FUNDO DE DEFESA DA CITRICULTURA MESTRADO PROFISSIONAL EM CONTROLE DE DOENÇAS E PRAGAS DOS CITROS IVALDO SALA

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1 FUNDO DE DEFESA DA CITRICULTURA MESTRADO PROFISSIONAL EM CONTROLE DE DOENÇAS E PRAGAS DOS CITROS IVALDO SALA Avaliação do tempo de exposição em armadilha adesiva amarela e das condições de armazenamento de adultos de Diaphorina citri na detecção de Candidatus Liberibacter asiaticus Dissertação apresentada ao Fundo de Defesa da Citricultura como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Fitossanidade Orientadora: Diva do Carmo Teixeira Coorientador: Renato Beozzo Bassanezi Araraquara Maio

2 I IVALDO SALA Avaliação do tempo de exposição em armadilha adesiva amarela e das condições de armazenamento de adultos de Diaphorina citri na detecção de Candidatus Liberibacter asiaticus Dissertação apresentada ao Fundo de Defesa da Citricultura como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Fitossanidade Orientadora: Diva do Carmo Teixeira Coorientador: Renato Beozzo Bassanezi Araraquara Maio

3 II IVALDO SALA Avaliação do tempo de exposição em armadilha adesiva amarela e das condições de armazenamento de adultos de Diaphorina citri na detecção de Candidatus Liberibacter asiaticus Dissertação apresentada ao Fundo de Defesa da Citricultura como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Fitossanidade Araraquara, 21/05/2013 BANCA EXAMINADORA Dr. Renato Beozzo Bassanezi Fundecitrus Dr. Nelson Arno Wulff Fundecitrus Dr. Helvécio Della Coletta Filho Centro APTA Citros Sylvio Moreira / IAC

4 III Dedico este trabalho a todos que de alguma forma me auxiliaram e orientaram no desenvolvimento do mesmo.

5 IV AGRADECIMENTOS Através deste pequeno espaço, venho agradecer primeiramente a todos que direta ou indiretamente colaboraram para a concretização deste trabalho. E, em especial agradeço: A Deus por me propiciar, através de sua força, o conhecimento necessário para buscar o aprimoramento pessoal e a concretização deste trabalho. Aos meus familiares pelo incentivo, paciência e carinho nos momentos em que mais precisei. Aos meus amigos, por estarem sempre presentes e dispostos a ajudar no que fosse preciso. Aos amigos e colegas do Mestrado Profissionalizante do Fundecitrus pelo excelente período de convivência e troca de conhecimento. Aos professores pela incansável busca ao conhecimento e excelência no ensino aos alunos. A todos os amigos e colegas que trabalharam e trabalham no Fundecitrus, importante instituição, na qual tenho grande carinho e admiração. Agradeço também aos funcionários do Fundecitrus: Elaine Cristina Martins, Luis Montesino, Daniela Aparecida Bonoti Coletti, Fabio Luis dos Santos, Eder Alexandre Souza, Jean Michel Martins, Sidnei Ferreira Alkimin, Deividson Fernandes Rodrigues, André Luís Sanches, Fernanda Alves Queirós Benedito, Tatiana M. M. Cardamori, Juliana Silva de Abreu. Ao Gerente Departamento de Pesquisa e Desenvolvimento do Fundecitrus Dr. Antonio Juliano Ayres e ao pesquisador e supervisor Dr. José Belasque Junior. Ao pesquisador Dr. Nelson Arno Wulff pela importante contribuição no desenvolvimento desta dissertação. Agradeço também meu coorientador Dr. Renato Beozzo Bassanezi pela amizade, apoio e ensinamentos durante a realização deste trabalho. Finalmente agradeço minha orientadora Dra. Diva do Carmo Teixeira pela paciência, amizade, sabedoria e profissionalismo com que conduziu os ensinamentos e orientação deste trabalho.

6 V RESUMO A avaliação da frequência de psilídeos asiático dos citros infectivos é importante para (i) estudos de aquisição e inoculação de bactérias por psilídeos, (ii) detecção da doença em zonas ainda livres, mas com a presença de psilídeos (iii) avaliação da eficiência das estratégias de redução de inóculo, (iv) avaliação da frequência de psilídeos infectivos para Candidatus Liberibacter asiaticus e da abundância de fontes de inóculo ou prováveis novas infecções de HLB. Para isso, os psilídeos podem ser coletados diretamente ou em armadilhas adesivas amarelas, comumente usadas por produtores brasileiros para monitoramento de psilídeos. As armadilhas adesivas amarelas normalmente são deixadas no campo durante duas semanas, após o que são avaliadas visualmente quanto à presença de psilídeos e, se estiverem presentes podem são removidos das armadilhas e testados por PCR em tempo real (qpcr) para a presença de psilídeos infectivos, em laboratório de diagnóstico. Estudos anteriores na Flórida mostraram que, a incidência de psilídeos infectivos diminui com o aumento do tempo, em armadilha adesiva amarela (Irey et al., 2011). Assim, o objetivo deste primeiro trabalho foi determinar se o tempo de exposição em armadilhas adesivas amarelas afeta os resultados de detecção de Ca. L. asiaticus por qpcr e se está relacionado com as condições metereológicas durante o inverno e verão. Adultos de psilídeos oriundos de ninfas criadas em árvores infectadas com Ca. L. asiaticus foram colocados em armadilhas adesivas (BUG- Agentes Biológicos) no campo e 20 amostras com 3 indivíduos foram testadas após 0, 1, 3, 9, 12 e 15 dias. Os resultados foram comparados com amostras de psilídeos coletadas diretamente das plantas infectadas sem contato com a cola da armadilha. O experimento foi realizado na cidade de Araraquara nos meses de junho, julho e agosto (inverno) e em janeiro, fevereiro e março (verão). Em contraste com o experimento da Flórida, não houve diferença significativa entre os tempos de exposição em armadilhas adesivas amarelas para detecção de Ca. L. Asiaticus por até 15 dias em ambas as estações do ano. Os psilídeos coletados diretamente em plantas de citros devem ser armazenados antes de seguirem a um laboratório de diagnose. Dependendo das condições e do tempo de armazenamento de psilídeos infectivos, o DNA da bactéria Ca. L. asiaticus pode degradar e ocorrer falsos resultados negativos. Assim, este segundo estudo foi realizado para avaliar a detecção de Ca. L. asiaticus por PCR em tempo real (qpcr) em adultos de psilídeos submetidos a diferentes métodos e tempos de armazenamento. Dois experimentos fatoriais foram conduzidos. Os fatores eram meio de estocagem (com etanol 70% e a seco), temperatura (-20 C, 4 C e 26 C) e tempo (0, 3, 7, 14, 21, 28 e 35 dias). Cada tratamento foi constituído de 20 amostras com 3 adultos de psilídeos oriundos de ninfas criadas em plantas infectadas por Ca. L. asiaticus, e testados por qpcr para a presença da bactéria. Não houve diferenças significativas nas porcentagens de amostras de psilídeos positivas para Ca. L. asiaticus entre os métodos de armazenamento até 35 dias, exceto uma leve tendência de declínio nas amostras armazenadas sem etanol a 26 C por mais de 14 dias. Palavras-chave: Psilídeo, Candidatus Liberibacter asiaticus, armadilhas adesivas amarelas, armazenamento, qpcr.

7 VI ABSTRACT The assessment of bacterialiferous Asian Citrus Psyllid (ACP) frequency is important for (i) studies of bacteria acquisition and inoculation by ACP, (ii) disease detection in disease free areas but with ACP presence, (iii) efficiency evaluation of inoculum reduction strategies, (iv) evaluation of frequency of Candidatus Liberibacter asiaticus (Las)-positive ACP and the abundance of inoculum sources or putative new HLB infections relationships. For that, ACP can be collected directly or on yellow sticky traps (YST) commonly used by Brazilian growers to monitor psyllid population. The YST are usually left in the field for 2 weeks after which time cards are visually evaluated for the ACP presence, and if present, the psyllids are removed from the cards and tested by real-time PCR (qpcr) for the presence of the bacteria. Previous studies in Florida showed that the incidence of Las-positive ACP declined with increasing time on the YST (Irey et al., 2011). Thus the objective of this first work was to determine how much the time on YST affects qpcr results in Las detection and if it was related to weather conditions during winter and summer. ACP adults from nymphs reared on Las infected trees were placed on YST (BUG-Agentes Biológicos) in the field and 20 samples with 3 individuals each were tested after 0, 1, 3, 9 12 and 15 days. The results were compared with psyllid samples directly collected from infected plants without trap glue. Experiments were done in June, July and August (winter) and in January, February and March (summer), at Araraquara city. In contrast with previous report in Florida, no difference on the incidence of Las-positive ACP samples was observed up to 15 days on the YST in both seasons. The psyllids collected directly in citrus plants must be stored before moving to a laboratory diagnosis. Depending on the conditions and time of storage of collected psyllids Las DNA in ACP could degraded and Las-false negative results could occur. Thus this second study was conducted to evaluate the detection of Las by real-time PCR (qpcr) in ACP adults submitted to different storage methods and time. Two 2x3x7 factorial experiments were conducted. Factors were storage medium (70% ethanol and dry), temperature (-20 C, 4 C and 26 C) and time (0, 3, 7, 14, 21, 28 and 35 days). For each treatment 20 samples with 3 ACP adults each from nymphs reared on Las infected trees were tested for Las presence by qpcr. No significant differences in percentages of psyllids samples positive for CLas were observed among the storage methods up to 35 days, except a slight trend of decline in Las detection in samples storage without ethanol at 26 C for more than 14 days. Keywords: Psyllid, Candidatus Liberibacter asiaticus, yellow sticky traps, storage, qpcr

8 VII LISTA DE FIGURAS Figura 1. Criação de Diaphorina citri em plantas infectadas com a bactéria Candidatus Liberibacter asiaticus Figura 2. Armadilhas adesivas amarelas instaladas em suportes metálicos ao ar livre na sede do Fundecitrus em Araraquara-SP Figura 3. Disposição dos psilídeos nas armadilhas adesivas amarelas (Três insetos por quadrícula) Figura 4. Esquema dos tratamentos aplicados em cada mês nos períodos de inverno (Junho, Julho e Agosto) e verão (Janeiro, Fevereiro e Março). Na legenda da figura: ins=insetos; am=amostra Figura 5. Psilídeos armazenados em etanol 70% (A) e a seco (B) Figura 6. Esquema dos tratamentos realizados para avaliar a influência das condições de conservação e armazenamento de amostras de Diaphorina citri coletadas diretamente na detecção de Candidatus Liberibacter asiaticus. Na legenda da figura: am=amostra; x3 = três insetos por amostra Figura 7. Curva padrão da diluição seriada 1:10 do plasmídeo pgem-t Easy contendo a sequência alvo de amplificação de Candidatus Liberibacter asiaticus Figura 8. Aparência dos psilídeos coletados nas armadilhas adesivas amarelas após diferentes tempos de exposição Figura 9. Concentração média de DNA proveniente das amostras de psilídeos coletados nas armadilhas adesivas amarelas durante o período de inverno. As barras correspondem ao erro padrão da média das repetições realizadas em junho, julho e agosto de Figura 10. Concentração média de DNA proveniente das amostras de psilídeos coletados nas armadilhas adesivas amarelas durante o período de verão. As barras correspondem ao erro padrão da média das repetições realizadas em janeiro, fevereiro e março de Figura 11. Valor médio de Ct das amostras de psilídeos coletados nas armadilhas adesivas amarelas durante o período de inverno. As barras correspondem ao erro padrão da média das repetições realizadas em junho, julho e agosto de Figura 12. Valor médio de Ct das amostras de psilídeos coletados nas armadilhas adesivas amarelas durante o período de verão. As barras correspondem ao erro padrão da média das repetições realizadas em janeiro, fevereiro e março de Figura 13. Porcentagem média de amostras de psilídeos positivas para Candidatus Liberibacter asiaticus coletados das armadilhas em relação às amostras controle coletadas diretamente em função do tempo de exposição nas armadilhas adesivas amarelas durante o período de inverno. As barras correspondem ao erro padrão da média das repetições realizadas em junho, julho e agosto de Figura 14. Porcentagem média de amostras de psilídeos positivas para Candidatus Liberibacter asiaticus coletados das armadilhas em relação às amostras controle coletadas

9 diretamente em função do tempo de exposição nas armadilhas adesivas amarelas durante o período de verão. As barras correspondem ao erro padrão da média das repetições realizadas em janeiro, fevereiro e março de Figura 15. Média do DNA total das amostras de psilídeos em função do período de armazenamento nos diferentes tratamentos de meio de estocagem (em etanol 70% e a seco) e temperatura de armazenamento (26 C, 4 C e -20 C). As barras correspondem ao erro padrão da média de duas repetições (20 amostras por repetição) Figura 16. Porcentagem média de amostras de psilídeos positivas para Candidatus Liberibacter asiaticus em função do período de armazenamento nos diferentes tratamentos de meio de estocagem (em etanol 70% e a seco) e temperatura de armazenamento (26 C, 4 C e - 20 C). As barras correspondem ao erro padrão da média de duas repetições (20 amostras por repetição) VIII

10 IX LISTA DE TABELAS Tabela 1. Valores de Ct obtidos com a diluição seriada de duas amostras positivas na qpcr para Candidatus Liberibacter asiaticus e submetidas a qpcr Tabela 2. Valores de Ct obtidos com a diluição seriada do plasmídeo pgem-t Easy contendo uma cópia do DNA alvo para Candidatus Liberibacter asiaticus Tabela 3. Dados das condições climáticas de temperatura média, umidade relativa média do ar e precipitação pluviométrica acumulada durante o período de 15 dias em cada mês que o experimento foi conduzido Tabela 4. Resultado da análise de regressão entre o DNA total extraído das amostras e período de armazenamento (de 0 a 35 dias) para cada meio de estocagem (em etanol 70% ou a seco) e temperatura armazenamento (26 C, 4 C ou -20 C)...34 Tabela 5. Resultado da análise de regressão entre porcentagem de amostras positivas para Candidatus Liberibacter asiaticus e período de armazenamento (de 0 a 35 dias) para cada meio de estocagem (em etanol 70% ou a seco) e temperatura armazenamento (26 C, 4 C ou - 20 C)...36

11 X SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO MATERIAIS E MÉTODOS Criação e coleta de psilídeos infectivos Experimento de avaliação do tempo de exposição de psilídeos em armadilhas adesivas amarelas Experimento de avaliação das condições de armazenamento de psilídeos coletados diretamente na planta Extração de DNA das amostras de psilídeos Quantificação, diluição e volume de DNA das amostras Detecção de Candidatus. Liberibacter asiaticus nas amostras de DNA de psilídeos Determinação do valor de Ct (Threshold Cycle) máximo para amostras positivas e avaliação da sensibilidade da reação de qpcr RESULTADOS E DISCUSSÃO Determinação do valor de Ct Avaliação da sensibilidade (limite de detecção) da qpcr Experimento de avaliação do tempo de exposição de psilídeos em armadilhas adesivas amarelas Experimento de avaliação das condições de armazenamento de psilídeos coletados diretamente na planta CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 40

12 11 1. INTRODUÇÃO O Brasil é o maior produtor mundial de suco de laranja. O país detém 50% da produção, exporta 98% do que produz e consegue 85% de participação no mercado mundial (Neves et al., 2010). Segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2013), em 2012 o Brasil possuía área plantada de ha de laranja e o estado de São Paulo ha, o que corresponde a 66% da área total. Na safra de 2011 foram colhidas no Brasil caixas de 40,8 kg de laranja e no estado de São Paulo caixas de 40,8 kg, que corresponde 77% do total colhido no país. Neves et al. (2010) afirma que a citricultura gera entre empregos diretos e indiretos 230 mil vagas e o faturamento total dos elos da cadeia produtiva de citros foi de US$ 14,6 bilhões em As pragas e doenças são ameaças constantes à produção de citros no Brasil e foram responsáveis pela erradicação de 40 milhões de árvores na primeira década deste século (Neves et al., 2010). O Huanglonbing (HLB), também conhecido como Greening, é considerado a pior doença dos citros no mundo. Na China, conhecida há mais de cem anos, foi relatada por Reiking, em 1919, com o nome de Huanglongbing, que significa doença do ramo amarelo (Reiking, 1919; Lin, 1956). No Brasil, o primeiro relato ocorreu no estado de São Paulo, em 2004 (Coleta-Filho et al., 2004; Teixeira et al., 2005a; 2005b; 2005c) e hoje se encontra distribuída em todas as regiões produtoras de São Paulo e em municípios dos estados de Minas Gerais e Paraná. O HLB é causado por uma bactéria de floema, pertencente ao gênero Candidatus Liberibacter e que ainda não foi cultivada in vitro com sucesso. Atualmente três liberibacters estão associadas ao HLB: Candidatus Liberibacter asiaticus, Candidatus Liberibacter africanus e Candidatus Liberibacter americanus (Bové et al., 2008 ). No Brasil, foram identificadas as espécies Ca. L. americanus e Ca. L. asiaticus, no entanto, ultimamente Ca. L. asiaticus prevalece sobre Ca. L. americanus nas propriedades citrícolas do estado de São Paulo. Em 2009, aproximadamente 96% das amostras analisadas no Fundecitrus para a ocorrência de HLB estavam associadas à presença de Ca. L. asiaticus (Teixeira et al., 2010). E de acordo com dados mais recentes, a prevalência de Ca. L. asiaticus sobre Ca. L. americanus continua, tendo sido de 99% no período de agosto de 2011 a junho de 2012 (Fundecitrus, dados não publicados). As bactérias causadoras do HLB podem ser transmitidas por enxertia de material infectado ou por psilídeos. A transmissão natural no campo de Ca. L. asiaticus e Ca. L.

13 12 americanus se dá pelo psilídeo Diaphorina citri Kuwayama (Capoor et al., 1974; Yamamoto et al., 2006), comumente chamado de psilídeo asiático dos citros. Este psilídeo é relatado no Brasil desde a década de 40 do século passado (Costa Lima, 1942). D. citri é um pequeno inseto que mede de 2 a 3 mm de comprimento, de cor cinza com manchas escuras nas asas, podendo o adulto viver de 3 a 4 meses (Gallo et al. 2002). Os ovos são colocados agrupados entre folhas novas, são de coloração amarela, de formato alongado e medem aproximadamente de 0,3 mm de comprimento; as ninfas são achatadas, amareladas e apresentam pernas curtas (Yamamoto, 2008). Para o controle do HLB são recomendadas três medidas que devem ser utilizadas em conjunto e de maneira regional: (i) plantio de mudas sadias; (ii) inspeção e eliminação de plantas doentes; (iii) monitoramento e controle do psilídeo vetor (Bové, 2006). Atualmente, o controle do psilídeo tem sido feito de maneira preventiva ou baseado no seu monitoramento em brotações ou com o auxílio de armadilhas adesivas atraentes, com o nível de ação independente da frequência de indivíduos infectivos na população, isto é, da presença de indivíduos com a bactéria associada ao HLB. Entretanto, o conhecimento da frequência de psilídeos infectivos em uma determinada população permitiria definir o grau de tolerância à presença do psilídeo no campo, com o intuito de se determinar o nível de ação para o controle do mesmo, isto é, quanto mais psilídeos infectivos menor a tolerância à sua presença. A determinação da frequência de psilídeos infectivos numa população também é essencial para estudos de aquisição e transmissão da bactéria pelo psilídeo. Ainda não há informações consistentes sobre a eficiência de transmissão das espécies de Ca. Liberibacter spp por D. citri no Brasil. Os principais estudos foram realizados na Ásia e registraram taxas de transmissão que variaram de 1 a 100% (Capoor et al., 1974; Huang et al., 1984; Xu et al., 1988). Estudos realizados por Capoor et al. (1974), indicaram que adultos de D. citri podem adquirir ou inocular a forma asiática do patógeno em um tempo mínimo de minutos. O monitoramento e detecção da doença em áreas onde a mesma ainda não foi relatada, mas que já têm a presença do vetor seria importante para estabelecer estratégias de controle do vetor e da doença. Sétamou et al. (2012) mantiveram no Texas (EUA), durante seis anos, estudos para detecção precoce da doença, que até o ano de 2012 era ausente no Estado. O psilídeo foi detectado no Texas no ano de 2001 e a partir de 2010 houve um esforço para o controle do inseto vetor, visando reduzir sua população e o risco do aparecimento do HLB. A avaliação da efetividade das medidas de redução de fonte de inóculo na propriedade e na região pode também ser determinada pela quantificação da frequência de psilídeos infectivos, pois quanto

14 13 maior a eficiência da redução de fontes de inóculo e redução da aquisição do patógeno pelos psilídeos, deve resultar em menor infectividade da população local de psilídeos (Bassanezi et al., 2013). Outra utilidade em se determinar a infectividade da população, local de psilídeos seria a previsão da quantidade de novas plantas contaminadas no futuro, uma vez que isto depende não somente do número total de psilídeos em uma população, mas também da porcentagem de psilídeos infectados com o patógeno do HLB, sendo fácil entender que uma população com 90% de psilídeos infectados é muito mais eficiente em transmitir a liberibacter do HLB que uma mesma população com apenas 1% de insetos infectivos. Manjunath et al. (2008) coletou 1500 amostras de psilídeos vivos em vários locais na Flórida (EUA) em plantas sintomáticas e assintomáticas para HLB e chegou a 105 amostras positivas para Ca. Liberibacter asiaticus e sugeriu que uma população infectiva de psilídeos e plantas poderiam disseminar o HLB na Flórida. Seja qual for o objetivo da detecção das bactérias do HLB nos psilídeos vetores, o modo de captura, o modo de armazenamento ou conservação do inseto e o tempo de armazenamento em determinada condição podem interferir na taxa de detecção da bactéria pelos métodos empregados rotineiramente. Normalmente, os testes de detecção têm sido feitos por meio da extração de DNA dos insetos, juntamente com o DNA da bactéria caso esteja presente, que é posteriormente submetido à reação da polimerase em cadeia (PCR) para a amplificação de determinada sequência do DNA alvo (do patógeno) que se quer determinar. Desta forma, quanto melhor a qualidade do modo de coleta e armazenamento, melhor será a qualidade da amostra, o que pode refletir diretamente na qualidade do DNA usado para a detecção do patógeno. Em propriedades citrícolas, um dos métodos de monitoramento do movimento e imigração (entrada) de D. citri na propriedade envolve o uso de armadilhas adesivas atrativas (amarelas ou verdes) colocadas em pontos estratégicos da propriedade, com posterior avaliação da captura ou não do inseto. Yamamoto, (2008) descreve que o monitoramento do psilídeo pode ser realizado por meio de avaliação visual direta em ramos de plantas cítricas ou em armadilhas adesivas amarelas que devem ser posicionadas na periferia da propriedade e em alguns locais dentro da propriedade, visando monitorar os locais e momento da entrada do vetor e a migração para o interior da mesma. Adicionalmente, em muitos locais do mundo, levantamentos para detectar a presença de HLB antes da descoberta de plantas sintomáticas também são conduzidos com o monitoramento de D. citri em armadilhas adesivas atraentes, seguido pelo teste dos psilídeos capturados por PCR convencional ou PCR em tempo real

15 14 (qpcr) para verificar a presença das bactérias associadas ao HLB nos insetos. Em ambos os casos onde os psilídeos são monitorados em armadilhas adesivas, estas permanecem no campo por uma a duas semanas, quando são avaliadas visualmente para a presença dos psilídeos, os quais são removidos e levados ao laboratório para os testes de detecção das bactérias. O processo que envolve a coleta dos psilídeos capturados nas armadilhas até o seu processamento no laboratório pode levar até um mês dependendo do fluxo de trabalho dos inspetores de campo e dos técnicos do laboratório. Como a análise dos psilídeos é um método destrutivo com respeito à amostra de insetos, é difícil provar que um resultado de PCR negativo é devido à ausência da bactéria alvo ou devido à degradação do DNA bacteriano durante o tempo de exposição do psilídeo na armadilha e às condições de armazenamento e ao tempo de conservação do psilídeo retirado da armadilha (Irey et al., 2011). São poucas as informações sobre o período que os psilídeos capturados nas armadilhas podem permanecer expostos em contato com a cola ou qual o tempo de armazenamento após a coleta esses insetos podem permanecer sem que tenham alterações que interfiram na detecção da bactéria em laboratório. Apenas dois testes independentes foram realizados por Irey et al. (2011) nas condições climáticas da Florida e com as armadilhas utilizadas pelos citricultores locais. Neste caso, os autores observaram que a incidência de amostras positivas para a presença de Ca. L. asiaticus por meio de qpcr diminuiu com o aumento do tempo de permanência dos psilídeos nas armadilhas, entretanto, maiores detalhes sobre as condições de armazenamento dos psilídeos coletados não foram divulgadas. Tomando por base esse método de coleta, é importante avaliar o tempo de exposição e permanência dos insetos nas armadilhas para posterior envio ao laboratório e análise, nas condições dos pomares no estado de São Paulo, em diferentes épocas do ano e com as armadilhas adesivas utilizadas pelos citricultores locais. Outro método de monitoramento da população de psilídeos nos pomares envolve a observação dos insetos em brotações. Neste caso, o psilídeo pode ser coletado diretamente na planta com puçá (rede entomológica) ou sugador e processado em seguida no laboratório. Este método tem sido o mais utilizado em trabalhos de detecção da bactéria em psilídeos (Hung et al., 2004; Teixeira et al., 2005b; Damsteegt et al., 2010), uma vez que os insetos permanecem em melhores condições de manuseio e análise. Quando se pretende conservar os insetos durante o seu transporte a longas distâncias ou por maior tempo até seu processamento no laboratório, os insetos coletados podem ser armazenados em tubos a seco ou contendo substâncias conservadoras, como por exemplo, o etanol e mantidos em diferentes condições de refrigeração. Entretanto, não há no Brasil uma descrição detalhada ou parece não haver um

16 15 consenso sobre o efeito das condições de temperatura e do tempo de armazenamento antes do processamento da amostra sobre a eficiência de detecção da bactéria nos insetos. Meyer et al. (2007), para estudar a frequência de psilídeos infectados por Ca. L. asiaticus, em suas coletas, colocou os psilídeos em etanol 95%, acondicionando-os no gelo durante o seu transporte até o laboratório. Por outro lado, Manjunath et al. (2008) estudou a infectividade de psilídeos coletados vivos e conservados em etanol 95% e mantidos a -20 C até o processamento das amostras. Em outro trabalho para determinar a infectividade de psilídeos em estudos de aquisição e transmissão de Ca. L. asiaticus por D. citri, Pelz-Stelinski et al.. (2010) mantiveram os psilídeos em etanol 80% e a -20 C até o momento da extração de DNA para a detecção de Ca. L. asiaticus. Em seu protocolo de diagnóstico de espécies Ca. Liberibacter. por qpcr, o Servício Nacional de Sanidad Inocuidad y Calidad Agroalimentaria (Senasica) do México, responsável pela detecção de HLB neste país, recomenda coletar os psilídeos vivos e armazená-los imediatamente em frascos com etanol 70% e manter as amostras à temperatura ambiente para a detecção da bactéria (SENASICA, 2010). Finalmente, Hall et al. (2011), estudando a influência do modo, temperatura e tempo de armazenamento na detecção de Ca. L. asiaticus em psilídeos individuais, concluíram que todos os métodos de armazenamento testados (em etanol 70% ou 95% ou propilenoglicol conservados à temperatura ambiente ou a -25 C), com exceção do método a seco a -25 C, foram efetivos em conservar a bactéria nos psilídeos infectados por até 59 dias. Segundo os autores, o armazenamento a seco a -25 C foi eficaz até 38 dias, mas tendeu a perder a efetividade aos 59 dias. Desta forma, este trabalho teve como objetivo avaliar o tempo de exposição em armadilhas adesivas amarelas e as condições de armazenamento de psilídeos adultos na detecção de Ca. L. asiaticus por meio da técnica de qpcr. Em um primeiro experimento foi avaliada a influência do tempo de exposição do psilídeo capturado em armadilha adesiva amarela, durante as condições climáticas de inverno e verão na região de Araraquara-SP. Em um segundo experimento foi avaliado a influência do meio de estocagem (a seco ou em etanol 70%), da temperatura de conservação e do tempo de armazenamento dos insetos vivos coletados diretamente. Em função dos resultados obtidos procurou-se estabelecer um protocolo de detecção de psilídeos infectivos, seja eles provenientes de captura direta ou em armadilhas adesivas.

17 16 2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1. Criação e coleta de psilídeos infectivos Os psilídeos utilizados nos experimentos foram provenientes de criação em laranjeiras doces sabidamente infectadas com Ca. L. asiaticus e mantidas em estufa com tela anti-afídica, na sede do Fundecitrus, em Araraquara-SP (Figura 1). O ciclo de D. citri, que corresponde às fases de ovo, ninfas e adulto foi completado nessas plantas, de maneira a garantir alta infectividade da população dos insetos utilizados no experimento. Os psilídeos adultos utilizados em cada experimento foram coletados diretamente das plantas com auxílio de um sugador bucal. Figura 1. Criação de Diaphorina citri em plantas infectadas com a bactéria Candidatus Liberibacter asiaticus.

18 Experimento de avaliação do tempo de exposição de psilídeos em armadilhas adesivas amarelas Este experimento foi realizado em duas épocas do ano, no inverno, com repetições nos meses de junho, julho e agosto, e no verão, com repetições nos meses de janeiro, fevereiro e março. Para cada repetição foram utilizadas 10 armadilhas adesivas amarelas quadriculadas, dupla face, de 15 x 10 cm (BUG-Agentes Biológicos, Piracicaba-SP) instaladas ao ar livre (Figura 2) na sede do Fundecitrus em Araraquara-SP, cidade localizada a 664 metros de altitude, de clima tropical com inverno seco e possuindo as coordenadas latitude 21º47'40" Sul e longitude 48º10'32" Oeste. Figura 2. Armadilhas adesivas amarelas instaladas em suportes metálicos ao ar livre na sede do Fundecitrus em Araraquara-SP. Cada armadilha recebeu 60 psilídeos, dispostos de forma que pudessem ser identificados no momento da coleta, sendo 3 psilídeos por quadricula na armadilha (Figura 3). Para cada repetição do experimento foram colocados 120 insetos a mais do que o necessário nas análises para compensar uma possível perda dos insetos devido à lavagem por chuva ou

19 18 degradação do mesmo na época de coleta. Quando o número de psilídeos encontrados, após o tempo de exposição fosse diferente de três em uma das quadrículas, estes não foram coletados para garantir que todos psilídeos utilizados fossem provenientes da criação e não da captura de psilídeos externos ao experimento, ocorrida após a instalação das armadilhas. Figura 3. Disposição dos psilídeos nas armadilhas adesivas amarelas (Três insetos por quadrícula). Os tratamentos testados foram diferentes tempos de exposição dos insetos nas armadilhas (0, 1, 3, 6, 9, 12 e 15 dias) e mais um tratamento Controle constituído por insetos infectivos sem passar pelas armadilhas, capturados diretamente na planta fonte e armazenados. O tratamento 0 dias na armadilha foi constituído por insetos colocados em contato com a cola da armadilha e retirados logo em seguida. A cada tempo de coleta estabelecido, os insetos foram retirados das armadilhas com auxílio de um arame, transferidos para tubos eppendorf de 1,5 ml e armazenados à temperatura de -20ºC. O processamento para a extração de DNA de todas as amostras foi realizado uma semana após a última coleta dos psilídeos expostos por 15 dias.

20 19 Para cada tratamento foram coletadas e analisadas 20 amostras compostas por três psilídeos cada, totalizando 160 amostras com 480 insetos em cada mês e 960 amostras ao final do experimento (Figura 4). Figura 4. Esquema dos tratamentos aplicados em cada mês nos períodos de inverno (Junho, Julho e Agosto) e verão (Janeiro, Fevereiro e Março). Na legenda da figura: ins=insetos; am=amostra. Durante a execução de todo o experimento as condições climáticas de temperatura, umidade relativa do ar e precipitação pluviométrica foram monitoradas e registradas. O efeito do tempo de exposição dos psilídeos nas armadilhas sobre a quantidade média de DNA total extraído nas amostras, o valor médio de Ct e a porcentagem de amostras positivas para Ca. L. asiaticus em relação às amostras de psilídeos coletados diretamente (sem passar pela armadilha) foram analisadas por regressão linear considerando os dados de cada um dos três meses de cada estação (inverno ou verão) como repetições. Para a comparação das médias das estações foi realizado o teste t comparando-se os valores dos coeficientes angulares das retas obtidas Experimento de avaliação das condições de armazenamento de psilídeos coletados diretamente na planta Neste experimento foi realizada a coleta direta de psilídeos adultos vivos por meio de sugadores bucais nas mesmas plantas descritas no item 2.1. Em seguida, os insetos foram colocados em tubos eppendorf de 1,5 ml em número de três insetos por tubo (Figura 5) e submetidos aos diferentes tratamentos. A extração de DNA foi realizada imediatamente ao final de cada tempo de armazenamento estabelecido (Figura 6).

21 20 O delineamento experimental foi de blocos casualizados e fatorial 2x3x7, onde os blocos foram as repetições do experimento em diferentes meses (setembro e outubro) e os fatores testados foram: - Meio de estocagem : em etanol 70% ou a seco; - Temperatura de armazenamento : temperatura ambiente (em torno de 26 C), temperatura de geladeira (4ºC) e congelador (-20ºC); - Tempo de armazenamento : 0, 3, 7, 14, 21, 28 e 35 dias. (A) (B) Figura 5. Psilídeos armazenados em etanol 70% (A) e a seco (B). Cada tratamento foi constituído por 20 amostras com três psilídeos por amostra e os resultados foram apresentados como porcentagem de amostras positivas para Ca. L. asiaticus (média das duas repetições do experimento).

22 21 Figura 6. Esquema dos tratamentos realizados para avaliar a influência das condições de conservação e armazenamento de amostras de Diaphorina citri coletadas diretamente na detecção de Candidatus Liberibacter asiaticus. Na legenda da figura: am=amostra; x3 = três insetos por amostra. O efeito do tempo de armazenamento dos insetos na quantidade média de DNA total extraído, no valor de Ct e na eficiência de detecção da bactéria nas amostras de psilídeos em cada combinação Meio de estocagem e Temperatura de armazenamento foi analisado por regressão linear considerando o tempo de armazenamento como variável independente e a quantidade média de DNA total, o valor de Ct e a porcentagem de amostras positivas para Ca. L. asiaticus como variáveis dependentes.

23 Extração de DNA das amostras de psilídeos A extração de DNA a partir dos psilídeos coletados nos dois experimentos foi feita utilizando-se o método do CTAB (Murray & Thompson, 1980). As amostras de insetos foram maceradas, com auxílio de um pistilo, diretamente em tubos de 1,5 ml com 400 µl de tampão CTAB (CTAB 2,0%, NaCl 8,2%, PVP ,0%, Tris 0,01 M ph 8,0 e EDTA 0,05 M ph 8,0) contendo 0,2% de β-mercaptoetanol e em seguida, submetidas à incubação a 65ºC durante 30 minutos e centrifugação a 960 g por 5 minutos. Foram recuperados 350 µl do sobrenadante e adicionados 350 µl da solução de clorofórmio: álcool isoamilico (24:1). Após homogeneização, as amostras foram centrifugadas a g por 10 minutos e 300 µl do sobrenadante transferido para novos tubos. Em cada amostra acrescentou-se 0,6 volumes de isopropanol (180 µl) para precipitação do DNA por meio de incubação a -20 C por 30 minutos. Após esse período, as amostras foram centrifugadas a g por 20 minutos, o sobrenadante descartado e o sedimento lavado duas vezes com 700 µl de etanol 70%. Após a última centrifugação (15300 g por 10 minutos) do processo de lavagem, as amostras foram secas por 5 minutos em Speed Vac (Eppendorf) e o pellet de DNA ressuspenso em 30 µl de H 2 O deionizada autoclavada. As extrações foram realizadas no Laboratório do Centro de Diagnóstico de Doenças e Pragas dos citros do Departamento de Pesquisa e Desenvolvimento do Fundecitrus, em Araraquara-SP Quantificação, diluição e volume de DNA das amostras Após a extração, o DNA das amostras foi quantificado em NanoDrop (ND 1000 V 3.7.1). Com base na concentração de DNA as amostras foram divididas em três categorias: amostras com concentração de DNA maior que 100 ng/µl, foram diluídas com água para uma concentração final de 100 ng/µl, sendo utilizado 3 µl de DNA na reação de PCR. Para amostras com concentração de DNA entre 90 e 100 ng/µl, foram utilizados 3 µl de DNA sem diluição na reação de PCR. Para amostras que apresentaram concentração de DNA menor que 90 ng/µl, foram empregados 6 µl de DNA na reação de PCR. Assim, a quantidade de DNA na reação de PCR variou de 25,08 até 538,98 ng. A divisão das amostras com base na concentração de DNA total obtido nas extrações teve como objetivo normalizar ou minimizar as diferenças na quantidade de DNA que seria empregada nas reações de PCR.

24 Detecção de Ca. L. asiaticus nas amostras de DNA de psilídeos A detecção de Ca. L. asiaticus nas amostras de DNA obtidas dos psilídeos, nos dois experimentos, foi realizada por meio da técnica de qpcr (PCR em tempo real), considerada mais sensível que a PCR convencional para a detecção da bactéria Ca. L. asiaticus (Li et al, 2006; Teixeira et al., 2008). Para a detecção da bactéria foram utilizados os oligonucleotídeos (primers) e sonda com base na região do DNA ribossomal 16S (DNAr 16S), desenvolvidos por Li et al. (2006) e utilizados como padrão pelo Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS). Para cada reação de qpcr utilizou-se 3 ou 6 µl de DNA, conforme descrito no item 2.5, Master Mix [1X], 0,5 µm dos primers HLBas: 5 TCGAGCGCGTATGCAATACG 3 (forward) e HLBr: 5 GCGTTATCCCGTAGAAAAAGGTAG 3 (reverse) e 0,2 µm da sonda HLBp: FAN AGACGGGTGAGTAACGCG MGB-NFQ, em um volume final de reação igual a 15 µl. A reação de PCR consistiu de desnaturação inicial por 10 minutos a 95 ºC seguidos de 45 ciclos de 15 segundos a 95 C de desnaturação e 45 segundos a 58 C de anelamento e extensão. Os controles utilizados foram: sadio (psilídeos sem a presença de Ca. Liberibacter spp.), positivo (psilídeos com a presença de Ca. L. asiaticus) e negativo (água - ausência de DNA). Todas as amostras, inclusive os controles foram realizadas em duplicata em termociclador StepOnePlus (Applied Biosystem). As reações foram feitas no Centro de Diagnóstico de Doenças e Pragas dos Citros do Departamento de Pesquisa e Desenvolvimento do Fundecitrus, em Araraquara-SP Determinação do valor de Ct (Threshold Cycle) máximo para amostras positivas e avaliação da sensibilidade da reação de qpcr Com a finalidade de se estabelecer o valor de Ct máximo que pudesse ser adotado para considerar uma amostra positiva por qpcr, duas amostras sabidamente positivas para Ca. L. asiaticus foram diluídas serialmente na proporção 1:1 (DNA:H₂O), até a máxima diluição de 1:256. Para ambas as amostras a quantidade inicial de DNA total na reação foi igual a 300 ng. Assim, as diluições subsequentes continham 150, 75, 37,5, 18,7, 9,4, 4,7, 2,3 e 1,2 ng de DNA total nas reações. As diluições foram utilizadas em duplicata. Para se verificar a sensibilidade ou o limite de detecção do teste de qpcr utilizado, uma reta padrão foi obtida através da utilização de um plasmídeo (pgemt Easy) contendo a sequencia alvo de amplificação. Admite-se que cada molécula do plasmídeo equivale a uma

25 24 cópia do alvo da qpcr. Para esta análise foram empregadas oito diluições seriadas com fator de diluição igual a 10, de modo que a menor diluição continha 6,5 x 10 8 cópias do inserto enquanto a maior equivaleu a 65 cópias, o que em última análise significa o número alvos de liberibacter na amostra. As diluições foram utilizadas em duplicata.

26 25 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1. Determinação do valor de Ct Com a finalidade em se determinar o valor de Ct máximo para considerar uma amostra positiva na avaliação por qpcr, diluições seriadas (na ordem 1:1) de duas amostras sabidamente positivas, e com valores de Ct conhecidos, foram empregadas. Quando se dilui uma amostra 1:1 espera-se ter a metade de alvos da qpcr a cada diluição e consequentemente o valor de Ct deve aumentar em 1Ct. Na Tabela 1 são mostrados os resultados de Ct obtidos a partir deste experimento, onde se verificou que a cada diluição, o valor de Ct correspondente aumentou em aproximadamente 1 Ct, sendo esta linearidade observada até as diluições finais de ambas as amostras empregadas (amostras 27 e 54), com poucas discrepâncias observadas nas últimas diluições, o que pode ocorrer devido ao baixo número de cópias na reação. Ainda que os valores iniciais de Ct tenham variado em função da quantidade inicial de DNA da liberibacter em cada amostra (maior a quantidade de DNA da bactéria na amostra, menor o valor de Ct e vice-versa), verificamos uma boa linearidade nos valores de Ct, de onde se pode estimar que o valor de Ct igual a 35 seria um valor confiável a ser adotado para se considerar uma amostra positiva (o que correspondeu em média a 1,1x10 3 alvos da qpcr). Assim, o valor de Ct limite adotado para uma amostra ser considera como positiva foi de 35, o que corrobora os dados apresentados por Santos et al. (2011). Tabela 1. Valores de Ct obtidos com a diluição seriada de duas amostras positivas na qpcr para Candidatus Liberibacter asiaticus e submetidas a qpcr. Diluição DNA (ng) Valores de Ct Amostra 27 Amostra 54 Amostra sadia 1 (Original) ,7 26,8 Indeterminado 1/ ,6 27,6-1/ ,4 28,4-1/8 37,5 32,4 29,3-1/16 18,7 33,4 30,5-1/32 9,4 34,2 31,6-1/64 4,7 35,4 32,5-1/128 2,3 38,6 33,9-1/256 1,2 37,6 35,3 -

27 Avaliação da sensibilidade (limite de detecção) da qpcr O valor de Ct (Threshold Cycle ou ciclo limiar) em uma reação de qpcr representa o ciclo da PCR no qual ocorre a interseção entre a curva de amplificação de uma amostra e a linha do threshold, ou em outras palavras, o número de ciclos requeridos para que o sinal de fluorescência gerado em uma determinada amplificação ultrapasse o threshold (nível de background) da reação. Ele é a medida relativa da concentração de um alvo na reação de qpcr. Os valores de Ct são inversamente proporcionais à quantidade de DNA alvo na amostra, assim, quanto maior a quantidade deste na amostra, menor será o valor de Ct. Na tabela 2, os valores de Ct obtidos com as diluições do plasmídeo seguem uma linearidade (intervalo médio de 3,61 ± 0,21 Ct para diluições 1:10) até a amostra contendo 6,5 x 10 2 cópias. Entretanto, o intervalo de Ct para a diluição seguinte (65 cópias) foi de 0,74, diferente de 3,6, indicando perda de linearidade na detecção de alvos da PCR. Tabela 2. Valores de Ct obtidos com a diluição seriada do plasmídeo pgem-t Easy contendo uma cópia do DNA alvo para Candidatus Liberibacter asiaticus. Cópias do plasmídeo Ct médio 6,5 x ,05 6,5 x ,29 6,5 x ,85 6,5 x ,62 6,5 x ,34 6,5 x ,89 6,5 x , ,44 Observa-se que o limite de detecção (menor concentração que pode ser detectada) foi de 65 cópias. Entretanto para fins de quantificação, ainda que não nos propuséssemos a quantificar as amostras, deve-se considerar a faixa de linearidade da reta, o que neste caso ficou em torno de 650 cópias (Ct igual a 36,7). Esse resultado corrobora o valor de Ct máximo de 35 estabelecido anteriormente para se considerar uma amostra positiva, o que nos da segurança no valor adotado, evitando considerar amostras negativas como positivas (falsos

28 27 positivos) nas analises das reações de qpcr. A reta padrão é mostrada na Figura 7 abaixo, tendo sido obtido valor de eficiência igual a 93,75%. Figura 7. Curva padrão da diluição seriada 1:10 do plasmídeo pgem-t Easy contendo a sequência alvo de amplificação de Candidatus Liberibacter asiaticus Experimento de avaliação do tempo de exposição de psilídeos em armadilhas adesivas amarelas Em todas as repetições, tanto no inverno como no verão, a frequência de amostras positivas para os psilídeos coletados diretamente sem contato com a armadilha, variou entre 95 e 100%, indicando alta infectividade das populações de psilídeos adultos obtidos da criação em plantas sintomáticas. Isto corrobora com os resultados de Nascimento et al. (2010) que ao manter ninfas de D. citri de quarto instar por um período de acesso à aquisição (PAA) de 48 horas em plantas sintomáticas, obteve 84% de adultos infectados com Ca. L. asiaticus 21 dias após o início do PAA. Com o aumento do tempo de exposição dos psilídeos nas armadilhas adesivas, observou-se uma aparente degradação dos mesmos, seus corpos tornaram-se menos firmes e mais escuros (Figura 8).

29 28 0 dias 3 dias 6 dias 9 dias 15 dias Figura 8. Aparência dos psilídeos coletados nas armadilhas adesivas amarelas após diferentes tempos de exposição. Como pode ser observado nas Figuras 9 e 10, tanto no inverno como no verão, quanto maior o tempo de exposição dos psilídeos nas armadilhas menor a quantidade de DNA total obtido das amostras após a extração, sendo observada uma redução mais expressiva ainda, principalmente a partir do terceiro dia de exposição dos insetos nas armadilhas, indicando haver um efeito da cola e/ou do clima na degradação do DNA total. Tanto no inverno quanto no verão o coeficiente angular da reta (α) entre a média do DNA total e o tempo de exposição dos psilídeos nas armadilhas adesivas amarelas foi negativo e significativamente diferente de zero. No inverno, α = -6,86, erro padrão = 1,06 e P = 0,000007; e no verão, α = -8,38, erro padrão = 1,26 e P = 0, Não houve diferença significativa do α entre o verão e o inverno (P = 0,3627), indicando que apesar das diferenças climáticas de temperatura média, umidade relativa média e precipitação entre as duas estações do ano (Tabela 3), a degradação do psilídeo capturado durante os 15 dias de exposição foi semelhante.

30 DNA total (ng/ul) Controle Dias de exposição na armadilha adesiva Figura 9. Concentração média de DNA proveniente das amostras de psilídeos coletados nas armadilhas adesivas amarelas durante o período de inverno. As barras correspondem ao erro padrão da média das repetições realizadas em junho, julho e agosto de DNA total (ng/ul) Controle Dias de exposição nas armadilhas adesivas Figura 10. Concentração média de DNA proveniente das amostras de psilídeos coletados nas armadilhas adesivas amarelas durante o período de verão. As barras correspondem ao erro padrão da média das repetições realizadas em janeiro, fevereiro e março de 2012.

31 30 Esta redução na quantidade de DNA total extraído em função do tempo de exposição nas armadilhas foi refletida no aumento dos valores médios de Ct obtidos para as amostras, tanto no verão (Figura 11), quanto no inverno (Figura 12). Nos dois períodos o coeficiente angular da reta (α) entre a média do valor de Ct e o tempo de exposição dos psilídeos nas armadilhas adesivas amarelas foi positivo e significativamente diferente de zero. No inverno, α = 0,18, erro padrão = 0,07 e P = 0,022; e no verão α = 0,26, erro padrão = 0,08 e P = 0,003. Entretanto, não houve diferença significativa do α entre o verão e o inverno (P = 0,4527). Tabela 3. Dados das condições climáticas de temperatura média, umidade relativa média do ar e precipitação pluviométrica acumulada durante o período de 15 dias em cada mês que o experimento foi conduzido. Mês/Clima Temperatura ( C) Umidade Relativa (%) Precipitação (mm) Junho 17,7 77,0 46 Julho 17,9 72,9 0,5 Agosto 19,3 64,0 11 Inverno 18,3 71,3 19,2 Janeiro 21,5 76,3 316 Fevereiro 24,6 76,3 180 Março 24,0 77,7 159 Verão 23,4 76,8 218,3 Embora tenha havido uma menor quantidade de DNA total extraído nas amostras e um maior valor de Ct com o aumento do tempo de exposição nas armadilhas, os valores de Ct na maioria dos casos ficou abaixo do limiar (Ct < 35) para considerar a amostra positiva e não foi observada redução na porcentagem relativa de amostras detectadas positivas pelo qpcr em função do tempo de exposição das amostras nas armadilhas, tanto no inverno como no verão (Figuras 13 e 14), isto é, os valores de α não foram significativamente diferentes de zero. No inverno α = -0,49, erro padrão = 0,34 e P = 0,1647; no verão α = -0,77, erro padrão = 0,38 e P = 0,0562.

32 Ct Controle Dias de exposição na armadilha adesiva Figura 11. Valor médio de Ct das amostras de psilídeos coletados nas armadilhas adesivas amarelas durante o período de inverno. As barras correspondem ao erro padrão da média das repetições realizadas em junho, julho e agosto de Ct Controle 0 1 dia 3 dias 6 dias 9 dias 12 dias 15 dias Dias de exposição nas armadilhas adesivas Figura 12. Valor médio de Ct das amostras de psilídeos coletados nas armadilhas adesivas amarelas durante o período de verão. As barras correspondem ao erro padrão da média das repetições realizadas em janeiro, fevereiro e março de 2012.

33 32 % de amostras positivas nas armadilhas em relação às amostras controle Dias de exposição nas armadilhas adesivas Figura 13. Porcentagem média de amostras de psilídeos positivas para Candidatus Liberibacter asiaticus coletados das armadilhas em relação às amostras controle coletadas diretamente em função do tempo de exposição nas armadilhas adesivas amarelas durante o período de inverno. As barras correspondem ao erro padrão da média das repetições realizadas em junho, julho e agosto de % de amostras positivas nas armadilhas em relação às amostras controle Dias de exposição nas armadilhas adesivas Figura 14. Porcentagem média de amostras de psilídeos positivas para Candidatus Liberibacter asiaticus coletados das armadilhas em relação às amostras controle coletadas diretamente em função do tempo de exposição nas armadilhas adesivas amarelas durante o período de verão. As barras correspondem ao erro padrão da média das repetições realizadas em janeiro, fevereiro e março de 2012.