PRÉ-TRATAMENTO EM REATOR SEMI-PILOTO DE BAGAÇO E PALHA DE CANA-DE-AÇÚCAR E AVALIAÇÃO DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DA BIOMASSA PRÉ-TRATADA

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1 PRÉ-TRATAMENTO EM REATOR SEMI-PILOTO DE BAGAÇO E PALHA DE CANA-DE-AÇÚCAR E AVALIAÇÃO DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DA BIOMASSA PRÉ-TRATADA Lira, R. C. (1) ; Nascimento, M. S. (1) ; Silva, M. J. (1) ; Rocha, G. J. M (2) rafa.cavalcanti.lira@gmail.com (1) Universidade Federal de Pernambuco UFPE, Recife PE, Brasil; (2) Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol, Recife PE, Brasil. RESUMO Os materiais lignocelulósicos são os mais abundantes no mundo. O objetivo desse trabalho foi empregar a etapa de pré-tratamento hidrotérmico ao bagaço e palha de cana-de-açúcar e avaliar seu efeito na hidrólise enzimática. A etapa de pré-tratamento removeu aproximadamente 90% da hemicelulose contida no material in natura, apresentado fatores de severidade considerados severos, 4,4 (bagaço) e 5,4 (palha). Os ensaios de conversão enzimática mostraram que a conversão celulósica aumentou em aproximadamente 27% para o bagaço, quando adicionado o surfactante e foi indiferente para a palha e a composição química do bagaço e palha corroboram com outras descritas na literatura. De acordo com os dados conclui-se que o pré-tratamento é uma importante etapa para remoção de hemicelulose deixando o bagaço e palha mais susceptíveis a hidrólise enzimática e posterior produção de Bioetanol de segunda geração. Palavras-chaves: Materiais Lignocelulósicos, Hemicelulose, Bioetanol 2G. INTRODUÇÃO O bagaço de cana-de-açúcar é um material lignocelulósico composto por carboidratos (celulose + hemicelulose) e lignina, como principais componentes macromoleculares, conforme mostrado na Figura 1.

2 Figura 1. Estrutura da Lignocelulose. Fonte: Rubin, A utilização de biomassa vegetal como matéria-prima para a obtenção de insumos químicos exige pré-tratamento que leve à desestruturação do complexo lignocelulósico, tendo com um dos principais desafios, a remoção seletiva da hemicelulose e da lignina (Martin, 2011). O pré-tratamento hidrotérmico promove a clivagem das ligações do complexo lignina-carboidratos, com ruptura das ligações glicosídicas dos polissacarídeos, principalmente das hemiceluloses (Sun; Cheng, 2002). A utilização do bagaço tem se limitado a produção de polpas celulósicas, utilização em ração animal e, mais recentemente, na geração de energia pela sua queima em caldeiras (Sindaçúcar, 2012). Entretanto a viabilização de novas tecnologias de utilização da biomassa poderá desviar parte desse bagaço para a produção de compostos de maior valor econômico. Este trabalho teve como objetivo pré-tratar hidrotermicamente bagaço e palha de cana in natura visando à obtenção de um material lignocelulósico mais facilmente hidrolisável com enzimas celulolíticas, investigado também a ação do emprego de surfactante na conversão enzimática da celulose em glicose como etapa na obtenção de etanol de segunda geração. MATERIAL E MÉTODOS O bagaço e palha de cana utilizados nesse trabalho foram gentilmente cedidos pela Granja Santa Helena de Goiana-PE. As biomassas vegetais foram caracterizadas de

3 acordo com Gouveia, et al., Amostras do bagaço e palha in natura foram separadas e submetidas à extração com solução ciclohexano/etanol na proporção 1:1 em aparelho soxhlet em seguida extraídas com água a 60 ºC. Após extração, o material foi seco e quantificado o teor de extrativos. Para a caracterização físico-química do material livre de extrativos, pesou-se em triplicata amostras de 2g de bagaço e palha in natura. Esse material foi transferido para béqueres de 100 ml e tratadas com 12 ml de H 2 SO 4 72% (m/v) em um banho termostatizado a 45 ± 1ºC por 8 min. As amostras foram transferidas para erlenmeyers de 500 ml, adicionou-se o volume de 225 ml de água destilada. Os erlenmeyers foram fechados com papel alumínio e autoclavados a 121 ºC por 30 min. Após hidrólise o material foi filtrado usando papel de filtro quantitativo separando-se o hidrolisado dos sólidos presentes na solução. A fração líquida foi transferida para balão de 500 ml, completado seu volume com água destilada e armazenada para análises posteriores de de carboidratos, ácidos orgânicos, furfural, hidroximetilfurfural por HPLC e lignina solúvel (espectrofotometria em ultravioleta). A lignina retida no papel de filtro foi lavada com aproximadamente 1500 ml de água destilada, seca em estufa a 105ºC, pesada para determinação de lignina insolúvel. Após a determinação da lignina o material sólido resultante foi calcinado para determinação do teor de cinzas na lignina. Amostras de bagaço e palha in natura sem extrativos foram calcinadas em mufla para determinação das cinzas totais. As amostras de material prétratado seguiram a mesma metodologia, com exceção da remoção de extrativos. O processo de pré-tratamento utilizado foi o hidrotérmico nas condições descritas por Oliveira et al., Nesta operação foi empregado um reator de 20L da marca REGMED EU/20 numa temperatura de 190ºC, tempo de 10 min e relação sólido/líquido de 1:10. Após reação o reator foi descarregado e o material filtrado, lavado com aproximadamente 30L de água aquecida, secos a temperatura ambiente e moídos em peneira de 0,840 mm (20 mesh), para caracterização e posteriores etapas de hidrólise enzimática. O fator severidade foi calculado de acordo com a equação descrita por Overend e Chornet, Para a hidrólise enzimática foi utilizado solução tampão de citrato de sódio (50mM, ph 4,8). A atividade enzimática da Celluclast utilizada nas hidrólises foi de 108,82 FPU/mL e da β-glicosidade de 2129,83 UI/mL. A partir dos dados da atividade enzimática foi possível calcular a quantidade de enzima necessária para as hidrólises,

4 utilizando-se 15 FPU/g e 10 UI/g de biomassa, para a Celluclast e β-glicosidade, respectivamente. A hidrólise foi realizada em frascos tampados de 2 L, contendo 100 g de biomassa, 13,784 ml de preparação comercial de enzima Celluclast 1.5 L, 469,5 µl de β-glicosidade, 0,1 g de Azida (para evitar contaminação) e aproximadamente 986 ml de solução tampão tendo no final a relação sólido/líquido de 1:10. Os frascos foram mantidos em mesa incubadora da marca New Brunswick Scientific, modelo Innova 44, à 50ºC e 150 rpm, por 72 horas. Após hidrólise o material foi filtrado à vácuo e o hidrolisado armazenado para análise de carboidratos por HPLC. Também foram realizadas hidrólises com adição de surfactante não iônico (Tween 20) a 1% para o bagaço e palha pré-tratados nas mesmas condições descritas acima porém utilizando uma massa de 3 gramas de biomassa. RESULTADOS E DISCUSSÃO As rampas de aquecimento até as temperaturas desejadas e o posterior resfriamento após as reações estão descritas para a condição de pré-tratamento estabelecida (Figuras 2A e 2B). A partir da integração matemática das curvas das Figuras 2A e 2B foram calculados os fatores severidade para o pré-tratamento de ambas as biomassas. O fator de severidade obtido para a condição de pré-tratamento foi de 4,4 e 5,4 para o bagaço e palha, respectivamente. Um pré-tratamento com índice de severidade entre 0-3 é considerado brando e entre 4-6 considerado severo. Observa-se com os dados de caracterização obtidos para o material pré-tratado que aproximadamente 90% da hemicelulose foram removidos nessa etapa. Silva (2009) descreveu vários pré-tratamentos hidrotérmicos em condições diferentes com os fatores de severidade variando de 4,5 a 5,9 e observou que quanto maior a severidade do prétratamento maior a quantidade de hemicelulose removida. Os resultados analíticos dos componentes do bagaço e palha de cana in natura livre de extrativos e pré-tratado são apresentados nas Tabelas 1 e 2, respectivamente. Os resultados analíticos das matérias-primas corroboram com os reportados por Rocha et al o qual caracterizou quimicamente diferentes amostras de bagaço de cana-deaçúcar e encontrou uma composição média de 43,1% para celulose, 25,2% para hemicelulose e 22,9% para lignina e por Silva, 2009 caracterizou amostras de palha e

5 encontrou uma composição média de 51,09% para celulose, 17% para hemicelulose e 29% para lignina. A B Figura 2. Rampa de aquecimento pré-tratamento para bagaço (2A) e palha (2B) de cana de açúcar. A composição química do bagaço e palha pré-tratados mostrou uma redução maior que 90% da concentração inicial de hemicelulose e consequentemente um aumento na concentração de celulose e lignina, quando comparado com o in natura livre de extrativos resultados estes semelhantes aos encontrados por Silva et al. (2011) para bagaço pré-tratado por processo hidrotérmico e por Oliveira (2012). Tabela 1. Componentes (%) do bagaço de cana-de-açúcar in natura livre de extrativos e pré-tratado. Componente (%) Livre de extrativos Bagaço de cana-de-açúcar Pré-tratado Celulose 41,12 ± 0,22 60,68 ± 0,12 Hemicelulose 27,76 ± 0,16 2,50 ± 0,05 Lignina Total 21,03 ± 0,38 32,06 ± 0,01 Cinzas Totais 4,08 ± 0,02 6,82 ± 0,00 Extrativos 5,16 ± 0,41 - Total 99,16 ± 0,36 102,06 ± 0,16 Foram realizados ensaios de hidrólise enzimática para o material pré-tratado sem e com o surfactante comercial Tween 20 a 1% e os resultados apresentados na tabela 3. Analisando a Tabela 3 observa-se que com a adição do surfactante a conversão de celulose para o bagaço foi aproximadamente 28% superior que do material sem surfactante. O surfactante adsorve a lignina, impedindo que as enzimas sejam inibidas

6 pela mesma, tornando a celulose mais acessível (Eriksson et al., 2002). Para a palha não ocorreu diferença significativa na conversão enzimática após a adição do surfactante. A etapa de pré-tratamento é responsável pela solubilização da hemicelulose, e consequentemente maior acessibilidade das enzimas celulolíticas a celulose. Esses fatores refletem no aumento da conversão de celulose em glicose. Tabela 2. Componentes (%) da palha de cana-de-açúcar in natura livre de extrativos e pré-tratada. Componente (%) Livre de extrativos Palha de cana-de-açúcar Pré-tratada Celulose 34,53 ± 1,64 57,30 ± 0,08 Hemicelulose 32,18 ± 1,18 2,09 ± 0,01 Lignina Total 19,31 ± 1,13 41,26 ± 0,25 Cinzas Totais 0,85 ± 0,00 1,22 ± 0,00 Extrativos 12,81 ± 0,47 - Total 99,68 ± 0,21 101,88 ± 0,15 Tabela 3. Concentração de glicose (g/l) e conversão de celulose (%) no material pré-tratado e pré-tratado mais surfactante. Concentração de Massa(g) baseseca (%) Conversão de celulose Material glicose no hidrolisado (g/l) Bagaço pré-tratado Palha pré-tratada Bagaço pré-tratado + surfactante Palha pré-tratada + surfactante ,48 12,98 23,47 31,23 9,62 47,76 7,01 36,84 A baixa conversão de celulose em glicose do bagaço pré-tratado sem o uso do surfactante pode ser atribuído a menor fator severidade (4,4), quando comparado com o da palha (5,4) o qual proporcionou uma maior conversão. CONCLUSÃO

7 A composição química do bagaço e da palha de cana-de-açúcar empregados neste trabalho foi semelhante às encontradas na literatura. O processo de pré-tratamento removeu mais de 90% da hemicelulose tanto para o bagaço quanto para a palha. O maior fator severidade para a palha proporcionou uma maior conversão de celulose em glicose. O uso de surfactante na etapa de hidrólise enzimática para o bagaço pré-tratado proporcionou um aumento de aproximadamente 28% na conversão de celulose em glicose. Para a palha pré-tratada o uso do surfactante não acresceu significativamente a conversão. REFERÊNCIAS ERIKSSON et al. Mechanism of surfactant effect in enzymatic hydrolysis of lignocellulose. Enzyme and Microbial Technology, v. 31, p , GOUVEIA, E. R. et al. Validação de Metodologia para a Caracterização Química de Bagaço de Cana-deaçúcar. Química Nova, v. 32, n. 6, p , LUIS RICARDO MARTINS OLIVEIRA. Estudo de alternativas de pré-tratamento e hidrólise do bagaço e palha de cana-de-açúcar para obtenção de etanol a partir de celulose. Tese de Doutorado. Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, MARTIN, C. Biorrefinaria Industrial. O Papel, março 2011, p OLIVEIRA et al., Industrial-scale steam explosion pretreatment of sugarcane straw for enzymatic hydrolysis of cellulose for production of second generation ethanol and valueadded products. Bioresource Technology, v. 130, p , OVEREND, R. P.; CHORNET, E. Fractionation of lignocellulosics by steam-aqueous pretreatments. Philosophical Transactions for the Royal Society of London. Series A, Mathematical and Physical SicencesPhilos, v. 321, p , ROCHA, G. J. M.; MARTIN, C.; VINÍCIUS F. N. DA SILVA; EDGARDO G. OLIVAREZ; ADILSON R. GONÇALVES. Mass balance of pilot-scale pretreatment of sugarcane bagasse by steam explosion followed by alkaline delignification. Bioresource Technology, v. 111, p , RUBIN, E. M. Genomics of cellulosic biofuels. Nature, v. 454, n. 14, p , SINDAÇÚCAR, Comparativo da produção sucroalcooleira nos estados Norte/Nordeste safra 2012/2013. Disponível em < Acessado: 11/11/2012. VINICIUS FERNANDES NUNES DA SILVA. Estudos de pré-tratamento e sacarificação enzimática de resíduos agroindústrias como etapas nos processos de obtenção de etanol celulósico. Dissertação de mestrado. Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, 2011.

8 SILVA et al. Fermentation of cellulosic hydrolysates obtained by enzymaticsaccharification of sugarcane bagasse pretreated by hydrothermal processing. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, v. 38, n. 7, p , SUN, Y.; CHENG, J. Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review. Bioresource Technology, v. 83, p. 1 11, 2002.