Ensaios e Ciência: Ciências Biológicas, Agrárias e da Saúde ISSN: Universidade Anhanguera Brasil

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1 Ensaios e Ciência: Ciências Biológicas, Agrárias e da Saúde ISSN: editora@uniderp.br Universidade Anhanguera Brasil Pedroso de Moraes, Cristiano; Santambrosio Santos, Natália; Massaro, Raquel; Marcelino Cordeiro, Germana; de Souza Leal, Thiago DESENVOLVIMENTO IN VITRO DE CATTLEYA TIGRINA A. RICHARD (ORCHIDACEAE) UTILIZANDO FERTILIZANTES COMERCIAIS Ensaios e Ciência: Ciências Biológicas, Agrárias e da Saúde, vol. XIII, núm. 2, 2009, pp Universidade Anhanguera Campo Grande, Brasil Disponível em: Como citar este artigo Número completo Mais artigos Home da revista no Redalyc Sistema de Informação Científica Rede de Revistas Científicas da América Latina, Caribe, Espanha e Portugal Projeto acadêmico sem fins lucrativos desenvolvido no âmbito da iniciativa Acesso Aberto

2 Ensaios e Ciência Ciências Biológicas, Agrárias e da Saúde Vol. XIII, Nº. 2, Ano 2009 DESENVOLVIMENTO IN VITRO DE CATTLEYA TIGRINA A. RICHARD (ORCHIDACEAE) UTILIZANDO FERTILIZANTES COMERCIAIS Cristiano Pedroso de Moraes Centro Universitário Hermínio Ometto Uniararas pedroso@uniararas.br Natália Santambrosio Santos Centro Universitário Hermínio Ometto Uniararas nty-nha@hotmail.com Raquel Massaro Centro Universitário Hermínio Ometto Uniararas keeeeelrida@hotmail.com Germana Marcelino Cordeiro Centro Universitário Hermínio Ometto Uniararas germana_cordeiro@hotmail.com RESUMO A semeadura in vitro representa, em relação à germinação em condições naturais, uma alternativa importante para a propagação de várias espécies de orquídeas, sobretudo para as ameaçadas de extinção, por ser um protocolo para produção de orquídeas em curtos períodos de tempo. O presente trabalho teve como objetivo estudar a influência do meio de cultura MS e de dois meios à base de fertilizantes, Hyponex e Kristalon Laranja, no desenvolvimento in vitro de Cattleya tigrina A. Richard, espécie ameaçada de extinção. Após 180 dias de cultivo, o meio de cultura à base do fertilizante Kristalon Laranja mostrou-se mais eficiente para a germinação e o desenvolvimento das sementes, uma vez que apresentou as maiores médias para as seguintes variáveis: altura das plântulas, número de raízes, massa fresca e comprimento da maior raiz. O meio de cultura à base do fertilizante Kristalon Laranja pode ser utilizado tanto de maneira comercial quanto para recomposição de áreas degradadas via programas de semeadura, uma vez que apresenta baixo custo e maior facilidade de produção. Palavras-Chave: semeadura in vitro; Kristalon Laranja; orquídeas; micropropagação. ABSTRACT Thiago de Souza Leal Centro Universitário Hermínio Ometto Uniararas thiagosouzaleal@hotmail.com Anhanguera Educacional S.A. Correspondência/Contato Alameda Maria Tereza, 2000 Valinhos, São Paulo CEP rc.ipade@unianhanguera.edu.br In vitro seed germination constitutes an important alternative for the propagation of several orchid species, especially those that are threatened with extinction, such as Cattleya tigrina A. Richard, since it represents a way to produce orchids in shorter time periods. The present paper aimed to study the influence of the MS culture medium and of two fertilizer media (one composed of Hyponex and the other of Kristalon Laranja) on the in vitro development of Cattleya tigrina. After 180 days of in vitro culture, the Kristalon Laranja fertilizer culture medium showed to be the most effective one for the germination and the development of seeds, presenting the highest averages for the following measures: heigh of the plantules, number of roots, fresh mass and length of the longest root. The Kristalon Laranja fertilizer culture medium can be used not only commercially, but also for the recomposition of degraded areas through seeding programs since it shows low cost and easeness of production. Keywords: in vitro seed germination; Cattleya; Kristalon Laranja. Coordenação Instituto de Pesquisas Aplicadas e Desenvolvimento Educacional - IPADE

3 tornar críticos para o estabelecimento da cultura (ARDITTI; ERNST, 1992). Não há, ainda, 58 Desenvolvimento in vitro de Cattleya tigrina A. Richard (Orchidaceae) utilizando fertilizantes comerciais 1. INTRODUÇÃO As orquídeas destacam-se como importantes plantas ornamentais, de grande interesse botânico e econômico, em função da beleza e exuberância de suas flores (SHEEHAN, 1992). Além desses atributos, Zanenga-Godoy e Costa (2003) explicitam que o cultivo de orquídeas do gênero Cattleya é de grande importância para o agronegócio florícola mundial, devido à ampla capacidade de recombinação genética, além de características de suas flores como forma, tamanho e durabilidade. As orquídeas são comumente retiradas de seus habitates, sendo alvos constantes de exploração por meio de coletas indiscriminadas. A retirada de orquídeas de seu ambiente natural vem aumentando devido a diversos fatores como a urbanização, aumento das atividades agrícolas e extrativismo predatório (MENEZES, 1987; 1995). Entre as orquídeas brasileiras, o gênero Catlleya merece destaque, sendo considerado por Arditti e Ernst (1992) como um sinônimo de orquídea e por Menezes (1987), como a rainha das orquídeas pela sua exuberância e tamanho da flor. Adicionalmente, apresenta alto valor comercial (VENTURA et al., 2002), tornando-se com isso um importante alvo de coleta predatória no Brasil. Entre as orquídeas desse gênero vulneráveis à extinção (BIOTA, 2009) está Cattleya tigrina A. Richard. Essa espécie, anteriormente conhecida como Cattleya guttata, habita trechos de matas ribeirinhas, caracterizados pela alta umidade, estando distribuída pelo litoral atlântico, desde o sul do Brasil até o estado do Rio de Janeiro (PRIDGEON et al., 2005). Seu período de floração ocorre em janeiro, época da alta temporada turística no litoral brasileiro, tornando-a alvo constante de coleta por mateiros, que exploram os lucros de sua venda (VENTURA et al., 2002). A cultura assimbiótica ou semeadura in vitro de orquídeas é utilizada no Brasil há cerca de 25 anos, com o principal objetivo de aumentar a produção de mudas, o que reduz seu custo e contribui para evitar a extinção de diversas espécies de orquídeas (STANCATO; BEMELMANS; VEGRO, 2001). Este tipo de cultura resulta em maiores percentuais de germinação, em comparação com a germinação em condições naturais, a qual é dependente da infecção por fungos micorrízicos simbiontes (MARTINI et al., 2001). A resposta às condições do cultivo in vitro varia fortemente entre gêneros, espécies, cultivares e até mesmo plantas de um mesmo genótipo cultivadas sob diferentes condições ambientais. Além disso, em plantas que sofrem alterações anuais ou mesmo diárias de fatores climáticos, parecem existir ritmos fisiológicos endógenos que podem se

4 Cristiano Pedroso de Moraes, Natália Santambrosio Santos, Raquel Massaro, Germana Marcelino Cordeiro, Thiago de Souza Leal 59 um meio de cultura específico que se adeque às exigências de um gênero, espécie, híbrido ou clone. Em geral, é difícil definir os motivos pelos quais certas combinações de meio e condições de cultivo obtém sucesso, ao passo que outras fracassam (VENTURA et al., 2002). Em relação ao gênero Catlleya, Arditti e Ernst (1992) descrevem as seguintes formulações de meio: KC, (KNUDSON, 1946); VW (VACIN; WENT, 1949); H (HELLER, 1953); MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962); LS (LISMAIER; SKOOG, 1965); e RM (REINERT; MOHR, 1967). Cada um desses meios possui uma composição própria de macro e micronutrientes, assim como diferentes fontes de carbono, vitaminas e reguladores de crescimento (VENTURA, 2007). Essa complexidade tende a dificultar sua preparação e elevar os custos dessa forma de propagação (PEDROSO DE MORAES et al., 2009). Estudos in vitro realizados por Stancato, Bemelmans e Vegro (2001) e Pedroso-de- Moraes et al. (2009), demonstram que a diminuição de custos é possível através da simplificação dos meios de cultura atuais, principalmente com o emprego de fertilizantes como base de meios de cultura. Este tipo de procedimento tem como objetivo a produção em larga escala de alguns representantes do gênero Cattleya que requerem condições de cultivo específicas. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o desenvolvimento de plântulas de Cattleya tigrina em meio de cultura MS com metade da concentração de macronutientes (MURASHIGE; SKOOG, 1962), e em dois meios complexos à base dos fertilizantes Hyponex e Kristalon laranja, durante o período de 180 dias de cultivo in vitro. 2. MATERIAL E MÉTODOS Para a realização do presente trabalho, cinco flores de plantas de diferentes genótipos de Cattleya tigrina foram autopolinizadas artificialmente em janeiro de Seis meses após a autopolinização, foram coletados frutos maturos, os quais foram levados ao Laboratório de Botânica e Análises Ambientais do Centro Universitário Hermínio Ometto Uniararas, para obtenção das sementes. No laboratório, foram preparados três tipos de meios de cultura, sendo o primeiro composto por meio MS com metade da concentração de macronutrientes (MURASHIGE; SKOOG, 1962), o qual foi usado como controle. Adicionalmente, dois meios de cultura à base de fertilizante Hyponex (NPK 6,5-9-19) ou Kristalon laranja (NPK ) a 2 g.l -1, acrescidos de 1 g.l -1 de carvão ativado, 30 g.l -1 de sacarose com ph ajustado para ph 5,8 antes da adição de 7 g.l -1 de agar-banana foram utilizados para o

5 60 Desenvolvimento in vitro de Cattleya tigrina A. Richard (Orchidaceae) utilizando fertilizantes comerciais experimento. Os meios à base de fertilizantes não foram suplementados com a solução de micronutrientes do meio MS. Finalmente, quatro frascos por tratamento receberam 50 ml de cada um dos meios de cultura e, em seguida, foram esterilizados em autoclave a 121ºC e 1 atm de pressão durante 20 minutos (ARDITTI; ERNEST, 1992). Para a desinfestação das sementes, optou-se pela utilização de hipoclorito de sódio a 5%. Em seguida à desinfestação, as sementes foram submetidas à agitação na solução durante cinco minutos, em tubos Eppendorf. Posteriormente, os tubos foram mergulhados em álcool 70% e levados à câmara de fluxo laminar, onde as sementes foram lavadas quatro vezes em água destilada com o auxílio de seringa de 1 ml. Ainda utilizando-se a seringa, as sementes foram depositadas, juntamente com 1 ml de água destilada, nos frascos contendo os meios de cultura (ARDITTI; ERNEST, 1992). Os frascos semeados foram fechados com tampa plástica transparente e mantidos durante 180 dias em câmara climática (B.O.D. MA 403), à temperatura de 25 ± 2 C, com um fotoperíodo de 12 horas e intensidade luminosa de aproximadamente 40 µmol.m -2.s -1. Foram semeados quatro frascos por tratamento sendo inoculadas, por recipiente, 1g de sementes, com desenvolvimento de cerca de 50 plântulas por frasco (PEDROSO DE MORAES et al., 2009). Para a análise estatística, foram utilizadas vinte plântulas retiradas aleatoriamente de cada um dos quatro recipientes, sendo cada um deles considerado uma repetição (PEDROSO DE MORAES et al., 2009). Os dados referentes à altura das plântulas (AP), comprimento da maior raiz (CMR) e comprimento da maior folha (CMF), foram obtidos pelo uso de paquímetro digital (Digimess 100A). Para a obtenção da massa de matéria fresca (MFR) e massa de matéria seca (MSR) de raízes foi utilizada balança analítica (Gehaka BG 400). Para inferência da massa de matéria seca, as plântulas foram submetidas à estufa com circulação de ar forçada a 60 C por 24 horas. Após resfriamento espontâneo, em dessecador, obteve-se o peso da biomassa seca. O número de raízes (NR) também foi contabilizado. Os dados obtidos foram submetidos a análises de variância (ANOVA) pela utilização do aplicativo BioEstat 5.0, sendo a comparação das médias realizada pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Para a análise estatística, foram utilizados os dados brutos. 3. RESULTADOS Os resultados demonstraram que as plântulas de Cattleya tigrina cultivadas em meio de cultura à base de fertilizante Kristalon laranja apresentaram as maiores médias, que

6 Cristiano Pedroso de Moraes, Natália Santambrosio Santos, Raquel Massaro, Germana Marcelino Cordeiro, Thiago de Souza Leal 61 diferiram significativamente das médias obtidas para plântulas cultivadas em meio à base de Hyponex, para as seguintes variáveis: altura das plântulas (AP), número de raízes (NR), massa fresca (MFR) e comprimento da maior raiz (CMR). Para massa de matéria seca de raízes (MSR) e comprimento da maior folha (CMF), não houve diferença significativa entre os meios de cultivo à base de Hyponex e Kristalon laranja. O meio de cultivo MS com metade da concentração de macronutrientes apresentou as menores médias para todas as variáveis analisadas, com exceção da variável massa da matéria fresca (MFR), na qual o resultado da média não apontou diferença significativa quando comparado ao meio Hyponex (Tab. 1). Tabela 1 - Valores médios referentes à altura das plântulas (AP), número de raízes (NR), massa fresca (MFR), massa seca (MSR), comprimento da maior raiz (CMR) e comprimento da maior folha (CMF) de Cattleya. tigrina, após 180 dias cultivo, nos meios de cultura ½ MS, Hyponex e Kristalon laranja. Variáveis Avaliadas Meios de Cultura AP (cm) NR MFR (g) MSR (g) CMR (cm) CMF (cm) ½ MS 2.05 c c 0.34 b 0.07 b 1.61 b 0.95 b Hyponex 2.53 b 1.63 b 0.38 b 0.14 a 1.94 a 1.21 a Kristalon laranja 2.85 a 1.86 a 0.54 a 0.15 a 2.35 a 1.29 a CV % Médias seguidas de letras iguais na mesma coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5 % de significância. 4. DISCUSSÃO O uso de fertilizantes comerciais tem se intensificado como forma de facilitação para o preparo de meios de cultura e redução de custos de produção em várias espécies de orquídeas (PEDROSO-DE-MORAES et al., 2009). Oliveira e Faria (2005) em estudo comparativo entre os meios MS, Knudson C, Vacin e Went e meios à base de adubos NPK (10-5-5) e NPK ( ) na concentração de 3,0 g.l -1, obtiveram as melhores médias para comprimento da maior raiz nas espécies Catasetum fimbriatum e Cyrtopodium paranaensis quando utilizaram o meio à base do adubo NPK (10-5-5). O meio à base do fertilizante NPK ( ) apresentou a melhor média em número de raízes para Catasetum fimbriatum neste mesmo estudo. Ainda, em relação à massa da matéria seca da raiz e massa da matéria seca da parte aérea, os autores obtiveram que os dois meios à base de fertilizantes se destacaram para a espécie Cyrtopodium paranaensis. Tais resultados são corroborados com os encontrados para orquídeas terrestres, em que fertilizantes utilizados e possuidores de concentrações semelhantes das fontes de nitrogênio, quando da análise do sistema radicular, apresentaram resultados positivos, tanto para o número, quanto para o comprimento de raízes (WEN; HEW, 1993; PAN; CHEN, 1994). No entanto, meios de cultura apropriados devem ser estabelecidos para cada espécie, o que deve

7 62 Desenvolvimento in vitro de Cattleya tigrina A. Richard (Orchidaceae) utilizando fertilizantes comerciais resultar em maior qualidade de plantas produzidas in vitro (Oliveira; Faria, 2005), sugestão que pode ser apoiada também através dos resultados obtidos no presente estudo. Os resultados encontrados no presente trabalho estão de acordo com os descritos para Cattleya loddigesii Lindl. por Pedroso-de-Moraes et al. (2009), nos quais o meio de cultura à base de fertilizante Kristalon laranja apresentou as maiores médias para as variáveis: altura das plântulas, massa da matéria fresca e seca, comprimento da maior raiz e maior folha, quando comparados aos meios MS com metade da concentração de macronutrientes e Hyponex. Para Cattleya forbesii Lindl., Unemoto et al. (2007) utilizando meio de cultura à base de fertilizante NPK (6-6-8) na concentração de 3 ml.l -1, obteve os melhores resultados para as variáveis: comprimento da maior raiz, número de raízes e massa da matéria fresca total quando comparado aos meios MS tradicional e MS com metade da concentração de macronutrientes. Também, Da Silva (2003), trabalhando com Cattleya tigrina, obteve melhores resultados na propagação in vitro para todas as variáveis biométricas analisadas, utilizando fertilizante Dyna Gro (7-9-5) como base para meio de cultura acrescido de tomate e água de coco quando comparado ao meio MS. Dronk (2004), utilizando meio de cultura à base de fertilizante Dyna Gro (7-7-7) acrescido com banana e água de coco, também obteve os melhores resultados na propagação de Cattleya ametistoglossa Linden & Rchb.f. principalmente com relação às variáveis massa da matéria fresca e massa da matéria seca. Dessa forma, os resultados obtidos nesses trabalhos comprovam a eficácia de meios à base de fertilizantes para o desenvolvimento de plântulas do gênero Cattleya, assim como o encontrado para este ensaio. Ainda que Da Silva (2003) e Dronk (2004) tenham obtido bons resultados em seus estudos, vale ressaltar que a utilização de polpas de frutas e de endosperma líquido servem como complemento para meios de cultura, sejam eles à base de fertilizantes ou não, principalmente em relação a fontes de sais potássicos, fosfatos e fitormônios. Malavolta et al. (1997) sugerem que a absorção de um dado nutriente pode ser influenciada por outro. Em relação ao potássio, pressupõe-se uma correlação entre esse elemento e o fósforo, sendo que a deficiência no meio de cultura conduz à hiperidricidade e ao decréscimo na taxa de absorção de fosfato (Pasqual, 2001). O meio MS possui baixas concentrações de sais contendo sódio e cloro, porém, estudos para propagação em massa de orquídeas demonstraram a necessidade de se adicionar ao meio concentrações maiores desses sais. Possivelmente, as baixas concentrações representam o principal fator responsável pelas menores médias apresentadas por esse meio de cultura em relação aos meios à base dos fertilizantes

8 Cristiano Pedroso de Moraes, Natália Santambrosio Santos, Raquel Massaro, Germana Marcelino Cordeiro, Thiago de Souza Leal 63 Kristalon laranja e Hyponex, que apresentam maiores concentrações destes elementos em suas formulações (CHEN; CHANG; CHANG, 2000). O fertilizante Kristalon laranja, de acordo com os resultados para este trabalho, pode ser utilizado tanto comercialmente quanto em programas de semeadura para recomposição de áreas degradadas, por apresentar maior facilidade e baixo custo de produção em relação ao meio MS com metade da concentração de macronutrientes e ao meio à base de fertilizante Hyponex. 5. CONSIDERAÇÕES FINAIS O meio de cultura à base de fertilizante Kristalon laranja demonstrou maior eficácia no desenvolvimento in vitro de plântulas de Cattleya tigrina considerando as variáveis: altura da planta, número de raízes, matéria fresca e comprimento da maior raiz. Em relação às variáveis: massa seca e comprimento da maior raiz não houve diferença significativa entre os meios à base de fertilizantes analisados. REFERÊNCIAS ARDITTI, J.; ERNEST, R. Micropropagation of orchids. New York: John Wiley & Sons, 1992, 682p. BIOTA Lista oficial de espécies de plantas ameaçadas de extinção no Estado de São Paulo. Disponível em: < Acesso em: 3 set CHEN, Y.C.; CHANG, C.; CHANG, W.C. A reliable protocol for plant regeneration from callus culture of Phalaenopsis. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant, v. 36, n. 5, p , DA SILVA, A.L.L. Avaliação de uma receita para o cultivo de orquídeas in vitro. Orquidário, v. 17, n. 1, p , DRONK, A.G. Meios de cultura e condições de luminosidade para o cultivo in vitro de Cattleya amethystoglossa Linden & Rchib.f f. Dissertação (Mestrado em Agronomia) Curso e Pós-graduação em Agronomia, Universidade Federal do Paraná, Curitiba. HELLER, R. Recherches sur la nutrition minérale des tissus cultivés in vitro. Ann. Sci. Nat. Biol. Veg., v. 14, p , KNUDSON, L. A new nutrient solution for germination of orchid seed. American Orchid Society Bulletin, West Palm Beach, v. 15, p , LISMAIER, E.M.; SKOOG, F. Organic growth factor requirements of tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., v. 18, p , MALAVOLTA, E.; VITTI, G.C.; OLIVEIRA, S.A. Avaliação do estado nutricional das plantas: princípios e aplicações. 2.ed. Piracicaba: Associação Brasileira para Pesquisa da Potassa e do Fosfato, 1997, 319p. MARTINI, P.C. et al. Propagação de orquídea Gongora quinquenervis por semeadura in vitro. Pesq. Agrpec. Bras., v. 36, p , MENEZES, L.C. Cattleya labiata Lindley. Orquídeas Brasileiras. Rio de Janeiro: Expressão e

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10 Cristiano Pedroso de Moraes, Natália Santambrosio Santos, Raquel Massaro, Germana Marcelino Cordeiro, Thiago de Souza Leal 65 Germana Marcelino Cordeiro Bacharelado e Licenciatura em Ciências Biológicas do Centro Universitário Hermínio Ometto. Thiago de Souza Leal Bacharelado e Licenciatura em Ciências Biológicas do Centro Universitário Hermínio Ometto.