POTENCIAL ANTIMICROBIANO DE AMOSTRAS DE MEL DE JATAÍ (Tetragonisca angustulla Latreille) IN NATURA E PASTEURIZADO

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1 POTENCIAL ANTIMICROBIANO DE AMOSTRAS DE MEL DE JATAÍ (Tetragonisca angustulla Latreille) IN NATURA E PASTEURIZADO Mariana Gato Stachissini [Voluntário] 1, Elizabete Satsuki Sekine [Orientador] 2, Murilo Keith Umada [Colaborador] 1 1 Acadêmicos do Curso de Engenharia Ambiental UTFPR 2 Professor da Coordenação de Engenharia Ambiental UTFPR Câmpus Campo Mourão Universidade Tecnológica Federal do Paraná - UTFPR BR 369 Km - 0,5 Campo Mourão PR CEP: marianagatos@hotmail.com, essekine@gmail.com, murilo.keith@gmail.com Resumo - O mel, além de servir de alimento, tem propriedades medicinais a ele popularmente atribuídas, que são relatadas desde a antiguidade como costumes indígenas. O presente trabalho teve por objetivo verificar o potencial antimicrobiano do mel da abelha nativa jataí (Tetragonisca angustula Latreille), para amostras de mel in natura e após receber tratamento térmico (pasteurização). Para avaliação da atividade antimicrobiana dessas amostras foi empregado o método de disco-difusão, utilizando-se discos de 5 mm frente à bactéria Salmonella sp. Os discos controle foram impregnados com antibiótico comercial amoxicilina. Nos testes feitos, não se observou formação de halo inibitório, indicando que, para este tipo de bactéria, o mel in natura ou pasteurizado de abelha nativa não apresenta potencial antimicrobiano satisfatório. Palavras-chave: Abelha Nativa; McFarland; Peróxido de hidrogênio; Antibiose. Abstract - Honey is used as food and has popularly attributed medicinal properties, as are reported since beginnings how customs of the Brazilian natives. This study aimed to verify the honey antimicrobial potential of native bee, Tegragonisca angustulla, for samples of in natura and after thermic treatment (pasteurization). To appraisal the antimicrobial activity of these samples was used disk diffusion method, using discs 5 mm before to the bacterium Salmonella sp. The control discs were impregnated with commercial antibiotic amoxicillin. In tests, there was not inhibition halo formation, indicating that for this type of bacterium, the honey in natura or pasteurized of this native bee not presents satisfactory antimicrobial potential. Keywords: Native bee; McFarland; hydrogen peroxide; Antibiosis INTRODUÇÃO Na América antes de Cabral os produtos das abelhas sem ferrão eram parte dos costumes indígenas, utilizadas para fins medicinais, alimentares, ritualísticos e comerciais [1]. A principal contribuição das abelhas é a sua relação com as plantas. Seu papel como agente polinizador é importante para a manutenção da diversidade florística e do equilíbrio ecológico dentro do ecossistema. Um dos efeitos diretos disso pode ser vistos no aumento da produtividade de plantas cultivadas, quando há a introdução de ninhos de abelhas nas áreas de cultivos [2].

2 As abelhas popularmente conhecidas como jataí (Tetragonisca angustulla Latreille), são consideradas facilmente adaptáveis por isso podem ser criadas em áreas urbanas e rurais [3]. De acordo com Lopes et al. (2005) [3]; Racowski et al. (2007) [4]; Bobany et al. (2010) [5], o mel de abelhas nativas é comumente procurado devido às suas características medicinais. Apesar da crescente demanda pelo mel de abelhas nativas devido a essas características, há poucos estudos sobre meliponídeos em geral e sobre a composição físicoquímica do mel produzida por essas abelhas sem ferrão [6]. De acordo com Borsato et al. (2009) [7], são muitos os fatores que podem estar envolvidos na variação da atividade antimicrobiana do mel, dentre as quais: diferença do solo, condições atmosféricas, bem como o tipo e fisiologia de cada planta. Para Bogdanov (2012) [8], existem dois tipos de agentes antimicrobianos no mel: o primeiro é o peróxido de hidrogênio, produzido pela glicose oxidase e destruído pela catalase a resultante dessas enzimas determinará a acumulação do peróxido de hidrogênio no mel, porém se aquecidos ou armazenados na luz é destruído, O segundo tipo de agente antimicrobiano é a não relacionada ao peróxido de hidrogênio (não-peróxido), este por sua vez é estável ao calor e ao armazenamento [9], [10] e [11]. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade antimicrobiana do mel de jataí na forma in natura e pasteurizado frente ao microrganismo de Salmonella sp., no mel da região de Campo Mourão, Paraná, verificando se o tratamento térmico (pasteurização) tem influência sobre a atividade antimicrobiana do mel. METODOLOGIA Obtenção das amostras de mel. Foram selecionadas e coletadas quatro amostras de mel de jataí, obtidas na Universidade Tecnológica Federal do Paraná UTFPR, câmpus Campo Mourão, em março de Para a coleta utilizou-se seringa estéril de 10 ml. Em laboratório as amostras passaram por processo de filtração, em seguida foram envasadas em frascos plásticos translúcidos estéreis, armazenados no escuro à temperatura de 6ºC. Padronização da concentração de mel. Na literatura, são utilizadas diferentes concentrações de mel para verificar o potencial antimicrobiano [9]. Para estabelecer a melhor concentração do mel a ser utilizada para determinar a atividade antimicrobiana na forma in natura e pasteurizado, foram utilizados concentrações de 10%, 30%, 50% e 100% das amostras de mel em ensaio preliminar pelo método de disco-difusão, idealizado por Kirby-Bauer (1966) [12]. Os dados obtidos para bactéria Salmonella sp., foram analisados usando o software BioEstat 5.0 [13], sendo calculado o coeficiente de regressão linear simples. A partir dos resultados, foram plotados no gráfico concentração versus espessura dos halos de inibição. Preparo das amostras. As quatro amostras de mel foram homogeneizados com bastão de vidro até observar-se a homogeneidade completa. Alíquotas das amostras de mel foram transferidas para tubos de ensaios, fechados com papel filme, a fim de evitar a absorção de água evaporada pelo processo de aquecimento em banho-maria. Posteriormente as amostras foram submetidas a tratamento térmico (pasteurização) conforme a portaria nº6 de 25 de julho de 1985 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento [14]. Na pasteurização do mel respeitaram-se os seguintes tempo e temperatura: 470 minutos em 52ºC; 170 minutos em 54,5ºC; 60 minutos em 57ºC; 22 minutos em 59,5ºC; 7,5 minutos em 65,5ºC; 2,8 minutos em 65,5ºC; 1 minuto em 68ºC e 24 segundos em 71,1 ºC. Após a pasteurização foi retirada uma alíquota de cada amostra (pasteurizada e in natura) para a realização das análises. Para a análise antimicrobiana com o mel, foram

3 adaptados discos de papel de filtro estéril, recortados em círculos (5 mm), acrescidos de 1 ml de mel sobre cada disco, mantidos em estufa a 35ºC por 24h para secagem, e posteriormente acondicionados em recipientes estéreis e armazenados em geladeira a 6ºC, baseado na técnica de Bauer et al. (1966) [13]. Padronização do inoculo e semeadura. O microrganismo Salmonella sp., foi semeado em placas de petri com meio de cultura Ágar Müeller-Hinton contendo cerca de 15mL, com espessura de aproximadamente 4 mm e incubados em estufa bacteriológica a 35 C por 24 horas, posteriormente as colônias de bactérias foram transferidas para solução salina estéril (0,9 %) até obtenção de turvação, correspondente ao tubo 0,5 da escala McFarland em espectrofotômetro (correspondente a 580 nm). O resultado da absorbância compreende entre 0,08 e 0,10, correspondente a 1,5 x 10 8 UFC/mL, conforme [15]. Em seguida alíquotas de 1000 µl da suspensão bacteriana de Salmonella sp. foram semeados e espalhadas com auxílio de alça de Drigalski nas placas de petri contendo cerca de 15 ml do meio Ágar Müeller- Hinton [16]. Ensaio de antibiose. Após a semeadura, as placas foram identificadas e os discos impregnados com mel na forma in natura, pasteurizado e com o antibiótico (amoxicilina), foram dispostos em quadrantes, deixando uma distância de aproximadamente 40 mm entre os discos, obedecendo aos limites para o crescimento dos halos de inibição. As placas foram incubadas em estufa a 35 C por 24 horas, em cada amostra de mel foram realizadas oito repetições. A leitura dos resultados foi feita com auxílio de um paquímetro. RESULTADOS E DISCUSSÃO De acordo com os resultados obtidos (Figura 1), não houve correlação significativa entre espessura do halo de inibição e a concentração de mel utilizada. Optou-se por utilizar a concentração de 100 % para o ensaio de antibiose. Figura 1 Curva da regressão linear simples entre a espessura do halo de inibição (cm) e as concentrações (10%, 30%, 50% e 100%) de mel da abelha jataí frente ao microrganismo Salmonella sp. (p=0.0738; F=3.2168; GL=1; r²=0.0596; Desvio padrão=0,3025; Média das espessuras dos halos de inibição (cm)=0,1317; Equação: Y =a+bx; n=36).

4 Verificou-se visualmente e com auxílio do paquímetro, que nas placas de petri com discos impregnados com as amostras de mel de abelha jataí na forma in natura e pasteurizado não houve halo de inibição de crescimento frente à bactéria Salmonella sp. Constatou-se uma sensível mudança na coloração próxima às bordas dos discos (Figura 2) Figura 2 A) Desenvolvimento da bactéria Salmonella sp. e os discos de antibiose impregnados com mel na forma in natura (1), controle com antibiótico (2) e controle com água destilada (3). B) Desenvolvimento da bactéria Salmonella sp. e os discos de antibiose impregnados com mel na forma pasteurizado (1), controle com antibiótico (2) e controle com água destilada (3). Bobany et al. (2010) [5], testou a eficiência do mel de abelha jataí frente a microrganismos de Staphylococcus sp., Bacillus sp. e leveduras, encontrando halos médios com 18 mm, incluindo o disco de papel filtro de 7 mm. Gonçalves et al. (2005) [18], utilizaram em seu estudo o mel da abelha nativa Nannotrigona testaceicornis, frente a dez focos infecciosos diferentes, concluindo o excelente potencial antimicrobiano do mel. Contudo a atividade antibacteriana do mel pode variar de acordo com a concentração do mel, a origem floral, o tratamento térmico e exposição à luz [9]. O processamento térmico frequentemente é utilizado para prevenir a cristalização, bem como evitar a fermentação [19]. Para White e Subers (1964) [17], estudos sobre antibiose em amostras de mel aquecidos mostram redução nos valores de atividade antimicrobiana e também uma redução no conteúdo de peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio encontrado no mel é considerado por muitos autores como sendo o responsável pela atividade antimicrobiana constatada no mel [4], [7], [18] e [20]. Tho e Schmidt (2011) [21] observaram que méis que passam por tratamento térmico sofrem modificações físico-químicas, causando alterações em suas propriedades naturais. Devido aos poucos estudos encontrados sobre a atividade antimicrobiana de mel de abelhas nativas, não se pode haver claras conclusões, por isso em seu trabalho Gonçalves et al. (2005) [18], sugere que sejam feitos maiores esforços a fim de determinar parâmetros. CONCLUSÕES Os resultados obtidos não apresentaram valores de halos de inibição que pudessem confirmar a ação antimicrobiana do mel de jataí tanto nas amostras in natura quanto na amostra pós-tratamento térmico (pasteurizado) para a bactéria de Salmonella sp. Não houve também diferenças visíveis que pudessem afirmar que o processo de aquecimento do mel influenciou nos resultados para amostras do mel pasteurizado.

5 A escolha de mais bactérias poderia auxiliar obtenção de valores comparativos para melhor avaliar e confirmar o poder antimicrobiano atribuído ao mel de abelhas nativas na forma in natura e pós-tratamento térmico (pasteurizado). A identificação da origem floral do mel e a análise de parâmetros físico-químicos também são fatores importantes para determinar o potencial antimicrobiano do mel da abelha jataí. REFERÊNCIAS [1] BALLIVIÁN, J. M. P. P., Abelhas Nativas sem ferrão. São Leopoldo-RS. Oikos, Disponível em: < >. Acesso em: 4 jun [2] MENEZES-PEDRO, S. R.; CAMARGO, J. F. M.; Biodiversidade do estado de São Paulo: síntese do conhecimento ao final do século XX. Apoidea, Apiformes. Disponível em: < Acesso em: 18 jun [3] LOPES, M.; FERREIRA, J. B.; SANTOS, G. Abelhas sem-ferrão: a biodiversidade invisível. Agriculturas, v.2, n.4, Disponível em: < Acesso em: 4 jun [4] RACOWSKI, I.; SILVAS, F. P. C.; TAKUSHI, D. T. T.; SILVA, D. W. G. da; MIRANDA, P. dos S. Ação Antimicrobiana do Mel em Leite Fermentado. Revista Analytica. n.30, [5] BOBANY, D. M.; PIMENTEL, M. A. P.; MARTINS, R. R. C.; NETTO, B. A. S.; TOLLA, M. S. Atividade antimicrobiana do mel de abelhas jataí (Tetragonisca angustula) em cultivo de microrganismos do conduto auditivo de caninos comésticos (Canis familiaris). Ci. Anim. Bras., Goiânia, v. 11, n. 2. P , [6] SOUZA, B. A.; MARCHINI, L. C.; DIAS, C. T. S.; ODA-SOUZA, M.; CARVALHO, C. A. L.; ALVES, R. M. O. Avaliação microbiológica de amostras de mel de trigoíneos (Apidae: Trigonini do Estado da Bahia. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 29, n. 4, p , [7] BORSATO, D. M.; CRUZ, M. C. R.; ALMEIDA, M. M. Atividade Antimicrobiana de Méis Comercializados na Região dos Campos Gerais - Paraná; Visão Acadêmica, Curitiba-Pr; v. 10, n. 1, [8] BOGDANOV, S.; Honey as Nutrient and Functional Food; Bee Product Science. v. 15 p Disponível em: < ew.pdf>. Acesso: 28 ago [9] MOLAN, P. C. The antibacterial activity of honey. The nature of the antibacterial activity. Bee World, v. 73, n. 1, p. 5-28, [10] WAHDAN, H. Causes of the antimicrobial activity of honey. Infection, 26:26, [11] FRANCHINI, R. A. de A.; MATOS, R. C. Determinação amperométrica on-line dos níveis de Peróxido de Hidrogênio em Amostras de mel. 30ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, [12] BAUER, A. W.; KIRBY, W. M. M.; SHERRIS, J. C.; TURK, M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. American Journal of Clinical Pathology, v. 45, n. 4, p , [13] AYRES, M.; AYRES JÚNIOR, M.; AYRES, D. L.; SANTOS, A. A BIOESTAT Aplicações estatísticas nas áreas das ciências bio-médicas. Ong Mamiraua. Belém, PA. [14] BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Inspeção de Produto Animal. Portaria nº6, de 25 de julho de Normas Higiênico-Sanitárias e Tecnológicas para Mel, Cera de Abelhas e Derivados.

6 [15] KONEMAN, E. W.; ALLEN, S. D.; JANDA, W. A.; SCHRECKNBERGER, P. C.; WIM, W. C. Jr. Diagnóstico Microbiológico: texto e atlas colorido. 5 ed. Rio de Janeiro: Medsi, p [16] SHADOMY, S.; SPINEL-INGROF, A. Susceptibility testing: with antifungal drugs. In: LENNETTE, E. (Ed.). Manual of clinical microbiology. 3.ed. Washington: Americam Society for Microbiology, Cap. 62, p [17] WHITE, J. W.; SUBERS, M. H. Studies on honey inhibine. 3. Effect of heat. Journal of Apicultural Research, v. 3, n. 1, p , [18] GONÇALVES, A. L.; ALVES FILHO, A.; MENEZES, H. Atividade antimicrobiana do mel da abelha nativa sem ferrão Nannotrigona testaceicornis (Hymenoptera: Apidae, Meliponini). Arq. Inst. Biol., São Paulo, v. 72, n. 4, p , [19] SINGH, N., SINGH, S., BAWA, A. S., & SEKHON, K.S. Honey its food uses. Indian Food Packer, v. 42, p , [20] FRANCHINI, R. A. de A.; MATOS, R. C. Determinação amperométrica on-line dos níveis de Peróxido de Hidrogênio em Amostras de mel. 30ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, [21] THO, K. A.; SCHMIDT, F. L. Caracterização de diversos méis no Brasil. XIX Congresso interno de iniciação científica. UNICAMP Disponível em: < pdf>. Acesso em: 20 set