,5 em 0,5 nm. O índice de humificação proposto por Zsolnay et al. (1999) (A 4 /A 1 ) foi calculado a partir do espectro de emissão (com excitação a 240 nm) dividindo-se a área sob o espectro entre 570 e 645 nm (A 4 ) pela área sob o espectro entre 356 e 432 nm (A 1 ). Os índices de humificação propostos por Kalbitz et al. (1999) foram calculados a partir do espectro no modo síncrono, dividindo-se a

34 Caracterização dos Ácidos Húmicos 74 intensidade de fluorescência a 470 nm pela intensidade a 400 nm (I 470 /I 400 ) e pela intensidade a 360 nm (I 470 /I 400 ). Já o grau de humificação proposto pelo método de Milori et al. (2002) (A 465 ) corresponde à área total do espectro de emissão (com excitação a 465 nm) Resultados e Discussão Os espectros de emissão (com excitação a 240 nm) das amostras de AH estão mostrados na figura 28. Pode ser observado que, nas amostras de AH de turfa, o máximo de intensidade ocorre próximo a 500 nm, enquanto que, nas amostras de AH de vermicomposto, o máximo ocorre entre 400 e 450 nm, com um ombro proeminente a 360 nm. Esses espectros se assemelham aos encontrados em amostras de composto de resíduos domésticos e industriais (Miikki et al., 1997). Os valores do índice A 4 /A 1 (tabela 16) variaram de 0,053 a 0,475. Os mais baixos valores ocorreram para as amostras de AH de vermicomposto (0,053 e 0,089) e os valores mais altos (0,439 e 0,475) ocorreram para as amostras de AH de turfa. Intensidade de fluorescência (u.a.) turfa/naoh turfa/na 4 P 2 O 7 vermicomposto/naoh vermicomposto/na 4 P 2 O λ em (nm) FIGURA 28 - Espectro de emissão (com excitação a 240 nm) das amostras de ácidos húmicos.