NEMATOLOGIA BRASILEIRA - V. 33 N

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1 NEMATOLOGIA BRASILEIRA - V. 33 N Efeito da Aplicação de Nematoides Entomopatogênicos sobre Frutos Infestados com Broca-do-café, Hypothenemus hampei (Coleoptera: Scolytidae) - Juan Pablo Molina- Acevedo & Juan Carlos López-Núñez Fungos Nematófagos em Pomares de Citros nos Estados de São Paulo e Goiás - Paulo R.P. Martinelli1, Jaime M. Santos, Samuel J. Sant Anna & Pedro L.M. Soares Controle de Meloidogyne javanica pelo Uso de Bactérias Isoladas de Solo Biofumigado com Resíduos de Diferentes Espécies de Brássicas - Wânia S. Neves, Leandro G. Freitas, Maurício D. Costa, Vanessa S. Almeida & Silamar Ferraz Cultivo e Incorporação de Leguminosas, Gramíneas e Outras Plantas no Controle de Meloidogyne incognita Raça 1 em Cenoura Nantes - João M. Charchar, Jairo V. Vieira, Valter R. Oliveira & Antônio W. Moita Penetração, Desenvolvimento e Reprodução de Meloidogyne incognita Raça l e M. javanica em Cultivares de Batata no Campo - João M. Charchar, Valter R. Oliveira & Antônio W. Moita Effect of Soil Temperature on the Life Cycle of Meloidogyne chitwoodi Races 1 and 2 and M. hapla on Russet Burbank Potato - João M. Charchar & Gerald S. Santo Incorporação de Farinha de Sementes de Mamão (Carica papaya L.) para o Controle de Meloidogyne javanica - Marcelo M. Coutinho, Leandro G. Freitas, Wânia S. Neves, Rosangela Dallemole-Giaretta, Silamar Ferraz, Everaldo A. Lopes & Rosângela D.L. Oliveira Controle de Meloidogyne javanica com Pochonia chlamydosporia e Farinha de Sementes de Mamão - Marcelo M. Coutinho2, Leandro G. Freitas, Rosangela Dallemole-Giaretta, Wânia S. Neves, Everaldo A. Lopes & Silamar Ferraz Estimativa do Impacto Econômico e Social Direto de Meloidogyne mayaguensis na Cultura da Goiaba no Brasil - Fernando O.M. Pereira, Ricardo Moreira de Souza, Paulo M. Souza, Claudia Dolinski & Grace K. Santos Ocorrência de Meloidogyne mayaguensis em Goiabeira no Estado do Tocantins - João M. Charchar, Maria Esther N. Fonseca, Leonardo S. Boiteux & Artur F. Lima Neto Primeiro Relato da Ocorrência de Meloidogyne paranaensis em Cafeeiro no Estado de Goiás - Rodrigo V. Silva, Rosângela D.L. Oliveira & Laércio Zambolim Atividade Nematófaga de Pochonia chlamydosporia em Solo Natural ou Autoclavado sobre Meloidogyne javanica - Guilherme S. Podestá, Rosangela Dallemole-Giaretta, Leandro G. Freitas, Everaldo A. Lopes, Silamar Ferraz & Ronaldo J.F. Zooca Observations on the Life Cycle and Pathogenicity of Heterorhabditis amazonensis (Rhabditida: Heterorhabditidae) - Vanessa Andaló, Grazielle F. Moreira, Ricardo S. Cavalcanti & Alcides Moino Jr Reação de Gramíneas e Leguminosas a Meloidogyne mayaguensis - Keyla C. Silva & Gilson S. Silva

2 NEMATOLOGIA BRASILEIRA - V. 33 N Effect of applicaton of entomopathogenic nematodes on infested fruits with coffee berry borer, Hypothenemus hampei (Coleoptera: Scolytidae) - Juan Pablo Molina-Acevedo & Juan Carlos López-Núñez Nematophagous fungi from citrus orchards in São Paulo and Goiás States - Paulo R.P. Martinelli1, Jaime M. Santos, Samuel J. Sant Anna & Pedro L.M. Soares Control of Meloidogyne javanica through the use of bacteria isolated from biofumigated soil with residues of different species of Brassicaceae - Wânia S. Neves, Leandro G. Freitas, Maurício D. Costa, Vanessa S. Almeida & Silamar Ferraz Cultivation and incorporation of legumes, gramineous, and other plants to control Meloidogyne incognita race 1 on carrot Nantes - João M. Charchar, Jairo V. Vieira, Valter R. Oliveira & Antônio W. Moita Penetration, development, and reproduction of Meloidogyne incognita race l and M. javanica on potato cultivars in the field - João M. Charchar, Valter R. Oliveira & Antônio W. Moita * Effect of Soil Temperature on the Life Cycle of Meloidogyne chitwoodi Races 1 and 2 and M. hapla on Russet Burbank Potato - João M. Charchar & Gerald S. Santo Incorporation of papaya (Carica papaya L.) seed flour for the control of Meloidogyne javanica - Marcelo M. Coutinho, Leandro G. Freitas, Wânia S. Neves, Rosangela Dallemole-Giaretta, Silamar Ferraz, Everaldo A. Lopes & Rosângela D.L. Oliveira Control of Meloidogyne javanica by Pochonia chlamydosporia and papaya seed flour - Marcelo M. Coutinho2, Leandro G. Freitas, Rosangela Dallemole-Giaretta, Wânia S. Neves, Everaldo A. Lopes & Silamar Ferraz Estimate of the economical and social impact of Meloidogyne mayaguensis onto the guava crop in Brazil - Fernando O.M. Pereira, Ricardo Moreira de Souza, Paulo M. Souza, Claudia Dolinski & Grace K. Santos Occurrence of Meloidogyne mayaguensis on guava in Tocantins State, Brazil - João M. Charchar, Maria Esther N. Fonseca, Leonardo S. Boiteux & Artur F. Lima Neto First record of Meloidogyne paranaensis on coffee plants in Goiás State, Brazil - Rodrigo V. Silva, Rosângela D.L. Oliveira & Laércio Zambolim Nematophagous activity of Pochonia chlamydosporia into natural and autoclaved soil on Meloidogyne javanica - Guilherme S. Podestá, Rosangela Dallemole-Giaretta, Leandro G. Freitas, Everaldo A. Lopes, Silamar Ferraz & Ronaldo J.F. Zooca * Observations on the Life Cycle and Pathogenicity of Heterorhabditis amazonensis (Rhabditida: Heterorhabditidae) - Vanessa Andaló, Grazielle F. Moreira, Ricardo S. Cavalcanti & Alcides Moino Jr Reaction of grasses and legumes to Meloidogyne mayaguensis - Keyla C. Silva & Gilson S. Silva (* : with full text in English)

3 ARTIGO Efeito da Aplicação de Nematoides Entomopatogênicos sobre Frutos Infestados com Broca-do-café, Hypothenemus hampei (Coleoptera: Scolytidae) Efeito da Aplicação de Nematoides Entomopatogênicos sobre Frutos Infestados com Broca-do-café, Hypothenemus hampei (Coleoptera: Scolytidae) Juan Pablo Molina-Acevedo 1 * & Juan Carlos López-Núñez 2 * 1 Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria, Corpoica km 13 vía Montería-Cereté, Córdoba, Colômbia. 2 Disciplina de Entomologia, Centro Nacional de Investigaciones de Café (Cenicafé), A.A 2427 Manizales, Colômbia. *Autores para correspondência: jpmolina@corpoica.org.co, juancarlos.lopez@cafedecolombia.com Recebido para publicação em 13 / 11 / Aceito em 31 / 07 / 2008 Editado por Regina Carneiro e Mário Inomoto Resumo Molina, J.P. & J.C. López Efeito da aplicação de nematoides entomopatogênicos sobre frutos infestados com broca-do-café, Hypothenemus hampei (Coleoptera: Scolytidae). A broca-do-café, Hypothenemus hampei (Ferrari), é o inseto praga mais importante da cultura do café e ocorre em quase todos os países produtores. Dentre os seus controladores biológicos, destacam-se os parasitóides, porém os nematoides entomopatogênicos podem ser outra alternativa dentro do manejo integrado de pragas. Esta pesquisa teve por objetivo avaliar a penetração e a letalidade de juvenis infectantes (JI) pertencentes a duas espécies de nematoides: Heterorhabditis bacteriophora e Steinernema feltiae (Rhabditida: Steinernematidae e Heterorhabditidae), aplicados nas dosagens de cinco, 25, 125 e 625 JIs por fruto infestado com H. hampei. As variáveis avaliadas foram: índice de penetração no fruto e percentagem de mortalidade da broca. Essas variáveis foram avaliadas 168 horas depois da aplicação dos nematoides sobre os frutos infestados por H. hampei. Nas altas dosagens de 125 e 625 JIs por fruto, para as duas espécies de nematoides, foram obtidos os maiores índices de penetração, 18,7 e 15,0 %, respectivamente. Esses resultados foram diferentes (P 0,05) daqueles apresentados nas dosagens iguais a 25 e cinco JIs que apresentaram 5,2 e 0,7 % de penetração, respectivamente. Da mesma forma nas altas dosagens, 125 e 625 JIs por fruto, aconteceram as maiores mortalidades, 49,6 e 50,9 % respectivamente. Quanto à espécie de nematoide, H. bacteriophora provocou maior mortalidade média em todas as dosagens, 46,9 %. Esse resultado diferiu estatisticamente (P 0,05) da mortalidade causada por S. feltiae, que foi de 28,8 %. Estes resultados demonstram que os ambos os nematoides, mas principalmente H. bacteriophora, penetram frutos de café e causam a morte da broca. Portanto, estudos futuros devem ser efetuados para a utilização dos nematoides no controle de H. hampei em frutos caídos no solo. Palavras-chaves: nematoide entomopatogênico, praga do café, Steinernema feltiae, Heterorhabditis bacteriophora, controle microbiano. Summary - Molina, J.P. & J.C. López Effect of applicaton of entomopathogenic nematodes on infested fruits with coffee berry borer, Hypothenemus hampei (Coleoptera: Scolytidae). The coffee berry borer (CBB), Hypothenemus hampei (Ferrari), is the most important pest of almost all coffee producing countries. Parasitoids of CBB have been intensively studied as the main biological control agents; however another alternative for the integrated management is the use of entomopathogenic nematodes. The objective of this investigation was to evaluate the penetration and lethality of Heterorhabditis bacteriophora and Steinernema feltiae (Rhabditida: Heterorhabditidae and Steinernematidae), applied in four concentrations of infective juveniles (IJs) (5, 25, 125 and 625 per fruit), on fruits infested with CBB. The evaluated variables were: index of penetration into the fruit and percentage of mortality of the borer verified 168 hours after the application of the nematodes. In the concentrations 125 and 625 IJs / fruit, for both nematodes, the indexes of penetration were 18.7 and 15.0 %, which differed (P 0.05) from those obtained with the lower concentrations (5.2 % for Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 115

4 Juan Pablo Molina-Acevedo & Juan Carlos López-Núñez 25 IJs / fruit and 0.7 % for 5 IJs / fruit). Likewise, higher concentrations of nematodes were associated with higher mortality of CBB (49.6 and 50.9 %). Considering the nematode species, H. bacteriophora caused higher average mortality (46.9 %), differing from S. feltiae (28.8 %). These results proved that IJs of both species, but mainly H. bacteriophora, penetrated coffee berries and causes CBB death. Therefore, future investigations should be carried out in order to evaluate the control of CBB in fruits that fall on the soil. Key words: enthomopathogenic nematode, coffee pest, Steinernema feltiae, Heterorhabditis bacteriophora, microbial control. Introdução A broca-do-café, Hypothenemus hampei, é considerada a praga mais importante da cafeicultura mundial, sendo encontrada em praticamente todas as regiões produtoras. Essa praga é caracterizada por atacar diretamente o fruto, causando perda de massa, depreciação do grão e perda na qualidade da bebida (Bustillo et al.,1998; Cure et al., 1998; Bustillo, 2002). Estudos realizados no Centro Nacional de Investigações de Café (Cenicafé) da Colômbia demonstram aumento populacional das brocas dentro dos frutos de café que caem no solo. Nos períodos das chuvas, os adultos da praga emergem e se dispersam pelo cafezal, infestando novos frutos (Baker, 1999; Bustillo, 2006; Castaño et al., 2005). De acordo com Okumura et al. (2003), uma das formas de controlar a broca sem a utilização do controle químico é a adoção do controle biológico e controle comportamental. Porém, os métodos utilizados para o manejo integrado da broca em frutos caídos no solo, que são os inseticidas e os fungos entomopatogênicos, têm se mostrado ineficientes até o momento, já que não conseguem controlar a praga no interior do fruto, pois esta possui hábito críptico. Neste sentido, os nematoides entomopatogênicos (NEPs), como controladores de pragas de solo e de hábito críptico, constituem-se em agentes potenciais para o controle da broca, sendo os únicos agentes biológicos que poderiam controlar a praga no interior do fruto (Baker, 1999). Os NEPs têm sido considerados como inimigos naturais da praga (Commonwealth Institute of Biological Control, 1990; Georgis & Hom, 1992), porém somente com registros de ocorrência natural. O primeiro desses registros se deu na Índia, onde Varaprasad et al. (1994) encontraram o nematoide Panagrolaimus sp. (Panagrolaimidae) infectando adultos de H. hampei. O segundo registro foi no México, onde a ocorrência do parasitismo foi comprovada em frutos de café caídos no solo e cujo nematoide foi identificado como Sphaerulariopsis sp. (Tylenchida: Sphaerularioidea) (Castillo & Barrera, 1998; Castillo et al., 2002). Finalmente, Methaparasitilenchus hypothenemi (Allantonematidae) (Poinar Jr. et al., 2004) foi registrada parasitando fêmeas de H. hampei. Com relação ao efeito patogênico de espécies das famílias Heterorhabditidae e Steinernematidae sobre a broca do café, destaca-se o trabalho de Allard & Moore (1989), em que foi evidenciado o efeito de Steinernema carpocapsae e Heterorhabditis bacteriophora sobre larvas e adultos. Posteriormente, foi registrado o efeito em laboratório de S. glaseri, S. feltiae, S. carpocapsae e H. bacteriophora sobre adultos da broca (Lubego, 1992; Castillo & Marbán, 1996). Na América Latina são escassos os trabalhos sobre o uso potencial de NEPs para o controle da broca (Giraldo, 2003; Castillo Del, 2004). Molina & López (2002) verificaram que H. bacteriophora e S. feltiae diferenciam-se entre si por serem atraídos por diferentes estados de desenvolvimento do fruto com broca. Não se verificou-se efeito de três classes texturais do solo (arenosa, franca e franco arenosa) no deslocamento dos nematoides até o fruto. Em frutos secos e maduros caídos nos três tipos de solo, os nematoides foram capazes de entrar pelo orifício de perfuração feito pela broca, parasitar diferentes estádios da broca e multiplicar no interior dos estádios. Posteriormente, Molina & López (2003) descreveram o comportamento destes nematoides em condições de laboratório, obtendo resultados que comprovaram comportamento diferencial das duas espécies (Molina & López, 2003). O presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de diferentes dosagens de H. bacteriophora e S. 116 Vol. 33(2)

5 Efeito da Aplicação de Nematoides Entomopatogênicos sobre Frutos Infestados com Broca-do-café, Hypothenemus hampei (Coleoptera: Scolytidae) feltiae, aplicadas sobre a superfície de frutos brocados em condições de laboratório, no deslocamento dos NEPs sobre frutos e na sua capacidade em penetrar nos frutos e causar a morte da broca-do-café. Material e Métodos O experimento foi realizado no Centro Nacional de Investigações de Café Pedro Uribe Mejía (Cenicafé), localizado no município de Chinchiná, Caldas, Colômbia, em altitude de m. As espécies de nematoides avaliadas no experimento foram Steinernema feltiae UK strain (Rhabditida: Steinernematidae), formulação comercial Nemasys, e Heterorhabditis bacteriophora (Rhabditida: Heterorhabditidae). Essas espécies foram fornecidas pelos Drs. Bernard Briscoe e William Hominick do CABI (Centre for Agriculture and Biosciences International, CABI Biosciences, Lane, Egham-Surrey, Inglaterra). Todas as espécies foram multiplicadas em larvas da Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) de acordo com a metodologia descrita por Molina & López (2001) e mantidas em laboratório a 12 ± 2 C. Os frutos de café utilizados foram da cultivar Colômbia e com idade fisiológica de 260 dias de desenvolvimento. Esses frutos foram expostas à broca na relação de três brocas adultas por fruto durante 30 dias. Ao final do período, os frutos encontravam-se com 290 dias, correspondente ao estádio de frutos secos. Foram utilizados frutos com no máximo de duas perfurações causadas pela broca, que foram esterilizados superficialmente com NaOCl a 0,05 %. A unidade experimental (UE) foi uma placa-de-petri de 9 cm de diâmetro; no centro dessa foi colocada uma base que sustentou um fruto seco de café infestado (Figura 1). Cada espécie de NEP foi testada em quatro dosagens (cinco, 25, 125 e 625 JIs por fruto), que foram diluídas em 35 ml de água destilada estéril (ADE) com 0,5 % de Tween 80 e aplicadas diretamente sobre o fruto. Como testemunha, aplicou-se uma gota de 35 ml de ADE sem NEPs nos frutos. O bioensaio foi composto por uma bandeja de plástico (24 x 15 x 12 cm), sobre a qual foram colocadas cinco UEs dispostas de forma aleatória. Essas bandejas plásticas foram seladas e mantidas em sala climatizada e sob condições assépticas, em escuridão constante, em temperatura de 24 ºC durante 168 horas. Ao final desse tempo de incubação, realizouse lavagem superficial dos frutos com água destilada (AD) para eliminar os nematoides que não penetraram. Posteriormente foram realizadas consecutivas dessecações e lavagens com AD nos frutos. Finalmente, com auxílio de câmara de contagem de nematoides, contabilizou-se o número de JIs que conseguiram penetrar o fruto. Todos os diferentes estádios Aplicação de JI Orifício Fruto Base Figura 1 - Modelo da unidade experimental. Placa de Petri Diâmetro 9cm Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 117

6 Juan Pablo Molina-Acevedo & Juan Carlos López-Núñez biológicos da broca (larva, pupa e adulto), tanto vivos como mortos, foram separados em placas-de-petri com papel filtro seco, onde inicialmente verificou-se sintomatologia por infecção de NEPs. Posteriormente, abriram-se brocas em todos os estádios, realizando lavagem com solução Ringer, para verificar se existiu parasitismo por NEPs, e registrar a presença de JIs e dos outros estádios do ciclo de vida do nematoide em formação na broca (J 4, machos e fêmeas para S. feltiae; J 4 e adultos hermafroditas para H. bacteriophora). Utilizou-se delineamento inteiramente ao acaso, em esquema fatorial 2 x 4, com duas espécies de nematoides, quatro dosagens de JIs e uma testemunha (ADE sem nematoide) constituindo nove tratamentos, cada um com quinze repetições. As variáveis avaliadas foram; índice de penetração de nematoides no fruto de café (IPF) e percentagem de mortalidade (PM), que foi corrigida pelos valores de mortalidade apresentados pela população testemunha (PMC). Com isso obtiveram-se valores reais de mortalidade dos diferentes estádios da broca-do-café mortos no interior do fruto por efeito direto dos NEP. Essas variáveis estão descritas abaixo: Índice de penetração no fruto (IPF), obtido pela relação entre o número de JIs encontrados dentro do fruto depois de 168 horas e o número de JIs iniciais aplicados por tratamento: IPF = (n o. de JIs dentro do fruto x 100) / (n o. de JIs aplicados) Percentagem de mortalidade (PM), determinada com base na relação entre o número de indivíduos de broca em diferentes estádios mortos (larvas, pupas e adultos) por parasitismo dos nematoides e o número total de indivíduos de broca (vivos e mortos) em diferentes estádios da praga presentes dentro do fruto: PM = (n o. de indivíduos mortos de broca dentro do fruto x 100) / (n o. total de indivíduos de broca dentro do fruto) Após a determinação da PM em cada tratamento e na testemunha, foi calculada a percentagem de mortalidade corrigida (PMC) para os tratamentos, levando em consideração a percentagem de mortalidade na testemunha: PMC = [(PM do tratamento PM da testemunha) x 100] / (100 PM da testemunha) Foram calculadas as médias e a variação do IPF e de PMC e realizou-se uma análise de variância (ANOVA). Aplicou-se uma prova de contraste ao nível de 5 %. Quando a interação simples entre os fatores dos tratamentos avaliados por variável foi significativa, aplicou-se a prova de comparação de médias pelo teste de Tukey ao nível de 5 %. Os dados foram transformados pela fórmula TD = ( (X 5) ) 5 + para as variáveis IPF e PMC. Resultados e Discussão Em geral, o deslocamento dos JIs, a penetração pelo orifício de perfuração do fruto e o parasitismo nos estádios da broca pelas espécies de nematoides foram proporcionais às dosagens. Os JIs formaram vários grupos em seu caminho na busca do orifício de perfuração do fruto. Depois de 168 horas, foi encontrado um grupo de JIs que permaneceu sobre o fruto, ainda apresentando mobilidade. Outra parte dos JIs foi encontrada nas galerias no interior do fruto, em menor quantidade, onde os primeiros JIs penetraram rapidamente a broca, evento que se deu para ambas as espécies de nematoides em todas as dosagens. No tratamento S. feltiae cinco JIs / fruto, não foram encontrados JIs no fruto, mas ocorreu a penetração nos diferentes estádios da broca do café. O maior número de JIs que se deslocou e penetrou foi obtido principalmente nas maiores dosagens avaliadas (125 e 625 JIs) para ambas as espécies de NEPs, com valores máximos de 104 e 202 JIs por fruto para o H. bacteriophora e S. feltiae, respectivamente, na dosagem mais elevada (Tabela 1). Os JIs deslocaram-se através das galerias e câmaras de oviposição, provavelmente atraídos pelos voláteis emitidos pelo fruto e os estádios biológicos da praga. Portanto, confirmou-se que os estádios biológicos da broca-do-café no interior do fruto e mesmo o fruto são fatores de atração dos NEPs, já que ambas as espécies se deslocaram pela superfície do fruto e penetraram pelo orifício de perfuração da broca. De acordo com Castillo & Marbán (1996), com base em ensaios realizados em condições de laboratório, os JIs conseguem localizar os estádios biológicos da broca dentro do fruto, acontecendo o desenvolvimento completo do ciclo de vida dos NEPs nestes estádios, quando é aplicada uma alta dosagem de JIs de S. feltiae. Da mesma forma, JIs da espécie H. bacteriophora apresentaram alta capacidade de deslocamento no 118 Vol. 33(2)

7 Efeito da Aplicação de Nematoides Entomopatogênicos sobre Frutos Infestados com Broca-do-café, Hypothenemus hampei (Coleoptera: Scolytidae) interior do fruto, em bioensaios realizados em condições de laboratório (Allard & Moore, 1989; Castillo & Marbán, 1996). Para a variável IPF, a análise de variância mostrou diferenças (P 0,05) em relação às dosagens de JIs, pois as maiores (125 e 625 JI) apresentaram médias de 18,68 e 15,04 % independentemente da espécie de NEPs avaliada (Tabela 2). Por outro lado, as espécies de NEPs avaliadas não apresentaram diferenças estatísticas no IPF. Para a variável PMC, a ANOVA não mostrou efeito da interação dosagens por NEPs, entretanto mostrou diferenças nas dosagens médias. Nas maiores dosagens (125 e 625 JIs), a variável PMC foi mais elevada que nas dosagens de 5 e 25 JIs (Tabela 3), resultado que evidencia uma relação direta entre as variáveis IPF e PMC, com maior número de JIs dentro fruto causando maior mortalidade da broca. Porém, mesmo na dosagem de cinco JIs, alguns estádios imaturos da broca foram parasitados e mortos por S. feltiae, demonstrando que, embora a quantidade de inóculo tenha sido baixa, foi suficiente para matar parte da população de brocas. No caso, os JIs parasitaram e mataram principalmente as larvas da broca (Figura 2). Comprovou-se, portanto, a alta virulência desses NEPs, principalmente de H. bacteriophora (Tabela 3). Nas condições experimentais utilizadas, H. bacteriophora foi superior a S. feltiae em relação à busca pelo hospedeiro e letalidade (Tabela 3), portanto apresenta maior potencial para ser utilizado no Tabela 1 - Médias, máximos e mínimos de JIs encontrados nos frutos. Nematoides S. feltiae H. bacteriophora Dosagens Média Máximo Mínimo Média Máximo Mínimo 5 JI , JI 0, , JI 17, , JI 135, , Tabela 2 - Médias e variação para a variável IPF (índice de penetração no fruto). Nematoides Dosagens S. feltiae H. bacteriophora Média dosagens (%) Média (%) EE Média (%) EE Média (%) EE 5 JI 0 0 1,33 0,97 0,67 c 0,22 25 JI 2,93 1,91 7,47 2,23 5,2 b 1, JI 13,97 0,46 23,36 2,75 18,68 a 2, JI 21,61 1,69 8,46 0,73 15,04 a 2,15 Média nematoides (%) 9,63 A 10,15 A EE 1,97 2,16 Médias seguidas da mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na linha, para a mesma variável, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P 0,05). Tabela 3 - Médias e variação para a variável PMC (percentagem de mortalidade corrigida). Nematoides Dosagens S. feltiae H. bacteriophora Média dosagens (%) Média (%) EE Média (%) EE Média (%) EE 5 JI 14,22 0,87 24,85 1,47 19,53 c 1,75 25 JI 17,63 1,86 45,24 3,15 31,43 b 1, JI 42,88 4,04 56,27 2,24 49,57 a 3, JI 40,58 2,37 61,16 5,94 50,87 a 2,28 Média nematoides (%) 28,83 B 46,88 A EE 2,17 2,96 Médias seguidas da mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na linha, para a mesma variável, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P 0,05). Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 119

8 Juan Pablo Molina-Acevedo & Juan Carlos López-Núñez Figura 2 - Sintomatologia e desenvolvimento de Steinernema feltiae em larvas L1 (a), L2 e pupas de Hypothenemus hampei (b). Figura 3 - Sintomatologia e desenvolvimento de Heterorhabditis bacteriophora em larvas L1, L2 pupas (a,b) e adultos não melanizados de Hypothenemus hampei (c). Figura 4 - Consumo de reservas em larvas L2 por Steinernema feltiae. 120 Vol. 33(2)

9 Efeito da Aplicação de Nematoides Entomopatogênicos sobre Frutos Infestados com Broca-do-café, Hypothenemus hampei (Coleoptera: Scolytidae) controle da broca, em aplicação sobre frutos infestados A alta infecção encontrada nos diferentes estádios da broca dentro do fruto confirmou sua suscetibilidade às NEPs. A sintomatologia típica causada por S. feltiae em larvas L1 foi observada. Passaram a apresentar coloração amarela (Figura 2a) e permitiram o desenvolvimento completo do nematoide; a seguir ocorreu a completa decomposição dos tecidos internos de L1, L2 e pupas de broca (Figura 2b). Da mesma forma, foi observada sintomatologia típica do H. bacteriophora em larvas L1, L2, pré-pupas e pupas (Figura 3a,b - cor variando entre laranja a vermelho) e em adultos não melanizados (Figura 3c cor vermelha). Em adultos melanizados de H. hampei, devido à cutícula escura, não se evidenciou alteração de cor. Os adultos de broca afetados por H. bacteriophora apresentaram separação dos segmentos do corpo, dos quais emergiram os JI, tal como o registrado Molina & López (2002). De acordo com Castillo & Marbán (1996), o intumescimento e destruição do corpo do inseto são devidos à ação exercida pela bactéria simbionte associada aos nematoides e à ação mecânica dos JI na saída do inseto. Quanto à sintomatologia em adultos não melanizados, a infecção por S. feltiae não causou mudanças na coloração, nem foi evidente a presença de JIs desenvolvidos. Em estudos realizados em laboratório aplicando diretamente JIs de H. bacteriophora em broca-do-café, verificou-se desenvolvimento dos nematoides em adultos, pupas e larvas da praga (Allard & Moore, 1989; Castillo & Marbán, 1996; Molina & López, 2003). O completo desenvolvimento de H. bacteriophora, incluindo multiplicação e emergência em todos os estádios biológicos da praga, indica que o fruto brocado de café proporciona condições favoráveis à esse NEP, confirmando sua potencialidade para o controle da praga remanescente em frutos do solo. Por outro lado, S. feltiae somente desenvolveu-se até atingir o estádio adulto, em larvas L1, L2 e pupas da broca, e até consumir as reservas do inseto, mas sem multiplicação nas maiores dosagens, o que restringe seu uso em baixas dosagens para o controle da praga (Figura 4). Os presentes resultados demonstraram que a aplicação direta de NEPs sobre frutos infestados com broca exerce um papel importante na regulação de populações da praga, já que os JIs penetram os estádios biológicos da praga, parasitando-os. Isso confirma os trabalhos feitos por Molina & López (2003), em que JI de H. bacteriophora conseguiu se deslocar por uma barreira física e depois atingir o fruto, parasitando as pupas e adultos não melanizados da broca. Mais estudos são necessários para conhecer e explorar os NEPs como ferramentas de controle biológico da broca-do-café, pois são necessárias informações sobre: (a) sistema de aplicações; (b) frequência e dosagens das aplicações - para determinação do momento oportuno das aplicações; (c) interação com outros agentes entomopatogênicos; (d) desenvolvimento de formulações - para permitir maior permanência do nematoide no campo. O desenvolvimento de formulações deverá ter estreito vínculo com a contínua descoberta e uso de nematoides nativos, para preservar a biodiversidade da região, além de aproveitar sua adaptação ao ambiente, principalmente ao clima e ao solo. Agradecimentos Os autores agradecem à Federación Nacional de Cafeteros de Colômbia, ao Centro Nacional de Investigaciones de Café (Cenicafé) e ao Colciencias pelo financiamento do trabalho; à bióloga Viviane Araujo Dalbon [Universidade Estadual Norte Fluminense, Campos (RJ) Brasil] e ao Dr. Hamilton Gomes de Oliveira (EPAMIG, estado de Minas Gerais) pelos aportes e pela revisão em português do manuscrito. Literatura Citada ALLARD, G.B. & D. MOORE Heterorhabditis spp. nematodes as control agents for coffee berry borer Hypothenemus hampei (Scolytidae). Journal of Invertebrate Pathology, 54 (1): BAKER, P.S La broca del café en Colombia (informe final del proyecto MIB para el café DFID CENICAFE CABI Bioscience). Chinchiná - Colômbia, 154 p. BUSTILLO, A.E., M.R. CARDENAS, G.D. VILLALBA, M.P BENAVIDES, H.J. OROZCO. & F.J. POSADA Manejo Integrado de la Broca del Café Hypothenemus hampei (Ferr.) en Colombia. Cenicafé, Chinchiná - Colômbia, 127 p. Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 121

10 Juan Pablo Molina-Acevedo & Juan Carlos López-Núñez BUSTILLO, A.E El Manejo de Cafetales y su Relación con el Control de la Broca del Café en Colombia. FNC - Cenicafé, Chinchiná - Colômbia, 40 p. (Boletín Técnico n.. 24). BUSTILLO, A.E Una revisión sobre la broca del café Hypothenemus hampei (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae), en Colombia. Revista Colombiana de Entomología, 32 (2): CASTAÑO, A., P. BENAVIDES. & P.S. BAKER Dispersión de Hypothenemus hampei en cafetales zoqueados. Revista Cenicafé, 56 (2): CASTILLO, A. & M.N. MARBÁN Evaluación en laboratorio de nematodos Steinernematidos y Heterorhabditidos para el control biológico de la broca del café, Hypothenemus hampei Fer. Nematropica, 26: CASTILLO, A. & J.F. BARRERA Primer registro de nematodo parasitando a la broca del café en cafetales de México. In: REUNIÓN INTERCONTINENTAL SOBRE BROCA DEL CAFÉ, II, Tapachula (Chiapas) México, p. 47. CASTILLO, A., F. INFANTE., J.F. BARRERA., L. CARTA. & F.E. VEGA First field report of a nematode (Tylenchida: Spherurlarioidea) attacking the coffee berry borer, Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera: Scolytidae) in the Americas. Journal of Invertebrate Pathology, 79: CASTILLO R., J.A. DEL Evaluación de mezclas de entomopatógenos para el control de poblaciones de broca en el suelo. (Tesis: Ingeniero Agrónomo). Facultad de Ciencias Agrícolas - Universidad de Nariño, Pasto (Nariño) Colômbia. 97 p. COMMONWEALTH INSTITUTE OF BIOLOGICAL CONTROL Control biológico de la broca de la cereza del cafeto. In: Manual de Capacitación de Control Biológico. Cenicafé, Chinchiná - Colômbia, p CURE, J.R., R.H.S. SANTOS, J.C. MORAES, E.F. VILELA. & A.P. GUTIERREZ Fenologia e dinâmica populacional da broca-do-café Hypothenemus hampei (Ferrari, 1876) relacionadas às fases de desenvolvimento do fruto. In: ANAIS DA SOCIEDADE ENTOMOLOLÓGICA DO BRASIL, XXVII, Jaboticabal. p GEORGIS, R. & A. HOM Introduction of entomopathogenic nematode products into Latin America and the Caribbean. Nematropica, 22: GIRALDO G., D.P Comportamiento de entomonematodos en el control de poblaciones de broca en árboles de café. (Tesis: Ingeniero Agrónomo). Facultad de Ciencias Agropecuarias - Universidad de Caldas, Manizales - Colômbia, 83 p. LUBEGO, S The use of four Rhabditid Nematode species in the control of Cosmopolites sordidus, Hypothenemus hampei and Cylas puncticollis. (Thesis: M.Sc. in Technology of Crop Protection). Department of Agriculture - University of Reading, Reading - UK, 111 p. MOLINA, J.P. & J.C. LÓPEZ Producción in vivo de tres entomonematodos con dos sistemas de infección en dos hospedantes. Revista Colombiana de Entomología, 27: MOLINA, J.P. & J.C. LÓPEZ Desplazamiento y parasitismo de los entomonematodos Steinernema feltiae (Rhabditida: Steinernematidae) y Heterorhabditis bacteriophora (Rhabditida: Heterorhabditidae) hacia frutos infestados con la broca del café Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera: Curculionidae). Revista Colombiana de Entomología, 28: MOLINA, J.P. & J.C. LÓPEZ Supervivencia y parasitismo de nematodos entomopatógenos para el control de Hypothenemus hampei (Coleoptera: Curculionidae) en frutos de café. Boletín de Sanidad Vegetal Plagas, 29: OKUMURA, K.A.S., O.J.P. NEVES., A.F. POSSAGNOLO., R.V. CHOCOROSQUI. & P.H. SANTORO Controle da broca-do-café (Hypothenemus hampei) FERRARI em terreiros de secagem de café. Semina - Ciências Agrárias, Londrina, 24 (2): POINAR, G.O. Jr., F.E VEGA, CASTILLO, A., I.E. CHAVEZ & F. INFANTE Metaparasitylenchus hypothenemi N. Sp (Nematoda: Allantonematidae), a parasite of the coffee berry borer, Hypothenemus hampei (Curculionidae: Scolytinae). Journal of Parasitology, 90 (5): VARAPRASAD, K.S., S. BALASUBRAMANIAN, B.J. DIWAKAR. & C.V.R. RAMA First report of an entomogenous nematode, Panagrolaimus sp., from coffeeberry borer, Hypothenemus gampei (Ferrari) from Karnataka, India. Plant Protection Bulletin, 46: Vol. 33(2)

11 ARTIGO Fungos Nematófagos em Pomares de Citros nos Estados de São Paulo e Goiás* Fungos Nematófagos em Pomares de Citros nos Estados de São Paulo e Goiás* Paulo R.P. Martinelli 1 **, Jaime M. Santos 1, Samuel J. Sant Anna 2 & Pedro L.M. Soares 1 *Parte da Dissertação de Mestrado do primeiro autor. 1 Departamento de Fitossanidade, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias Universidade Estadual Paulista (FCAV UNESP), Jaboticabal (SP) Brasil 2 Graduando em Agronomia, Universidade Federal de Viçosa. **Autor para correspondência: prpmartinelli@yahoo.com.br Recebido para publicação em 02 / 02 / Aceito em 11 / 10 / 2008 Editado por Guilherme Asmus Resumo Martinelli, P.R.P., J.M. Santos, S.J. Sant Anna & P.L.M. Soares Fungos nematófagos em pomares de citros nos Estado de São Paulo e Goiás. Trinta e nove amostras de pomares de citros dos Estados de São Paulo e Goiás, todos infestados por Tylenchulus semipenetrans e/ou por Pratylenchus jaehni, foram analisadas quanto à presença de fungos nematófagos. Em 68,4 % das amostras foram encontrados fungos predadores de nematoides. As principais espécies fúngicas isoladas pertencem ao gênero Arthrobotrys, sendo a frequência de Arthrobotrys robusta de 23,7 % nas amostras, A. musiformis 18,4 %, A. oligospora 10,5 % e A. conoides 5,2 %. As espécies Monacrosporium elegans, M. eudermatum, Dactyllela leptospora e Paecilomices lilacinus foram encontradas em 2,63 % das amostras. Do total de 26 isolados dos fungos obtidos, 92,8 % foram patogênicos a T. semipenetrans e 82,1 % a P. jaehni. A capacidade predatória dos isolados variou entre espécies e entre os isolados de uma mesma espécie. Os isolados que exibiram maior capacidade predatória a T. semipenetrans in vitro foram A. oligospora ppm-1, A. oligospora ppm-2, A.musiformis ppm-2, A. musiformis ppm-5, A. robusta ppm-1, A. robusta ppm-2, M. eudermatum, M. elegans e D. leptospora. Para P. jaehni, os isolados M. eudermatum, M. elegans, D. leptospora, A. oligospora ppm-2, A. oligospora ppm-1, A. robusta ppm-3 e A. musiformis ppm-4 foram os mais eficazes. Palavras-chaves: nematoide-dos-citros, nematoide-das-lesões-radiculares-dos-citros, fungos nematófagos, controle biológico, Arthrobotrys spp., Monacrosporium spp. Summary - Martinelli, P.R.P., J.M. Santos, S.J. Sant Anna & P.L.M. Soares Nematophagous fungi from citrus orchards in São Paulo and Goiás States. Thirty-nine samples from citrus orchards in São Paulo and Goiás States, all infested by Tylenchulus semipenetrans and/or Pratylenchus jaehni, were screened for the presence of nematophagous fungi. Fungal predator of nematodes in the soil were found in 68.4 % of the samples. The main species isolated were of the genus Arthrobotrys, with 23.7 % of the samples infested with Arthrobotrys robusta, 18.4 % with A. musiformis, 10.5 % with A. oligospora and 5.2 % with A. conoides. The fungi Monacrosporium elegans, M. eudermatum, Dactyllela leptospora and Paecilomices lilacinus were found in 2.63 % of the samples. From the total of 26 isolates of nematophagous fungi obtained, 92.8 % were pathogenic to T. semipenetrans and 82.1 % to P. jaehni. The predatory capacity of the isolates was not the same among the species not even among isolates of the same species. The isolates with higher in vitro predatory capacity to T. semipenetrans were A. oligospora ppm-1, A. oligospora ppm-2, A. musiformis ppm-2, A. musiformis ppm-5, A. robusta ppm-1, A. robusta ppm-2, M. eudermatum, M. elegans and D. leptospora The isolates M. eudermatum, M. elegans, D. leptospora, A. oligospora ppm-2, A. oligospora ppm-1, A. robusta ppm-3 and A. musiformis ppm-4 were the most effective for P. jaehni. Key words: citrus nematode, citrus lesion nematode, nematophagous fungi, biological control, Arthrobotrys spp., Monacrosporium spp. Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 123

12 Paulo R.P. Martinelli, Jaime M. Santos, Samuel J. Sant Anna & Pedro L.M. Soares Introdução Entre os vários nematoides associadas às plantas cítricas, cerca de dez espécies são consideradas espécies-chaves para a cultura (Duncan & Cohn, 1990). No Brasil, as espécies-chaves da citricultura são apenas Tylenchulus semipenetrans e Pratylenchus jaehni. Com efeito, embora as perdas causadas por nematoides aos citros ainda não tenham sido quantificadas Brasil, apenas essas duas espécies estão associadas a danos expressivos à cultura no Estado de São Paulo (Santos et al., 2006). As perdas causadas por nematoides à produção mundial dos citros são estimadas em 14,2 % (Sasser & Freckman, 1987). Entretanto, Tersi et al. (1995) constatou que, em talhões infestados por P. jaehni no município Itápolis (SP), a produção foi cerca de três vezes menor que em talhões não infestados. O controle biológico com fungos nematófagos vem despertando grande interesse para o manejo de nematoides, tanto no Brasil como no exterior (Barron, 1977; Santos, 1991; Maia et al., 2001; Corbani, 2002; Martinelli & Santos, 2007ab). Numerosos microorganismos já foram encontrados associados a T. semipenetrans, tais como espécies de fungos predadores (Stirling & Mankau, 1978; Gaspard & Mankau, 1986; Walter & Kaplan, 1990; Raccuzzo et al., 1992) e as bactérias hiperparasitas Pasteuria spp. (Fattah et al., 1989; Walter & Kaplan, 1990; Sorribas et al., 2000). Cerca de 75 % desses fungos pertencem à biota dos solos agricultáveis (Jatala, 1986; Van Gundy, 1985 citado por Santos, 1991; Stirling, 1991). Quanto a P. jaehni, os estudos sobre os inimigos naturais ainda são incipientes, em razão de a espécie ter sido descrita recentemente (Inserra et al., 2001). Martinelli & Santos (2007c) isolaram algumas espécies de Arthrobotrys, Monacrosporium e Dactyllela em pomares de citros do Estado de São Paulo infestados por P. jaehni. O objetivo desse trabalho foi isolar fungos nematófagos da rizosfera de pomares cítricos infestados por T. semipenetrans e P. jaehni, identificálos, documentá-los ao microscópio fotônico e avaliar a capacidade predatória in vitro desses agentes para ambos nematoides. Material e Métodos O estudo foi conduzido no Laboratório de Nematologia do Departamento de Fitossanidade da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias Universidade Estadual Paulista (FCAV UNESP), Jaboticabal (SP). Foram utilizadas 38 amostras de vários pomares de citros dos Estados de São Paulo e Goiás para o estudo. A detecção e isolamento dos fungos foram efetuados pelo método de espalhamento de solo segundo Barron (1977), modificado por Santos (1991). Em placas-de-petri (9 cm) contendo ágar-água 2 % foi colocado 1 a 2 g de solo das amostras, no centro das placas. Em seguida foi adicionado 1 ml de suspensão aquosa contendo aproximadamente exemplares de Panagrellus sp., obtidos através de populações puras mantidas em meio de cultura de aveia, que serviram de isca para os fungos. Foram preparadas três repetições por amostra. Essas culturas foram incubadas à temperatura ambiente no escuro. As observações foram efetuadas diariamente, com auxilio de um estereoscópio, a partir de dois dias do início do período de incubação. Depois de uma semana, foram efetuadas observações semanais durante dois meses. Os fungos isolados foram transferidos para placas-de-petri (9 cm de diâmetro) contendo o meio BDA (batata-dextroságar), onde foram mantidos por 15 dias. Os testes para avaliação da capacidade predatória dos fungos foram conduzidos em placas-de-petri contendo ágar-água 2 %. Discos de 5 mm de diâmetro retirados dos bordos das colônias dos fungos mantidos em BDA foram depositados no centro de cada placa. Foram adotadas três repetições cada uma constituída por uma placa. As culturas foram incubadas em câmara tipo BOD (biochemical oxygen demand), à temperatura de 25 ± 1 C no escuro. Após cinco dias, adicionaram-se 100 espécimes de T. semipenetrans ou de P. jaehni por placa e avaliou-se a capacidade predatória dos isolados diariamente por três dias, determinando-se a percentagem de nematoides predados. Para os isolados de P. lilacinus não foram realizados teste de patogenicidade. O nematoide T. semipentrans utilizado nos testes in vitro foram obtidos de amostras de raízes coletadas em plantas infestadas no campo; P. jaehni foi mantido em culturas axênicas em cilindros de cenoura pela técnica de Moody (1972) modificada por Gonzaga (2006). Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias foram comparadas pelo teste 124 Vol. 33(2)

13 Fungos Nematófagos em Pomares de Citros nos Estados de São Paulo e Goiás* de Tukey a 5 % de probabilidade, utilizando-se o programa ESTAT 2.0 (Barbosa et al., 1992). Para a extração dos nematoides, as amostras de solo foram processadas pela técnica da flutuação centrífuga em solução de sacarose (Jenkins, 1964), e as raízes pelo método de Coolen & D Herde (1972). Para a identificação dos fungos, foram utilizadas chaves de identificação (Cooke & Godfrey, 1964; Rubner, 1996; Barron, 1972) que levam em consideração os tipos de órgãos de captura, formato e tamanho dos conídios e tipos de conidióforos formados. Resultados e Discussão Os fungos nematófagos foram detectados em 68,4 % das amostras de solo. Dos fungos isolados, 92,8 % foram patogênicos a T. semipenetrans (Tabela 1). Esses resultados assemelham-se aos dados obtidos Gené et al. (2005), que encontraram fungos nematófagos em 69 % das amostras de solo de pomares de citros na região da Catalúnia, Espanha. As espécies mais abundantes foram do gênero Arthrobotrys Corda, tendo sido A. robusta Dudd a espécie mais frequente (23,7 %), seguida de A. musiformis Drechsler (18,42 %), A. oligospora Fresenius (10,5 %) e A. conoides Drechsler (5,26 %). Outras espécies foram encontradas em 2,63 % das amostras: Monacrosporium elegans Oudem, Monacrosporium eudermatum Drechsler, Dactyllela leptospora Grove e Paecilomices lilacinus Thorn (Figura 1 A-F). Foram ainda encontradas duas espécies não identificadas (CAN e GO49) em 2,63 %. As espécies predominantes encontradas no presente estudo também foram encontradas em pomares da Espanha (Gené et al., 2005) e Flórida (EUA) (Walter & Kaplan, 1990). Na Califórnia (EUA), as espécies de Arthrobotrys também predominaram na rizosfera de pomares de citros (Gaspard & Mankau, 1986). No Brasil, em estudos envolvendo a detecção de fungos nematófagos da rizosfera de outras culturas, essas espécies também foram muito frequentes (Ribeiro et al., 1999; Maia, 2000). No que diz respeito à predação de T. semipenetrans (Tabela 2), os isolados ppm-1, ppm-2, ppm-3, ppm- 4, ppm-5, ppm-6 e ppm-7 de A. musiformis tiveram comportamento muito semelhante em todas as avaliações. Não houve diferença estatística entre os isolados ppm-1 a ppm-8 de A. robusta nas avaliações de 24 e 48 horas após a adição dos nematoides às culturas dos fungos. Entretanto, depois de 72 horas, o isolado ppm-4 de A. robusta exibiu a menor porcentagem de predação (53,18 %), diferindo dos demais. Com efeito, todos os outros isolados predaram mais que 75 % dos espécimes adicionados às culturas dos fungos. Entre os isolados de A. oligospora obtidos, ppm-1 e ppm-2 foram os mais promissores com predação acima de 60 % no período Tabela 1 - Espécies de fungos nematófagos isolados de amostras de solo da rizosfera de plantas cítricas em pomares infestados por Tylenchulus semipenetrans e/ou Pratylenchus jaehni nos Estados de São Paulo e Goiás. Espécies de fungos % das espécies Patogenicidade a Patogenicidade a presentes T. semipenetrans P. jaehni Arthobotrys conoides 5,26 +1 ± Arthobotrys musiformis 18, Arthobotrys oligospora 10,5 ±2 ± Arthobotrys robusta 23,7 + ± Dactylella leptospora 2, Monacrosporium elegans 2, Monacrosporium eudermatum 2, Paecilomyces lilacinus 2, CAN 2,63 ± - GO49 2, % de pomares com fungos 68,4 92,8 82,1 % de pomares sem fungos 31,6 7,2 17,9 Total 100,0 1 Todos os isolados predaram ou parasitaram os nematodes. 2 Alguns isolados da espécie não predaram os nematodes. 3 Não foi feito teste de patogenicidade. Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 125

14 Paulo R.P. Martinelli, Jaime M. Santos, Samuel J. Sant Anna & Pedro L.M. Soares Figura 1 - Fotomicrografias dos órgãos de captura de fungos nematófagos isolados de amostras de solo de citros no Estado de São Paulo: (A) espécime de Tylenchulus semipenetrans capturado por rede adesiva tridimensional de Arthrobotrys robusta; (B) T. semipenetrans capturado por A. musiformis; (C) fêmea de T. semipenetrans parasitada por Paecilomyces lilacinus; (D) rede bidimensional de Monacrosporium eudermatum; (E) fêmea de T. semipenetrans com ovos parasitados por P. lilacinus; (F) T. semipenetrans capturado em rede adesiva de A. oligospora; (G) Pratylenchus jaehni capturado por A. robusta; (H) P. jaehni capturado por A. musiformis. 126 Vol. 33(2)

15 Fungos Nematófagos em Pomares de Citros nos Estados de São Paulo e Goiás* Tabela 2 - Porcentagem da predação in vitro de T. semipenetrans por 26 isolados de fungos nematófagos após 24, 48 e 72 horas de exposição. Isolados Capacidade predatória 24 horas 48 horas 72 horas Arthrobotrys musiformis ppm-2 62,5 a 80,9 ab 90,5 a A. musiformis ppm-3 62,3 a 75,7 abc 78,8 a Monacrosporium elegans 61,6 ab 84,9 a 95,4 a A. robusta ppm-1 61,3 ab 75,0 abc 84,1 a A. musiformis ppm-4 60,7 ab 76,9 ab 88,7 a A. musiformis ppm-1 61,1 ab 77,9 ab 80,6 a A. oligospora ppm-1 59,8 ab 81,4 abc 89,5 a A. oligospora ppm-2 60,2 ab 78,7 ab 90,2 a M. eudermatum 59,9 ab 80,3 ab 92,0 a A. musiformis ppm-7 59,9ab 75,7 ab 79,5 a A. robusta ppm-6 50,2 ab 50,7 bc 65,6 ab A. musiformis ppm-6 44,1 ab 56,9 abc 75,3 ab A. robusta ppm-2 42,9 ab 74,3 abc 85,5 a A. robusta ppm-7 41,1 ab 55,8 abc 79,4 a A. conoides ppm-2 39,4 ab 63,0 abc 77,5 a A. robusta ppm-3 39,5 ab 85,5 a 88,9 a A. robusta ppm-4 38,1 ab 41,6 c 53,1 b A. robusta ppm-5 34,1 abc 49,9 bc 77,5 a A. robusta ppm-8 33,7 abc 68,2 abc 90,3 a CAN 28,9 abc 38,7 c 50,1 b A. musiformis ppm-5 27,3 abc 62,7 abc 80,3 a A. conoides ppm-1 26,0 bc 60,7 abc 76,2 ab Dactylella leptospora 5,7 cd 60,4 abc 78,0 a A. oligospora ppm-3 2,4 cd 2,4 d 2,4 c GO-49 0 d 0 d 0 c A. oligospora ppm-4 0 d 0 d 0 c Teste F 15,42** 27,78** 28,31** CV (%) 21,5 14,7 8,6 Médias seguidas pelas mesmas letras nas colunas não diferem entre si pelo teste Tukey a 5 % de probabilidade; para análise estatística os dados foram transformados em arc sen %. **Significativo a 1% de probabilidade. de 24 horas, 80 % em 48 horas e ao redor de 90 % em 72 horas. Corbani et al. (2001) e Corbani (2002) também observaram alta capacidade predatória de A. oligospora a T. semipenetrans, com predação de 100 % dos espécimes no tempo de 96 horas. Os isolados ppm-3 e ppm-4 de A. oligospora apresentaram a menor capacidade predatória do nematoide. O primeiro predou apenas 2,45 % dos espécimes de T. semipenetrans adicionados às placas, enquanto o segundo não foi patogênico ao nematoide. Araujo et al. (1993) também observaram comportamento díspar entre isolados da mesma espécie de Arthrobotrys em seus estudos. Os isolados ppm-1 e ppm-2 de A. conoides diferiram estatisticamente entre si na avaliação depois de 24 horas, com predação de 26 e 39,4 % respectivamente. Entretanto, nas avaliações de 48 e 72 horas, os dois isolados não diferiram estatisticamente e obtiveram predação em torno de 77 %. O isolado de M. eudermatum e o de M. elegans obtidos não diferiram estatisticamente entre si nem da maioria dos demais isolados; predaram mais de 90 % dos espécimes de T. semipenetrans em 72 horas. Por conseguinte, esses fungos também podem ser considerados agentes potenciais do controle biológico do nematoide. A capacidade predatória do isolado de D. leptospora a T. semipenetrans foi inferior a da maioria dos demais isolados obtidos, no período de 24 horas. Entretanto, nos períodos de 48 e 72 horas, a capacidade predatória desse isolado foi incluída entre os melhores. Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 127

16 Paulo R.P. Martinelli, Jaime M. Santos, Samuel J. Sant Anna & Pedro L.M. Soares Os dois isolados não identificados (CAN e GO49) não demonstraram potencial como agentes do controle biológico de T. semipenetrans, visto que depois 72 horas as porcentagens de predação foram de 50,15 % e zero, respectivamente (Tabela 2). No que diz respeito a P. jaehni, 82,1 % dos fungos nematófagos isolados foram patogênicos (Tabela 1), sendo que alguns isolados da mesma espécie não predaram ambos os nematoides (Tabela 3). Isso ocorre por se tratarem de isolados encontrados em amostras retiradas em áreas onde uma ou outra espécie dos nematoides não estavam presentes (Tabela 4). Com efeito, Ahren & Tunlid (2003) mencionaram que a coevolução das espécies de fungos nematófagos com os nematoides é um pré-requisito para o desenvolvimento da capacidade predatória dos fungos. Nordbring-Hertz (1972) demonstrou que existe especificidade do fungo com relação ao nematoide, e que esta é de natureza bioquímica. Se houver reconhecimento entre as lecitinas dos órgãos de captura do fungo e açúcares presentes na cutícula do nematoide, pode ser estabelecida a relação de parasitismo. Esse fato justifica a patogenicidade ou não de um isolado a um certo nematoide. Araujo et al. (1993) também observaram diferenças na capacidade predatória entre isolados de uma mesma espécie de Arthrobotrys a juvenis de Meloidogyne sp. A maioria dos isolados fúngicos foi menos eficiente na predação de P. jaehni, sendo que alguns isolados da mesma espécie de fungo e de espécies diferentes Tabela 3 - Porcentagem de predação in vitro de Pratylenchus jaehni por 26 isolados de fungos nematófagos após 24, 48 e 72 horas de exposição. Isolados Capacidade predatória 24 horas 48 horas 72 horas Arthrobotrys oligospora ppm-2 64,4 a 80,3 a 85,5 ab Monacrosporium elegans 57,5 ab 74,7 abc 93,1 a A. musiformis ppm-6 54,9 ab 61,1 abcd 69,7 abcd A. robusta ppm-1 54,3 ab 59,3 abcde 61,6 abcde A. musiformis ppm-3 47,6 abc 49,9 abcdefg 70,5 abcd A. oligospora ppm-1 43,9 abc 78,1 ab 80,1 abc M. eudermatum 40,2 abcd 75,9 ab 95,3 a A. robusta ppm-3 40,0 abcd 77,2 ab 79,1 abcd A. musiformis ppm-1 32,1 abcde 41,6 bcdefg 58,2 abcdef A. musiformis ppm-4 30,5 abcde 62,6 abcd 78,1 abcd A. robusta ppm-6 27,8 bcdefg 57,1 abcdef 65,2 abcde A. robusta ppm-7 23,3 bcdefg 36,6 bcdefg 38,7 bcdefg A. musiformis ppm-2 20,4 bcdefg 29,6 bcdefg 33,5 defg A. oligospora ppm-3 18,9 bcdefg 25,1 cdefgh 35,3 cdefg Dactylella leptospora 16,2 cdefg 67,1 abc 89,7 a A. conoides ppm-1 13,1 defgh 13,1 defgh 13,1 gh A. robusta ppm-4 7,2 efgh 10,2 efgh 13,1 gh A. robusta ppm-5 6,7 efgh 12,0 efgh 17,8 fgh A. musiformis ppm-5 5,7 efgh 12,8 efgh 24,0 efgh A. musiformis ppm-7 5,5 fgh 6,1 fgh 6,4 gh A. conoides ppm-1 3,5 gh 4,3 gh 8,4 gh GO 49 0 h 0 h 0 h CAN 0 h 0 h 0 h A. robusta ppm-2 0 h 0 h 0 h A. conoides ppm-2 0 h 0 h 0 h A. oligospora ppm-4 0 h 0 h 0 h Teste F 15,75** 22,34** 24,45** DMS - Tukey 5 % 23,95 26,64 29,47 CV (%) 36,35 30,38 29,11 Médias seguidas pelas mesmas letras nas colunas não diferem entre si pelo teste Tukey a 5 % de probabilidade; para análise estatística os dados foram transformados em arc sen %. **Significativo a 1% de probabilidade. 128 Vol. 33(2)

17 Fungos Nematófagos em Pomares de Citros nos Estados de São Paulo e Goiás* Tabela 4 - Distribuição dos fungos nematófagos em amostras de solo de pomares de citros infestados por Tylenchulus semipenetrans e Pratylenchus jaehni nos Estados de São Paulo e Goiás. Município Amostra Cultura Idade Espécimes Espécimes Fungos (anos) T. semipenetrans P. jaehni isolados Solo Raiz Ovos Solo Raiz Ovos (100 cm 3 ) (10 g) (10g) (100 cm 3 ) (10 g) (10 g) Bebedouro Arthrobotrys robusta Amostra 1 Laranja Pêra A. musiformis Amostra A. robusta Amostra A. oligospora Amostra Amostra Cândido Rodrigues Amostra 1 Lima ácida Tahiti A. conoides Amostra A. robusta Amostra A. musiformis Amostra A. musiformis Amostra A. oligospora Amostra A. oligospora Amostra Paecilomyces lilacinus Goiânia (GO) Amostra 1 Laranja Valência Monacrosporium elegans Amostra Itápolis (SP) Amostra 1 Laranja Natal A. musiformis Amostra A. robusta Amostra A. oligospora Amostra A. musiformis Amostra Amostra M. eudermatum Amostra Monte Alto (SP) A. musiformis Amostra 1 Laranja Pêra A. robusta Amostra Amostra Amostra Amostra A. robusta Amostra Amostra Taquaral (SP) Amostra 1 Laranja Pêra Amostra Amostra A. robusta Taquaritinga (SP) Amostra 1 Laranja Pêra A. musiformis Amostra A. conoides Amostra A. robusta Amostra Dactylella leptospora Amostra A. oligospora Amostra Amostra A. robusta Médias seguidas pelas mesmas letras nas colunas não diferem entre si pelo teste Tukey a 5 % de probabilidade; para análise estatística os dados foram transformados em arc sen %. **Significativo a 1% de probabilidade. diferiram estatisticamente quanto a sua capacidade predatória (Tabela 3). Os isolados mais eficientes no controle de P. jaehni foram M. eudermatum, M. elegans, D. leptospora, A. oligospora ppm-2, A. oligospora ppm-1, A. robusta ppm-1, ppm-3 e ppm-6 e A. musiformis ppm-1, ppm-3 e ppm-6, com porcentagens de predação em 72 horas de 95,3; 93,1; 89,6; 85,5; 80,2; 61,6; 79; 65,2; 58,2; 70,5; e 69,7 respectivamente, não diferindo estatisticamente entre si. Enquanto os isolados A. oligospora ppm-4, A. conoides ppm-2, A. robusta ppm-2, CAN, GO49, A. conoides ppm-1, A. musiformis ppm-7 tiveram patogenicidade muito baixa Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 129

18 Paulo R.P. Martinelli, Jaime M. Santos, Samuel J. Sant Anna & Pedro L.M. Soares menos de 10 % ou não predaram o nematoide (Tabela 3). As diferenças na capacidade predatória dos isolados fúngicos a T. semipenetrans e a P. jaehni (Tabelas 2 e 3) provavelmente decorrem do fato de que a maioria das amostras analisadas (94,8 %) tinha a presença de T. semipenetrans, enquanto que P. jaenhi foi constatado em apenas 21,1 % delas (Tabela 1 e 4). Contudo, Santos (1991) explica que o tamanho do corpo do nematoide e a forma de movimentação dos nematoides influenciam na porcentagem de captura ou até mesmo na não captura do nematoide. A predominância de T. semipenetrans nas amostras de solo dos pomares de citros foi proporcional ao número de fungos nematófagos encontrados nas amostras, os quais foram patogênicos a esse patógeno, conforme Walter & Kaplan (1990) já haviam observado. Alguns isolados exibiram expressiva capacidade predatória a ambos nematoides, podendo ser usados no manejo desses patógenos como alternativa de controle. Gaspard & Mankau (1986) e Walter & Kaplan (1990) também mencionaram que os isolados de fungos nematófagos associados a T. semipenetrans podem ser utilizados no manejo desse nematoide. Martinelli & Santos (2007a,c) demonstraram o potencial do controle biológico in vitro de alguns fungos no controle de P. jaehni e T. semipenetrans. Em outros estudos desenvolvidos no Laboratório de Nematologia da UNESP/FCAV de Jaboticabal, foi demonstrado o potencial do controle biológico de diferentes nematoides por outros fungos em diversas outras culturas (Corbani, 2002; Bernardo, 2002; Soares, 2006). Os resultados obtidos no presente trabalho reforçam a possibilidade do uso de fungos nematófagos no controle de T. semipenetrans e P. jaehni. Literatura Citada AHREN, D. & A. TUNLID Evolution of parasitism in nematode-traping fungi. Journal of Nematology, 35 (2): ARAUJO, J.V., M.A., SANTOS, S. FERRAZ & A.S. MAIA Antagonistic effect of predacious Arthrobotrys fungi on effective Haemonchus placei larvae. Journal of Helminthology, 67 (1): BARBOSA, J.C., E.B. MALHEIROS & D.A. BANZATTO ESTA - um Sistema de Análises Estatísticas de Ensaios Agronômicos. BARRON, G.L The Genera of Hyphomycetes from Soil. R.E. Krieger Publishing Co., Huntington & New York,364 p. BARRON, G.L The Nematode-destroing Fungi. Canadian Biological Publications Ltda., Ghelph, 140 p. BARRON, G.L. & R.G. THORN Destruction of nematodes by species of Pleurotus. Canadian Journal of Botany, 65: BERNARDO, E.R.A Eficácia do controle biológico de Rotylenchulus reniformis (Linford & Oliveira, 1940) em algodoeiro (Gossypium hirsutum L.) com fungos nematófagos.(dissertação de Mestrado). Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias Universidade Estadual Paulista (FCAV UNESP), Jaboticabal (SP), 74 p. COOKE, R.C. & B.E.S. GODFREY A key to the nematode-destroying fungi. Trans. Brit. Mycol. Soc, 47 (1): COOLEN, W.A. & D HERDE, C.J A Method for the Quantitative Extration of Nematodes from Plant Tissue. State Agricultural Reserch Center, Gent, 77 p. CORBANI, R.Z Potencial do controle biológico de Tylenchulus semipenetrans com fungos nematófagos. (Dissertação de Mestrado). Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias Universidade Estadual Paulista (FCAV UNESP), Jaboticabal (SP), 44 p. CORBANI, R.Z., SANTOS, J.M. & MAIA, A.S Estudo de agentes potenciais do controle biológico do nematóide dos citros (Tylenchulus semipenetrans). In: CONGRESSO PAULISTA DE FITOPATOLOGIA, XXIV, Piracicaba Summa Phytopathologica, 27 (supl.): DUNCAN, L.W. & E. COHN Nematode diseases of citrus. In: BRIDGE, J., M. LUC & R. SIKORA (ed). Plant Parasitic Nematodes in Subtropical Agriculture. CAB International, Wallingford (UK), p FATTAH, F.A., H.M. SALEH & H.M. ABOUD Parasitism of the citrus nematode, Tylenchulus semipenetrans, by Pasteuria penetrans in Iraq. Journal of Nematology, 21 (3): GASPARD, J.T. & R. MANKAU Nematophagous fungi associated with Tylenchulus semipenetrans and the citrus rhizosphere. Nematologica, 32: GENÉ, J., S. VERDEJO-LUCAS, A.M. STCHIGEL, F.J. SORRIBAS. & J. GUARRO Microbial parasites associated with Tylenchulus semipenetrans in citrus orchards of Catalonia, Spain. Biocontrol Science and Technology, 15 (7): GONZAGA, V., J.M. SANTOS & M.A.F. COSTA Multiplicação de Pratylenchus spp. in vitro em cilindros de cenoura. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE FITOPATOLOGIA, XXXIX, Salvador. Fitopatologia Brasileira 31 (supl.): 208. INSERRA, R.N., L.W. DUNCAN, A. TROCCOLI, D. DUNN, J.M.dos SANTOS, D. KAPLAN & N. VOVLAS Pratylenchus jaehni sp. n. from citrus in Brazil and its relationship with P. coffeae and P. loosi (Nematoda: Pratylenchidae) Nematology, 3 (7): Vol. 33(2)

19 Fungos Nematófagos em Pomares de Citros nos Estados de São Paulo e Goiás* JATALA, P Biological control of plant-parasitic nematodes. Annual Review of Phytopathology, 24: JENKINS, W.R A rapid centrifugal-flotation technique for separating nematodes from soil. Plant Disease Reporter, 48: MAIA, A.S Isolamento, identificação e potencialidade de fungos como agentes de biocontrole de Meloidogyne spp. e Heterodera glycines. (Tese de Doutorado). Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias Universidade Estadual Paulista (FCAV UNESP), Jaboticabal (SP), 117 p. MAIA, A.S., J.M.dos SANTOS & A. DI MAURO Estudos in vitro da habilidade predatória de Monacrosporium robustum sobre Heterodera glycines. Fitopatologia Brasilera, 18: MARTINELLI, P.R.P. & J.M.dos SANTOS. 2007a. Detecção e isolamento de fungos nematófagos de Tylenchulus semipenetrans em amostras de solo de pomares de citros do estado de São Paulo. In: CONGRESSO PAULISTA DE FITOPATOLOGIA, XXX, Jaboticabal. Summa Phytopathologica, 33 (supl.): 23. MARTINELLI, P.R.P. & J.M.dos SANTOS. 2007b. Patogenicidade in vitro de espécies de Arthobotrys A Pratylenchus jaehni. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE NEMATOLOGIA, XXVII, Goiânia. Resumos, p.54. MARTINELLI, P.R.P. & J.M.dos SANTOS. 2007c. Patogenicidade in vitro de espécies de Arthobotrys a Tylenchulus semipenetrans. In: CONGRESSO PAULISTA DE FITOPATOLOGIA, XXX, Jaboticabal. Summa Phytopathologica, 33 (supl.): 24. MOODY, E.H.; LOWNSBERY, B.F. & AHMED, J.M Culture of the root-lesion nematode Pratylenchus vulnus on carrot disks. Journal of Nematology, 5: (3), NORDBRING-HERTZ, B Scanning electron microscopy of the nematode-trapping organs in Arthrobotrys oligospora. Physiologia Plantarum, 26 (1): RACCUZO, G., A. CIANCIO & V. LO GUIDICE Some observations on the ecology of the citrus nematode Tylenchulus semipenetrans Cobb in Southern Italy. Proceedings of International Society of Citriculture, 3: RIBEIRO, R.C.F., S. FERRAZ, E.H. MIZOBUTSI & M. MENDES Levantamento de espécies de Monacrosporium em diversas regiões brasileiras. Nematologia Brasileira, 23: RUBNER, A Revision of predacious Hyphomycetes in the Dactylella-Monacrosporium complex. Studies in Mycology, 39. SANTOS, J.M.dos, A.S. CAMPOS & C.I., AGUILAR- VILDOSO Nematóide dos citros. In: JUNIOR, D.M., J.D. NEGRI, R.M PIO, & J.P. JUNIOR. (ed). Citros. Cordeirópolis, p SANTOS, M.A Detecção, identificação e avaliação do potencial antagonista de fungos nematófagos em solos do Brasil. (Dissertação de Mestrado). Universidade Federal de Viçosa, 97 p. SASSER, J.N. & D.W. FRECKMAN A world perspective on nematology: the role of the society. In: VEECH, J.A. & D.W. DICKSON (ed) Vistas on Nematology. Society of Nematologists, Maryland, p SOARES, P.L.M Estudos do controle biológico de fitonematóides com fungos nematófagos. (Tese de Doutorado). Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias Universidade Estadual Paulista (FCAV UNESP), Jaboticabal (SP), 217 p. STIRLING, G.R Biological Control of Plant Parasitic Nematodes: Progress, Problems and Prospects. CAB International, Wallinford (UK). STIRLING, G.R. & R. MANKAU Dactylella oviparasitica, a new fungal parasite of Meloidogyne eggs. Mycologia, 70 (4): TERSI, F.E.A., J.M. dos SANTOS & A.S. MAIA Pratylenchus coffeae e Tylenchulus semipenetrans causam redução de produtividade de citros em São Paulo, Brasil. Nematropica, 25: 106. VAN GUNDY, S.D Biological control of nematodes: status and prospects in agricultural IPM Systems. In: HOY, M.A. & D.C. HERZOG. (ed). Biological Control in Agricultural IPM systems. Academic Press, New York, p WALTER, D.E. & D.T. KAPLAN Antagonists of plant-parasitic nematodes in Florida citrus. Journal of Nematology, 22: Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 131

20 ARTIGO Wânia S. Neves, Leandro G. Freitas, Maurício D. Costa, Vanessa S. Almeida & Silamar Ferraz Controle de Meloidogyne javanica pelo Uso de Bactérias Isoladas de Solo Biofumigado com Resíduos de Diferentes Espécies de Brássicas Wânia S. Neves 1 *, Leandro G. Freitas 2, Maurício D. Costa 3, Vanessa S. Almeida 2 & Silamar Ferraz 2 1 Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais Unidade Regional Norte de Minas. Rodovia MGT km 155, Nova Porteirinha (MG) Brasil. 2 Departamento de Fitopatologia, Universidade Federal de Viçosa (UFV), Viçosa (MG) Brasil. 3 Departamento de Microbiologia, UFV. *Autora para correspondência: waniasantosneves@yahoo.com.br Recebido para publicação em 18 / 06 / Aceito em 22 / 04 / 2009 Editado por Claudio Marcelo Oliveira Resumo Neves, W.S., L.G. Freitas, M.D. Costa, V.S. Almeida & S. Ferraz Controle de Meloidogyne javanica pelo uso de bactérias isoladas de solo biofumigado com resíduos de diferentes espécies de brássicas. Esse trabalho teve como objetivo avaliar o potencial de bactérias, isoladas de solo biofumigado com diferentes espécies de brássicas, para o controle biológico de Meloidogyne javanica. Amostras de solo biofumigado com 50 gramas de resíduos de repolho (Brassica oleracea var. capitata), mostarda (Brassica juncea), couve-flor (Brassica oleracea var. botrytis) ou de brócolis (Brassica oleracea var. italica) por quilo de solo foram coletadas e 60 isolados de bactérias foram obtidos por centrifugação e posteriormente pelo método de diluição serial. Procedeu-se em casa de vegetação à seleção massal de isolados com maior potencial de controle. Sementes de tomateiro Santa Cruz Kada foram imersas em suspensão bacteriana por 24 horas e transferidas para mistura de solo e areia 1:1 (v:v) em tubete plástico com capacidade de 250 cm 3. Após 20 dias, o solo de cada tubete foi infestado com suspensão aquosa de ovos de M. javanica. Água foi utilizada como testemunha. Após 45 dias, avaliaram-se a altura das plantas e o número de massas de ovos por sistema radicular. Dos 60 isolados avaliados, 19 se diferenciaram estatisticamente da testemunha e reduziram em mais de 50 % o número de massas de ovos. Nenhum dos isolados promoveu aumento na altura das plantas quando comparados com a testemunha. Entre os 19 isolados, seis se destacaram e reduziram o número de massas de ovos em 63, 65, 73, 77, 78 e 93 % em relação à testemunha. Os isolados com maior potencial de controle foram reavaliados em casa de vegetação e in vitro para medir a inibição de eclosão de juvenis dos ovos do nematoide. Em nenhum dos dois experimentos os isolados diferenciaram-se da testemunha em relação ao controle do nematoide, não promovendo também o crescimento das plantas em casa de vegetação. Palavras-chaves: controle, Meloidogyne javanica, solo biofumigado, bactérias. Summary - Neves, W.S., L.G. Freitas, M.D. Costa, V.S. Almeida & S. Ferraz Control of Meloidogyne javanica through the use of bacteria isolated from biofumigated soil with residues of different species of Brassicaceae. This study evaluated the potential of bacteria, isolated from soil biofumigated with different Brassica species, for the biological control of Meloidogyne javanica. Soil samples biofumigated with 50 grams of residues of broccoli, cauliflower, mustard or cabbage per kg of soil were collected and 60 isolates of bacteria were obtained by the centrifugation and serial dilution method. A screening of isolates with potential for the control of the nematode was conducted in the greenhouse. Seeds of tomato plants Santa Cruz Kada were immerged in a bacterial suspension for 24 hours and then transferred into a mixture of soil and sand 1:1 (v:v) in 250 cm 3 plastic tube. After 20 days, the soil of each tube was infested with aqueous suspension of 1,000 eggs of M. javanica. Water was used as control. After 45 days, the height of the plants and the number of egg masses were 132 Vol. 33(2)

21 Controle de Meloidogyne javanica pelo Uso de Bactérias Isoladas de Solo Biofumigado com Resíduos de Diferentes Espécies de Brássicas evaluated in the root system. None of the isolates increased plant height when compared to the control. Among the 19 isolates that reduced the number of eggs per plant, six stood out, with reductions of 63, 65, 73, 77, 78 and 93 % when compared to the control. These isolates were re-evaluated in the greenhouse and tested for egg-hatching reduction in vitro. However, in both experiments the isolates did not differ from the control treatment. Key words: control, Meloidogyne javanica, biofumigated soil, bacteria. Introdução Os nematoides do gênero Meloidogyne Goeldi, também conhecidos como nematoides-das-galhas, são considerados os mais importantes do mundo (Sasser & Frekman, 1987), causando grandes perdas em olerícolas, principalmente em tomateiro (Lycopersicon esculentum), com prejuízos que chegam a 18 milhões de toneladas por ano (Sasser, 1989). O uso de nematicidas químicos é caro e poluente, por isso métodos alternativos de controle são de grande importância para a produção agrícola sustentável. O uso de matéria orgânica, a solarização do solo, a biofumigação e o controle biológico com fungos e bactérias são alguns dos métodos ecologicamente aceitáveis que vêm sendo cada vez mais investigados. Certos resíduos vegetais e animais, quando incorporados ao solo, liberam gases tóxicos ao serem decompostos. Além da ação direta dos gases, a utilização de materiais orgânicos pode melhorar as características físico-químicas do solo e aumentar a diversidade da microbiota, favorecendo também o controle biológico de doenças de plantas (Hoitink & Fahy, 1986). A solarização do solo tem ação limitada contra os nematoides, mas quando combinada com a incorporação de matéria orgânica, acelera sua decomposição e aprisiona os gases que atuam contra os nematoides. Além disso, ao alterar a composição da microbiota do solo, pode favorecer o desenvolvimento de organismos benéficos enquanto reduz a ocorrência dos fitopatogênicos. Stevens et al. (2003) relataram o aumento significativo de bactérias de espécies de Bacillus e Pseudomonas fluorescentes na rizosfera, rizoplano e no interior de tecidos radiculares de tomateiro e batata doce, cultivados em solo solarizado, quando comparado com solo não solarizado. Essas bactérias geralmente estão associadas às raízes de plantas e são conhecidas como rizobactérias promotoras de crescimento de plantas e biocontroladoras de fitonematoides, assim como outras bactérias dos gêneros Azobacter, Azospirillum e Acetobacter (Brown, 1974; Elmerich, 1984; Kloepper et al., 1986; Glick, 1995). Além dos efeitos diretos de produção de toxinas e antibióticos, as rizobactérias são capazes de ativar mecanismos de defesa das plantas através da indução de resistência sistêmica (Oostendorp & Sikora, 1990). O uso dessas bactérias pode ser de grande importância para o controle de fitonematoides, uma vez que não causam impacto ambiental e oferecem maior segurança para aplicadores e consumidores. A hipótese deste trabalho é que a biofumigação do solo promove o desenvolvimento de bactérias que são agentes eficientes de controle biológico de nematoides. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo isolar bactérias associadas ao solo biofumigado com espécies de brássicas e avaliar seu potencial para o controle biológico de Meloidogyne javanica (Treub, 1885) Chitwood, Material e Métodos O nematoide M. javanica foi multiplicado e mantido em raízes de tomateiro Santa Clara, em casa de vegetação por aproximadamente 70 dias. Decorrido esse período, foi feita a extração de ovos pelo método de Hussey & Barker (1973) modificado por Boneti & Ferraz (1981). As concentrações das suspensões dos ovos foram ajustadas em câmara de Peters ao microscópio estereoscópio, para a utilização como inóculo nos experimentos. Foram colocados na superfície do solo de cada vaso (2 litros de capacidade) 50 gramas de resíduos de repolho (Brassica oleracea var. capitata), mostarda (B. juncea), couve-flor (B. oleracea var. botrytis) ou brócolis (B. oleracea var. italica) por kg de solo. O material foi incorporado ao solo e, após seis dias, o solo foi molhado até próximo a capacidade de campo e envolto por um plástico de Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 133

22 Wânia S. Neves, Leandro G. Freitas, Maurício D. Costa, Vanessa S. Almeida & Silamar Ferraz polietileno transparente com espessura de 100 µm. Após 30 dias o plástico foi retirado e foram coletadas amostras de solo de cada um dos tratamentos para o isolamento das bactérias. O isolamento das bactérias do solo foi feito pelo método de diluição em placas de Petri, em que foram adicionados 10 g da mistura de solo de cada tratamento em 100 ml de solução salina (NaCl 0,85 %). As amostras foram preparadas e mantidas sobre agitação vigorosa por 1 hora e, em seguida, foram submetidas à diluição em série, das quais foram utilizados 100 µl das suspensões de 10 4 a 10 9 para semeio em placas de Petri contendo o meio 523 de Kado & Heskett (1970), com alça de Drigalsky. As placas foram levadas à incubadora a 28 C, onde permaneceram por 24 horas. As colônias que surgiram foram repicadas para tubos de ensaio contendo o mesmo meio. Os tubos foram mantidos em incubadora por 24 horas à mesma temperatura. A seleção das bactérias foi realizada avaliando-se o seu potencial como agente de controle de nematoides e o seu efeito no crescimento das plantas em casa de vegetação. Para isso, sementes de tomate Santa Cruz Kada foram microbiolizadas utilizando-se o método descrito por Oostendorp & Sikora (1989) modificado para 24 horas (Fabry, 2002). A suspensão bacteriana foi obtida a partir de colônias cultivadas em meio de cultura 523 de Kado & Heskett (1970) em tubos de ensaios. Foram adicionados 3 ml de água destilada em cada tubo, que foram tampados e em seguida agitados por 10 segundos em aparelho vortex. As sementes foram imersas na suspensão bacteriana e mantidas à temperatura ambiente. Sementes mantidas em água foram usadas como testemunha. Após 24 horas as sementes foram semeadas em tubetes plásticos com capacidade para 250 ml, contendo mistura de solo e areia na proporção 1:1 previamente tratada com brometo de metila. Foram usadas três sementes por tubete e após a germinação foi feito desbaste, deixando-se apenas uma planta por tubete. Cinco dias após o desbaste o solo foi infestado com uma suspensão contendo ovos de Meloidogyne javanica. Foi usado também um tratamento no qual as sementes que foram imersas apenas em água foram plantadas em solo sem infestação de nematoides, totalizando 372 parcelas experimentais. As avaliações foram feitas 45 dias após a infestação do solo. Foram avaliados a altura das plantas e o número de massas de ovos por sistema radicular. Para a contagem do número de massas de ovos por sistema radicular, as raízes foram imersas por 15 minutos em solução aquosa de floxina B (15 mg de floxina B por l de água) para coloração das massas de ovos. Depois de coradas as raízes foram colocadas em papel toalha e armazenadas em geladeira até o momento da avaliação. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, com seis repetições por tratamento, num total de 62 tratamentos, e os dados obtidos foram submetidos à análise de variância através do programa estatístico SAEG (Euclydes, 1983). As médias dos tratamentos foram comparadas pelo método de Scott-Knott a 5 % de probabilidade. Os isolados bacterianos com maior potencial de controle foram reavaliados em casa de vegetação. O experimento foi montado de forma a avaliar duas formas de aplicação da bactéria: microbiolização das sementes e suspensão bacteriana sob a forma de rega diretamente no solo. O método de microbiolização das sementes com suspensão bacteriana foi montado da mesma forma descrita anteriormente, porém utilizando-se vasos de 4 l de capacidade. As culturas dos isolados foram raspadas por um minuto com alça de Drigalski sobre meio B de King (King et al., 1954) em placas de Petri e mantidas a 28 o C durante 48 horas. Após esse período, fez-se a raspagem da cultura bacteriana e preparou-se uma suspensão aquosa ajustada para DO 540 = 0,5. As sementes foram imersas em suspensão bacteriana preparada com água destilada e mantidas à temperatura ambiente. Sementes mantidas em água foram usadas como testemunha. Após 24 horas as sementes foram semeadas em vasos de plástico. No método em que a suspensão bacteriana foi aplicada diretamente no solo, utilizouse 5 ml dos respectivos isolados que foram preparados como descrito anteriormente, e colocados sob a forma de rega diretamente sobre as plântulas, 15 dias após as sementes terem sido colocadas no solo sem nenhum tratamento. Para ambos os métodos, 20 dias após a semeadura o solo de cada vaso foi infestado com ovos de M. javanica. Dez repetições por tratamento foram utilizadas, para cada forma de aplicação da bactéria. 134 Vol. 33(2)

23 Controle de Meloidogyne javanica pelo Uso de Bactérias Isoladas de Solo Biofumigado com Resíduos de Diferentes Espécies de Brássicas As variáveis avaliadas foram altura, massa da parte aérea, massa das raízes e número de ovos e de galhas por sistema radicular das plantas. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, com dez repetições por tratamento e os dados obtidos foram submetidos à análise de variância. As médias dos tratamentos foram comparadas pelo teste de Duncan a 5 % de probabilidade. Foi feita também uma avaliação in vitro dos isolados que se apresentaram mais eficientes no controle de M. javanica em casa de vegetação, com o propósito de medir a inibição de eclosão dos juvenis de segundo estádio (J 2 ). Aproximadamente 200 ovos de M. javanica, contidos em 1 ml de água, foram colocados em 2 ml de suspensão aquosa de bactérias em placas de Petri com 5 cm de diâmetro. O tratamento usado como testemunha foi composto pela suspensão contendo os ovos do nematoide e água. Os ovos em suspensão foram incubados a 26 o C, em recipiente fechado durante 21 dias. As avaliações foram feitas 24 horas após a montagem do experimento e, a cada três dias, foram feitas leituras do número de J 2 eclodidos e de ovos remanescentes, em microscópio estereoscópio. Os resultados foram expressos em porcentagem de eclosão de J 2 de acordo com a fórmula: % de eclosão = [n o. de J 2 / (n o. de J 2 + n o. de ovos)] x 100. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, com cinco repetições por tratamento e os dados obtidos foram submetidos à análise de variância utilizando-se o sistema SAEG (Euclydes, 1983). As médias dos tratamentos foram comparadas pelo teste de Duncan a 5 % de probabilidade. Resultados e Discussão Dos 60 isolados avaliados no primeiro ensaio, 19 se diferenciaram estatisticamente da testemunha reduzindo em mais de 50 % o número de massas de ovos por sistema radicular. Entre os 19 isolados, seis se destacaram, reduzindo o número de massas de ovos em 63, 65, 73, 77, 78 e 93% em relação à testemunha (Figura 1). Nenhum dos isolados promoveu aumento na altura das plantas. Na reavaliação desses seis isolados bacterianos não houve diferença estatística da testemunha em relação ao número de galhas nas duas formas de aplicação. Não houve diferença estatística também em relação ao número de ovos quando aplicados na forma de rega, porém sob a forma de microbiolização das sementes o isolado bacteriano 23 resultou em maior multiplicação do nematoide (Figura 2). Em relação à massa da parte aérea das plantas, todos os tratamentos foram estatisticamente iguais à testemunha com e sem nematoide, sendo que as plantas cultivadas em solo Nº de Massas de Ovos a a a a a a a a a b b b b b b b b b b b b b b c d c b b c c c c c c d d c d d d d d d d c d e d c e e e e f 0 Testemunha Figura 1 - Número de massas de ovos de M. javanica por sistema radicular de tomateiros oriundos de sementes microbiolizadas com diferentes isolados bacterianos obtidos de solo biofumigado com diferentes espécies de brássicas. Barras em destaque indicam isolados bacterianos que apresentaram valores médios estatisticamente menores que os demais tratamentos quando comparados pelo método de Scott-Knott ao nível de 5 % de probabilidade (médias de seis repetições) Tratamentos Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 135

24 Wânia S. Neves, Leandro G. Freitas, Maurício D. Costa, Vanessa S. Almeida & Silamar Ferraz a Microbiolização de sementes Rega Número de Ovos b ab ab b b Testemunha Tratamentos Figura 2 - Número de ovos de M. javanica por sistema radicular de plantas cultivadas em solo infestado com nematoides, oriundas de sementes e mudas tratadas com suspensão bacteriana de isolados obtidos de solo biofumigado com espécies de brássicas. Letras iguais indicam ausência de diferença pelo teste de Duncan a 5 % de probabilidade (médias de dez repetições). ns = não significativo. Massa da Parte Aérea (g) a 32 b Microbiolização de sementes Rega a ab ab ab ab ab Tratamentos Testemunha Sem Nematoide Figura 3 - Massa da parte aérea (g) de plantas cultivadas em solo infestado com nematoides, oriundas de sementes e mudas tratadas com suspensão bacteriana de isolados obtidos de solo biofumigado com espécies de brássicas. Letras iguais indicam ausência de diferença pelo teste de Duncan a 5 % de probabilidade (média de dez repetições). ns = não significativo. tratado com suspensões bacterianas dos isolados 83 e 23 diferiram estatisticamente das plantas do isolado 32, resultando em maior massa da parte aérea (Figura 3). A altura e a massa das raízes das plantas não diferiram significativamente entre os tratamentos, tanto para a microbiolização das sementes como para a suspensão bacteriana aplicada diretamente ao solo. Segundo Cook & Baker (1993), o tratamento do solo com vapor, calor ou fumigação forma um vácuo biológico e os primeiros organismos a recolonizar o solo possuem alta capacidade saprofítica. No trabalho aqui desenvolvido, apesar dos isolados terem sido obtidos de solo em que foi incorporada matéria orgânica e coberto com plástico, tais isolados só foram eficientes em controlar o nematoide na seleção massal em que foi utilizado pequeno volume de solo. Quando esse volume foi aumentado, as bactérias testadas não foram capazes de efetuar o controle dos nematoides ou de promover o crescimento das plantas. Alguns autores relatam que a forma de aplicação das rizobactérias pode ser um fator importante na multiplicação das bactérias e colonização da rizosfera (Mazzola et al., 1995). Segundo Kloepper et al. (1985), os isolados de rizobactérias com habilidade de utilizar exsudatos de sementes possuem vantagem competitiva na colonização das raízes, o que parece não ter sido o caso dos isolados testados no presente trabalho, visto que em nenhuma das formas de aplicação da bactéria houve controle do nematoide. Os isolados não diferiram estatisticamente da 136 Vol. 33(2)

25 Controle de Meloidogyne javanica pelo Uso de Bactérias Isoladas de Solo Biofumigado com Resíduos de Diferentes Espécies de Brássicas testemunha (água) em relação à eclosão de juvenis de M. javanica no experimento realizado in vitro. Pouco se sabe sobre os mecanismos de ação das rizobactérias sobre os fitonematoides. Presume-se que envolvam a produção de toxinas, a modificação dos exsudatos radiculares da planta, reduzindo a eclosão de ovos, a atração e o reconhecimento do hospedeiro e a indução de resistência sistêmica (Oostendorp & Sikora, 1990). No teste in vitro não foi observada redução ou atraso na eclosão dos juvenis em nenhum dos isolados testados, o que indica que a inibição da eclosão não tenha sido o mecanismo de ação envolvido. Contudo, a falta de inibição de eclosão dos juvenis não significa que o isolado não seja também efetivo in vivo, pois as bactérias podem atuar por outros mecanismos de ação, em outra fase do ciclo de vida do nematoide. Por outro lado, alguns autores relatam que organismos com boa atividade antagônica in vitro nem sempre possuem boa atividade antagonista no solo (Becker et al., 1988; Neipp & Becker, 1999; Racke & Sikora, 1992). De acordo com Kloepper et al. (1990) a indução de crescimento das plantas pode ser outro mecanismo de atuação das rizobactérias, porém no presente trabalho, nos experimentos realizados em casa de vegetação, não foram observadas maiores massa e altura nas plantas tratadas com os isolados bacterianos. Os resultados obtidos nos experimentos realizados no presente trabalho podem ser devido a fatores abióticos, visto que a seleção massal foi realizada em época quente do ano, de dezembro a fevereiro, e a reavaliação das bactérias em casa de vegetação foi feita em época fria, de abril a junho. Segundo Weller (1988), a atividade microbiana aumenta com o aumento da temperatura. Outro fator que pode ter feito com que os isolados selecionados não fossem eficientes quando reavaliados é o fato da população do nematoide ter sido quatro vezes maior que a população da seleção massal, que foi de ovos por tubete. As bactérias foram aplicadas apenas uma vez, por microbiolização das sementes ou via rega no solo, e talvez esse fato tenha sido outra razão de não se ter obtido sucesso em relação ao controle como foi obtido na seleção massal. É possível que a proteção conferida por esses agentes de biocontrole só seja eficiente em maior volume de solo, quando aplicados mais vezes, durante a condução da cultura. Com base nos resultados obtidos, pode-se aqui concluir que bactérias isoladas de solo submetido à biofumigação com o uso de diferentes espécies de brássicas não se comportaram como bons agentes de controle de nematoides. Apesar de o resultado obtido na seleção massal ter sido bastante promissor em relação ao controle de Meloidogyne sp., o mesmo não se confirmou em nenhuma das formas de aplicação quando foi usado um maior volume de solo. O que podemos concluir nesse trabalho é que a inibição da eclosão não é o mecanismo de ação que os isolados bacterianos selecionados utilizaram para promover o controle dos nematoides na seleção massal, visto que no experimento in vitro não houve redução da eclosão de nematoides com o uso de nenhum dos isolados selecionados. Em nenhum dos experimentos realizados em casa de vegetação, os isolados bacterianos selecionados atuaram como promotores de crescimento das plantas. Apesar de algumas espécies de plantas, quando incorporadas ao solo, apresentarem ação positiva no crescimento de plantas e muitas vezes no controle de certos patógenos de solo (Stapleton & DeVay, 1983; Hoitink & Fahy, 1986; Neves et al.; 2007), as bactérias isoladas de solo biofumigado com brássicas em nosso trabalho não apresentaram tal efeito. Talvez para que tais efeitos sejam observados, sejam necessárias aplicações semanais de bactérias ao solo. Para comprovar tal hipótese, novos experimentos devem ser realizados para que assim isolados bacterianos advindos de solo onde foi realizada a incorporação de brássicas possam ser indicados para uso eficiente em campo. Agradecimentos Os autores agradecem ao apoio financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Literatura Citada BECKER, J.O., E. ZAVALETA-MEJIA, S.F. COLBERT, M.N. SCHROTH, A.R. WEINHOLD, J.G. HANCOCK, S.D.V. GUNDY & S.D. VAN-GUNDY Effects of rhizobacteria on root-knot nematodes and gall formation. Phytopathology, 78: BONETI, J.I.S. & S. FERRAZ Modificação do Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 137

26 Wânia S. Neves, Leandro G. Freitas, Maurício D. Costa, Vanessa S. Almeida & Silamar Ferraz método de Hussey & Barker para extração de ovos de Meloidogyne exigua de raízes de cafeeiro. Fitopatologia Brasileira, 6: 553. BROWN, M.E Seed and root bacterization. Annual Review of Phytopathology, 12: COOK, R.J. & K.F. BAKER The Nature and Practice of Biological Control of Plant Pathogens. The American Phytopathological Society, St. Paul (EUA), 523 p. ELMERICH, C Molecular biology and ecology of diazotrophs associated with non-leguminous plants. Bio/Technology, 2: EUCLYDES, R.F Sistema para Análise Estatística Genética: SAEG. Editora da UFV, Viçosa (MG), 57 p. FABRY, C.F.S Controle de Meloidogyne javanica por rizobactérias antagonistas a fitonematoides. (Tese de Mestrado). Universidade Federal de Viçosa, Viçosa (MG), 68 p. GLICK, B.R The enhancement of plant growth by free-living bacteria. Canadian Journal of Microbiology, 41: HOITINK, H.A.J. & P.C. FAHY Basis for the control of soilborne plant pathogens with compost. Annual Review Phytopathology, 24: KADO, C.I. & M.G. RESKETT Selective media for isolation of Agrobacterium, Corynebacterium, Erwinia, Pseudomonas and Xanthomonas. Phytopathology, 60: KING, E.O., M.K. WARD & D.E. RANEY Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. The Journal of Laboratory Clinical Medicine, 44: KLOEPPER, J.W., F.M. SCHER, M. LALIBERTÉ & I. ZALESCA Measuring the spermosphere colonizing capacity of bacterial inoculants. Canadian Journal of Microbiology, 31: KLOEPPER, J.W., F.M. SCHER, M. LALIBERTÉ & B. TIPPING Emergence promoting rhizobacteria: description and implications for agriculture. In: SWINBURN, T.R. (ed). Iron, Siderophores and Plant Disease. Plenum Press, New York, p KLOEPPER, J.W., R.M. ZABLOTOWICZ & R. LIFSHITZ Plant growth-promoting mediated by rhizosphere colonizers. In: KEISTER, D.L. & P.B. CREGAN (ed). The Rhizosphere and Plant Growth. Academic Publishers, Dordrecht, p MAZZOLA, M., W.P. STHALMAN & J. E. LEACH Application method affects the distribution and efficacy of rhizobacteria suppressive of downy brome (Bromus tectorum). Soil Biology and Biochemistry, 27 (10): NEIPP, P.W. & J.O. BECKER Evaluation of biocontrol activity of rhizobacteria from Beta vulgaris vulgaris against Heterodera schachtii. Journal of Nematology, 31 (1): NEVES, W.S., L.G. FREITAS, M.M. COUTINHO, D.F. PARREIRA, S. FERRAZ. & M.D. COSTA. Biofumigação do solo com espécies de brássicas para o controle de Meloidogyne javanica. Nematologia Brasileira, 31(3): OOSTENDORP, M. & R.A. SIKORA Seed treatment with antagonistic rhizobacteria for the suppression of Heterodera schachtii early root infection of sugar beet. Review Nematology, 12: OOSTENDORP, M. & R.A. SIKORA In vitro interrelationships between rhizosphere bacteria and Heterodera schachtii. Review Nematology, 14: RACKE, J. & R.A. SIKORA Influence of the plant health-promoting rhizobacteria Agrobacterium radiobacter and Bacillus sphaericus on Globodera pallida root infection of potato and subsequent plant growth. Journal of Phytopathology, 134: SASSER, J.N Plant parasitic nematodes: The farmer s hidden enemy. University Graphics - North Carolina State University, Raleigh (EUA), 114 p. SASSER, J.N. & D.W. FRECKMAN A world perspective on nematology: the role of the society. In: VEECH, J.A. & D.W. DICKSON (ed) Vistas on Nematology. Society of Nematologists, Hyattsville (EUA), p STAPLETON, J.J. & J.E. DEVAY Response of phytoparasitic and free-living nematodes to soil solarization and 1,3-dichloropropene in California. Phytopathology, 73: STEVENS, C., V.A. KHAN, R. RODRIGUEZ-KABANA, L.D. PLOPER, P.A. BACKMAN, D.J. COLLINS, J.E. BROWN & M.A. WILSON Integration of soil solarization with chemical, biological and cultural control for the management of soilborne diseases of vegetables. Plant and Soils, 253: WELLER, D.M Biological control of soil-borne plant pathogens in the rhizosphere with bacteria. Annual Review of Phytopathology, 26: Vol. 33(2)

27 ARTIGO Cultivo e Incorporação de Leguminosas, Gramíneas e Outras Plantas no Controle de Meloidogyne incognita Raça 1 em Cenoura Nantes Cultivo e Incorporação de Leguminosas, Gramíneas e Outras Plantas no Controle de Meloidogyne incognita Raça 1 em Cenoura Nantes João M. Charchar*, Jairo V. Vieira, Valter R. Oliveira & Antônio W. Moita Embrapa Hortaliças, Brasília (DF) Brasil. *Autor para correspondência: charchar@cnph.embrapa.br Recebido para publicação em 28 / 03 / Aceito em 23 / 12 / 2008 Editado por Mário Inomoto Resumo Charchar, J.M., J.V. Vieira, V.R. Oliveira & A.W. Moita Cultivo e incorporação de leguminosas, gramíneas e outras plantas no controle de Meloidogyne incognita raça 1 em cenoura Nantes. Dois experimentos foram feitos para avaliação do cultivo seguido de incorporação da biomassa das plantas (leguminosas, gramíneas e outras plantas) no controle de Meloidogyne incognita raça 1 em cenoura Nantes no campo. No primeiro experimento, a biomassa de Crotalaria spectabilis, C. paulina, Stylosanthes guyanensis e Tagetes erecta (cravo-de-defunto) e, no segundo experimento, a biomassa de milho doce Doce Cristal, milho amarelo AG-1051, sorgo Brand 501 e Thesis 503 e trigo-sarraceno Konan foram trituradas e incorporadas ao solo na profundidade de cm, em áreas infestadas com M. incognita raça 1. Parcelas em alqueive e com quiabeiro Santa Cruz 47 (suscetível a M. incognita) foram incluídas para comparação com os tratamentos. Não ocorreu infecção das raízes comerciais de Nantes por M. incognita raça 1 e a produtividade de raízes de Nantes foi 3 a 9 x maior no primeiro experimento (leguminosas e cravo-de-defunto), em comparação com o segundo (gramíneas e trigo-sarraceno). O cultivo seguido de incorporação da biomassa de gramíneas e de trigo-sarraceno permitiu infecção por M. incognita raça 1 em raízes de cenoura Nantes, que variou de 79,3 a 95,8 %. Palavras-chaves: Daucus carota, nematoide- de-galhas, adubo verde, manejo. Summary Charchar, J.M., J.V. Vieira, V.R. Oliveira & A.W. Moita Cultivation and incorporation of legumes, gramineous, and other plants to control Meloidogyne incognita race 1 on carrot Nantes. Two experiments were done to evaluated the cultivation following biomass incorporation of the plants (leguminous, graminaceous and others plants) in the soil to control Meloidogyne incognita race 1 on carrot Nantes in the field. In the first experiment, biomass of Crotalaria spectabilis, C. paulina, Stylosanthes guyanensis, and of Tagetes erecta (marigold), and in second experiment, biomass of sweet-corn Doce Cristal, yellow-corn AG- 1051, sorghum Brand 501 and Thesis 503 and of buckwheat Konan were triturated and incorporated 20 to 25 cm deep in the soil, after cultivation for 80 days, in fields infested with Meloidogyne incognita race 1. Plots in fallow or cultivated with okra Santa Cruz 47 (susceptible to M. incognita) were included for comparison. After leguminous and marigold (experiment 1) the infection on Nantes roots by the nematode was zero (0 %), as well as the Nantes yielded 3 to 9 x higher than after gramineous and buckwheat (experiment 2). The cultivation followed by incorporation of gramineous and buckwheat allowed infection by M. incognita race 1 varying from 79.3 to 95.8 % on roots of carrot Nantes, in the same field conditions. Key words: Daucus carota, root-knot nematodes, green-manure, management. Introdução O nematoide-das-galhas Meloidogyne incognita (Kofoid & White) Chitwood raça 1 é a espécie que ocorre com maior frequência em cultivos de cenoura (Daucus carota), ervilha (Pisum sativum) e feijão (Phaseolus vulgaris) no Distrito Federal (Charchar, 1995). Nos Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 139

28 João M. Charchar, Jairo V. Vieira, Valter R. Oliveira & Antônio W. Moita cultivos de ervilha e de feijão irrigados pelos sistemas de aspersão convencional e pivô, a rotação prévia com crotalárias (Crotalaria spectabilis ou C. juncea), milho (Zea mays) e sorgo (Sorghum vulgare) é prática utilizada pelos agricultores para redução populacional de nematoides do gênero Meloidogyne (Charchar & Vieira, 1991; Charchar & Aragão, 2003; Charchar et al., 2005). Para o cultivo da cenoura, a rotação com leguminosas e gramíneas tem sido usada com frequência no controle de Meloidogyne spp. na região de cerrado do Centro- Oeste do Brasil (Huang et al., 1980; Charchar & Vieira, 1991; 1994). As leguminosas atuam principalmente como agentes antagônicos e alelopáticos à Meloidogyne spp. (Charchar & Vieira, 1991; Johnson et al., 1992; Charchar & Moita, 1995; Chavarría-Carvajal & Rodríguez-Kábana, 1998). Gramíneas são plantas também citadas como antagônicas de nematoides das galhas (Brito & Ferraz, 1987; Mojtahedi et al., 1993; Macguidwin & Layne, 1995; Dias-Arieira et al., 2003). Crotalárias, estilosantes e mucunas são utilizadas também como fontes de nutrientes e de matéria orgânica em solos de cerrado com baixa fertilidade (Magalhães et al., 1991). Em cultivares suscetíveis de hortaliças, é possível observar perdas no verão causadas por Meloidogyne spp., mesmo após rotação com crotalárias, estilosantes, mucunas, milho e sorgo. Isso ocorre em consequência da presença de inóculo residual, que sobrevive após a rotação e que, existindo condições de temperatura e umidade elevadas do solo, aumentam rapidamente nas raízes das hortaliças (Charchar & Aragão, 2005). O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de leguminosas, gramíneas e outras plantas antagônicas no controle de M. incognita raça 1, em solos de cerrado cultivados com cenoura Nantes. Material e Métodos Dois experimentos com cenoura foram instalados separadamente em áreas contíguas do campo experimental da Embrapa Hortaliças, Brasília (DF), em solos classificados como latossolo vermelho escuro (LVE) com 12 % de areia, 19 % de silte, 69 % de argila e ph 5,9. Os experimentos foram conduzidos na época de primavera-outono (setembro de 2000 a abril de 2001), coincidindo com o período chuvoso, para a avaliação da ocorrência de danos causado por Meloidogyne incognita raça 1 em cenoura Nantes, cultivada após o cultivo e incorporação da biomassa de leguminosas, gramíneas e outras plantas antagônicas ao solo. As duas áreas experimentais foram infestadas com M. incognita raça 1, inicialmente cultivando-se o quiabeiro Santa Cruz 47 no espaçamento de 0,50 x 0,50 m, por 120 dias. Suspensão contendo ovos da população do nematoide foi inoculada nas raízes de cada planta de quiabeiro aos 30 dias após a semeadura. Após a eliminação do quiabeiro, demarcaram-se parcelas (canteiros) medindo 2,0 m 2 (1,0 x 2,0 m) nas duas áreas experimentais. Os canteiros foram levantados com auxílio de enxada rotativa e de encanteirador tratorizados. No experimento 1, incluíram-se como tratamentos as espécies Crotalaria spectabilis, C. paulina Schrank e Stylosanthes guyanensis (Leguminosae), além do cravode-defunto Tagetes erecta L. (Compositae). Os tratamentos no experimento 2 foram milho doce Doce Cristal, milho amarelo AG-1051, sorgo Brand 501 e Thesis 503 (Gramineae), além do trigosarraceno Konan Fagopyrum esculentum Moench (Polygonaceae). Foram incluídos ainda, nos dois experimentos, um tratamento com alqueive (parcelas mantidas limpas com capinas manuais) e um tratamento testemunha cultivado com quiabeiro Santa Cruz 47 (suscetível). As espécies vegetais foram semeadas em quatro linhas distanciadas em 20 cm no canteiro. Nas linhas, as leguminosas, cravo-de-defunto e trigo-sarraceno foram semeados no espaçamento de 10 cm entre plantas, enquanto as gramíneas semeadas no espaçamento de 20 cm. As parcelas com plantas foram mantidas em cultivo durante 80 dias. Após o período, as plantas foram cortadas na região do colo e toda parte aérea, incluindo hastes e folhas, foi triturada com auxílio de equipamento tratorizado. A biomassa aérea de cada espécie foi coletada em saco de lona acoplado e depois distribuída uniformemente nos canteiros restabelecidos nas parcelas experimentais. Imediatamente após o corte das espécies vegetais e restabelecimento dos canteiros, procedeu-se à incorporação da massa verde de cada espécie até a profundidade de cm, com auxílio da enxada rotativa tratorizada. Após a incorporação, 140 Vol. 33(2)

29 Cultivo e Incorporação de Leguminosas, Gramíneas e Outras Plantas no Controle de Meloidogyne incognita Raça 1 em Cenoura Nantes as áreas foram irrigadas por aspersão duas vezes por semana. A operação de revolvimento foi repetida semanalmente, no total de cinco vezes, para acelerar o processo de decomposição da biomassa. O alqueive foi mantido por capinas manuais por 120 dias. A cenoura Nantes foi semeada em quatro linhas horizontais distanciadas 20 cm entre si nas parcelas (canteiros), aos 40 dias após a incorporação das plantas (= 120 dias após a semeadura das plantas). O ciclo vegetativo da cenoura Nantes nos experimentos foi de 110 dias. As adubações de ambos os experimentos para manutenção das plantas testadas e da cenoura Nantes consistiram da aplicação de 300 g / m 2 de NPK formulação A adubação de cobertura da cenoura com 100 g / m 2 de sulfato de amônio foi feita aos 30 dias após a semeadura, no desbaste da cenoura. As áreas experimentais foram irrigadas por aspersão e a temperatura do solo foi monitorada através de termógrafo automático, com dois sensores de temperatura enterrados a 20 cm de profundidade e distanciados de 10 m, em cada experimento. A temperatura do solo foi monitorada desde o início do período rotacional até a colheita da cenoura. Amostras de 2 kg de solo foram coletadas de cinco pontos distintos por parcela nos dois experimentos, para a determinação das populações inicial (Pi), intermediária (Pint) e final (Pf) do nematoide. A Pi foi obtida antes do semeadura das plantas antagônicas, a Pint imediatamente antes da semeadura da cenoura e a Pf na colheita da cenoura. As amostras foram homogeneizadas para a retirada de subamostras de 200 cm 3, usadas para estimar as Pi, Pint e Pf de M. incognita raça 1 no solo. As Pi, Pint e Pf foram estimadas pela contagem do número de juvenis do segundo estádio (J 2 ) do nematoide, pelos processos de extração descritos por Flegg & Hooper (1970) e de Jenkins (1964). Os fatores de reprodução (FR1 e FR2) do nematoide foram determinados pelas relações FR1=Pint / Pi e FR2 = Pf / Pint. A infecção (I) de M. incognita raça 1 em cenoura Nantes foi avaliada com base na presença de galhas nas raízes comerciais, com a separação de três classes distintas de raízes: (1) raízes comerciais sem galhas, (2) raízes comerciais com galhas, e (3) raízes refugos. Raízes com 12,0 cm de comprimento ou superior foram consideradas comerciais. A produtividade (PROD) em toneladas por hectare de raízes comerciais foi obtida pela somatória da massa de raízes comerciais com galhas (MRCG) e massa de raízes comerciais sem galhas (MRSG). Também foi calculada a percentagem de raízes comerciais com galhas (%RCG), usando a seguinte fórmula [%RCG = (MRCG / PROD) x 100]. O delineamento experimental dos dois experimentos foi o de blocos ao acaso, com seis repetições. A análise de variância para os dois experimentos foi feita com base no programa SAS e a diferenciação de médias pelo teste de Tukey (P 0,05). Resultados e Discussão A temperatura do solo a 20 cm de profundidade variou nos dois experimentos de 18,5 a 30,0 ºC, no período de setembro de 2000 a abril de Os valores médios da população inicial (Pi) de M. incognita raça 1, estimados após o cultivo de quiabeiro, variaram de 79 a 191 J 2 no experimento 1 e de 103 a 191 no experimento 2. Não houve diferença significativa entre as médias de Pi obtidas nos dois experimentos, mostrando que a infestação das duas áreas experimentais com a população de M. incognita raça 1 foi uniforme (Figuras 1 e 2). O cultivo e a incorporação da biomassa de leguminosas e de cravode-defunto reduziram o número de J 2 do nematoide em cerca de 99,6 % em relação à parcela com quiabeiro (Figura 1). O cultivo e a incorporação de gramíneas e de trigo-sarraceno reduziram o número de J 2 em até 91,9 % (Figura 2). Portanto, as espécies de leguminosas e de gramíneas, o cravo-de-defunto e o trigosarraceno foram eficientes na redução do número de J 2, sendo que as leguminosas aparentemente exerceram efeitos mais efetivos sobre a população de M. incognita raça 1 que as gramíneas (Figuras 1 e 2). Nos tratamentos com leguminosas, cravo-dedefunto e alqueive, as Pint do nematoide não diferiram entre si, mas diferiram do quiabeiro (Figura 1). No experimento 2 (gramíneas e trigo-sarraceno), semelhante ao ocorrido no experimento 1 (leguminosas e cravo-de-defunto), a Pint na testemunha (quiabeiro) foi estatisticamente superior aos demais tratamentos, entre os quais o sorgo Thesis 503 resultou em Pint menor e não diferiu dos tratamentos com alqueive e com milho amarelo (Figura 2). O Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 141

30 João M. Charchar, Jairo V. Vieira, Valter R. Oliveira & Antônio W. Moita a 178 a 187 a ,8 a a 132 a Produtividade (t/ha) FR 2 FR 1 Pi ,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0, a Tratamentos de rotação 1,53 a 0,04 b 0,02 b 0,01 b 0,02 b 0,01 b Tratamentos de rotação 31,3 a 30,3 a 28,3 a 19,8 a 15,2 a 5,5 a Tratamentos de rotação 72,8 a 72,2 a 65,2 a 59,3 a 63,0 a 0,0 b Refugos (t/ha) Infecção de raízes (%) Pf Pint ,0 b 1,8 b 1,0 b 1,0 b 1,0 b Tratamentos de rotação 1.670,0 a 19,8 b 45,5 b 31,3 b 15,2 b 30,3 b Tratamentos de rotação Tratamentos de rotação 47,0 a 26,4 b 18,0 b 21,0 b 16,2 b 17,4 b Tratamentos de rotação Tratamentos de rotação Figura 1 - Efeitos do cultivo e incorporação da biomassa de leguminosas (1-Crotalaria spectabilis, 2-C. paulina e 3- Stylosanthes guyanensis), cravo-de-defunto (4) e quiabeiro Santa Cruz 47 (6), em comparação ao alqueive (5), na população inicial (Pi), intermediária (Pint), final (Pf), fator de reprodução (FR1 e FR2) de Meloidogyne incognita raça 1, na produtividade de raízes comercias e de refugos da cenoura Nantes, e na percentagem de infecção de raízes comerciais por M. incognita raça 1. Médias seguidas da mesma letra não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey (P 0,05). 142 Vol. 33(2)

31 Cultivo e Incorporação de Leguminosas, Gramíneas e Outras Plantas no Controle de Meloidogyne incognita Raça 1 em Cenoura Nantes Produtividade (t/ha) FR 2 FR 1 Pi ,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, a 186 a 175 a 145 a 159 a 119 a 103 a Tratamentos de rotação 1,77 a 0,17 bc 0,12 bc 0,24 bc 0,08 c 0,34 b 0,21 bc Tratamentos de rotação 8,7 a 4,5 ab 3,6 ab 3,7 ab 3,7 ab 2,7 b 2,9 b Tratamentos de rotação 24,3 a 22,3 ab 15,5 bc 14,6 bcd 10,7 cde 6,5 de 4,6 e Refugos (t/ha) Infecção de raízes (%) Pf Pint ,5 c 13,3 de 19,9 cd 11,0 e 30,0 b 17,3 cde 279,2 a Tratamentos de rotação 2.420,0 a 60,5 b 66,5 b 71,3 b 39,8 b 91,3 b 68,7 b 85,9 bc Tratamentos de rotação 79,3 c 80,0 c 95,8 ab 93,3 abc 100,0 a 85,4 bc ,0 bc 4,6 b 4,7 b Tratamentos de rotação 3,3 bc 1,7 c 2,8 bc 23,9 a Tratamentos de rotação Tratamentos de rotação Figura 2 - Efeito do cultivo e incorporação com gramíneas (1-milho doce Doce Cristal, 2-milho amarelo AG-1051, 3-sorgo Brand 501 e 4-sorgo Thesis 503 ), trigo-sarraceno Konan (5) e quiabeiro Santa Cruz 47 (7), em comparação ao alqueive (6), na população inicial (Pi), intermediária (Pint), final (Pf), fator de reprodução (FR1 e FR2) de Meloidogyne incognita raça 1, na produtividade de raízes comercias e de refugos da cenoura Nantes, e na percentagem de infecção de raízes comerciais por M. incognita raça 1. Médias seguidas da mesma letra não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey (P 0,05). Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 143

32 João M. Charchar, Jairo V. Vieira, Valter R. Oliveira & Antônio W. Moita alqueive (parcela com capina manual) manteve a Pint do nematoide em nível baixo, semelhante aos níveis das espécies leguminosas, do cravo-de-defunto e das gramíneas. Portanto, pode-se considerar o alqueive também como tratamento eficiente no controle de M. incognita raça 1 (Figuras 1 e 2). O fator de reprodução FR1 de M. incognita raça 1 foi menor que 1,0 após o cultivo e incorporação da biomassa das espécies de leguminosas e de gramíneas, sendo que os FR1 do nematoide nas quatro gramíneas foi em média 6,5 vezes maiores que a média dos FR1 nas leguminosas, sugerindo que as gramíneas foram hospedeiras mais favoráveis à M. incognita raça 1 que as leguminosas (Figuras 1 e 2). Os valores de FR1 nas parcelas com cravo-de-defunto e alqueive também foram menores que 1,0 e não diferiram estatisticamente das leguminosas, indicando que ambos os tratamentos exerceram a mesma eficiência que as espécies leguminosas no controle do nematoide (Figura 1). No experimento 2, o trigo-sarraceno resultou em maior FR1 que o sorgo Thesis 503 e não diferiu dos demais (Figura 2). Em ambos os experimentos, o cultivo e a incorporação do quiabeiro resultaram em FR1 maior que 1,0, mostrando que a incorporação da sua biomassa não compensou sua suscetibilidade a M. incognita raça 1 (Figuras 1 e 2). Os valores de J 2 da população final (Pf) de M. incognita raça 1 foram estatisticamente iguais entre os tratamentos, exceto a testemunha (quiabeiro), em ambos os experimentos (Figuras 1 e 2). Os números médios de J 2 na Pf nos tratamentos com as espécies leguminosas e gramíneas foram, respectivamente, 1,9 e 2,5 % do valor de Pf da testemunha (Figuras 1 e 2). No trigo-sarraceno, a Pf do nematoide foi seis vezes maior que a Pf estimada em cravo-de-defunto, bem como a Pf do nematoide no alqueive adjacente no experimento 2 foi aproximadamente duas vezes maior que a Pf no alqueive no experimento 1 (Figuras 1 e 2). O fator de reprodução FR2 de M. incognita raça 1 não diferiu entre tratamentos no experimento com leguminosas e cravo-de-defunto (Figura 1). Porém, no experimento 2, o milho doce e o trigo-sarraceno não diferiram das demais gramíneas e alqueive, mas diferiram significativamente da testemunha (Figura 2). O FR2 médio nos tratamentos com leguminosas foi 26,5 e nos tratamentos com gramíneas foi 3,6 (Figuras 1 e 2), que pode ser compreendido pelos números elevados de J 2 de M. incognita raça 1 obtidos na fase de Pint com as gramíneas, que mantiveram os FR2 do nematoide mais baixos em relação às leguminosas. Nos experimento 1, não houve infecção de raízes comerciais de cenoura por M. incognita raça 1, exceto na testemunha (quiabeiro), que apresentou 100 % de raízes infectadas pelo nematoide (Figura 1). Milho amarelo e doce, sorgo Brand 501 e Thesis 503, por sua vez, proporcionaram percentagens de raízes com infecção por M. incognita raça 1 entre 79,3 a 85,9 %, que não diferiram entre si, mas foram estatisticamente inferiores ao valor obtido para a testemunha, cuja percentagem de raízes infectadas foi igual a 100 % (Figura 2). O trigo-sarraceno proporcionou 95,8 % de infecção de raízes de Nantes, não diferindo do alqueive com 93,3 % e da testemunha (Figura 2). No experimento 1, as produtividades de raízes comerciais de Nantes, que variaram de 59,3 a 72,8 t / ha nos tratamentos de leguminosas, cravo-dedefunto e alqueive, não diferiram estatisticamente entre si, mas foram superiores à testemunha (quiabeiro), que produziu somente raízes refugos (Figura 1). No experimento 2, a produtividade de Nantes com o milho amarelo (24,3 t / ha) superou significativamente as obtidas nos demais tratamentos, com exceção do tratamento com sorgo Brand 501 que proporcionou produtividade semelhante de 22,3 t / ha (Figura 2). Nos tratamentos com gramíneas, trigo-sarraceno e alqueive, a cenoura Nantes obteve produtividades de 3 a 9 x menores, comparado às leguminosas, ao cravo-de-defunto e ao alqueive, indicando que embora os últimos tenham proporcionado maiores FR2 do nematoide, houve o estímulo para maior produtividade da cenoura com as leguminosas, sem que houvesse infecção de raízes por M. incognita raça 1, demonstrando mais uma vez, que as leguminosas foram melhores antagonistas contra M. incognita raça 1 que as gramíneas, em condições de campo (Figuras 1 e 2). A quantidade de raízes refugo foi diretamente proporcional à produtividade de raízes comerciais, sendo que no experimento 1 a quantidade de refugos foi de 5,5 a 9,5 vezes maior, considerando que as produtividades de raízes comerciais foram de 3 a 9 x 144 Vol. 33(2)

33 Cultivo e Incorporação de Leguminosas, Gramíneas e Outras Plantas no Controle de Meloidogyne incognita Raça 1 em Cenoura Nantes maiores que no experimento 2. No tratamento de rotação e incorporação das plantas de quiabeiro, a quantidade de refugo da cenoura foi 2 x maior no experimento com leguminosas, comparado ao de gramíneas (Figuras 1 e 2). As gramíneas, juntamente com o trigo-sarraceno e o alqueive, não impediram a infecção das raízes de Nantes pelo nematoide (Figura 2), indicando que o cultivo e incorporação destas espécies vegetais não resultaram em benefício para a cenoura cultivada em sucessão. O contrário foi observado nos tratamentos com leguminosas, cravo-de-defunto e alqueive, onde não houve infecção das raízes comerciais de Nantes por M. incognita raça 1 (Figura 1). Provavelmente, as elevadas produtividades de Nantes, obtidas com o cultivo e incorporação prévias das leguminosas ao solo tenham sido originadas parcialmente em função dos nutrientes disponibilizados pela decomposição da matéria orgânica. Magalhães et al. (1991) relatam que as leguminosas e trigo-sarraceno, depois de decompostas no solo, disponibilizam elevados níveis de N, P, K, Ca e Mg para as plantas. Crotalárias, estilosantes e mucunas são utilizadas como agentes antagônicos e alelopáticos das espécies de Meloidogyne (Rodríguez-Kábana & Ivey, 1986; Chavarría-Carvajal & Rodríguez-Kábana, 1998). Charchar & Vieira (1991), relatam que a rotação com C. spectabilis, S. guyanensis e Centrosema pubescens por 120 dias controlou M. incognita raça 1 em cenoura Nantes em até 92,0 % no campo. Neste trabalho, confirmouse também que o cultivo seguido de incorporação da biomassa de leguminosas ao solo controlou em 100 % a infecção da cenoura Nantes por M. incognita raça 1. Há relatos de que a rotação e incorporação da biomassa de gramíneas ao solo pode exercer ação antagonista sobre Meloidogyne spp. (Rodríguez-Kábana & Touchton, 1984; Brito & Ferraz, 1987; Rodríguez- Kábana et al., 1990; Mojtahedi et al., 1993; Macguidwin & Layne, 1995; Dias-Arieira et al., 2003). Neste trabalho, o cultivo e incorporação da biomassa de gramíneas ao solo não controlou eficazmente a infecção por M. incognita raça 1 em cenoura Nantes, em condições de campo. As leguminosas forrageiras (estilosante, centrosema e mucuna preta) e as não forrageiras (crotalárias) são usadas em solos de cerrado do Brasil central com dupla finalidade, controle de Meloidogyne spp. e fornecimento de nutrientes e matéria orgânica. Neste trabalho, observou-se com grande evidência que as leguminosas exerceram melhor efeito antagônico sobre o nematoide-de-galhas M. incognita em relação às gramíneas, já que proporcionaram maiores produtividades da cenoura Nantes, em condições naturais de campo. Literatura Citada BRITO, J.A. & S. FERRAZ Seleção de gramíneas antagonistas a Meloidogyne javanica. Nematologia Brasileira, 11 (1): CHARCHAR, J.M Meloidogyne em hortaliças. In: CONGRESSO INTERNACIONAL DE NEMATOLOGIA TROPICAL, XXVII, Rio Quente. Resumos, p CHARCHAR, J.M. & A.W. MOITA, Declínio populacional de Meloidogyne incognita raça 1 em cenoura Nantes através da incorporação de plantas antagônicas, gramíneas e trigo-sarraceno. Fitopatologia Brasileira, 20 (S): 285 (Resumo). CHARCHAR, J.M. & F.A.S. ARAGÃO Seqüência de cultivos no controle de Meloidogyne javanica em campo. Nematologia Brasileira, 27 (1): CHARCHAR, J.M. & F.A.S. ARAGÃO Variação anual da população mista de Meloidogyne incognita raça 1 e M. javanica em cultivos de batata Bintje no campo. Nematologia Brasileira, 29 (2): CHARCHAR, J.M. & J.V. VIEIRA Controle de Meloidogyne incognita raça 1 em cenoura cv. Nantes através de rotação com plantas antagônicas. Fitopatologia Brasileira, 16 (3): CHARCHAR, J.M. & J.V. VIEIRA, Seleção de cenoura com resistência a nematóides de galhas (Meloidogyne spp.). Horticultura Brasileira, 12 (2): CHARCHAR, J.M., W.A. MAROUELLI, L.B. GIORDANO & F.A.S. ARAGÃO Reprodução de Meloidogyne incognita raça 1 e produtividade de cultivares de ervilha sob diferentes lâminas de água. Pesquisa Agropecuária Brasileira, 40 (10): CHAVARRÍA-CARVAJAL, J.A. & R. RODRÍGUEZ- KABANA Changes in soil enzymatic activity and control of Meloidogyne incognita using four organic amendments. Nematropica, 28 (1): DIAS-ARIEIRA, C.R., S. FERRAZ, E.H. MISOBUTSI & L.G. FREITAS Eficiência de gramíneas forrageiras no controle de Heterodera glycines e de populações compostas por H. glycines - Meloidogyne spp. Summa Phytopathologica, 29 (1): FLEGG, J.J. & D.J. HOOPER, Extraction of freeliving stages from soil. In: Southey, J.F. (ed.). Laboratory Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 145

34 João M. Charchar, Jairo V. Vieira, Valter R. Oliveira & Antônio W. Moita Methods for Working with Plant and Soil Nematodes. Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, London, 148p. (Tech. Bull. n. 2). HUANG, C.S., J.M. CHARCHAR & R.C.V. TENENTE Controle de nematóides das galhas em cenoura através de rotação. Fitopatologia Brasileira, 5 (3): JENKINS, W.R A rapid centrifugal flotation technique for separating nematode from soil. Plant Disease Reporter, 48: 62. JOHNSON, A.W., A.M. GOLDEN, D.L. AULD & D.R. SUMMER Effects of rapeseed and vetch as green manure crops and fallow on nematodes and soil-borne pathogens. Journal of Nematology, 24: MACGUIDWIN, A. & T.L. LAYNE Response of nematodes communities to sudangrass and sorghumsudangrass hybrids grown as green manure crops. Journal of Nematology, 27 (4): MAGALHÃES, J.C.A.J., R.F. VIEIRA, J. PEREIRA & J.R.R. PERES Efeito da adubação verde na disponibilidade de fósforo de fosfatos, numa sucessão de culturas, em solo de cerrado. Revista Brasileira da Ciência do Solo, 15 (3): MOJTAHEDI, H., G. SANTO & R.E. INGHAM Suppression of Meloidogyne chitwoodi with sudangrass cultivars as green manure. Journal of Nematology, 25 (3): RODRÍGUEZ-KÁBANA, R., D.B. WEAVER, D.G.ROBERTSON & E.L. CARDEN Sorghum in rotation with soybean for the management of cyst and root-knot nematodes. Nematropica, 20 (1): RODRÍGUEZ-KÁBANA, R. & H. IVEY Crop rotation systems for management of Meloidogyne arenaria in peanut. Nematropica, 16 (1): RODRÍGUEZ-KÁBANA, R. & J.T. TOUCHTON, Corn and sorghum rotational crops for management of Meloidogyne arenaria in peanut. Nematropica, 14 (1): Vol. 33(2)

35 ARTIGO Penetração, Desenvolvimento e Reprodução de Meloidogyne incognita Raça l e M. javanica em Cultivares de Batata no Campo Penetração, Desenvolvimento e Reprodução de Meloidogyne incognita Raça l e M. javanica em Cultivares de Batata no Campo João M. Charchar*, Valter R. Oliveira & Antônio W. Moita Embrapa Hortaliças, C. Postal 218, Brasília (DF) Brasil. *Autor para correspondência: charchar@cnph.embrapa.br Recebido para publicação em 25 / 08 /2008. Aceito em 25 / 04 / 2009 Editado por Mário Inomoto Resumo Charchar, J.M., V.R. Oliveira & A.W. Moita Penetração, desenvolvimento e reprodução de Meloidogyne incognita raça l e M. javanica em cultivares de batata no campo. Os ciclos de vida de Meloidogyne incognita raça 1 e M. javanica foram determinados em batata Achat e Baronesa no campo, em duas épocas de cultivo (seca e chuvosa). Na época seca, em que as médias de temperaturas mínimas e máximas no solo foram 19,7 e 23,9 C, M. incognita e M. javanica completaram seus ciclos 56 dias após inoculação com juvenis de segundo estádio (J 2 ) em Baronesa e 63 dias em Achat. A penetração de J 2 de ambos os nematoides foi detectada em raízes de Baronesa no 7 o. dia após a inoculação e em raízes de Achat no 14 o. dia. Terceiro (J 3 ) e quarto (J 4 ) estádios juvenis dos nematoides foram detectados em raízes de Baronesa e de Achat do 21 o. ao 42 o. dias após a inoculação, e as fêmeas sem e com massa de ovos foram detectadas a partir do 35 o. dia em raízes de Baronesa e a partir do 42 o. dia em raízes de Achat, detectandose os J 2 da segunda geração dos nematoides nos tubérculos de Baronesa e Achat no 56 o. e 63 o. dias após a inoculação, respectivamente. Na época chuvosa, com médias de temperaturas mínimas e máximas do solo de 24,6 e 29 C, as duas populações de nematoides completaram seus ciclos de vida aos 30 dias em Baronesa e aos 36 dias em Achat. A penetração de J 2 dos nematoides foi detectada em raízes de ambas as cultivares no 6 o. dia após a inoculação. Os estádios J 3 e J 4 dos nematoides foram detectados em raízes de ambas as cultivares entre o 12 o. e o 30 o. dia após a inoculação, e as fêmeas sem e com massa de ovos foram detectadas a partir do 24 o. dia em raízes de Baronesa e a partir do 30 o. dia em raízes de Achat. Considerando o ciclo vegetativo das cultivares de 110 dias no campo, os nematoides completaram 1,7 gerações (J 2 a J 2 ) em Achat e duas gerações em Baronesa na época seca, e três gerações em Achat e 3,7 gerações em Baronesa na época chuvosa, sendo que a primeira geração dos nematoides completou-se nas raízes e as demais gerações completaram-se nos tubérculos de ambas as cultivares de batata. Palavras-chaves: Solanum tuberosum, nematoides-de-galhas, ciclo de vida, biologia. Summary Charchar, J.M., V.R. Oliveira & A.W. Moita Penetration, development, and reproduction of Meloidogyne incognita race l and M. javanica on potato cultivars in the field. The life cycles of Meloidogyne incognita race 1 and M. javanica were determined on potato Achat and Baronesa, in two seasons (dry and rainy) in the field conditions of Brasília (Federal District) Brazil. In the dry season, in which the average minimum and maximum soil temperatures were 19.7 ºC and 23.9 ºC, Meloidogyne incognita race 1 and M. javanica completed their life cycles in 56 days after the inoculation with second stage juveniles (J 2 ) in roots of potato Baronesa and 63 days in roots of potato Achat. The penetration of J 2 of both nematodes was detected in roots of Baronesa seven days after inoculation and in the roots of Achat 14 days after inoculation. Third (J 3 ) and fourth (J 4 ) stage juveniles were detected in roots of Baronesa and Achat in the 21º. and 42º. day after inoculation respectively, and the females without and with egg masses were detected from the 35º. day in roots of Baronesa and from the 42º. day in roots of Achat. The J 2 of the second generation of the nematodes were detected in the tubers of Baronesa and Achat 56 and 63 days after inoculation respectively. Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 147

36 João M. Charchar, Valter R. Oliveira & Antônio W. Moita In the rainy season, with mean soil temperatures of 24.6 and 29.0 ºC, the nematodes completed their life cycles in 30 days in Baronesa and 36 days in Achat. The penetration of J 2 of both nematodes was detected in the roots of both cultivars in the first evaluation (sixth day after the inoculation). The stages J 3 and J 4 of both nematodes were detected in the roots of both cultivars between the 12º. and the 30º. day after the inoculation, and the female without and with egg masses were detected from the 24º. day in the roots of Baronesa and from the 30º. day in the roots of Achat. Considering the vegetative cycles of both potato cultivars of the 110 days in the field, the nematodes completed 1.7 generations (J 2 to J 2 ) in Achat and two generations in Baronesa in the dry season, and three generations in Achat and 3.7 generations in Baronesa in the rainy season. The first generation occurred in roots and the others generations in the tubers of the both potato cultivars. Key words: Solanum tuberosum, root-knot nematodes, life cycle, biology. Introdução A batata (Solanum tuberosum) é uma das mais importantes hortaliças cultivadas no Brasil. Em 2007, a área total cultivada foi de hectares, com a produção total de toneladas de tubérculos (IBGE, 2008). Os estados de Minas Gerais, São Paulo e Paraná foram os maiores produtores e responderam por 70 % da área cultivada e 73 % da produção nacional (FNP - Consultoria e Comércio, 2000). Aproximadamente 60 % da área cultivada com batatas são infestadas por nematoides de galhas, Meloidogyne incognita e M. javanica isoladamente ou em combinação (Charchar, 1995). Os nematoides causam danos severos na produção por reduzirem a qualidade dos tubérculos, inviabilizando-os para a comercialização e consumo, principalmente quando as duas espécies ocorrem simultaneamente (Charchar & Moita, 1996, 1997, 2001). Levantamentos realizados em áreas de produção no Brasil indicaram que M. incognita e M. javanica foram as espécies mais frequentes nos cultivos de batata, enquanto que M. arenaria e M. hapla tiveram ocorrências restritas (Charchar, 1997). A alta incidência de M. incognita e M. javanica é atribuída à habilidade de se reproduzirem em uma faixa ampla de temperaturas (18,0 a 31,5 ºC), diferentemente de M. arenaria e M. hapla que requerem temperaturas mais baixas e mais constantes (Charchar & Moita, 2001). As temperaturas que ocorrem durante as épocas de produção de batata enquadram-se melhor entre os limites ótimos para penetração, desenvolvimento e reprodução de M. incognita e M. javanica, mas nem sempre entre os limites de M. arenaria e M. hapla. As espécies M. incognita e M. javanica são capazes de se estabelecer no cultivo de batata quando a temperatura ainda é baixa (± 18ºC), acelerando o ciclo de vida com o aumento da temperatura, o que resulta em maior número de gerações dos nematoides à medida que os cultivos se aproximam do período de verão (Charchar, 1995; Charchar, 1997; Charchar & Aragão, 2005). Informações relativas aos ciclos de vida de Meloidogyne spp. em batata obtidas no campo ainda não estão disponíveis no Brasil. Ferris (1976) relata que a determinação do ciclo de vida das espécies de nematoides é importante para estabelecer modelos preventivos de controle. Os métodos mais usuais de controle dos nematoides em batata são a rotação de culturas com gramíneas e leguminosas antagônicas (Charchar, 1981; 1995) e a aplicação de nematicidas (Zem et al., 1981; Weingartner et al., 1993; Charchar et al., 2003). Os nematicidas registrados para o cultivo da batata são aldicarbe e carbofuram, ambos carbamatos granulados sistêmicos, e o etoprofós, organofosforado granulado de contato. São usualmente aplicados 25 a 30 kg (produto comercial Temik 100G) / ha de aldicarbe ou 60 a 80 kg (produto comercial Furadan 50G) / ha de carbofuram em 80 % das áreas cultivadas no país, que elevam os custos de produção da batata em até 25 % (Charchar, 1995). O etoprofós (nome comercial Rhocap) ainda não é aplicado extensivamente nos cultivos de batata no Brasil. O objetivo deste trabalho foi estudar os ciclos de vida de M. incognita raça l e de M. javanica em batata Achat e Baronesa nas épocas seca e chuvosa no Distrito Federal, para prognosticar o tempo mínimo para a formação inicial de massas de ovos dos nematoides nas raízes e fornecer subsídios para o 148 Vol. 33(2)

37 Penetração, Desenvolvimento e Reprodução de Meloidogyne incognita Raça l e M. javanica em Cultivares de Batata no Campo estabelecimento de medidas preventivas à infecção de tubérculos. Material e Métodos Os ciclos de vida e os aspectos biológicos das espécies Meloidogyne incognita raça 1 e M. javanica foram monitorados em solo do tipo latossolo vermelho escuro (LVE) com 12 % de areia, 30 % de silte, 58 % de argila e ph 5,7, localizado na área experimental da Embrapa Hortaliças, em Brasília (DF), no período de 2001 a 2003, em batata Achat (com resistência moderada aos nematoides) e Baronesa (suscetível aos nematoides). Os experimentos foram instalados em duas épocas de cultivo, de maio a agosto (época seca) e de janeiro a abril (época chuvosa). Os mesmos procedimentos metodológicos foram utilizados no experimento da época seca e da época chuvosa. Para o estabelecimento das unidades experimentais, denominadas de microparcelas, foram confeccionados 60 recipientes metálicos cilíndricos com 60 cm de diâmetro e 70 cm de altura, contendo cinco furos de 10 cm de diâmetro no fundo (recipiente = microparcela). Estes recipientes foram dispostos no campo em duas filas de 30 cilindros e enterrados a 60 cm de profundidade. As filas foram distanciadas de 4 m e os cilindros separados em 1 m na fila. No fundo de cada cilindro, colocou-se uma camada de 10 cm de brita para facilitar a drenagem da água, completando-se o volume dos cilindros com a mistura composta de LVE e esterco de gado curtido, esterilizados em autoclave a 120 ºC, na proporção de 2:1 em volume. As 60 microparcelas foram divididas em três conjuntos de 20, constituindo os blocos, para a distribuição dos tratamentos. Em cada conjunto, dez microparcelas foram plantadas com três tubérculos de Achat e 10 com três tubérculos de Baronesa. Sete dias após o plantio, quatro microparcelas com Achat e quatro com Baronesa de cada um dos blocos foram inoculadas com juvenis de segundo estádio (J 2 ) de M. incognita raça 1, pipetando-se 500 J 2 em 25 ml de água por planta. Outras quato microparcelas com Achat e quatro com Baronesa de cada bloco foram inoculadas com J 2 de M. javanica por microparcela utilizando o mesmo procedimento. Mantiveram-se, em cada bloco, duas microparcelas cultivadas com Achat e duas com Baronesa sem inoculação como controle. O delineamento experimental utilizado foi o de blocos ao acaso em arranjo fatorial 2 x 2 (duas espécies de nematoides versus duas cultivares de batata) e três repetições. Os J 2 das duas espécies de nematoides utilizados como inóculos foram obtidos de populações puras mantidas em tomateiro Rutgers em condições de casa de vegetação. Os J 2 foram obtidos de suspensões de ovos sobre tela de 500 mesh (25 mm de abertura), incubados separadamente a 24 ºC por horas. A adubação por microparcela foi feita com a aplicação de 120 g da formulação no plantio e de 30 g de sulfato de amônio aos 30 e aos 60 dias após o plantio. A temperatura do solo nas microparcelas foi monitorada com termógrafo automático, com dois sensores enterrados a 25 cm de profundidade, colocados um em cada fila de microparcelas, mantendo-se a distância entre sensores de 10 m. A irrigação das plantas foi feita por aspersão. Para a determinação das fases dos ciclos de vida dos nematoides, as raízes das plantas de batata foram coletadas a cada sete dias após a inoculação na época seca, e a cada seis dias na época chuvosa, sem danificar a planta, determinando-se o tempo mínimo, em dias, entre a inoculação e a penetração de J 2 dos nematoides em raízes, bem como o tempo mínimo em dias para a penetração de tubérculos por J 2 da segunda geração. Como outros fatores biológicos relacionados aos ciclos de vida dos nematoides, determinaram-se os tempos mínimos em dias para o desenvolvimento de juvenis de terceiro (J 3 ) e de quarto (J 4 ) estádios, bem como os tempos mínimos para o desenvolvimento de fêmeas sem massa de ovos (F) e para o desenvolvimento de fêmeas adultas com massa de ovos (FMO) completamente desenvolvidas.para a detecção da penetração e do desenvolvimento dos nematoides, as raízes coletadas foram lavadas para a retirada do solo aderente, enxugadas com papel toalha e coloridas pela técnica de NaOCl fuccina ácida (Byrd et al., 1983), para a visualização dos nematoides no interior das raízes. Aos 35 dias após a inoculação na época seca e aos 24 dias na época chuvosa, iniciaram-se as coletas de tubérculos. Colheram-se três tubérculos semanalmente na época seca e três tubérculos a cada seis dias na Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 149

38 João M. Charchar, Valter R. Oliveira & Antônio W. Moita época chuvosa, por microparcela, coletando-se um tubérculo por planta. Os tubérculos foram lavados em água corrente com a remoção da periderme. Seções finas dos mesmos foram cortadas a uma profundidade de até 1,0 mm da superfície e coloridas com a técnica de NaOCl fuccina ácida, para visualização e contagem do número de J 2 da segunda geração dos nematoides penetrados nos tubérculos. Para avaliação da reprodução dos nematoides, as raízes coletadas a partir da terceira semana após a inoculação na época seca e a partir da segunda semana após a inoculação na época chuvosa, depois de lavadas, enxugadas e pesadas, foram coloridas primeiramente com floxina B (Dickson & Struble, 1965), para detecção e contagem do número de fêmeas com massas de ovos (FMO), e em seguida agitadas em solução de NaOCl a 1 % (Hussey & Barker, 1973), para separação e contagem do número de ovos por massa. Finalmente, com a coloração das raízes pela técnica de NaOCl fuccina ácida, quantificou-se o número total de fêmeas de nematoides no interior das raízes. Os números dos diferentes estádios (J 2, J 3, J 4 e F) e de FMO, bem como os números de ovos por massa (NO/M) dos nematoides nas cultivares de batata foram quantificados sob microscópio com aumentos de até 40 vezes. Os estádios J 3 e J 4 foram agrupados para contagem (J 3 +J 4 ) pela dificuldade de separação dos mesmos. A análise de variância dos experimentos foi feita com o auxílio do programa SAS e a diferenciação de médias baseou-se no teste de Tukey (P 0,05). Resultados e Discussão Ciclo de vida. No experimento de época seca, quando a temperatura média do solo variou de 19,7 a 23,9 ºC, M. incognita raça 1 e M. javanica requereram 63 dias para completar o ciclo de vida (de J 2 a J 2 ) na batata Achat e 56 dias em Baronesa. Na época chuvosa, com a temperatura média variando de 24,6 a 29,0 ºC, foram necessários 36 dias para os nematoides completarem o ciclo de vida em Achat e 30 dias na Baronesa (Tabela 1). Os nematoides apresentaram ciclos de vida mais curtos em Baronesa (sete dias mais curto na época seca e seis dias mais curto na época chuvosa), pelo fato que Achat tem resistência e Baronesa suscetibilidade aos nematoides (Tabela 1). Penetração. Na época seca, a penetração dos J 2 de M. incognita e de M. javanica foi detectada em raízes de Baronesa logo na primeira avaliação após a inoculação (aos sete dias após a inoculação), enquanto a penetração em Achat foi detectada aos 14 dias após a inoculação (Tabela 1). Na época chuvosa, a penetração dos J 2 de ambas as espécies de nematoides foi detectada nas duas cultivares de batata na primeira avaliação, no sexto dia após a inoculação. Em ambas as espécies de nematoides, os J 2 foram detectados em raízes de Achat e de Baronesa até o 21º. dia após a inoculação na época seca, e até o 12º. dia após a inoculação na época chuvosa (Tabela 1). Na época seca, não houve diferenças entre as espécies de nematoides quanto ao número de J 2 penetrados nas raízes em ambas as cultivares de batata (Tabela 2). Na época chuvosa, igual número de J 2 de ambos os nematoides penetrou raízes de Achat, mas o número de J 2 de M. incognita raça 1 que penetrou as raízes da cultivar Baronesa foi significativamente maior (Tabela 2). Não houve diferença entre cultivares de batata em relação ao número de J 2 de M. incognita raça 1 penetrados na época seca. Na época chuvosa, houve significativamente maior número de J 2 penetrados em Baronesa que em Achat (Tabela 2). Com relação a M. javanica, houve diferenças entre cultivares na época seca e os J 2 penetraram em maior número nas raízes de Baronesa, enquanto na época chuvosa Achat foi a cultivar de batata na qual se detectou maior quantidade de J 2 penetrados (Tabela 2). A infecção de tubérculos por J 2 das duas espécies de nematoides ocorreu através das lenticelas superficiais. Em Achat, os J 2 penetraram mais tardiamente que em Baronesa na época seca, indicando que o retardamento de abertura das lenticelas nos tubérculos de Achat funcionou como mecanismo de resistência desta cultivar à penetração dos nematoides (Charchar & Moita, 2001). Desenvolvimento. Terceiro e quarto estádios juvenis (J 3 + J 4 ) foram observados em raízes de Achat e de Baronesa entre o 21 o. e 42 o. dia após a inoculação na época seca, e entre o 12 o. e 30 o. dias após a inoculação na época chuvosa (Tabela 1). Na época seca, fêmeas imaturas sem massa de ovos (F) de M. 150 Vol. 33(2)

39 Penetração, Desenvolvimento e Reprodução de Meloidogyne incognita Raça l e M. javanica em Cultivares de Batata no Campo Tabela 1 - Dias requeridos para penetração, desenvolvimento e reprodução dos estádios (J 2, J 3 e J 4 correspondem ao segundo, terceiro e quarto estádios juvenis; F, FMO e NO/M correspondem a fêmeas sem massa de ovos, fêmeas com massa de ovos e aos números de ovos por massa) de Meloidogyne incognita raça 1 e de M. javanica em cultivares de batata, nas épocas seca e chuvosa no campo Meloidogyne incognita raça l Meloidogyne javanica Achat Baronesa Achat Baronesa Temperatura 2 Dias 1 Raiz Tub. 3 Raiz Tub. Raiz Tub. Raiz Tub. ( C) J 2 J 3 +J 4 F FM NO/M J 2 J 2 J 3 +J 4 F FM NO/M J 2 J2 J3+J4 F FM NO/M J 2 J 2 J 3 +J 4 F FM NO/M J 2 Mín. Máx. Época seca (maio a setembro) ,5 20, ,6 23, ,6 24, ,3 23, ,2 23, ,5 23, ,5 24, ,1 25, NA NA 6 21,7 26,1 Médias 19,7 23,9 Época chuvosa (dezembro a março) ,8 31, ,1 29, ,9 28, ,1 28, ,1 28, NA NA 23,7 28,8 Médias 24,6 29,0 1 Dias após a inoculação com J 2 M. incognita raça l e de M. javanica. 2 Médias das temperaturas mínimas (Mín.) e máximas (Máx.) registradas diariamente. 3 Tubérculo. 4 Não detectado. 5 Não analisado. Tabela 2 - Números médios de espécimes (J 2, J 3 e J 4 correspondem ao segundo, terceiro e quarto estádios juvenis; F, FMO e NO/M correspondem a fêmeas sem massa de ovos, fêmeas com massa de ovos e aos números de ovos por massa) de Meloidogyne incognita raça l (MI) e M. javanica (MJ) observadas em raízes de batata Achat e de Baronesa, nas épocas seca e chuvosa no campo. Cultivar J 2 J 3 + J 4 F FMO NO/M M I MJ Média M I MJ Média M I MJ Média M I MJ Média M I MJ Média Época seca (maio a agosto) Achat 11,5 Aa 7,0 Ab 9,3 12,2Aa 9,3 Ab 10,8 4,5Ab 8,5 Ab 6,5 5,5 10,6 8,1 b 190,5 Bb291,3Aa 240,9 Baronesa 12,0 Aa 19,2 Aa 15,6 16,3Aa 22,0 Aa 19,1 100,8Aa 70,1 Ba 85,4 95,8 105,1 100,5 a 294,8 Aa 218,0Ba 256,4 Média 11,8 13,1 14,2 15,7 52,7 39,2 50,7B 57,9A 242,7 254,7 Época chuvosa (janeiro a abril) Achat 11,5 Ab 15,0 Aa 13,3 9,8 9,5 9,6 b 2,5 Aa 9,2 Ab 5,8 7,0 13,0 10,0 b 241,3 Aa261,7 Aa 251,5 Baronesa 26,0 Aa 7,0 Bb 16,5 22,7 26,3 24,5a 8,3 Ba 37,3 Aa 22,8 11,2 22,7 17,0 a 246,7 Ba327,0 Aa 286,8 Média 18,8 11,0 16,2 A 17,9 A 5,4 23,3 9,1 B 17,8 A 244,0 294,3 Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na linha não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey (P 0,05). incognita e de M. javanica foram detectadas em raízes de Baronesa a partir do 35 o. dia após a inoculação e em raízes de Achat sete dias mais tarde (Tabela 1). Na época chuvosa, o retardamento na detecção de fêmeas sem massa de ovos em Achat em relação a Baronesa se repetiu, detectando-se as fêmeas a partir do 24 o. dia após a inoculação em Baronesa e a partir do 30 o. dia após a inoculação em Achat (Tabela 1). Em ambas as épocas, não houve diferenças significativas entre as espécies de nematoides quanto ao número de J 3 + J 4 desenvolvidos a partir de J 2 em nenhuma das cultivares (Tabela 2). Por sua vez, o número de J 3 + J 4 de M. javanica em Baronesa na época chuvosa foi aproximadamente 2,5 vezes maior que em Achat. Na época seca, o número de J 3 + J 4 em Baronesa também foi maior que em Achat, mas apenas para M. javanica, não se detectando diferenças entre médias de cultivares para M. incognita (Tabela 2). Os números de fêmeas sem massa de ovos (F) das duas populações de nematoides foram iguais em ambas as épocas em raízes de Achat (Tabela 2). Em Baronesa, o F de M. incognita foi maior que de M. Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 151

40 João M. Charchar, Valter R. Oliveira & Antônio W. Moita javanica na época seca, enquanto na época chuvosa o resultado foi inverso (Tabela 2). De modo geral, os valores de F para os dois nematoides foram maiores em Baronesa do que em Achat. Na época seca, o valor de F em Baronesa foi 22 vezes maior que em Achat para M. incognita e oito vezes maior para M. javanica (Tabela 2). Reprodução. Fêmeas adultas completamente desenvolvidas e com massa de ovos (FMO) começaram a ser detectadas em raízes de Baronesa a partir do 35 o. dia após a inoculação de J 2 na época seca e a partir do 24 o. dia após a inoculação na época chuvosa (Tabela 1). Em Achat, fêmeas adultas com massas de ovos só começaram ser detectadas nas épocas seca e chuvosa a partir do 42 o. e 30 o. dia após a inoculação, respectivamente. Portanto, tanto na época seca quanto chuvosa, ambos os nematoides atingiram suas fases reprodutivas mais cedo em Baronesa do que em Achat. Além disso, as médias de FMO foram maiores em Baronesa, em ambas as épocas de plantio (Tabela 2). As médias de FMO de M. javanica foram significativamente maiores que as de M. incognita em ambas as épocas (Tabela 2). As médias das temperaturas mínimas e máximas foram cerca de 5 C mais altas na época chuvosa do que na época seca, e isto pode ser considerado como fator importante no encurtamento dos ciclos de vida dos nematoides em 27 dias em Achat e em 26 dias em Baronesa na época chuvosa, em relação à época seca (Tabela 1). Meloidogyne javanica produziu igual ou mais ovos por massa do que M. incognita tanto na época seca quanto na chuvosa, com exceção apenas de Baronesa na época seca, na qual M. incognita produziu mais ovos por massa do que M. javanica (Tabela 2). Seguindo a mesma tendência do ocorrido com FMO, o número de ovos por massa em Baronesa foi igual ou maior que em Achat em ambas as épocas seca e chuvosa (Tabela 2). A razão do monitoramento de F e de FMO dos nematoides em Baronesa ter continuado até o 63 o. dia na época seca e até o 36 o. dia na época chuvosa, foi para a tomada de dados para análise estatística e também para demonstrar que o processo reprodutivo dos nematoides nas raízes não cessa, mesmo após os nematoides terem completado os seus ciclos de vida nos tubérculos. Os ciclos de vida de ambos os nematoides foram considerados completos com o início da infecção de tubérculos por J 2 da segunda geração, que na época seca ocorreu 56 dias após a inoculação em Baronesa e aos 63 dias em Achat, época cujas médias das temperaturas mínimas e máximas foram 19,7 e 23,9 C, respectivamente (Tabela 1). Na época chuvosa, os ciclos de vida dos nematoides completaram-se aos 30 dias em Baronesa e aos 36 dias em Achat, época cujas médias de temperaturas mínimas e máximas foram 24,6 e 29,0 C, respectivamente (Tabela 1). Tarjan (1952) determinou que o ciclo de vida de M. incognita completou-se em 37 dias, enquanto que os de M. javanica, M. arenaria e M. hapla completaram-se aos 39 dias em Antirrhium majus L., em temperatura de 21 C. Considerando o ciclo vegetativo de 110 dias para as cultivares Achat e Baronesa, as duas espécies de nematoides completaram aproximadamente 1,7 gerações (uma geração nas raízes e 0,7 geração nos tubérculos) em Achat e duas gerações (uma geração nas raízes e uma geração nos tubérculos) em Baronesa na época seca; e três gerações (uma geração nas raízes e duas gerações nos tubérculos) em Achat e 3,7 gerações (uma geração nas raízes e 2,7 gerações nos tubérculos) em Baronesa, na época chuvosa, considerando que o início da produção de tubérculos de Achat e Baronesa ocorreu entre 30 e 40 dias após o plantio, nas duas épocas de cultivo (Tabela 1). De modo geral, maiores médias de J 2, J 3 + J 4, F, FMO e NO/M de M. incognita raça 1 e M. javanica foram detectadas em raízes de Baronesa do que em Achat em ambas as épocas (Tabela 2). As médias dos estádios detectados em raízes de Baronesa foram 6,7 e 6,2 vezes maiores, respectivamente, na época seca, e 2,2 e 2,0 vezes maiores, respectivamente, em relação aos números de estádios detectados conjuntamente em raízes de Achat, na época chuvosa (Tabela 2). Os estudos dos ciclos de vida de M. incognita raça 1 e de M. javanica em batata no campo elucidaram aspectos da biologia dos nematoides importantes para melhorar a eficiência do controle químico dos nematoides, em solos de cerrado no Centro-Oeste brasileiro. Os nematicidas aldicarbe (Temik 100G) e 152 Vol. 33(2)

41 Penetração, Desenvolvimento e Reprodução de Meloidogyne incognita Raça l e M. javanica em Cultivares de Batata no Campo carbofuram (Furadan 50G) são aplicados em doses de 40 e 80 kg do produto comercial por hectare respectivamente, nos cultivos da batata. As aplicações dos produtos são feitas em dose única no sulco de plantio ou metade da dose no sulco de plantio e a outra metade cerca de 30 dias após o plantio, na amontoa. Porém, testes de laboratório mostraram que esses produtos quando aplicados na amontoa se acumulam como resíduos tóxicos nos tubérculos (Charchar et al., 2003). Portanto, considerando ser o início da penetração de tubérculos por J 2 da segunda geração dos nematoides entre o 30 o. e o 40 o. dia após o plantio, o controle dos nematoides poderia ser mais eficiente aplicando-se metade da dose de aldicarbe ou do carbofuram no sulco de plantio para a proteção das raízes, e posteriormente, 20 kg de Rhocap (produto comercial) / ha por ocasião da amontoa, pois esse nematicida tem ação de contato e pode prevenir a infecção de tubérculos pelos nematoides (Charchar et al., 2003). O Rhocap é registrado para uso no cultivo da batata no Brasil, possui baixa toxicidade e não apresenta risco de se acumular como resíduo tóxico nos tubérculos para consumo, mesmo quando aplicado na amontoa. O Rhocap foi eficiente no controle da infecção de tubérculos pelos nematoides no campo e é facilmente disponível no mercado, porém ainda é pouco usado no cultivo da batata. A ação do Rhocap é essencialmente sobre a proteção de tubérculos contra a penetração de J 2 da segunda geração dos nematoides através das lenticelas (Charchar et al., 2003). Literatura Citada BYRD, D.W.J., T. KIRKPATRICK & K.R. BARKER An improved technique for cleaning and staining plant tissues for detection of nematodes. Journal of Nematology, 15 (1): CHARCHAR, J.M Nematóides de importância para a cultura da batata. Informe Agropecuário, 7 (76): CHARCHAR, J.M Meloidogyne em hortaliças. In: CONGRESSO INTERNACIONAL DE NEMATOLOGIA TROPICAL, XXVII, Rio Quente. Resumos, p CHACHAR, J.M Nematóides fitoparasitas associados à cultura da batata nas principais regiões de produção do Brasil. Nematologia Brasileira, 21 (2): CHARCHAR, J.M. & A.W. MOITA Reação de cultivares de batata à infecção por Meloidogyne incognita raça 1. Horticultura Brasileira, 14 (2): CHARCHAR, J.M. & A.W. MOITA Reação de cultivares de batata a uma infestação mista de Meloidogyne incognita raça 1 e M. javanica. Nematologia Brasileira, 21 (1): CHARCHAR, J.M. & A.W. MOITA Resistência de genótipos de batata a M. javanica. Pesquisa Agropecuária Brasileira, 36 (3): CHARCHAR, J.M. & F.A.S. ARAGÃO Variação anual da população mista de Meloidogyne incognita raça 1e M. javanica em cultivos de batata Bintje no campo. Nematologia Brasileira, 29 (2): CHARCHAR, J.M., J. PACCINI NETO & F.A.S. ARAGÃO Controle químico de Meloidogyne spp. em batata. Nematologia Brasileira, 27 (1): DICKSON, D.W. & F.B. STRUBLE A sieving-staining technique for extraction of egg mass of Meloidogyne incognita from soil. Phytopathology, 55: 497. FERRIS, H.A A generalizes nematode simulator based on heat-unit summation. Journal of Nematology, 8 (4): 284. (Resumo). FNP - CONSULTORIA E COMÉRCIO Batata inglesa - produção brasileira: área colhida. In: Agrianual: Anuário da Agricultura Brasileira 2001, p HUSSEY, R.S. & K.R. BARKER A comparison of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp. including a new technique. Plant Disease Reporter, 57 (12): IBGE Levantamento sistemático da produção agrícola. < indicadores/agropecuaria/lspa/lspa_200807_5.shtm> acesso em 7 de agosto de TARJAN, A.C Comparative studies of some rootknot nematodes infecting the common snap dragon, Antirrhium majus L. Phytopathology, 42 (12): WEINGARTNER, D.F., R. MCSORLEY & R.W. GOTH Management strategies for nematodes and soilborne diseases in subtropical Florida. Nematropica, 23 (2): ZEM, A.C., J.I. ZANNON & L.G.E. LORDELLO Doses e épocas de aplicação do nematicida Carbofuran no controle de Meloidogyne javanica na cultura da batata (Solanum tuberosum L.). In: REUNIÃO DE NEMATOLOGIA, V, Londrina. Trabalhos Apresentados, p Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 153

42 João M. Charchar & Gerald S. Santo ARTIGO Effect of Soil Temperature on the Life Cycle of Meloidogyne chitwoodi Races 1 and 2 and M. hapla on Russet Burbank Potato João M. Charchar 1 * & Gerald S. Santo 2 1 Embrapa Hortaliças, C. Postal 218, Brasília (DF) Brazil. 2 Department of Plant Pathology, Washington State University, Irrigated Agriculture Research and Extension Center, Prosser (WA) USA. *Author for correspondence: charchar@cnph.embrapa.br Received for publication on January 8, Accepted on April 29, Edited by Luiz Carlos Ferraz Summary Charchar, J.M. & G.S. Santo Effect of soil temperature on the life cycle of Meloidogyne chitwoodi races 1 and 2 and M. hapla on Russet Burbank potato. The effect of soil temperature on the development, reproduction and life cycle of M. chitwoodi races 1 and 2 and M. hapla on Russet Burbank potato seedlings was studied under greenhouse condition. Meloidogyne chitwoodi race 1 (MC1) took 93, 54, 39, and 42 days or 651, 702, 741 and 1,050 degree-days (DD); M. chitwoodi race 2 (MC2) took 95, 59, 39, and 39 days or 665, 767, 741 and 975 DD; and M. hapla (MH) took 106, 72, 44 and 35 days or 212, 576, 616 and 700 DD to complete a life cycle, from J 2 to J 2, respectively, at 12, 18, 24 and 30 o C. None of the nematodes were able to complete a life cycle at 6 ºC in 115 days. MC2 had a wider temperature range for development to adult females than MC1 or MH in the same experimental condition. Optimum temperature determined for reproduction at the end of the first generation was 30 ºC for MH. For MC races 1 and 2, it was situated between 12 and 24 ºC. Key words: Solanum tuberosum, Columbia root-knot nematode, Northern root-knot nematode, development, reproduction. Resumo Charchar, J.M. & G.S. Santo Efeito da temperatura do solo no ciclo de vida de Meloidogyne chitwoodi raças 1 e 2 e M. hapla em batata Russet Burbank. O experimento foi conduzido para determinar o efeito da temperatura do solo no desenvolvimento, reprodução e ciclo de vida de M. chitwoodi raças 1 e 2 e M. hapla em plantas de batata Russet Burbank, em condições de casa de vegetação. Meloidogyne chitwoodi raça 1 (MC1) requereu 93, 54, 39 e 42 dias ou 651, 702, 741 e graus-dias (GD); M. chitwoodi raça 2 (MC2) requereu 95, 59, 39 e 39 dias ou 665, 767, 741 e 975 GD; e M. hapla (MH) requereu 106, 72, 44 e 35 dias ou 212, 576, 616 e 700 GD para completar o ciclo de vida de J 2 a J 2, nas temperaturas de 12, 18, 24 e 30 ºC respectivamente. Nenhuma das espécies de nematoide completou o ciclo de vida à temperatura de 6 ºC durante o período vegetativo de 115 dias. Juvenis J 2 de MC2 originaram fêmeas adultas sob maior variação de temperaturas que MC1 e MH, no mesmo experimento. A temperatura ótima determinada para a reprodução de M. chitwoodi raças 1 e 2 ao final da primeira geração situou-se entre 12 e 24 ºC, ao passo que para M. hapla foi 30 ºC. Palavras-chaves: Solanum tuberosum, nematoide de galhas de Colúmbia, nematoide de galhas do Norte, desenvolvimento, reprodução. Introduction Potato (Solanum tuberosum) is a very important vegetable crop cultivated in the Pacific Northwest USA, from were the finding of large commercial potato-growing areas infected with Meloidogyne chitwoodi and/or M. hapla has increased the interest in controlling 154 Vol. 33(2)

43 Effect of Soil Temperature on the Life Cycle of Meloidogyne chitwoodi Races 1 and 2 and M. hapla on Russet Burbank Potato the damage caused by root-knot nematodes (Brown & Mojtahedi, 2005). Both nematode species cause economic losses in potato production because they reduce the quality of the potato tuber (Griffin & Jorgenson, 1969b; Santo & O Bannon, 1981a). Meloidogyne chitwoodi causes more severe tuber damage and is more difficult to control than M. hapla (Santo et al., 1980; 1981a; O Bannon & Santo, 1984) and populations of M. chitwoodi as low as 1 egg / 250 cm 3 soil cause economic loss in Pacific Northwest (Pinkerton et al., 1987; 1991). Santo & Pinkerton (1985) discovered the M. chitwoodi race 2 on potato Russet Burbank in Washington State, which is capable of reproducing on alfalfa (Medicago sativa L.), not a suitable host for M. chitwoodi race 1. Meloidogyne chitwoodi race 3 was found infecting a wild potato (Solanum bulbocastanum) in California State, which has resistance to races 1 and 2 (Mojtahedi et al., 1994; 1995). Studies of Pinkerton et al. (1986; 1987; 1991) demonstrated that race 2 causes tuber damage similar to race 1, and it can be found widespread in all the major potato growing regions of the Pacific Northwest. The infection and number of generations of M. chitwoodi races 1 and 2 on potato cultivars increase as the temperature also increases, considering that more heat units or degree-days (DD) are accumulated (Pinkerton et al., 1991). The percent of tuber infection with internal symptoms of M. chitwoodi increases when the potato tuber is stored at 21 to 24 C and more than 740 DD is accumulated (David, 2007). Soil temperature has a marked effect on the development and reproduction of root-knot nematodes (Griffin & Jorgenson, 1969a; Taylor & Sasser, 1978). The dominance of M. chitwoodi races 1 and 2 over M. hapla is attributed to their ability to develop and reproduce over a wider temperature range. Meloidogyne chitwoodi races 1 and 2 develop in potato roots and reproduces at soil temperature as low as 6 ºC (Charchar, 1987), whereas M. hapla and other common root-knot nematode species do not reproduce at this low temperature (Finley, 1976; Santo & O Bannon, 1981b; Inserra et al., 1985). In the Pacific Northwest, M. chitwoodi becomes established and populations increase early in the season when soil temperatures are low, from this resulting more generations per year than in M. hapla (Santo & O Bannon, 1981b; O Bannon & Santo, 1984). Inserra et al. (1985) reported the effect of temperature on the life cycle of M. chitwoodi on Nugaines wheat (Triticum aestivum). The life cycle and reproduction of M. hapla have also previously been studied on potato (Thomason & Lear, 1961; Griffin & Jorgenson, 1969a), with development and reproduction occurring at 25 ºC, but not at 15 and 30 ºC (Griffin and Jorgenson, 1969a). Meloidogyne chitwoodi race 3 seems not to be spread around the potato producing areas of the United States since no damage of this race on the commercial potato cultivars has been reported (Mojtahedi et al., 1994). Considering that comparable information on the effect of soil temperature on the life cycle of M. chitwoodi races 1 and 2 and M. hapla on potato were not available, the objective of this paper was to determine the effect of soil temperature on development and reproduction of these root-knot nematodes on Russet Burbank potato seedlings under greenhouse conditions. Material and Methods Populations of Meloidogyne chitwoodi race 1 (MC1) from Washington and race 2 (MC2) from Oregon were isolated from potato Russet Burbank and maintained on wheat Nugaines and alfalfa Thor, respectively. A population of M. hapla (MH) from Washington was isolated from alfalfa and maintained on pepper (Capsicum annuum) California Wonder, which served as differential host. These three nematode populations were reared on tomato (Lycopersicon esculentum) Columbia on separate benches maintained at 20 to 26 ºC under greenhouse conditions. Periodically, they were checked for possible contamination through a differential host test on alfalfa Thor, wheat Nugaines, pepper California Wonder, and carrot (Daucus carota) Chantenay Red Cored (Mojtahedi et al., 1988). Plants were watered as needed and fertilized monthly with a granulated Osmote formulation (Joe Berger & Co., Renton, Washington), (10 g / pot). Nematode eggs for inocula were extracted from galled roots of 55 to 65 day-old tomato plants with sodium hipochloride (NaOCl) for four minutes Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 155

44 João M. Charchar & Gerald S. Santo (Hussey & Barker, 1973). An inoculum of secondstage juveniles (J 2 ) was obtained by placing highly concentrated egg suspensions on 25 µm (500 mesh) screens and incubated at 24º C for 24 hours. Single-eye seed pieces of Russet Burbank potato were planted in methyl bromide fumigated sand in metal flats in the greenhouse. After five weeks, the original seed pieces were removed and a single plant was transplanted into an eight cm-diameter plastic cup containing 250 cm 3 of methyl bromide fumigated sandy loam soil. The plants were held in a greenhouse for one week. The cups were inserted into empty cups of the same size, placed in 25 cm-diameter glass jars, three cups per jar. Interspaces between cups were filled with methyl bromide fumigated soil to the top edge of the cups, which was four cm from the top of the jar. The jars were immersed in controlled water temperature tanks in a greenhouse (Charchar, 1987). After an additional week, inoculations were made by pipetting a suspension of 150 freshly hatched J 2 of MC1 and MC2, or MH in 5 ml of water around the exposed roots of the plants in each cup. Plants were randomized in eight replicates and grown at constant soil temperatures of 6, 12, 18, 24 and 30 ºC (± 1 ºC). Extra inoculated Russet Burbank potato seedlings served as indicators for the detection of nematode phases, reflecting time of harvest of the experimental seedlings. Plant foliage was kept at ambient temperature maintained at 22 to 26 ºC. The light source was a series of VHO cool white fluorescent bulbs with an intensity of 4.8 x 103 lux, positioned 91 cm above the temperature tanks. During the experimental period, plants received regular water and were fertilized once with a granulated Osmote formulation at a rate of 5 g / cup. A complete randomized block design with eight replicates for each nematode population was used to compare developmental stages of the nematode populations at the same temperature. A split-plot design with a separate tank for each temperature was used to compare phases of the nematode populations at different temperatures (Gomez & Gomez, 1969). The experiment was terminated at the respective temperatures six days prior to egg mass initiation (beginning of egg production) of the second generation, or when plants died. One plant for each nematode population from each temperature was harvested periodically and analysed for development and reproduction as characterized by the following three stages: a) egg mass initiation (beginning of egg production); b) root invasion of first generation J 2 (beginning of the second generation); and c) six days prior to egg mass initiation of the second generation. The three reproductive stages were assessed after 22 to 106 days, when indicator potato plants showed presence of egg mass initiation and invasion of the first generation of J 2 at all temperatures. The reproduction at the completion of the first generation was assessed for all nematode populations at all temperatures at least six days before the second generation of egg masses was established on the potato root system to avoid mixture of eggs between two generations of the nematodes. Roots were cut off the plant, washed, and stained individually with 2 % phloxin B for 15 minutes for quantification of egg mass matrices (Charchar et al., 1984). Following the phloxin B staining, the numbers of eggs per egg mass and the total egg production for each nematode population were determined by shaking the masses in 1 % NaOCl (Hussey & Barker, 1973) for separating and accounting eggs. Finally, the roots were stained with acid-fuchsin NaOCl technique (Byrd et al., 1983) to assess the total number of nematodes that invaded the root systems. Results and Discussion The number of days (D) and of degree-days (DD) to egg mass initiation (beginning of egg production) and completion of the first generation, from J 2 to J 2, were determined (Table 1) for MC1, MC2 and MH. To reach egg mass initiation, MC1 required 91, 49, 33, 22 and 28 D or 91, 343, 429, 418 and 700 DD (base 5 ºC) and MC2 required 74, 49, 33, 22 and 22 D or 74, 343, 429, 418 and 550 DD (base 5 ºC), respectively, at 6, 12, 18, 24 and 30ºC. MH required 59, 39, 27, and 22 D or 118, 312, 378 and 440 DD (base 10 ºC) at 12, 18, 24 and 30 ºC, respectively. MH was not able to initiate egg masses at 6 ºC. To complete its life cycle, MC1 required 93, 54, 39, and 42 D or 651, 702, 741 and 1,050 DD; MC2 95, 59, 39, and 39 D or 665, 767, 741 and 975 DD; and MH 106, 72, 44 and 35 D or 212, 576, 616 and 156 Vol. 33(2)

45 Effect of Soil Temperature on the Life Cycle of Meloidogyne chitwoodi Races 1 and 2 and M. hapla on Russet Burbank Potato 700 DD, respectively, at 12, 18, 24 and 30 ºC. At 6ºC none of the nematodes were able to complete a life cycle (Table 1). The initial population of J 2 of MC1, MC2 and MH developing to adult females and females producing egg mass were significantly (P 0.05) affected by soil temperature at egg mass initiation (Table 2). Egg mass initiation ranged from 22 to 91 days after inoculation depending on the nematode species and temperature (Table 1). The percent of MC1 J 2 developing to adult females was highest at 12ºC, followed by 18, 24, 30, and 6 ºC. More MC2 females developed at 30 ºC than at 6 or 12 ºC, but was not different from 18 or 24 ºC. The optimal developmental temperature for MH females was 30 ºC. Also more females were found at 12, 18, and 24 ºC than at 6 ºC, where none of the J 2 developed to females. No differences (P 0.05) were observed between MC1 and MC2 at 12, 18 and 24 ºC, but more females of MC2 were found at 6 and 30 ºC. No differences were observed in the percent of adult females between MH and MC1 or MC2 at 18 and 24 ºC. At 30 ºC more MH J 2 developed to females than MC1, but did not differ from MC2. Likewise, at 12 ºC MH did not differ from MC2, but infected roots contained fewer females than roots inoculated with MC1. Although no MH females developed at 6 ºC, it did not differ statistically from MC1 or MC2 (Table 2). More than 88 % of the females at egg mass initiation produced egg masses at all temperatures, except at 6 ºC, where MH did not produce egg masses (Table 2). Significantly fewer egg masses were produced by MC1 and MC2 females at 6 ºC than at all other temperatures. No differences were observed among the other temperatures, except for MH, where females at 12 ºC produced fewer egg masses than at 18, 24 and 30 ºC. A higher percentage of MH females produced egg masses at 30 ºC than MC1 and MC2, and more than MC2 at 18 and 24 ºC. Conversely, fewer egg masses were produced by MH than MC1 and MC2 at 6 and 12 ºC. No differences were observed between MC1 and MC2, except at 6 ºC, where MC2 produced more egg masses than MC1 (Table 2). Eggs produced per egg mass by MC1, MC2 and MH (none produced) at egg mass initiation were lowest at 6 ºC than at the other temperatures (Table 3). No significant differences were observed from 12 to 30 ºC for MC1 and MC2. More eggs / egg mass were recorded for MH at 30 ºC compared to 12 and 18 ºC, but did not differ from 24 ºC. Likewise, at 24 ºC MH females produced more eggs / egg mass than at 12 ºC, but not at 18 ºC. Meloidogyne chitwoodi race 1 produced more eggs / egg mass than MC2 at 24 ºC, and MH more than MC1 at 30 ºC (Table 3). No differences were found among the three populations at 6, 12 and 18 ºC. Egg production for MH was not observed at 6 ºC. In terms of total egg production more MC1 eggs were recovered at 12 ºC than at 6 or 30 ºC, but did not differ from 18 and Table 1 - Numbers of days and of degree-days required for the development of Meloidogyne chitwoodi races 1 (MC1) and 2 (MC2) and M. hapla (MH) from second stage juveniles (J 2 ) to egg mass initiation (beginning of egg production) and completion of the first generation, from J 2 to J 2. Days Degree-days 1 Temp. (ºC) Egg mass initiation First generation Egg mass initiation First generation MC1 MC2 MH MC1 MC2 MH MC1 MC2 MH MC1 MC2 MH , Degree-days were calculated by subtracting the constant temperature from the base temperature (base temperature used for M. chitwoodi was 5 ºC and for M. hapla 10 ºC) times the number of days required for the appearance of the egg masses and for presence of J 2 from the first generation. 2 No egg mass production. 3 First generation not completed in 115 days. Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 157

46 João M. Charchar & Gerald S. Santo Table 2 - Effect of temperature on the percent of Meloidogyne chitwoodi races 1 (MC1) and 2 (MC2) and of M. hapla (MH) adult females and females producing egg masses on Russet Burbank potato seedlings at the time of egg mass initiation (beginning of egg production) after inoculation with 150 second stage juveniles (J 2 ). Nematode Temperature (ºC) species/ race Percent of adult females MC1 2.1 Db 29.7 Aa 19.9 Ba 19.8 Ba 11.6 Cb MC Ca 17.7 BCab 21.3 ABa 25.5 Aa 29.7 Aa MH 0.0 Cb 11.6 Bb 11.5 Ba 18.5 Ba 39.6 Aa Percent of females producing egg mass MC Bb 99.1 Aa 97.7 Aab 97.0 Aab 88.6 Ab MC Ba 96.5 Aa 92.7 Ab 94.8 Ab 92.2 Ab MH 0.0 Cc 88.4 Bb 98.4 Aa 99.6 Aa 99.1 Aa Values are means of eight replicates. Values followed by the same low case letter in columns or values followed by the same capital letter in rows are not significantly different (P 0.05), according to Duncan s Multiple Range Test, based on arcsine-transformed data. Table 3 - Numbers of eggs per egg mass and total egg production of Meloidogyne chitwoodi races 1 (MC1) and 2 (MC2) and M. hapla (MH) on Russet Burbank potato seedlings at the time of egg mass initiation (beginning of egg production). Nematode Temperature (ºC) species/ race Eggs / egg mass MC1 2 Ba 136 Aa 68 Aa 98 Aa 81 Ab MC2 5 Ba 81 Aa 74 Aa 57 Ab 86 Aab MH 0 Da 50 BCa 54 Ba 91 ABab 184 Aa Total egg production MC1 13 Ca 3,744 Aa 1,083 ABa 1,061 ABa 549 Bb MC2 45 Ca 584 Ab 655 Aa 434 Ab 304 Bb MH 0 Da 250 Cb 689 BCa 1,012 Ba 8,403 Aa Values are means of eight replicates. Values followed by the same low case letter in columns or values followed by the same capital letter in rows are not significantly different (P 0.05) according to Duncan s Multiple Range Test, based on log-transformed data. 24 ºC (Table 3). Meloidogyne chitwoodi race 2 produced more eggs at 12, 18 and 24 ºC than at 6 or 30 ºC. Total egg production for MH increases as temperature increased with the highest number at 30 ºC. The lowest number of eggs produced for all three populations was at 6 ºC. Comparisons among the populations at each temperature showed that MC1 produced more eggs at 12 ºC; MH at 30 ºC; and MC1 and MH at 24 ºC. No differences among the populations were observed at 6 and 18 ºC (Table 3). Egg production was also observed at the completion of the first generation (Table 4). The completion of the first generation for MC1, MC2 and MH at the different temperatures ranged from 35 to 106 days (Table 1). Egg production was not recorded at 6 ºC because, as the plants died after 115 days, the nematodes did not complete a life cycle. The lowest number of eggs / egg mass and total egg production of MC1 and MC2 was observed at 30 ºC and no significant differences occurred at 12, 18 and 24 ºC. In terms of eggs / egg mass no differences were recorded for MH from 12 to 30 ºC (Table 3). However, at the completion of the first generation, MH produced more total egg production at 30 ºC with sequentially lower production at 24, 18 and 12 ºC (Table 4). Meloidogyne hapla produced more eggs / egg mass than the MC races 1 and 2 at 24 and 30 ºC. No other differences were observed among the three populations. Total egg production at the completion of the first generation for MC1 was greater than that of MC2 or MH at 12 ºC; MH was better than MC1 and MC2 at 24 and 30 ºC, and MC2 was better than MC1 at 30 ºC. No differences were observed at 18 ºC (Table 4). 158 Vol. 33(2)

47 Effect of Soil Temperature on the Life Cycle of Meloidogyne chitwoodi Races 1 and 2 and M. hapla on Russet Burbank Potato Six days prior to initial egg mass production of the second generation, total egg production for the first generation was determined (Table 5). Egg production per egg mass was similar to that observed at the end of the first generation (Table 4). The number of total eggs recovered was also comparable among the treatments, but with some statistical differences. Less total eggs of MC1 and MC2 were recovered at 30 ºC than at 12, 18 and 24 ºC. At 12 ºC MC2 and MH produced less egg than MC1. No differences in egg production were observed for MH at 18 and 24, and 24 and 30 ºC. Meloidogyne chitwoodi race 1 produced more eggs at 18 ºC than MH; MC2 and MH produced more at 24 ºC, and MC1 and MC2 did not differ at 30 ºC (Table 5). All three nematode populations were able to complete one life cycle at all temperatures, except at 6 ºC (Table 1). The number of days required for MH to complete a life cycle decreased with the increase in temperature, with a minimum of 35 days at 30 ºC. A similar pattern was observed with MC1 and MC2, which took 39 days to complete a life cycle at 24 ºC, the same period required by MC2 at 30 ºC. The M. chitwoodi races were able to complete a life cycle faster at the lower temperatures (12 to 24 ºC) than MH, and MH was faster at 30 ºC. However, at 24 and 30 ºC all three populations were able to complete one life cycle within five days of each other. At 12 and 18 ºC MH required at least 11 days longer than the MC races. Although none of the populations were able to complete a life cycle at 6 ºC, MC1 and MC2 were able to produce egg masses (Table 3). However, no reinfection of roots by J 2 was observed after 115 days, when the experiment was terminated due to the death of the plants. The MC races may have been able to complete a life cycle if the plants were able to survive longer at 6 ºC. Preliminary studies conducted on the effect of Table 4 - Numbers of egg per egg mass and total egg production of Meloidogyne chitwoodi races 1 (MC1) and 2 (MC2) and M. hapla (MH) on Russet Burbank potato seedlings at the completion of the first generation from J 2 to J 2. Nematode Temperature (ºC) species/ race Eggs / egg mass MC Aa 596 Aa 515 Ab 152 Bb MC2-534 Aa 606 Aa 434 Ab 164 Bb MH Aa 776 Aa 835 Aa 860 Aa Total egg production MC1-15,972 Aa 15,438 Aa 15,116 Ab 661 Ba MC2-8,875 Ab 12,430 Aa 10,643 Ab 4,591 Bb MH - 4,961 Cb 8,673 Ca 21,020 Ba 46,568 Ac Values are means of eight replicates. Values followed by the same low case letter in columns or values followed by the same capital letter in rows are not significantly different (P 0.05) according to Duncan s Multiple Range Test, based on log-transformed data. 1 Generation not completed in 115 days. Table 5 - Number of egg per egg mass and total egg production of Meloidogyne chitwoodi races 1 (MC1) and 2 (MC2) and M. hapla (MH) on Russet Burbank potato seedlings at least 6 days prior to egg mass production of the second generation. Nematode Temperature (ºC) species/ race Eggs / egg mass MC Aa 739 Aa 764 Aa 73 Bb MC2-416 Aa 780 Aa 770 Ab 99 Bb MH Aa 763 Aa 952 Ab 1,013 Aa Total egg production MC1-15,021 Aa 12,121 Aa 11,821 Ab 1,344 Bb MC2-2,965 Bb 9,226 Aab 17,377 Aa 1,135 Cb MH - 3,642 Cb 8,497 Bb 19,089 ABa 55,438 Aa Values are means of eight replicates. Values followed by the same low case letter in columns or values followed by the same capital letter in rows are not significantly different (P 0.05) according to Duncan s Multiple Range Test, based on log-transformed data. 1 Generation not completed in 115 days. Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 159

48 João M. Charchar & Gerald S. Santo temperature on the development duration of MC1 and MH on potato roots were not consistent with results reported in these studies (Charchar et al., 1984). The inconsistencies were due to several factors that occurred in the initial studies: 1) egg maturation was not taken into account, which would have lengthened the life cycle; 2) undesirable fluctuations in temperature were observed at 7 ºC during the experiment; and 3) confusion occurred in distinguishing between matrix material and actual egg production. Thus, when conducting life cycle studies, it is important that the exact stage of nematode development is known and can be easily recognized. The number of degree-days required for the nematodes to produce egg masses and complete a life cycle tended to increase with temperature (Table 1). Because the MC races 1 and 2 began accumulating heat units at lower temperatures, they required more DD than MH at each temperature. The determination of DD for a nematode to complete a life cycle is important in establishing predictive models (Ferris, 1976). In the Pacific Northwest potato tubers are not infected until J 2 from the first generation appears. Thus, being able to predict the time of egg mass initiation in the roots and emergence of J 2 will facilitate timing of nematode chemical control to protect the tubers from nematode invasion. Although MH (isolate WAMH) J 2 were able to penetrate roots at 6 ºC, they were not able to develop to adult females within 115 days (Tables 2 and 3). The most favorable temperature for development of MH females was at 30 ºC. The highest number of MC1 females was observed at 12 ºC and 18 to 30 ºC for MC2. This indicates that MC2 has a higher temperature tolerance than MC1 for female development. Development rate of MC2 was greater than MC1 at 6 and 30 ºC indicating that MC2 has a wider temperature range than MC1. The development rate of MH and MC2 did not differ at 12 to 30 ºC, which indicates a close similarity in the biological behavior of these two isolates at egg mass initiation. Soil temperatures did not seem to affect egg mass production as it did female development. Egg masses were produced by at least 88 % of the females at all temperatures, except at 6 ºC where it was considerable less (Table 2), indicating that the J 2 populations were synchronized before inoculations. Under the temperature regime of this study, the optimum temperature for total egg production of MH was at 30 ºC (Tables 3, 4 and 5). It is possible that the optimum temperature for reproduction of MH may be higher than 30 ºC. In addition, MH produced more eggs / egg mass at 24 and 30ºC, and more total eggs at 30 ºC than both MC races 1 and 2 at the end of the first generation. These results obtained with MH were consistent with previous studies using the same isolate (Santo & O Bannon, 1981b; O Bannon & Santo, 1984). However, Griffin and Jorgensen (1969a) reported that the optimum temperature for MH reproduction was at 25 ºC and was partially inhibited at 30 ºC. These differences may be related to the abilities of the different isolates to tolerate higher and lower temperatures (Stephan & Trudgill, 1982). The MC races 1 and 2 had a wider optimum temperature range for the total egg production at the end of the first generation (Table 4). Both races produced eggs equally well at 12, 18 and 24ºC. In relation to M. chitwoodi, MC1 produced more total eggs than MC2 at 12 ºC, but no differences were observed in female development and the number of eggs / egg mass at 12 ºC; MC2 had a higher reproductive potential at 30 ºC, indicating again a higher temperature tolerance than MC1. Comparing total egg production at egg mass initiation (Table 3) to completion of the first generation (Table 4), it is interesting to note that MC2 was able to produce eggs more rapidly than MC1 from 12 to 30 ºC. From egg mass initiation to the completion of the first generation, the total egg production of MC2 compared to MC1 increased from a low of 5-fold at 18 ºC to a high of 14-fold at 30 ºC. Even though the ability of MH to penetrate roots and the length of its life cycle were affected at temperatures of 12 to 24 ºC, it did not have a comparable effect on total egg production compared to MC1 and MC2. Egg production of the first generation females at least six days prior to egg mass initiation of the second generation (Table 5) generally followed the same pattern observed at the end of the first generation (Table 4). The females continued to lay eggs for a period of time after completion of a life cycle. It should be noted that the completion of the life cycle 160 Vol. 33(2)

49 Effect of Soil Temperature on the Life Cycle of Meloidogyne chitwoodi Races 1 and 2 and M. hapla on Russet Burbank Potato was determined from inoculated J 2 to the detection of J 2 in the roots and the end of egg production was not taken into account. It was demonstrated here that the number of degree-days for the three nematode populations to complete their life cycles increased by increasing the soil temperature. These findings were confirmed posterioly by Pinkerton et al. (1991) and David (2007). Literature Cited BROWN, C.R. & MOJTAHEDI, H Breeding for resistance to Meloidogyne species and trichodorid-vectored virus. In: M. RAZDAN & A.K. MATTO (ed). Genetic Improvement of Solanaceous Crops. Vol. I: Potato. Science Publishers, Enfield, p BYRD, D.W.JR., T. KIRKPATRICK & K.R. BARKER An improved technique for cleaning and staining plant tissues for detection of nematodes. Journal of Nematology, 15 (1): CHARCHAR, J.M Effect of temperature on the life cycle of Meloidogyne chitwoodi races 1 and 2 and M. hapla (PhD dissertation). Washington State University, Pulmann (WA) USA. CHARCHAR, J.M., G.S. SANTO & J.H. O BANNON Life cycle of Meloidogyne chitwoodi and M. hapla on potato in controlled temperature tanks and microplots. In: INTERNATIONAL CONGRESS OF NEMATOLOGY, I, Guelph, Canada, p.18. DAVID, N.L Biology and management of Meloidogyne chitwoodi using oxamyl on potato in the Western United States (PhD dissertation). Oregon State University, Corvallis (OR) USA. DICKSON, D.W. & F.B. STRUBLE A sieving-staining technique for extraction of egg mass of Meloidogyne incognita from soil. Phytopathology, 55 (5): 497. FERRIS, H.A A generalized nematode simulator based on heat-unit summation. Journal of Nematology, 8 (4): 284. FINLEY, A.M Histopathology of Meloidogyne chitwoodi on Russet Burbank potato. Journal of Nematology, 13 (4): GOMEZ, K.A. & A.A. GOMEZ Statistical Procedures for Agriculture Research. John Wiley, New York., 680 p. GRIFFIN, G.D. & E.C. JORGENSON. 1969a. Life cycle and reproduction of Meloidogyne hapla on potato. Plant Disease Reporter 53 (4): GRIFFIN, G.D. & E.C. JORGENSON, 1969b. Pathogenicity of the Northern root-knot nematode (Meloidogyne hapla) to potato. Proceedings, Helminthological Society Washington, 36 (1): HUSSEY, R.S. & K.R. BARKER, A comparison of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp. including a new technique. Plant Disease Reporter, 57 (12): INSERRA, R.N., N. VOVLAS, J.H. O BANNON & G.D. GRIFFIN Development of Meloidogyne chitwoodi on wheat. Journal of Nematology, 17 (3): MOJTAHEDI, H., C.R. BROWN & G.S. SANTO Characterization of resistance in a somatic hybrid of Solanum bulbocastanum and S. tuberosum to Meloidogyne chitwoodi. Journal of Nematology, 27 (1): MOJTAHEDI, H., G.S. SANTO & J.H. WILSON Host tests to differentiate Meloidogyne chitwoodi races 1 and 2 and M. hapla. Journal of Nematology, 20 (3): MOJTAHEDI, H., G.S. SANTO, C.R. BROWN, H.FERRIS & V. WILLIAMSON A new host race of Meloidogyne chitwoodi from California. Plant Disease, 78: O BANNON, J.N. & G.S. SANTO Effect of soil temperature on reproduction of Meloidogyne chitwoodi and M. hapla alone and in combination on potato and M. chitwoodi on rotation plants. Journal of Nematology, 16 (3): PINKERTON, J.N., G.S. SANTO & H. MOJTAHEDI Population dynamics of Meloidogyne chitwoodi on Russet Burbank potatoes in relation to degree-day accumulation. Journal of Nematology, 23 (3): PINKERTON, J.N., H. MOJTAHEDI & G.S. SANTO Reproductive efficiency of Pacific Northwest isolates of Meloidogyne chitwoodi on alfalfa. Journal of Nematology, 18 (1): 62. PINKERTON, J.N., H. MOJTAHEDI, G.S. SANTO & J.N. O BANNON Vertical migration of Meloidogyne chitwoodi and M. hapla under controlled temperature. Journal of Nematology, 19 (2): SANTO, G.S. & J.H. O BANNON. 1981a. Ecology of rootknot nematodes on Russet Burbank potato in Washington. Journal of Nematology, 13 (4): SANTO, G.S. & J.H. O BANNON. 1981b. Effect of soil temperature on the pathogenicity and reproduction of Meloidogyne chitwoodi and M. hapla on Russet Burbank potato. Journal of Nematology, 13 (4): SANTO, G.S. & J.N. PINKERTON A second race of Meloidogyne chitwoodi discovered in Washington State. Plant Disease, 69 (4): 361. SANTO, G.S., J.H. O BANNON, A.M. FINLEY & A.M. GOLDEN Occurrence and host range of a new root-knot nematode (Meloidogyne chitwoodi) in the Pacific Northwest. Plant Disease, 64 (7): STEPHAN, Z.A. & D.L. TRUDGILL Development of four populations of Meloidogyne hapla on two cultivars of cucumber at different temperatures. Journal of Nematology, 14 (4): TAYLOR, A.L. & J.N. SASSER Biology, identification and control of root-knot nematodes (Meloidogyne species). North Carolina State University Graphics, Raleigh (NC) USA, 111 p. THOMASON, I.J. & B. LEAR Rate of reproduction of Meloidogyne spp as influenced by soil temperature. Phytopathology, 51 (8): Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 161

50 ARTIGO Marcelo M. Coutinho, Leandro G. Freitas, Wânia S. Neves, Rosangela Dallemole-Giaretta, Silamar Ferraz, Everaldo A. Lopes & Rosângela D.L. Oliveira Incorporação de Farinha de Sementes de Mamão (Carica papaya L.) para o Controle de Meloidogyne javanica* Marcelo M. Coutinho 1,2, Leandro G. Freitas 2, Wânia S. Neves 3, Rosangela Dallemole-Giaretta 2, Silamar Ferraz 2, Everaldo A. Lopes 2 ** & Rosângela D.L. Oliveira 2 * Parte da Dissertação do primeiro autor para obtenção do grau de Mestre pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), Viçosa (MG) Brasil. 1 Bolsista da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). 2 Departamento de Fitopatologia, UFV, Viçosa (MG) Brasil. 3 Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais (EPAMIG), Unidade Regional Norte de Minas, Nova Porteirinha (MG) Brasil. **Autor para correspondência: everaldolopes@hotmail.com Recebido para publicação em 11 / 02 / Aceito em 13 / 05 / 2009 Editado por Claudio Marcelo Oliveira Resumo - Coutinho, M.M., L.G. Freitas, W.S. Neves, R. Dallemole-Giaretta, S. Ferraz, E.A. Lopes & R.D.L. Oliveira Incorporação de farinha de sementes de mamão (Carica papaya L.) para o controle de Meloidogyne javanica. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da incorporação de farinha de sementes de mamão (FSM) em substrato coberto ou não com plástico sobre Meloidogyne javanica em tomateiros. Para tanto, três experimentos foram conduzidos com as seguintes dosagens: 0; 0,0625; 0,125; 0,25; 0,5; 1; 2; 4 ou 8 g de FSM / kg de substrato. Em todos os experimentos, vasos contendo 0,5 kg de substrato foram infestados com ovos de M. javanica. No primeiro e terceiro experimentos, os vasos foram mantidos cobertos com filme plástico transparente (150 µm) por cinco dias antes do plantio de mudas de tomateiro. No segundo, os vasos não receberam cobertura. No terceiro, os vasos foram mantidos em câmara de crescimento a 26 C por cinco dias, antes de serem levados para casa de vegetação. As avaliações foram realizadas após 45 dias do transplantio. A incorporação de FSM e a cobertura do substrato no primeiro experimento reduziram drasticamente a população de M. javanica, independente da dose do material orgânico. No segundo experimento, a redução no número de galhas e de ovos foi superior a 80 %, apenas nas doses de 4 e 8 g de FSM / kg de substrato. Já no terceiro experimento, o número de galhas foi reduzido em 31, 35, 46 e 71 % pela aplicação de 0,125; 0,5; 4; e 8 g de FSM / kg de substrato, respectivamente. Todas as doses testadas reduziram o número de ovos de M. javanica por sistema radicular, quando comparada com a testemunha sem FSM. A dose mínima efetiva de FSM em substrato descoberto foi 4 g / kg de substrato. A cobertura do substrato com plástico transparente por pelo menos cinco dias pode reduzir a quantidade de FSM para se obter controle eficiente de M. javanica. Palavras-chaves: nematoide-das-galhas, matéria orgânica, isotiocianato. Summary - Coutinho, M.M., L.G. Freitas, W.S. Neves, R. Dallemole-Giaretta, S. Ferraz, E.A. Lopes & R.D.L. Oliveira Incorporation of papaya (Carica papaya L.) seed flour for the control of Meloidogyne javanica. The objective of this work was to evaluate the effect of the incorporation of papaya seed flour (PSF) and the covering of the substrate with plastic for the control of Meloidogyne javanica. Three experiments were carried out in order to test the effect of the following rates: 0; ; 0.125; 0.25; 1; 2; 4; and 8 g of PSF / kg of substrate. In all experiments, the pots filled with 0.5 kg of substrate were infested with 4,000 eggs of M. javanica. In the first and third experiments, the pots were covered with transparent polyethylene plastic (150 µm) for five days, in greenhouse, before planting tomato seedlings. In the second, the pots were uncovered. In the third, the pots were placed in the growth chamber at 26 C for five days, before taking them to the 162 Vol. 33(2)

51 Incorporação de Farinha de Sementes de Mamão (Carica papaya L.) para o Controle de Meloidogyne javanica greenhouse. Evaluations were performed forty-five days after transplanting the seedlings. Covering PSF amended substrate in the first experiment reduced drastically M. javanica population, regardless of the organic amendment rate. In the second experiment, the reduction of the number of galls and eggs was higher than 80 % at the rates of 4 and 8 g of PSF / kg of soil, without covering. In the third experiment, the number of galls was reduced by 31, 35, 46 and 71 % by using 0.125; 0.5; 4; and 8 g of PSF / kg of soil, respectively. All rates reduced the number of eggs of M. javanica per root, when compared to the control. The minimum effective rate of PSF in uncovered soil was 4 g / kg of substrate. Covering the soil with transparent polyethylene plastic can reduce the quantity of PSF required for an efficient control of M. javanica. Key words: root-knot nematode, organic amendment, isothiocyanate. Introdução Os nematoides-das-galhas (Meloidogyne spp.) causam perdas econômicas significativas na cultura do tomate (Solanum lycopersicon), podendo variar de 30 a 80 % (Lordello, 1978; Ferraz & Churata-Masca, 1983; Roberts & May, 1986; Charchar & Aragão, 2005). O controle do patógeno pode ser realizado pela aplicação de nematicidas. Entretanto, o uso intensivo e indiscriminado desses produtos tem causado diversos prejuízos à saúde humana e ao ambiente. Em razão desses impasses, muitos pesquisadores têm estudado métodos de controle que minimizem o uso de insumos químicos. Dentro desse contexto, a incorporação de matéria orgânica ao solo é uma das práticas culturais mais estudadas, pois além de favorecer o controle de diversas doenças de plantas (Stirling, 1991), pode também melhorar as características físico-químicas do solo e aumentar a população de microrganismos antagonistas aos nematoides (Linford et al., 1938; Hoitink & Fahy, 1986). Todavia, algumas substâncias nematicidas resultantes da decomposição dos resíduos orgânicos podem ser perdidas por volatilização (Stapleton, 2000; Souza, 2004). Portanto, aliar a incorporação de material orgânico à cobertura do solo com filme plástico poderia aumentar a possibilidade de manejo eficiente de fitonematoides. Nessa condição, a ação supressora sobre a população do patógeno seria resultado do efeito conjunto e cumulativo dos compostos formados durante a decomposição e das altas temperaturas aprisionadas sob o plástico. Além disso, a quantidade de material orgânico a ser incorporado ao solo poderia ser reduzida na biofumigação. A eficiência de determinado material orgânico no controle de nematoides depende de sua composição química e da quantidade incorporada ao solo (Rodríguez-Kábana et al., 1987; Lopes et al., 2005). Sementes de mamão (Carica papaya L.) são subprodutos da indústria de sucos, doces, geléias e outros produtos alimentícios. Na medicina popular, são usadas no controle de vermes. Sua ação antihelmíntica se deve à presença de glucosinolatos, que são hidrolisados pela enzima mirosinase, originando o composto benzil-isotiocianato, componente químico com ação ovicida e larvicida (Krishnakumari & Majumder, 1960; Dar et al., 1965; Seo & Tang, 1982; Kermanshai et al., 2001). Possivelmente, a incorporação das sementes de mamão ao substrato seja eficiente na redução da população de fitonematoides, em razão da composição química desse material orgânico. A supressão de patógenos e pragas pela liberação de compostos biocidas no solo, resultado da decomposição de resíduos vegetais, é normalmente conhecida por biofumigação (Kirkegaard et al., 1998). Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da incorporação de diferentes doses de farinha de sementes de mamão sobre M. javanica, cobrindo ou não os vasos com plástico transparente. Material e Métodos Os ensaios foram conduzidos em casa de vegetação e em câmara de crescimento do Departamento de Fitopatologia, ambas localizadas no campus da Universidade Federal de Viçosa. Obtenção do inóculo. Para a obtenção e multiplicação do inóculo, populações de Meloidogyne javanica foram multiplicadas em tomateiros (Solanum lycopersicon Santa Clara ), mantidos sob condições de casa de vegetação, por aproximadamente 70 dias. Antes da condução dos experimentos, foi realizada Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 163

52 Marcelo M. Coutinho, Leandro G. Freitas, Wânia S. Neves, Rosangela Dallemole-Giaretta, Silamar Ferraz, Everaldo A. Lopes & Rosângela D.L. Oliveira eletroforese de isoenzimas para a confirmação da espécie e a verificação da pureza do inóculo. Obtenção da farinha de sementes de mamão (FSM). As sementes de mamão foram cedidas pela Tropical Indústria de Alimentos S/A (TIAL) e secas ao ar, em terreiro de café. Após a secagem, foram trituradas em moinho de martelos rotativos equipado com peneira de 3 mm de abertura e a farinha resultante foi armazenada em local seco e ventilado, para posterior utilização. Efeito da aplicação de FSM para o controle de M. javanica. 1) Bioensaios em casa de vegetação. No primeiro experimento, o substrato contido em vasos plásticos de 500 cm 3 de capacidade foi infestado com ovos de M. javanica. Três dias após a infestação do substrato, foram incorporadas as seguintes doses de FSM: 0; 0,0625; 0,125; 0,25; 0,5; 1; 2; 4; ou 8 g FSM / kg de substrato. Após a incorporação, os vasos foram cobertos e vedados com plástico de polietileno transparente, com espessura de 150 µm, para verificar o possível efeito do aumento da temperatura do substrato sobre os nematoides. Decorridos cinco dias após a cobertura do substrato, uma muda de tomateiro Santa Cruz Kada de 21 dias de idade foi transplantada por vaso. Ao final de 45 dias foram avaliados número de galhas e de ovos, a massa da parte aérea, a altura das plantas e a massa das raízes. No segundo experimento, as mesmas doses de FSM descritas anteriormente foram incorporadas ao substrato. Entretanto, após a incorporação da FSM, os vasos não foram cobertos com plástico transparente. O primeiro e o segundo experimento foram conduzidos simultaneamente na mesma casa de vegetação e foram avaliadas as mesmas variáveis. A temperatura do ar e do substrato (a 10 cm de profundidade) foi monitorada duas vezes ao dia durante os ensaios. 2) Bioensaio em câmara de crescimento. Vasos plásticos contendo de 0,5 kg de substrato foram infestados com ovos de M. javanica. Após três dias, as mesmas doses de FSM adotadas nos bioensaios anteriores foram incorporadas ao substrato e os vasos foram cobertos com plástico de polietileno transparente com espessura de 150 µm, para verificar o possível efeito da retenção de produtos voláteis produzidos durante a decomposição da FSM. A cobertura plástica foi retirada após cinco dias e uma muda de tomateiro foi transplantada em cada vaso. Desde a infestação do substrato até o transplantio das mudas, os vasos foram mantidos em câmara de crescimento a 26 C, com o objetivo de eliminar o efeito da variação de temperatura nos cinco primeiros dias após a incorporação da FSM. Em seguida, os vasos foram transferidos para casa de vegetação, onde permaneceram por 45 dias até a avaliação. A temperatura da casa de vegetação e do substrato foi monitorada durante todo o experimento. Avaliaramse os números de galhas e de ovos, a massa da parte aérea, altura das plantas e a massa das raízes. Delineamento experimental e análises estatísticas. O delineamento adotado nos experimentos foi inteiramente casualizado, empregando-se oito repetições por tratamento. Os dados foram analisados com o auxílio do programa Statistica 7.0 (Statsoft, 2004), procedendo-se à análise do intervalo de confiança entre as médias, associada ao teste T a 5 % de probabilidade, pois nenhum modelo foi ajustado para uma possível análise de regressão dos dados. Resultados e Discussão A cobertura do substrato com plástico transparente permitiu maior redução no número de galhas e de ovos de M. javanica, em comparação com o substrato não coberto (Figura 1). A temperatura máxima média do substrato coberto foi de 41,8 C e no substrato não coberto foi de 35,5 C. A elevação da temperatura acima de 40 C no substrato coberto pode ter contribuído para reduzir em 98 % o número de galhas e de ovos, mesmo no tratamento sem a incorporação de FSM, cujo efeito seria apenas da cobertura do substrato com plástico. Neste caso, seria desnecessário o uso de FSM, pois a solarização do substrato já seria suficientemente efetiva no controle do nematoide. Stapleton & Duncan (1998) constataram que o número de galhas em tomateiros foi reduzido de 95 a 100 % após incorporação de resíduos de brássicas ao solo, em combinação com o aquecimento do substrato durante sete dias a 38 C. A temperatura ideal para a eclosão de M. javanica é de 30 C, para a mobilidade dos juvenis é de 25 C e temperaturas próximas a Vol. 33(2)

53 Incorporação de Farinha de Sementes de Mamão (Carica papaya L.) para o Controle de Meloidogyne javanica Número de galhas * Doses (g FSM/ kg solo) Número de galhas Dose FSM (g/kg de solo) Número de ovos * Número de ovos Doses (g FSM/ kg solo) Dose FSM (g/kg de solo) Altura das plantas (cm) * Altura das plantas (cm) Doses (g FSM/ kg solo) Dose FSM (g/kg de solo) Peso da parte aérea (g) * Peso da parte aérea (g) Doses (g FSM/ kg solo) Dose FSM (g/kg de solo) Peso da raiz (g) * Peso da raiz (g) Doses (g FSM/ kg solo) Dose FSM (g/kg de solo) Figura 1 Número de galhas, de ovos, altura das plantas, massa da parte aérea e das raízes de tomateiros inoculados com M. javanica, quarenta e cinco dias após a incorporação ao substrato de diferentes doses de FSM, em substrato coberto (coluna à esquerda) e não coberto (coluna à direita) com plástico transparente por 5 dias. As barras representam o intervalo de confiança, associado ao teste T a 5% de probabilidade. *Testemunha não solarizada. C são letais ou subletais (Bird & Wallace, 1965). Dessa forma, o controle obtido no substrato inicialmente coberto pode estar relacionado às elevadas temperaturas alcançadas nos primeiros após o tratamento do substrato. No substrato não coberto, houve redução significativa de 82 e 86 % no número de galhas e de 91 e 95 % no número de ovos ao se incorporar 4 e 8 g FSM / kg de substrato, respectivamente (Figura 1). A altura das plantas não foi influenciada pela adição de FSM. Por outro lado, a incorporação de 4 e 8 g FSM / kg de substrato aumentou a massa das raízes, Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 165

54 Marcelo M. Coutinho, Leandro G. Freitas, Wânia S. Neves, Rosangela Dallemole-Giaretta, Silamar Ferraz, Everaldo A. Lopes & Rosângela D.L. Oliveira em relação ao controle, em ambos os experimentos. A massa da parte aérea foi maior nas parcelas tratadas com FSM, e pode ser resultado da liberação de nutrientes após a decomposição dos resíduos orgânicos (Stirling, 1991). A ação nematicida de extratos de sementes de mamão já havia sido demonstrada contra Scutellonema bradys (Coimbra et al., 2006), M. incognita e M. javanica (Neves et al., 2005a, b). No entanto, conforme observado no presente estudo, a incorporação de FSM ao substrato também é eficiente no controle de M. javanica. Possivelmente, o efeito nematicida das sementes de mamão seja resultado da presença do composto benzilisotiocianato, originado após a hidrólise do glucosinolato (Kermanshai et al. 2001). O fato de que não houve controle efetivo quando o substrato não foi coberto aumenta a possibilidade de que o controle seja resultado da ação do isotiocianato e de outros compostos nematicidas liberados pela FSM. A redução no número de galhas e de ovos ocorreu a partir de 4 g de FSM / kg de substrato. Plantas cultivadas em câmara de crescimento não sofreram alterações significativas em relação à altura, massa da parte aérea e das raízes. Entretanto, o número de galhas foi reduzido em 31, 35, 46 e 71 % após a aplicação de 0,125; 0,5; 4; e 8 g de FSM por kg de substrato, respectivamente (Figura 2). Todas as doses de FSM testadas reduziram o número de ovos quando comparados com a testemunha (Figura 3), embora o controle tenha sido parcial. Desse modo, pode-se concluir que a decomposição da FSM no substrato liberou gases nocivos ao nematoide. O efeito do aumento das doses de FSM não foi tão pronunciado quando os vasos foram cobertos e mantidos inicialmente em câmara de crescimento, em comparação com a manutenção dos vasos em casa de vegetação nos cinco primeiros dias. Tal diferença pode ser explicada pela variação de temperatura entre Número de galhas Dose FSM (g/kg de solo) Figura 2 - Número de galhas por sistema radicular de tomateiros inoculados com M. javanica, quarenta e cinco dias após a incorporação ao substrato de diferentes doses de FSM. Substrato mantido coberto com plástico transparente por 5 dias em câmara de crescimento, a 26 C. As barras representam o intervalo de confiança, associado ao teste T, a 5% de probabilidade. 500 Número de ovos (x 1000) Dose FSM (g/kg de solo) Figura 3 - Número de ovos por sistema radicular de tomateiros inoculados com M. javanica, quarenta e cinco dias após a incorporação ao substrato de diferentes doses de FSM. Substrato mantido coberto com plástico transparente por 5 dias em câmara de crescimento, a 26 C. As barras representam o intervalo de confiança, associado ao teste T, a 5% de probabilidade. 166 Vol. 33(2)

55 Incorporação de Farinha de Sementes de Mamão (Carica papaya L.) para o Controle de Meloidogyne javanica os dois experimentos. A temperatura média foi aproximadamente 9 C mais elevada em casa de vegetação do que em câmara de crescimento. A decomposição da FSM pode ter sido acelerada por temperaturas mais altas, resultando em maior produção do gás isotiocianato. Na ausência de cobertura do substrato com plástico transparente, a dose mínima efetiva para o controle de M. javanica foi 4 g / kg de substrato. Considerando a aplicação em área total e a incorporação do material a 20 cm de profundidade, tal dose equivale a kg / ha. Essa quantidade de resíduo é muito elevada, principalmente em razão da disponibilidade das sementes de mamão ser basicamente concentrada em regiões próximas a unidades de processamento ou em polos produtores da fruta. Desta forma, o uso de tais resíduos apenas seria viável para a aplicação em pequenas áreas, ambientes protegidos, tratamento de substrato para a produção de mudas ou em culturas de alto valor econômico (Lopes et al., 2008), principalmente em locais próximos da fonte do material, em razão dos custos de transporte. Com o objetivo de reduzir as quantidades aplicadas de FSM, o substrato poderia ser coberto com plástico transparente por pelo menos cinco dias, após a incorporação do material. Deste modo, a eficiência de controle seria aumentada, visto que a elevação da temperatura do substrato, além de acelerar a decomposição da FSM, poderia atuar diretamente causando a mortalidade dos nematoides. Estudos posteriores devem ser conduzidos em condições de campo e envolvendo outros fitopatógenos com o objetivo de validar o método de controle avaliado neste trabalho. Agradecimentos As sementes de mamão foram gentilmente cedidas pela Tropical Indústria de Alimentos S/A (TIAL). Literatura Citada BIRD, A.F. & H.R. WALLACE The influence of temperature on Meloidogyne hapla and M. javanica. Nematologica, 11: CHARCHAR, J.M. & F.A.S. ARAGÃO Reprodução de Meloidogyne spp. em cultivares de tomate e pepino sob estufa plástica e campo. Nematologia Brasileira, 29 (2): COIMBRA, J.L., A.C.F. SOARES, M.S. GARRIDO, C.S. SOUSA & F.L.B. RIBEIRO Toxicidade de extratos vegetais a Scutellonema bradys. Pesquisa Agropecuária Brasileira, 41 (7): DAR, R.N., L.C. GARG & R.D. PATHAK Anthelmintic activity of Caryca papaya seeds. Indian Journal of Pharmacy, 27: FERRAZ, L.C.C.B. & M.G.C. CHURATA-MASCA Comportamento dos cultivares de tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill.) de crescimento determinado em relação ao nematoide Meloidogyne incognita (Kofoid & White, 1919) Chitwood, Científica, 11 (1): HOITINK, H.A.J. & P.C. FAHY Basis for the control of soilborne plant pathogens with compost. Annual Review Phytopathology, 24: KERMANSHAI, R., B.E. McCARRY, J. ROSENFELD, P.S. SUMMERS, E.A. WERETILNYK & G.J. SORGER Benzyl isothiocyanate is the chief or sole anthelmintic in papaya seed extracts. Phytochemistry, 57: KIRKEGAARD, J.A., M. SARWAR, J.N. MATTHIESSEN, G. THOMAS & A.A. MONTEIRO Assessing the biofumigation potential of crucifers. Acta Horticulturae, 459: KRISHNAKUMARI, M.K. & S.K. MAJUMDER Studies on anthelmintic activities of seeds of Carica papaya Linn. Annals of Biochemistry and Experimental Medicine, 20: LINFORD, M.B., Y. FRANCIS & J.M. OLIVEIRA Reduction of soil populations of the root-knot nematode during decomposition of organic matter. Soil Science, 45 (2): LOPES, E.A., S. FERRAZ, L.G. FREITAS, P.A. FERREIRA & D.X. AMORA Efeito da incorporação da parte aérea seca de mucuna preta e de tomateiro ao solo sobre Meloidogyne incognita e M. javanica. Nematologia Brasileira, 29 (1): LOPES, E.A., S. FERRAZ, L.G. FREITAS & P.A. FERREIRA Controle de Meloidogyne javanica com diferentes quantidades de torta de nim (Azadirachta indica). Revista Trópica, 1 (2): LORDELLO, L.G.E Nematoides das plantas cultivadas. Editora Nobel, São Paulo, 197 p. NEVES, W.S., M.M. COUTINHO, R. DALLEMOLE- GIARETTA, R.J.F. ZOOCA, L.G. FREITAS & C.F.S. FABRY. 2005a. Atividade nematicida de extratos de semente de mamão sobre juvenis de Meloidogyne javanica e M. incognita. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE FITOPATOLOGIA, XXXIII, Brasília. Resumos, p. 32. NEVES, W.S., M.M. COUTINHO, R.J.F. ZOOCA, R. DALLEMOLE-GIARETTA & L.G. FREITAS. 2005b. Inibição da eclosão de juvenis de Meloidogyne javanica e de M. incognita por extrato aquoso de sementes de mamão. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE FITOPATOLOGIA, XXXIII, Brasília. Resumos, p. 32. ROBERTS, P.A. & D. MAY Meloidogyne incognita Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 167

56 Marcelo M. Coutinho, Leandro G. Freitas, Wânia S. Neves, Rosangela Dallemole-Giaretta, Silamar Ferraz, Everaldo A. Lopes & Rosângela D.L. Oliveira resistance characteristic in tomato genotypes developed for processing. Journal of Nematology, 18: RODRÍGUEZ-KÁBANA, R., G. MORGAN-JONES & I. CHET Biological control of nematodes: Soil amendments and microbial antagonists. Plant and Soil, 100: SEO, S.T. & C.S. TANG Hawaiian fruit flies Diptera: (Tephritidae) toxicity of benzyl isothiocyanate against eggs or 1st instars of three species. Journal Economic Entomology, 75: SOUZA, N.L Interação entre solarização e incorporação prévia de matéria orgânica no solo. Summa Phytopathologica, 30 (1): STAPLETON, J.J Soil solarization in various agricultural production systems. Crop Protection, 19: STAPLETON J.J. & R.A DUNCAN Soil desinfestation with cruciferous amendments and sublethal heating: effects on Meloidogyne incognita, Sclerotium rolfsii and Pythium ultimum. Plant Pathology, 47: STATSOFT, Inc Statistica for Windows (Computer Program Manual). Statsoft Inc., Tulsa (OK) EUA. STIRLING, G.R Biological control of plant parasitic nematodes: Progress, problems and prospects. CAB International, Wallingford, 282 p. 168 Vol. 33(2)

57 ARTIGO Controle de Meloidogyne javanica com Pochonia chlamydosporia e Farinha de Sementes de Mamão Controle de Meloidogyne javanica com Pochonia chlamydosporia e Farinha de Sementes de Mamão* Marcelo M. Coutinho 1,2, Leandro G. Freitas 2, Rosangela Dallemole-Giaretta 2, Wânia S. Neves 3, Everaldo A. Lopes 2 ** & Silamar Ferraz 2 * Parte da Dissertação do primeiro autor para obtenção do grau de Mestre pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), Viçosa (MG) Brasil. 1 Bolsista da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). 2 Departamento de Fitopatologia, UFV, Viçosa (MG) Brasil. 3 Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais (EPAMIG), Unidade Regional Norte de Minas, Nova Porteirinha (MG) Brasil. **Autor para correspondência: everaldolopes@hotmail.com Recebido para publicação em 16 / 02 / Aceito em 26 / 05 / 2009 Editado por Guilherme Asmus Resumo - Coutinho, M.M., L.G. Freitas, R. Dallemole-Giaretta, W.S. Neves, E.A. Lopes & S. Ferraz Controle de Meloidogyne javanica com Pochonia chlamydosporia e farinha de sementes de mamão. Avaliou-se a efetividade do fungo nematófago Pochonia chlamydosporia, aplicado na forma de clamidósporos ou de fibra de coco colonizada, juntamente com diferentes doses de farinha de sementes de mamão (FSM) para o controle de Meloidogyne javanica em casa de vegetação. No primeiro experimento, o isolado Pc-10 de P. chlamydosporia foi aplicado ao solo na forma de clamidósporos (5.000 / g de solo) simultaneamente com 0, 1, 2 ou 4 g de FSM / kg de solo e ovos de M. javanica por vaso. Após 15 dias, uma planta de tomateiro foi transplantada por vaso. Na avaliação, após 45 dias, em todos os tratamentos em que foram incorporados os clamidósporos do fungo, independentemente da adição de FSM, o número de ovos de M. javanica foi 56 a 61 % menor do que no tratamento testemunha, e o número de galhas, 36 a 47 % menor. No segundo experimento, 20 g de fibra de coco colonizada por P. chlamydosporia foram incorporados por quilo de solo juntamente com as diferentes doses de FSM e ovos de M. javanica por vaso. Decorridos sete dias da infestação, transplantouse uma muda de tomateiro em cada recipiente. Ao final de 45 dias, o número de galhas por sistema radicular foi reduzido em 20, 31, 61 e 92 % para as doses da FSM de 0, 1, 2 ou 4 g / kg de solo, respectivamente. Em relação ao número de ovos, as reduções foram de 45, 79 e 95 % quando a farinha foi incorporada nas doses de 1, 2 ou 4 g / kg de solo, respectivamente. Palavras-chaves: nematoide-das-galhas, controle biológico, fungo nematófago, matéria orgânica. Summary - Coutinho, M.M., L.G. Freitas, R. Dallemole-Giaretta, W.S. Neves, E.A. Lopes & S. Ferraz Control of Meloidogyne javanica by Pochonia chlamydosporia and papaya seed flour. The control efficiency of Meloidogyne javanica by the nematophagous fungus Pochonia chlamydosporia, applied in the form of chlamydospores or as colonized coconut fiber, with different rates of papaya seed flour (PSF) was evaluated under greenhouse conditions. In the first experiment, P. chlamydosporia isolate Pc-10 was applied into the soil in the form of chlamydospores (5,000 / g of soil) simultaneously with 0, 1, 2 and 4 g of FSM / kg of soil and 4,000 eggs of M. javanica per pot. Tomato seedling was transplanted to each pot fifteen days after infestation. After 45 days, in all treatments in which the clamydospores were incorporated, regardless PSF amendment, the number of eggs and galls were reduced by 56 to 61 % and by 36 to 47 %, respectively, in comparison to the control. In the second experiment, 20 g of coconut fiber colonized by P. chlamydosporia were incorporated per kilogram of soil, with different rates of FSM and with 4,000 eggs of M. javanica per pot. Seven days after soil infestation, one tomato seedling was transplanted to the each pot. Forty-five days later, the Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 169

58 Marcelo M. Coutinho, Leandro G. Freitas, Rosangela Dallemole-Giaretta, Wânia S. Neves, Everaldo A. Lopes & Silamar Ferraz number of galls was reduced by 20, 31, 61 and 92 % in the PSF rates of 0, 1, 2 and 4 g / kg of soil, respectively. Concerning the number of eggs, there was reduction of 45, 79 and 95 % when the PSF was incorporated at 1, 2 and 4 g / kg of soil, respectively. Key words: root-knot nematodes, biological control, nematophagous fungi, organic amendment. Introdução Os nematoides-das-galhas (Meloidogyne spp.) são responsáveis por grandes perdas em hortaliças, podendo inviabilizar áreas de produção quando a sua infestação é considerada alta (Sikora & Fernández, 2004). Na tentativa de reduzir a população do nematoide abaixo do nível econômico de dano, vários métodos de controle têm sido pesquisados, a fim de proporcionar o controle satisfatório deste fitopatógeno, entre eles o controle biológico (Sikora & Fernández, 2004). Os organismos utilizados para o controle biológico podem ser introduzidos ou estarem presentes naturalmente no solo, controlando os patógenos da área (Bridge, 1996). O estímulo para aumentar a população e a eficiência dos antagonistas pode ser feito por meio da adição ao solo de materiais orgânicos que também podem melhorar as características físico-químicas do solo e liberar compostos nematicidas. Entre os agentes de biocontrole de nematoides com potencial de uso prático, pode-se destacar o fungo Pochonia chlamydosporia (Goddard) Zare & Gams, anteriormente conhecido como Verticillium chlamydosporium (Kerry, 2001). Esse fungo possui características relevantes que favorecem seu uso como agente de controle de nematoides, tais como: a) não ser patogênico a plantas, seres humanos e outros animais; b) ser capaz de se estabelecer no solo, mesmo na ausência de nematoides; c) ser parasita de ovos e fêmeas de Meloidogyne spp. (Kerry, 2001); d) ser considerado bom competidor saprofítico, na forma de conídios, micélios e clamidósporos (Crump & Kerry, 1981; Kerry et al.,1984); e) ser capaz de colonizar as raízes de plantas e promover seu desenvolvimento (Hidalgo-Díaz et al., 2000; Lopez-Llorca et al; 2002; Monfort et al., 2005; Dallemole-Giaretta, 2008). Entretanto, a interação entre a planta hospedeira, o nematoide e P. chlamydosporia deve ser considerada, visto que, em culturas altamente suscetíveis, o antagonista é menos efetivo em controlar Meloidogyne spp., devido à significante proporção de massas de ovos internas, não expostas ao parasitismo do fungo (Kerry, 2001). Para solucionar tal problema, uma alternativa seria combinar P. chlamydosporia com outros métodos de controle que não prejudicassem a colonização do fungo, como a adição de resíduos orgânicos com propriedades nematicidas (Bourne, 2001; Nico et al., 2004). As sementes de mamão (Carica papaya), subproduto da indústria de sucos, doces, geleias e outros produtos alimentícios, são conhecidas na medicina popular por sua ação anti-helmíntica. Elas são ricas em glucosinolatos, que ao serem hidrolisados pela enzima mirosinase, originam o composto benzil-isotiocianato, com comprovada ação ovicida e larvicida (Dar et al, 1965; Seo & Tang, 1982; Kermanshai et al., 2001). Em razão de tal composição química, as sementes de mamão apresentam potencial para o controle de fitonematoides. Os extratos preparados a partir desses resíduos inibiram drasticamente a eclosão de juvenis de M. javanica e M. incognita (Neves et al., 2005a, b), assim como causaram acentuada inativação ou morte de juvenis de Scutellonema bradys (Coimbra et al., 2006) e de Meloidogyne spp. (Neves et al., 2005a, b). A casca de coco é um subproduto da industrialização da água de coco, e pode compor condicionadores de solo com características nematicidas, pois a fibra de coco melhora as características físicas do solo, além de servir de substrato para a produção de P. chlamydosporia in vitro e favorecer o estabelecimento desse fungo em condições de campo. Além disso, as cascas de coco, que necessitam de oito anos para sua completa decomposição, teriam um destino mais nobre, evitando o acúmulo deste resíduo em lixões e nas margens das estradas (Carrijo, 2002). A ação combinada de P. chlamydosporia, farinha de sementes de mamão (FSM) e fibra de coco é desconhecida. Os múltiplos benefícios que podem advir da interação entre a ação nematicida da FSM, o parasitismo promovido pelo fungo e as melhorias estruturais do solo resultantes da incorporação da fibra 170 Vol. 33(2)

59 Controle de Meloidogyne javanica com Pochonia chlamydosporia e Farinha de Sementes de Mamão de coco são as premissas que motivaram a realização deste trabalho. Deste modo, o objetivo desta pesquisa foi avaliar a aplicação de P. chlamydosporia, incorporada ao solo na forma de clamidósporos ou de fibra de coco colonizada, juntamente com diferentes doses de farinha de sementes de mamão. Material e Métodos Os ensaios foram conduzidos no laboratório de controle biológico de fitonematoides do Instituto de Biotecnologia Aplicado à Agropecuária (BIOAGRO) e em casa de vegetação do Departamento de Fitopatologia, no campus da Universidade Federal de Viçosa. Produção do nematoide para inóculo. A população de M. javanica utilizada nos experimentos foi multiplicada em tomateiros (Lycopersicon esculentum Santa Clara ), mantidos em vasos de cm 3 sob condições de casa de vegetação, por aproximadamente 70 dias. Antes da condução dos experimentos, foi realizada eletroforese de isoenzimas para a confirmação da espécie e a verificação da ausência de contaminação. Os ovos foram extraídos pelo método de Hussey & Barker (1973), modificado por Boneti & Ferraz (1981), e as suspensões resultantes foram calibradas para as inoculações com o uso de microscópio estereoscópio e câmara de Peters. Efeito da incorporação de farinha de sementes de mamão (FSM) e do fungo P. chlamydosporia, aplicado na forma de clamidósporos, sobre M. javanica. 1) Produção dos clamidósporos de P. chlamydosporia. O isolado de P. chlamydosporia (Pc- 10), originário de Viçosa e pré-selecionado por reduzir o número de galhas e de ovos em experimentos preliminares (Lopes et al., 2007; Dallemole-Giaretta, 2008), foi repicado para placas de Petri contendo o meio CMA ( corn meal agar ) e incubado por 21 dias, a 26 ºC, no escuro. Três discos de micélio de 7 mm de diâmetro foram depositados no substrato mantido em um frasco erlenmeyer de 250 ml. O substrato foi composto por 40 g de milho triturado, 40 g de areia (1:1, m:m) e 60 ml de água destilada, previamente autoclavados por 30 minutos. Após 21 dias, o substrato colonizado pelo fungo foi retirado do erlenmeyer e recebeu 100 ml de água de torneira, para preparo de uma suspensão fúngica, que foi filtrada em gaze dupla. O número de clamidósporos da suspensão foi quantificado com o auxílio de câmara de Neubauer e microscópio óptico. A suspensão foi calibrada para que fossem aplicados clamidósporos / g de solo. 2) Bioensaio em casa de vegetação. Vasos plásticos com capacidade de 500 cm 3 foram cheios com mistura de solo argiloso e areia na proporção 1:1 (v:v), previamente tratada com brometo de metila. Esse substrato foi então umedecido até aproximadamente 60 % da capacidade de campo e infestado com ovos de M. javanica por vaso. Em seguida, foram incorporados os clamidósporos de P. chlamydosporia por grama de solo e a FSM nas doses de 0, 1, 2, ou 4g / kg de substrato. Os componentes de cada vaso foram colocados em um saco plástico de cm 3, homogeneizados manualmente e recolocados nos vasos. Os tratamentos contendo apenas substrato e substrato mais nematoides foram utilizados como testemunhas negativa e positiva, respectivamente. Decorridos quinze dias da infestação do solo, uma muda de tomateiro com 21 dias de idade foi transplantada para cada vaso. Quarenta e cinco dias após o transplantio foram avaliados a massa e a altura da parte aérea, a massa do sistema radicular, além do número de galhas e de ovos por planta. Para a retirada dos ovos do sistema radicular, as raízes de cada planta foram agitadas manualmente em NaOCl na concentração de 0,5 %, durante três minutos, segundo Hussey & Barker (1973). A seguir, os ovos foram coletados em peneira de 25 µm de abertura de malha (500 mesh), enxaguados em água corrente e armazenados em tubos plásticos em geladeira a 7 ºC até o momento da avaliação. Os ovos foram contados com o auxílio de câmara de Peters e microscópio estereoscópio. Efeito da incorporação de fibra de coco colonizada por P. chlamydosporia e de farinha de sementes de mamão sobre M. javanica. 1) Produção do inóculo do fungo na fibra de coco. Após o crescimento de P. chlamydosporia em placas de Petri, discos de micélios com 7 mm de diâmetro, retirados das bordas das colônias, foram colocados em 400 g de fibra de coco esterilizada, mantida em erlenmeyer de 1 l. Em seguida, o fungo foi incubado por 21 dias, para a colonização da fibra de coco. Para Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 171

60 Marcelo M. Coutinho, Leandro G. Freitas, Rosangela Dallemole-Giaretta, Wânia S. Neves, Everaldo A. Lopes & Silamar Ferraz se determinar a quantidade de clamidósporos produzidos pelo fungo no substrato, a suspensão fúngica foi preparada através da imersão de amostras de fibra de coco colonizada em água de torneira e, em seguida, filtrada em gaze dupla. O número de clamidósporos da suspensão foi quantificado com o auxílio de câmara de Neubauer e microscópio óptico. Foram produzidos 7.5 x 10 3 clamidósporos por grama de fibra de coco. 2) Bioensaio em casa de vegetação. Solo argiloso e areia 1:1 (v:v), previamente tratados com brometo de metila e distribuídos em vasos de 500 cm 3, foram infestados com ovos de M. javanica, como no bioensaio anterior. Em seguida, a FSM, nas doses 0, 1, 2, ou 4 g juntamente com 20 g de fibra de coco colonizada pelo fungo, foram adicionadas por quilo de solo. Dessa forma, o inóculo fúngico aplicado ao solo foi de clamidósporos por grama de solo. A mistura foi homogeneizada por agitação manual em saco plástico e vertida novamente nos vasos. Vasos contendo somente o substrato e o substrato inoculado com o nematoide constituíram as testemunhas negativa e positiva, respectivamente. Delineamento experimental e análises estatísticas. O delineamento adotado nos experimentos foi do tipo inteiramente casualizado, com oito repetições por tratamento. Os dados foram analisados com o auxílio do programa Statistica 7.0 (Statsoft, 2004). As médias foram comparadas entre si pelo teste de Duncan, ao nível de 5 % de probabilidade. Foi obtida a análise de regressão do índice de galhas e de ovos, resultante da divisão do número de galhas ou de ovos pela média desses índices nas respectivas testemunhas. O gráfico da regressão foi criado em função dos índices obtidos. Resultados e Discussão A aplicação de P. chlamydosporia isoladamente ou associada com a farinha de sementes de mamão reduziu o número de galhas e de ovos de M. javanica, independentemente da quantidade de FSM incorporada ao solo (Figuras 1 e 2). O fungo, aplicado 800 a Número de ovos (x 1000) b b b b 0 MJ PC 1g FSM+PC 2g FSM+PC 4g FSM+PC Tratamentos Figura 1 Número de ovos de M. javanica por sistema radicular de tomateiros, obtidos aos 45 dias após a inoculação com Pochonia chlamydosporia (PC) e diferentes doses de farinha de sementes de mamão (FSM). Diferentes letras nos tratamentos indicam diferenças pelo teste de Duncan a 5 % de probabilidade. 800 Número de galhas a b b b b 0 MJ PC 1g FSM+PC 2g FSM+PC 4g FSM+PC Tratamentos Figura 2 Número de galhas de M. javanica por sistema radicular de tomateiros, obtidos aos 45 dias após a inoculação com Pochonia chlamydosporia (PC) e diferentes doses de farinha de sementes de mamão (FSM). Diferentes letras nos tratamentos indicam diferenças pelo teste de Duncan a 5 % de probabilidade. 172 Vol. 33(2)

61 Controle de Meloidogyne javanica com Pochonia chlamydosporia e Farinha de Sementes de Mamão isoladamente reduziu em 60 e 36 % o número de ovos e de galhas do nematoide, respectivamente. A adição de FSM não resultou em controle do nematoide adicional ao uso do fungo. Não houve diferença entre as doses de FSM utilizadas, portanto a aplicação do antagonista foi o fator responsável pelo controle de M. javanica neste experimento. Era esperado que a aplicação conjunta de P. chlamydosporia com FSM promovesse controle superior à aplicação do fungo isoladamente, uma vez que, em trabalhos conduzidos por Neves et al. (2005a,b), a FSM reduziu de forma acentuada a eclosão e causou inativação ou morte de juvenis de M. javanica e M. incognita. A massa da parte aérea e das raízes e altura das plantas não foram influenciadas significativamente por nenhum tratamento. Quando a fibra de coco colonizada pelo fungo foi incorporada juntamente com a FSM, no segundo experimento, obteve-se uma resposta de função quadrática para redução do índice do número de ovos com o aumento das doses de FSM (Figura 3). A adição do fungo, sem a incorporação da FSM, apresentou índice de galhas superior ao apresentado quando FSM foi adicionado ao solo. Ao aumentar as doses de FSM, o índice de ovos decresceu, proporcionando controle de 100 % do nematoide quando se incorporou 4 g de FSM para cada quilo de solo. Em relação ao número de galhas, o resultado foi semelhante, entretanto, expresso pela função linear y = 0,85 0,24x (Figura 4). A altura das plantas, massa da parte aérea e massa da raiz não apresentaram diferenças significativas em relação ao tratamento controle. A densidade de inóculo do fungo (clamidósporos) incorporada neste experimento foi relativamente pequena, num total de clamidósporos por grama de solo. A baixa colonização da fibra de coco pode estar ligada à pequena quantidade de hemicelulose (3 a 12 %) presente na fibra de coco, Índice de ovos 1,5 1 0,5 Y = 1,03-0,58X +0,0821X 2 R 2 = 0, Doses de FSM (g/kg de solo) Figura 3 Relação entre o índice de ovos e as doses 0, 1, 2, ou 4 g de FSM juntamente com 20 g de fibra de coco colonizada pelo fungo Pochonia chlamydosporia por kg de solo, 45 dias após a infestação do solo com ovos de M. javanica. 1 Índice de galhas 0,8 0,6 0,4 0,2 Y = 0,85-0,24X R 2 = 0, Doses de FSM (g/kg de solo) Figura 4 Relação entre o índice de galhas e as doses 0, 1, 2, ou 4 g de FSM juntamente com 20 g de fibra de coco colonizada pelo fungo Pochonia chlamydosporia por quilo de solo, 45 dias após a infestação do solo com ovos de M. javanica. Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 173

62 Marcelo M. Coutinho, Leandro G. Freitas, Rosangela Dallemole-Giaretta, Wânia S. Neves, Everaldo A. Lopes & Silamar Ferraz que é a fração prontamente atacada pelos microrganismos (Noguera, 2000), o que pode ter dificultado o estabelecimento de P. chlamydosporia. Machado & Campos (1997) demonstraram que o desenvolvimento de P. chlamydosporia pode ser afetado pelo tipo de substrato e que sua eficiência no controle de M. javanica pode ter relação direta com a maior concentração do inóculo inicial do fungo no substrato. Ao final dos experimentos, independente da adição da FSM, o fungo P. chlamydosporia foi recuperado do solo em todos os tratamentos, mostrando capacidade de se estabelecer nestas condições experimentais. No primeiro experimento, adotou-se a concentração de clamidósporos / g de solo, comumente utilizada em experimentos com este fungo, a qual foi determinada como a concentração ideal para o controle de nematoides (De Leij & Kerry, 1991; Kerry, 2001). A menor eficiência de P. chlamydosporia no controle de M. javanica quando aplicado na forma de fibra de coco colonizada, porém sem a FSM, observada no segundo experimento, pode ser explicada pela baixa quantidade do inóculo incorporada ao solo. Doses inferiores a clamidósporos / g de solo proporcionam baixo controle de M. incognita (De Leij et al., 1992). Outro fato que pode ter afetado o desempenho do antagonista foi o tempo inicial diferenciado entre a infestação do solo, com os clamidósporos do fungo e os ovos do nematoide, e o transplantio das mudas nos experimentos. No primeiro experimento, o tempo de contato entre o antagonista e os ovos foi de quinze dias antes do transplantio do tomateiro e de sete dias no segundo experimento. O sucesso no controle utilizando o fungo P. chlamydosporia possivelmente pode estar associado ao tempo de exposição inicial entre a P. chlamydosporia e os ovos dos nematoides (Dallemole- Giaretta, 2008). Este maior tempo de exposição pode proporcionar melhor estabelecimento do fungo e consequentemente maior colonização dos ovos do nematoide, reduzindo o inóculo inicial, a infecção das raízes e, por consequência, o número de galhas e de ovos dos nematoides infectando as raízes. O efeito de doses de FSM no controle de M. javanica foi observado no experimento em que foram incorporadas a FSM e a fibra de coco colonizada pelo fungo P. chamydosporia. Por outro lado, quando as mesmas doses de FSM foram incorporadas juntamente com o fungo, mas na forma de clamidósporos, o efeito de doses de FSM não foi verificado. Possivelmente, as diferentes temperaturas atingidas durante a condução dos experimentos poderiam explicar tal discrepância. No primeiro experimento, sem o efeito de dose de FSM, a temperatura média da casa de vegetação foi inferior à encontrada no experimento onde se obteve o efeito de dose deste material com valores médios de máximas de 32,2 e 36,6 C, respectivamente. Temperaturas mais elevadas acelerariam a velocidade de decomposição da FSM, facilitando a formação do composto nematicida benzil-isotiocianato, originado da hidrólise do glucosinolato, conforme observado por Souza (2004). Conclui-se que o isolado de P. chlamydosporia utilizado neste trabalho é eficiente mesmo sem a adição de FSM para o controle de nematoides. A utilização do fungo em fibra de coco colonizada não se mostrou promissora como forma de introdução do fungo ao solo. Em estudos futuros, as doses entre 2 a 4 g de FSM / kg de solo devem ser novamente avaliadas, considerando que o controle mais eficiente do nematoide ocorreu nesta faixa de aplicação do produto. A aplicação de P. chlamydosporia deve ser feita em solo infestado e deve-se aguardar um período maior do que uma semana antes do plantio, para que o fungo possa se estabelecer e atuar sobre o inóculo inicial do nematoide, sendo assim mais efetivo. Literatura Citada BONETI, J.I.S. & S. FERRAZ Modificação do método para extração de ovos para Meloidogyne exigua em raízes de cafeeiro. Fitopatologia Brasileira, 6: 553. BOURNE, J.M Making a soil suppressive to rootknot nematodes by applications of Verticillium chlamydosporium. Tri-Trophic Interactions in the Rhizosphere IOBC / WPRS Bulletin, 24 (1): BRIDGE, J Nematode management in sustentable and subsistence agriculture. Annual Review Phytopathology, 34: CARRIJO, O.A., R.S. LIZ & N. MAKISHIMA Fibra da casca do coco verde como substrato agrícola. Horticultura Brasileira, 20 (4): COIMBRA, J.L., A.C.F. SOARES, M.S. GARRIDO, C.S. SOUSA & F.L.B. RIBEIRO Toxicidade de extratos vegetais a Scutellonema bradys. Pesquisa Agropecuária Brasileira, 41 (7): Vol. 33(2)

63 Controle de Meloidogyne javanica com Pochonia chlamydosporia e Farinha de Sementes de Mamão CRUMP, D.H. & B.R. KERRY A quantitative method for extracting resting spores of two nematode parasitic fungi, Nematophthora gynophila and Verticillium chlamydosporium, from soil. Nematologica, 27: DAR, R.N., L.C. GARG, R.D. PATHAK Anthelmintic activity of Caryca papaya seeds. Indian Journal of Pharmacy, 27: DE LEIJ, F.A.A.M. & B.R. KERRY The nematophagous fungus Verticilllium chlamydosporium as biological a potential control agent for Meloidogyne arenaria. Revué Nématologie, 14 (1): DE LEIJ, F.A.A.M., B.R. KERRY. & J.A. DENNEHY The effect of fungal application rate and nematode density on the effectiveness of Verticilllium chlamydosporium as a biological control agent for Meloidogyne incognita. Nematologica, 38: DALLEMOLE-GIARETTA, R Isolamento e identificação de Pochonia chlamydosporia de solos infestados com Meloidogyne spp. e avaliação do potencial de controle de M. javanica e de promoção de crescimento de tomateiro (Tese de Doutorado). Departamento de Fitopatologia, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa (MG), 132 p. HIDALGO-DÍAZ, L., J.M. BOURNE, B.R. KERRY & M.G. RODRÍGUEZ Nematophagous Verticillium spp. in soil infested Meloidogyne spp. in Cuba: isolation and screening. International Journal of Pest Management, 46(4): HUSSEY, R.S. & K.R. BARKER A comparison of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp., including a new technique. Plant Disease Reporter, 57: KERMANSHAI, R., B.E. MCCARRY, J. ROSENFELD, P.S. SUMMERS, E.A. WERETILNYK & G.J. SORGER Benzyl isothiocyanate is the chief or sole anthelmintic in papaya seed extracts. Phytochemistry, 57: KERRY, B.R Exploitation of nematophagous fungal Verticillium chlamydosporium Goddard for the biological control of root-knot nematodes (Meloidogyne spp.). In: BUTT, T.M., C. JACKSON & N. MAGAN (ed). Fungi as Biocontrol Agents: Progress, Problems and Potential. CAB International, Wallingford - UK, p KERRY, B.R., A. SIMON & A.D. ROVIRA Observations on the introduction of Verticillium chlamydosporium and other parasitic fungi into soil for control of the cereal cyst-nematode Heterodera avenae. Annual Applied. Biology, 105: LOPES, E.A., S. FERRAZ, P.A. FERREIRA, L.G. FREITAS, O.D. DHINGRA, C.G. GARDIANO & S.L. CARVALHO Potencial de fungos nematófagos no controle de Meloidogyne javanica. Nematologia Brasileira, 31(2): LOPEZ-LLORCA, L.V., J.J. BORDALLO, J. SALINAS, E. MONFORT & M.L. LÓPEZ-SERNA Use of light and scanning electron microscopy to examine colonisation of barley rhizosphere by the nematophagous Verticillium chlamydosporium. Micron, 33: MACHADO, V.O.F. & V.P. CAMPOS Cultivo de fungos antagonistas em diferentes substratos e avaliação da eficiência no controle de Meloidogyne javanica. Fitopatologia Brasileira, 22: MONFORT, E., L.V. LOPEZ-LLORCA, H.B. JANSSON, J. SALINAS, JA ON PARK & K. SIVASITHAMPARAM Colonisation of seminal roots of wheat and barley by egg-parasitic nematophagous fungi and their effects on Gaeumannomyces graminis var. tritici and development of root-rot. Soil Biology & Biochemistry, 37: NEVES, W.S., M.M. COUTINHO, R. DALLEMOLE- GIARETTA, R.J.F. ZOOCA, L.G. FREITAS & C.F.S. FABRY. 2005a. Atividade nematicida de extratos de semente de mamão sobre juvenis de Meloidogyne javanica e M. incognita. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE FITOPATOLOGIA, XXXIII, Brasília. Resumos, p. 32. NEVES, W.S., M.M. COUTINHO, R.J.F. ZOOCA, R. DALLEMOLE-GIARETTA & L.G. FREITAS. 2005b. Inibição da eclosão de juvenis de Meloidogyne javanica e de M. incognita por extrato aquoso de sementes de mamão. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE FITOPATOLOGIA, XXXIII, Brasília. Resumos, p. 32. NICO, A.I., R.M. JIMÉNEZ-DÍAZ & P. CASTILLO Control of root-knot nematodes by composted agroindustrial wastes in potting mixtures. Crop Protection, 23: NOGUERA, P., M. ABAD, V. NOGUERA, R. PURCHADES, A. MAQUIERA Coconut coir waste, a new and viable ecologically-friendly peat substitute. Acta Horticulturae, 517: SEO, S.T. & C.S. TANG Hawaiian fruit flies Diptera: (Tephritidae) toxicity of benzyl isothiocyanate against eggs or 1st instars of three species. Journal Economic Entomology, 75: SIKORA, R.A. & E. FERNÁNDEZ Nematode parasites of vegetables. In: CHEN, Z., S. CHEN & D.W. DICKSON (ed). Nematology Advances and Perspectives. Volume II: Nematode Management and Utilization. Beijing & Wallingford, Tsinghua University Press & CABI Publishing, p SOUZA, N.L Interação entre solarização e incorporação prévia de matéria orgânica no solo. Summa Phytopathologica, 30 (1): STATSOFT Statistica for Windows (Computer Program Manual). Statsoft Inc., Tulsa (OK) EUA. Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 175

64 ARTIGO Fernando O.M. Pereira, Ricardo Moreira de Souza, Paulo M. Souza, Claudia Dolinski & Grace K. Santos Estimativa do Impacto Econômico e Social Direto de Meloidogyne mayaguensis na Cultura da Goiaba no Brasil Fernando O.M. Pereira 1, Ricardo Moreira de Souza 1 *, Paulo M. Souza 2, Claudia Dolinski 1 & Grace K. Santos 1 1 Laboratório de Entomologia e Fitopatologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF), Campos dos Goytacazes (RJ) Brasil. 2 Laboratório de Engenharia Agrícola, UENF. Autor para correspondência: ricmsouza@censanet.com.br Recebido para publicação em 08 / 05 / Aceito em 10 / 10 / 2008 Editado por Guilherme Asmus Resumo - Pereira, F.O.M., R.M. Souza, P.M. Souza, C. Dolinski & G.K. Santos Estimativa do impacto econômico e social direto de Meloidogyne mayaguensis na cultura da goiaba no Brasil. Este estudo objetivou estimar o impacto causado pela meloidoginose da goiabeira, causada por M. mayaguensis aos produtores de goiaba em cinco Estados brasileiros. Através da análise de dados da área infestada pelo nematoide, do padrão de evolução da doença, da produtividade média dos pomares infestados e dos coeficientes técnicos da cultura, comparou-se o valor presente líquido (a diferentes taxas de desconto) e a taxa interna de retorno de pomares sadios e afetados pelo nematoide. Nas regiões produtoras estudadas, o prejuízo direto causado por M. mayaguensis foi estimado em 112,7 milhões de reais, aos quais se acrescentam o desemprego de trabalhadores rurais em tempo integral devido ao declínio e morte dos pomares. A estes valores somamse impactos que não puderam ser calculados, mas estão associados às atividades econômicas associadas à goiabicultura, como a redução da produção e comercialização de insumos, transporte, beneficiamento e comercialização da produção e recolhimento de impostos. Este estudo evidencia a importância de M. mayaguensis no Brasil, cuja relevância poderá aumentar se outras áreas produtoras de goiaba forem infestadas e/ou se outras culturas agrícolas forem seriamente afetadas por este nematoide. Palavras-chaves: nematoide-de-galhas, goiabicultura, Psidium guajava, perdas de produção, meloidoginose da goiabeira. Summary Pereira, F.O.M., R.M. Souza, P.M. Souza, C. Dolinski & G.K. Santos Estimate of the economical and social impact of Meloidogyne mayaguensis onto the guava crop in Brazil. This study aimed to estimate the impact caused by M. mayaguensis Rammah & Hirschmann, 1988 onto Brazilian guava growers. The net present worth (calculated at different discount rates) and the internal rate of return of nematode-free and infested guava orchards were calculated based on the nematode-infested area in five States, the pattern of the disease, the average productivity of infested orchards and the crop s technical coefficients. In the regions examined, the total economic loss caused by M. mayaguensis was estimated to be million reais (~US$ 61 millions). The decimation of the infested orchards resulted in the loss of 3,703 full-time job positions. This economical and social impact does not take into account the up- and down-stream effects of the widespread decimation of guava orchards, which include decrease in the production and commercialization of fertilizers and other items used for guava production, distribution, processing and reselling of the guava production and tax collection. This study indicates the economic importance of M. mayaguensis to Brazil, which may be further increased if other guava-producing regions become infested and/or if other crops become widely parasitized by this nematode. Key words: root-knot nematode, Psidium guajava, yield losses. 176 Vol. 33(2)

65 Estimativa do Impacto Econômico e Social Direto de Meloidogyne mayaguensis na Cultura da Goiaba no Brasil Introdução Nos últimos anos, o nematoide-de-galhas da goiabeira (NGG), Meloidogyne mayaguensis Rammah & Hirschmann, 1988, tornou-se o principal problema fitossanitário da cultura de goiaba (Psidium guajava) no Brasil. De fato, estima-se que mais de cinco mil hectares (ha) desta cultura estejam infestados pelo nematoide em vários Estados brasileiros. Devido à inexistência de métodos de controle eficientes, esta meloidoginose invariavelmente causa, a médio prazo, o declínio dos pomares com acentuada queda de produtividade, seguida de morte das goiabeiras. Vários estudos estão sendo realizados sobre esta doença nas áreas de resistência genética (Burla et al., 2007; Carneiro et al., 2007), manejo de pomares infestados (Souza et al., 2006; Gomes, 2007) e caracterização do patossistema (Gomes, 2007; Gomes et al., 2008). Até o momento, não foram realizados estudos voltados à estimativa do impacto econômico e social do NGG na cultura da goiaba (goiabicultura). Sabe-se que esta atividade é desenvolvida quase que exclusivamente por pequenos produtores, os quais dependem desta cultura para sustentação econômica. A goiabicultura também incrementa atividades econômicas à montante e à jusante da propriedade rural, como a produção e comercialização de insumos, agroindústrias, transporte, distribuição e comercialização da produção. Portanto, o objetivo deste trabalho foi estimar o impacto econômico e social do NGG nas regiões goiabicultoras mais afetadas e naquelas nas quais foram realizados levantamentos de áreas infestadas, compreendendo os estados do Rio de Janeiro (RJ), Rio Grande do Norte (RN) e Ceará (CE), bem como os perímetros irrigados pela CODEVASF próximos aos municípios de Petrolina (PE) e Juazeiro (BA). Material e Métodos Sabe-se que o NGG pode provocar declínio e morte de goiabeiras poucos meses após o seu plantio, caso as mudas tenham sido infectadas ainda no viveiro e/ou se o plantio for realizado em área altamente infestada. Entretanto, nematologistas e goiabicultores relatam que mais frequentemente o declínio causado pelo nematoide inicia-se quando o pomar chega à maturidade e atinge o seu potencial produtivo, em torno do quinto ano após o plantio. Estudos realizados em pomares comerciais por Souza et al. (2006) e Gomes (2007) indicam que pomares em declínio apresentam queda de produtividade entre 30 e 70 %, dependendo do manejo fitotécnico do pomar e do emprego de práticas e/ou produtos com ação antagônica ao nematoide. Na impossibilidade de se obter dados específicos sobre a incidência da meloidoginose em cada pomar afetado no RJ, CE, RN, BA e PE, adotou-se como hipótese de trabalho a evolução mais comumente observada para esta doença: no RJ, considerou-se os pomares em declínio no sexto ano após o plantio (produtividade de 50 % do potencial) e morte das goiabeiras no sétimo ano (produtividade nula). Na BA e PE, os pomares frequentemente permanecem em declínio no quinto e sexto anos (50 % de produtividade), ocorrendo a morte no oitavo ano (José A. Valença - Plantec Engenharia Agronômica Ltda., comunicação pessoal). Este mesmo padrão foi adotado para RN e CE. Como a meloidoginose provoca o extermínio de todos os pomares afetados, considerou-se que todos os pomares infestados já haviam sido dizimados, permitindo assim o cálculo do impacto econômico e social do nematoide em valores de Para o RJ, adotou-se os coeficientes técnicos da goiabicultura calculados por Ponciano et al. (2004), os quais representam condições de tecnologia média. Os preços de insumos e serviços listados por aqueles autores foram corrigidos pelo índice IGP-DI para valores de 2008 (Fundação Getúlio Vargas, 2008) e confirmados junto ao comércio local. O único item que requereu ajustes foi o valor da terra, cuja defasagem foi corrigida sob a orientação do engenheiro agrônomo J.L. Pacelli Rocha (Laboratório de Engenharia Agrícola, UENF / CCTA). Para PE e BA, os coeficientes técnicos atualizados para 2008 foram fornecidos pela Plantec Engenharia Agronômica Ltda. Para o RN e CE aplicaram-se os mesmos coeficientes, excetuando-se os gastos de uso da água de irrigação. Com base nos coeficientes técnicos foram elaborados fluxos de caixa, os quais corresponderam aos valores monetários que representam as entradas (receitas efetivas) e saídas (dispêndios efetivos) de Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 177

66 Fernando O.M. Pereira, Ricardo Moreira de Souza, Paulo M. Souza, Claudia Dolinski & Grace K. Santos recursos e produtos por unidade de tempo. A diferença entre receitas e despesas foi denominada fluxo líquido (Noronha, 1987). Definiu-se como prejuízo decorrente da meloidoginose a redução nos indicadores de viabilidade econômica da goiabicultura. Foram considerados como indicadores o valor presente líquido (VPL) e a taxa interna de retorno (TIR), que consideram o efeito da dimensão tempo nos valores monetários. Segundo Nogueira (1999), o VPL é calculado transferindo-se para o presente todas as variações do fluxo líquido, abatidas por uma taxa de desconto definida. O valor desta taxa é igual ao rendimento que poderia ser obtido pelo goiabicultor caso este tivesse investido o seu capital em outra atividade. Segundo Lapponi (2000), o modelo n FCt matemático do VPL é VPL = I + t [1] t= 1 (1 + K) no qual I é o investimento de capital na data zero, FC t representa o fluxo líquido na data t, n é o prazo de análise do projeto e k é a taxa de desconto definida. Portanto, um projeto agrícola (um pomar de goiaba, por exemplo) será lucrativo se o valor presente de fluxo líquido, calculado com a taxa mínima requerida k, superar o valor presente do investimento; entretanto dará prejuízo se o VPL for negativo. A TIR é a taxa interna de retorno do projeto agrícola, a qual por definição anula o VPL; em outras palavras, a TIR torna o valor presente dos lucros futuros equivalentes aos gastos realizados com o projeto, caracterizando assim a taxa de remuneração do capital investido (Frizzone & Silveira, 2000). O cálculo da TIR dá-se pelo modelo matemático n FCt 0 = I + [2]. t t= 1 (1 + TIR) Resultados e Discussão De acordo com as análises deste estudo, o impacto econômico do NGG no RJ é mostrado na Tabela 1. Em pomares sadios, o projeto agrícola apresenta indicadores econômicos atrativos, com TIR de 22,46 % ao ano e VPL positivo, entre R$ ,42 e R$ ,36 por ha, dependendo da taxa de desconto considerada. Já nos pomares infestados pelo NGG, todos os indicadores revelam uma situação de prejuízo financeiro. Devido à queda de produtividade, a TIR sofre redução de 32,54 pontos percentuais. Ocorre também uma redução do VPL, cujo valor depende da taxa de desconto utilizada; o VPL pode apresentar um prejuízo de até R$ ,91 por ha, caso a taxa de desconto considerada seja a de 6 % ao ano. Uma vez que taxas de desconto mais elevadas reduzem a rentabilidade dos pomares sadios, os prejuízos decorrentes da meloidoginose seriam considerados menores se utilizadas taxas de desconto de 8, 10 ou 12 % ao ano. Considerando-se que no RJ a área infestada pelo NGG é de cerca de 42,57 ha (Kawae, 2006), estimase que o impacto econômico direto do NGG sobre os goiabicultores foi de R$ ,22. Considerando-se que a goiabicultura emprega 0,73 homens / ha / ano, os quais trabalham em média 230 dias / ano, tem-se que o extermínio dos pomares resultou na dispensa de mão-de-obra (MDO) de 167,9 dias-homem / ha / ano ou 31 trabalhadores rurais em tempo integral. Embora este valor pareça pequeno, deve-se considerar que boa parte da mão-de-obra empregada na goiabicultura é sazonal ou trabalha em tempo parcial; assim, acredita-se que um número bem maior de trabalhadores tenha sido, de alguma maneira, afetado pela meloidoginose. O impacto econômico do NGG no CE e RN está sumarizado na Tabela 2. Nestes Estados tem-se um VPL de R$ ,18 por ha (à taxa de 6 % ao ano) para pomares sadios, o qual foi reduzido para R$ 7.816,45 (negativos) nos pomares infestados, o Tabela 1 Valor Presente Líquido (VPL) por hectare de projetos de produção de goiaba sadios ou infestados por Meloidogyne mayaguensis, considerando-se diferentes taxas de desconto, para o Estado do Rio de Janeiro, no ano de Condição do pomar Valores de VPL (em R$) TIR (%) 1 1 Taxa interna de retorno. 6% 8% 10% 12% Sadio (A) , , , ,42 22,46 Infestado (B) , , , ,26-10,08 Prejuízo (B-A) , , , ,68-32, Vol. 33(2)

67 Estimativa do Impacto Econômico e Social Direto de Meloidogyne mayaguensis na Cultura da Goiaba no Brasil que resultou num prejuízo de R$ ,63 por ha. A área infestada pelo NGG nestes estados é de aproximadamente 30 ha (Gustavo R.C. Torres, UFRPE, comunicação pessoal), o que resultou num prejuízo de cerca de R$ ,90. Para estes Estados não foi possível calcular a TIR, pois a incidência da meloidoginose resultou num fluxo de caixa negativo a partir do quinto ano do pomar, inviabilizando o cálculo da TIR através da fórmula [2]. A dispensa de MDO foi de 22 trabalhadores. O impacto econômico da meloidoginose no perímetro irrigado da BA e PE está sumarizado na Tabela 3. Nesta região tem-se um VPL de R$ 8.595,57 por ha (à taxa de 6 % ao ano) para pomares sadios, e uma redução deste índice para R$ ,40 (negativos) nos pomares infestados. Assim, considerando-se que a área infestada pelo NGG é de cerca de ha (José A. Valença, comum. pessoal), tem-se um prejuízo direto de R$ ,00 para os goiabicultores. A dispensa de MDO nesta região foi de trabalhadores. Deve-se notar que a área infestada pelo NGG nos Estados da BA e PE é possivelmente maior do que a considerada neste estudo. Em resumo, a estimativa do prejuízo direto causado pelo NGG para os goiabicultores das regiões estudadas chega a R$ 112,7 milhões, ao qual se soma a dispensa de trabalhadores rurais. Entretanto, é certo que o impacto vai além, em função da miríade de situações (e prejuízos) vividos pelos goiabicultores. Por exemplo, relatam-se goiabicultores que replantaram pomares em áreas infestadas por desconhecer o agente etiológico desta doença, reincidindo em prejuízo econômico. Além disto, em diversas propriedades os goiabicultores utilizaram mudas infectadas, resultando em pomares que sequer chegaram à fase produtiva. As regiões produtoras consideradas neste trabalho sofreram também prejuízos indiretos às atividades econômicas posicionadas à montante e à jusante da propriedade rural, como a produção e comercialização de insumos e serviços, distribuição, processamento e comercialização de goiabas e arrecadação de impostos. A precariedade dos dados estatísticos sobre a cultura da goiaba no Brasil e a complexidade destas atividades econômicas torna difícil a obtenção de estimativas confiáveis do impacto econômico indireto do NGG. A complexidade e a informalidade da atividade agrícola dos pequenos produtores não permitem uma estimativa abrangente do impacto social do NGG Tabela 2 Valor Presente Líquido (VPL) por hectare de projetos de produção de goiaba sadios ou infestados por Meloidogyne mayaguensis, considerando-se diferentes taxas de desconto, para os Estados do Rio Grande do Norte e Ceará, no ano de Condição do pomar Valores de VPL (em R$) TIR (%) 2 1 Dados baseados na incidência do nematóide nos municípios de Limoeiro do Norte e Cascavel (CE), Assu, Upanema, Baraúna e Touros (RN). 2 Taxa interna de retorno. 3 TIR incalculável pela fórmula [2]. 6% 8% 10% 12% Sadio (A) , , , ,74 20,26 Infestado (B) , , , ,64 Inc 3 Prejuízo (B-A) , , , ,38 Inc Tabela 3 Valor Presente Líquido (VPL) por hectare de projetos de produção de goiaba sadios ou infestados por Meloidogyne mayaguensis, considerando-se diferentes taxas de desconto, para os pólos frutícolas irrigados pela CODEVASF nos Estados de Pernambuco e Bahia, no ano de Condição do pomar Valores de VPL (em R$) TIR (%) 2 6% 8% 10% 12% Sadio (A) 8.595, , , ,21 11,91 Infestado (B) , , , ,58 Inc 3 Prejuízo (B-A) , , , ,79 Inc 1 Dados baseados na incidência do nematóide nos municípios de Petrolina (PE) e Juazeiro (BA). 2 Taxa interna de retorno. 3 TIR incalculável pela fórmula [2]. Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 179

68 Fernando O.M. Pereira, Ricardo Moreira de Souza, Paulo M. Souza, Claudia Dolinski & Grace K. Santos nas regiões estudadas, seja na redução do recolhimento de impostos e de repasse destes em benefícios à sociedade, seja na sobrecarga dos programas públicos de suporte a trabalhadores desempregados e famílias de baixa renda. Neste aspecto, deve-se destacar que o NGG provocou o desemprego de cerca de trabalhadores rurais em tempo integral. Presume-se que um número indeterminado de trabalhadores ligados às atividades econômicas à montante e à jusante da propriedade agrícola também tenha sido afetado. Sabe-se ainda da incidência do NGG em pomares de goiaba em outros Estados brasileiros. Entretanto, tratam-se de relatos isolados em regiões nas quais não foram feitos levantamentos sistemáticos para se conhecer a dimensão da área infestada. Possivelmente, o impacto do NGG deverá aumentar nos próximos anos, na medida em que este nematoide já foi relatado em outras culturas agrícolas brasileiras, como o pimentão, tomate, fumo, alface, pepino, soja, acerola e mamão (Souza et al., 2006; Carneiro et al., 2006; Gomes et al., 2006; Soares et al., 2007). Sabe-se que este nematoide parasita também diversas outras culturas e ervas daninhas. Provavelmente, a cultura da goiaba continuará a sofrer forte redução de sua área cultivada, a não ser que sejam encontradas alternativas de controle para o NGG. Este nematoide desestruturou quase toda a cadeia produtiva da goiaba nos pólos frutícolas irrigados pela CODEVASF. Situação semelhante poderá ocorrer se o NGG vier a infestar a principal região produtora brasileira, o Estado de São Paulo, na qual encontram-se cerca de ha plantados. É urgente pois que haja maior integração entre os grupos de pesquisa dedicados ao NGG no Brasil, bem como uma maior articulação destes com os goiabicultores e os órgãos de defesa fitossanitária federal e estaduais. Tal integração foi alcançada no RJ, a qual resultou na promulgação da resolução n o. 20 da Secretaria de Estado de Agricultura, Pecuária, Pesca e Abastecimento que regulamenta a produção e comercialização de mudas de goiabeiras visando a redução da disseminação do nematoide. Agradecimentos Os autores agradecem a J.L. Pacelli Rocha, José A. Valença, José Mauro C. Castro (Embrapa Semi- Árido) e Gustavo R.C. Torres pelas valiosas informações fornecidas, sem as quais este trabalho não poderia ter sido realizado. Literatura Citada BURLA, R.S., R.M. SOUZA, E. GONÇALVES Jr., & F.O.M. PEREIRA Reação de acessos de Psidium spp. a Meloidogyne mayaguensis. Nematologia Brasileira, 31: CARNEIRO, R.M.D.G., M.R.A. ALMEIDA, R.S. BRAGA, C.A. ALMEIDA & R. GIORIA, Primeiro registro de Meloidogyne mayaguensis parasitando plantas de tomate e pimentão resistentes à meloidoginose no Estado de São Paulo. Nematologia Brasileira, 30: CARNEIRO, R.M.D.G., P.A. CIROTTO, A.P. QUINTANILHA, D.B. SILVA & R.G. CARNEIRO Resistance to Meloidogyne mayaguensis in Psidium spp. acessions and their grafting compatibility with P. guajava cv. Paluma. Fitopatologia Brasileira, 32: FRIZZONE, J.A. & S.F.R. SILVEIRA Análise econômica de projetos hidroagrícolas. In: SILVA, D.D. & PRUSKI, F.F. (ed). Gestão de Recursos Hídricos: Aspectos Legais, Econômicos, Administrativos e Sociais. Secretaria de Recursos Hídricos, Brasília (DF). Universidade Federal de Viçosa e Associação Brasileira de Recursos Hídricos, Porto Alegre, p FUNDAÇÃO GETÚLIO VARGAS FGV DADOS: informação econômica on-line. < fgvdados.fgv.br> acesso em fevereiro de GOMES, V.M Meloidoginose da goiabeira: estudos sobre a sua patogênese e formas de convívio com a doença a campo. (Dissertação de Mestrado). Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Campos dos Goytacazes (RJ), 67 p. GOMES, C.B, D.L. LIMA & R.M.D.G. CARNEIRO Ocorrência de Meloidogyne mayaguensis em fumo no estado de Santa Catarina In: CONGRESSO BRASILEIRO DE NEMATOLOGIA, XXVI, Campos dos Goytacazes (RJ). Resumos, p. 88. GOMES, V.M., R.M. SOUZA, M.M. SILVA & C. DOLINSKI Caracterização do estado nutricional de goiabeiras em declínio parasitadas por Meloidogyne mayaguensis. Nematologia Brasileira 32 (2): KAWAE, L Levantamento em Propriedades que Apresentam Sintomas do Nematóide-de-galhas. SEAAPI / Superintendência de Defesa Sanitária, 1 p. LAPPONI, J.C Projetos de Investimento: Construção e Avaliação do Fluxo de Caixa. Modelos em Excel. Lapponi Treinamento e Editora, São Paulo, 376 p. NOGUEIRA, E Análise de investimentos. In: BATALHA, M. (ed). Gestão Agroindustrial. vol. 2. Atlas, São Paulo, p NORONHA, J.F Projetos Agropecuários: Administração Financeira, Orçamento e Viabilidade 180 Vol. 33(2)

69 Estimativa do Impacto Econômico e Social Direto de Meloidogyne mayaguensis na Cultura da Goiaba no Brasil Econômica. Atlas, São Paulo, 269 p. PONCIANO, N.J., P.M. SOUZA, H.T.C. MATA, J.R. VIEIRA & I.F. MORGADO Análise de viabilidade econômica e de risco da fruticultura na região Norte fluminense. Revista de Economia e Sociologia Rural, 42: SOARES, A.R., E.J. ALMEIDA, A.R. SILVA, B.F.F. BARBOSA & J.M. SANTOS Novos registros sobre Meloidogyne mayaguensis no Brasil. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE NEMATOLOGIA, XXVII, Goiânia. Resumos, p SOUZA, R.M., M.S. NOGUEIRA, I.M. LIMA, M. MELARATO & C. DOLINSKI Manejo do nematóide das galhas da goiabeira em São João da Barra (RJ) e relato de novos hospedeiros. Nematologia Brasileira, 30: Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 181

70 COMUNICAÇÃO João M. Charchar, Maria Esther N. Fonseca, Leonardo S. Boiteux & Artur F. Lima Neto Ocorrência de Meloidogyne mayaguensis em Goiabeira no Estado do Tocantins João M. Charchar 1 *, Maria Esther N. Fonseca 1, Leonardo S. Boiteux 1 & Artur F. Lima Neto 2 1 Embrapa Hortaliças, C. Postal 218, Brasília (DF) Brasil. 2 Fundação Universidade do Tocantins, Diretoria Estadual de Pesquisa Agropecuária, C. Postal 173, Palmas (TO) Brasil. *Autor para correspondência: boiteux@cnph.embrapa.br Recebido para publicação em 06 / 06 / Aceito em 11 / 10 / 2008 Editado por Guilherme Asmus Resumo Charchar, J.M., M.E.N. Fonseca, L.B. Boiteux & A.F. Lima Neto Ocorrência de Meloidogyne mayaguensis em goiabeira no estado do Tocantins. Meloidogyne mayaguensis tem causado severas perdas de produção no cultivo da goiabeira (Psidium guajava) no Brasil. Este patógeno já foi relatado em diferentes regiões produtoras de goiabas, causando consideráveis prejuízos econômicos. O presente trabalho relata a ocorrência de M. mayaguensis em goiaba Paluma no estado de Tocantins. Os sintomas da infecção de M. mayaguensis em goiabeiras com sete anos de idade incluíram queda prematura de folhas e ramos, rachadura do tronco, declínio e morte das árvores. Fêmeas de M. mayaguensis apresentaram dois padrões perineais distintos: (a) padrão perineal com linhas laterais e superiores em arcos ondulados e (b) padrão perineal com linhas laterais e superiores em arcos arredondados. Foi observado um fenótipo específico para o isolado de M. mayaguensis de Tocantins em análises com a enzima esterase. Este é aparentemente o primeiro relato formal de M. mayaguensis infectando goiabeiras no estado de Tocantins. O patógeno foi provavelmente introduzido e disseminado no Estado via mudas de goiabeiras infectadas. Neste contexto, o estabelecimento de um programa de produção de mudas certificadas é imprescindível para impedir uma disseminação mais ampla de M. mayaguensis para outras regiões produtoras de goiaba no Estado. Palavras-chaves: Psidium guajava, nematoides-das-galhas, detecção. Summary Charchar, J.M., M.E.N. Fonseca, L.B. Boiteux & A.F. Lima Neto Occurrence of Meloidogyne mayaguensis on guava in Tocantins State, Brazil. Meloidogyne mayaguensis might cause severe damage on guava (Psidium guajava) production in Brazil. Meloidogyne mayaguensis has been already reported on several guava production areas throughout the country, causing important economic losses. The present work describes the occurrence of M. mayaguensis on guava trees in Tocantins State. The symptoms on seven year old guava trees infected with M. mayaguensis were severe defoliation, followed by branch breakdown, trunk peeling and/or cracking, and tree decline and death. Females of M. mayaguensis displayed two distinct perineal patterns: (a) perineal pattern with lateral and superior lines disposed in waved arch and (b) perineal pattern with lateral and superior lines disposed in round arch. A phenotype specific for the M. mayaguensis isolate from Tocantins was observed in esterase assays. This is the first formal report of M. mayaguensis in Tocantins State. This nematode was more likely introduced into Tocantins via infected guava seedlings. Therefore, it is crucial to establish a certificate program for production of guava seedlings free of M. mayaguensis in order to avoid the dissemination of this pathogen to other guava-producing areas. Key words: Psidium guajava, root-knot nematode, detection. 182 Vol. 33(2)

71 Ocorrência de Meloidogyne mayaguensis em Goiabeira no Estado do Tocantins Conteúdo Meloidogyne mayaguensis é atualmente o nematoidedas-galhas mais importante nos cultivos comerciais de goiabeiras (Psidium guajava) no Brasil (Carneiro et al., 2001; 2006a; 2006b). Análises morfológicas, bioquímicas e moleculares mais recentes (Xu et al., 2004) têm indicado que M. mayaguensis e Meloidogyne enterolobii (Yang & Eisenback, 1983) podem representar uma mesma espécie. No Brasil, a espécie M. mayaguensis foi primeiramente assinalada no ano 2000 em Pernambuco (Petrolina) e na Bahia (Curuçá e Maniçoba). Os danos causados por este nematoide, sete anos após o registro da epidemia, resultaram em uma drástica redução da área plantada de ha para ha (Carneiro et al., 2006a). Após este primeiro relato, a espécie M. mayaguensis tem sido também detectada em outros estados e municípios brasileiros: Piauí, Rio Grande do Norte (Touros); Ceará (Açu e Limoeiro do Norte), Rio de Janeiro (São João da Barra e Mata Atlântica), Minas Gerais, São Paulo (Carneiro et al., 2006b; EPPO, 2008) e, mais recentemente, no Espírito Santo (Carneiro et al., 2007). No município de Santa Mariana (PR), este patógeno foi detectado em raízes de goiabeira e também em diferentes plantas invasoras (Carneiro et al., 2006b), incluindo picão preto (Bidens pilosa), abóbora (Curcubita pepo), caruru amargo (Erechtites hieracifolius) e em uma espécie de orquídea nativa (Oeceoclades maculata). Este nematoide é também capaz de infectar variedades resistentes de tomateiro (Solanum lycopersicum) Andrea e Débora R ; soja (Glycine max) Forest, batata-doce (Ipomoea batatas) CDH, cafeeiro (Coffea arabica) Mundo Novo, pimentão (Capsicum annuum) Silver e Magali R e a pimenteira (C. frutescens) Santanka 40 (Carneiro et al., 2006b). Nos anos de , pomares com goiabeiras (cultivar Paluma), ocupando uma área de cerca de 4 ha no município de Porto Nacional, no Estado do Tocantins, foram severamente afetados por um declínio associado com a presença de uma meloidoginose. Estes pomares foram estabelecidos com mudas procedentes do município de Petrolina (PE). Os sintomas da infecção do nematoide em goiabeiras mais velhas (árvores com sete anos de idade) constituíram-se, inicialmente, por severo desfolhamento, queda prematura de ramos, rachaduras dos troncos seguidos de um acentuado declínio e posterior morte das árvores. Foi detectado um número abundante de galhas nos sistemas radiculares nas amostras obtidas. Árvores mais jovens (com dois anos de idade) apresentaram galhas radiculares e bordas foliares necrosadas à semelhança de plantas com deficiência de magnésio (Figura 1E-F). O objetivo do presente trabalho foi confirmar o envolvimento da espécie M. mayaguensis como agente causal de uma meloidoginose em pomares comerciais de goiabeira no Estado do Tocantins. Raízes de goiabeiras jovens e também algumas árvores mais velhas (entre dois e sete anos) foram coletadas de um pomar de 4 ha no município de Porto Nacional (estado de Tocantins) apresentando os sintomas ilustrados na Figura 1. Os fragmentos de raízes obtidos destas goiabeiras em Porto Nacional foram lavados, acondicionados em sacos plásticos e enviados ao laboratório de Nematologia da Embrapa Hortaliças, em Brasília (DF). Inicialmente, algumas massas de ovos foram retiradas dos fragmentos de raízes das goiabeiras de ambas as idades e inoculadas em raízes de tomateiro (Solanum lycopersicum) Rutgers (suscetível), que foram mantidas em casa de vegetação. Os sintomas de galhas e a produção de massas de ovos foram reproduzidos na cultivar Rutgers. No exame morfológico, 100 cortes perineais de fêmeas adultas do nematoide (50 de goiabeiras jovens e 50 de árvores mais velhas) foram lavados em ácido lático a 40 %, montados em lâminas e lamínulas com glicerina, observados sob microscópio fotônico e fotografados (Eisenback, 1985). Os padrões perineais descritos por Yang & Eisenback (1983), Rammah & Hirschmann (1988) e Eisenback & Hirschmann- Triantaphyllou (1991) foram tomados como referência para a identificação da espécie. Para análise do fenótipo da enzima esterase foram utilizadas três fêmeas adultas intactas obtidas de goiabeiras jovens e três fêmeas obtidas de árvores mais velhas, tendo como base o protocolo de Esbenshade & Triantaphyllou (1985a). O fenótipo de esterase destes dois extratos foi comparado com os descritos por Esbenshade & Triantaphyllou (1985b), Eisenback & Hirschmann-Triantaphyllou (1991) e Carneiro et al. (2001; 2006a e 2006b). No presente trabalho, a Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 183

72 João M. Charchar, Maria Esther N. Fonseca, Leonardo S. Boiteux & Artur F. Lima Neto Figura 1. Sintomatologia em árvores de goiabeira induzida pela infecção de Meloidogyne mayaguensis. Árvores velhas mortas: (A) declínio; (B) queda prematura de folhas; (C) rachadura do tronco; e (D) galhas radiculares necrosadas. Árvores jovens vivas: (E) folhas com bordas necrosadas e (F) galhas radiculares não necrosadas. caracterização do fenótipo de esterase foi feita com o uso do gel de poliacrilamida como descrito por Morris & Wright (1974). Fêmeas adultas de M. javanica, processadas com as técnicas descritas acima, foram incluídas como padrão nos estudos bioquímicos. O exame morfológico indicou que fêmeas extraídas de raízes de árvores jovens e velhas de goiabeiras de Tocantins apresentaram dois padrões perineais: (A) (MMAY1) padrão perineal 1, exibindo linhas laterais e superiores em arcos ondulados, que ocorreu em 30 % das amostras observadas e (B) (MMAY2) padrão perineal 2, exibindo linhas laterais e superiores em arcos arredondados, que ocorreu em 40 % das amostras. Este último padrão aparece na descrição original de Rammah & Hirschmann (1988) e é típico de M. mayaguensis. O padrão MMAY1 difere do descrito originalmente para a espécie e pode representar uma característica peculiar dos isolados de Tocantins. Os demais padrões analisados (30 %) representaram variantes de MMAY1 ou de MMAY2 184 Vol. 33(2) (Figura 2 A-B). O padrão perineal de M. javanica (MJAV), usado como comparação, apresentou típicas linhas incisórias diagonais nos campos laterais (Figura 2 C). No exame bioquímico, observou-se que o fenótipo de esterase de M. mayaguensis apresentou o padrão característico da espécie com duas bandas fortes nas posições descritas por Carneiro et al. (2001; 2006a; 2006b). No entanto, a metodologia de eletroforese de alta resolução (Morris & Wright, 1974) empregada no presente trabalho, per mitiu a visualização de um total de cinco bandas nesta população (Figura 3). Estas mesmas cinco bandas, com pequenas diferenças na mobilidade eletroforética, podem ser também observadas no padrão de esterase descrito para isolados chineses de M. mayaguensis (= M. enterolobii) (Xu et al., 2004). A variação de resultados em relação ao perfil das bandas, isto é, visualização de bandas mais tênues, do padrão de esterase pode também ser explicada por pequenas diferenças no protocolo de extração das enzimas. No presente

73 Ocorrência de Meloidogyne mayaguensis em Goiabeira no Estado do Tocantins Figura 2. Variação no padrão perineal de fêmeas de Meloidogyne mayaguensis. (A) MMAY1- M. mayaguensis padrão perineal 1 com linhas superiores e laterais em arcos ondulados; (B) MMAY2- M. mayaguensis padrão perineal 2 com linhas superiores e laterais em arcos arredondados; e (C) MJAV-M. javanica. Figura 3. Fenótipos de esterase de Meloidogyne javanica (MJAV) e M. mayaguensis (MMAY). Meloidogyne javanica apresentou três bandas fortes (BF1 BF3) e M. mayaguensis apresentou cinco bandas, duas BF e três bandas fracas (BFR). As velocidades de migração (Vm) de bandas são: (ML) muito lenta, (L) lenta, (M) moderada e (R) rápida. trabalho, a extração foi realizada utilizando-se três fêmeas, enquanto que apenas uma fêmea foi utilizada nos trabalhos descritos por Carneiro et al. (2001; 2006a e 2006b) e quatro fêmeas foram utilizadas por Xu et al. (2004). A análise morfológica dos cortes perineais e os fenótipos de esterase dos espécimes indicaram que a espécie responsável por causar galhas radiculares e morte das goiabeiras Paluma em pomares localizados no município de Porto Nacional (TO) pode ser classificada como M. mayaguensis. Este é o primeiro registro deste fitonematoide na referida mirtácea no estado de Tocantins. A fruticultura no Estado de Tocantins está em plena expansão, porém as áreas cultivadas são pequenas e compõem-se, principalmente, de goiabeiras. Plantas doentes com sintomas típicos de M. mayaguensis foram coletadas somente de uma área de 4 ha localizada no município de Porto Nacional, não existindo informação da ocorrência do nematoide nas goiabeiras de outros municípios. Atualmente, está sendo implantado o Projeto de Fruticultura Irrigado do Tocantins (PFIT) Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 185

74 João M. Charchar, Maria Esther N. Fonseca, Leonardo S. Boiteux & Artur F. Lima Neto com área de aproximadamente ha de diferentes árvores frutíferas, semelhante ao projeto no Vale do Rio São Francisco (PE). No PFIT, aproximadamente ha de fruteiras já foram implantados. Outro projeto de ha com frutíferas está sendo instalado nas regiões compreendendo os municípios de Porto Nacional e Palmas. Em trabalhos anteriores, M. mayaguensis foi relatado como parasita de várias espécies botânicas entre fruteiras, hortaliças e outras plantas (EPPO, 2008). Portanto, existe a necessidade na elaboração de trabalhos para determinar, com maior precisão, o círculo de hospedeiras de M. mayaguensis incluindo frutíferas e hortaliças, uma vez que inúmeros projetos irrigados estão sendo instalados em todo o país. Uma informação relevante do ponto de vista do círculo de hospedeiras e da epidemiologia de M. mayaguensis foi a constatação que as raízes das árvores de frutapinha (Annona squamosa), localizadas ao lado das goiabeiras infectadas em Porto Nacional, estavam isentas de galhas radiculares. Fontes de resistência a M. mayaguensis têm sido identificadas e podem ser empregadas como portaenxertos para cultivares de goiabeira com características comerciais superiores (Carneiro et al., 2007). Existe também a necessidade do estabelecimento, em caráter emergencial, de um programa de certificação de mudas de goiabeiras livre do nematoide, na tentativa de bloquear a disseminação do patógeno para outros pólos de produção comercial de goiaba que ainda não existem registros da presença de M. mayaguensis. Literatura Citada CARNEIRO, R.M.D.G, W.A MOREIRA, M.R.A ALMEIDA & A.C.M.M GOMES Primeiro registro de Meloidogyne mayaguensis em goiabeira no Brasil. Nematologia Brasileira, 25: CARNEIRO, R.G., A.P.A MÔNACO, M.P MORITZ, K.C NAKAMURA & A SCHERER. 2006a. Identificação de Meloidogyne mayaguensis em goiabeira e em plantas invasoras, em solo argiloso, no estado do Paraná. Nematologia Brasileira, 30: CARNEIRO, R.M.D.G, M.R.A ALMEIDA, R.S BRAGA, C.A ALMEIDA & R GIORIA. 2006b. Primeiro registro de Meloidogyne mayaguensis parasitando plantas de tomate e pimentão resistentes à meloidoginose no estado de São Paulo. Nematologia Brasileira, 30: CARNEIRO, R.M.D.G, P.A CIROTTO, D.B SILVA & R.G CARNEIRO Resistance to Meloidogyne mayaguensis in Psidium spp. accessions and their grafting compatibility with P. guajava cv. Paluma. Fitopatologia Brasileira 32: EISENBACK, J.D Techniques for preparing nematodes for scanning electron microscopy. In: BARKER, K.R., C.C. CARTER & J.N. SASSER (ed). An Advanced Treatise on Meloidogyne. vol. 2, Methodology. North Carolina State University Graphics, Raleigh, p EISENBACK, J.D. & H HIRSCHMANN- TRIANTAPHYLLOU Root-knot nematodes: Meloidogyne species and races. In: W. R NICKLE (ed). Manual of Agricultural Nematology. Marcel Dekker, New York, p EPPO (European and Mediterranean Plant Protection Organization) An Emerging Root-knot Nematode, Meloidogyne enterolobii: Addition to the EPPO Alert List. EPPO Reporting Service n o. 5, Paris, 26 p. ESBENSHADE, P.R. & A.C TRIANTAPHYLLOU 1985a. Electrophoretic methods for the study of root-knot nematodes enzymes. In: BARKER, K.R., C.C CARTER & J.N SASSER (ed). An Advanced Treatise on Meloidogyne. vol. 2, Methodology. North Carolina State University Graphics, Raleigh, p ESBENSHADE, P.R. & A.C TRIANTAPHYLLOU. 1985b. Use of enzyme phenotypes for identification of Meloidogyne species. Journal of Nematology 17: MORRIS, T.J. & N.S WRIGHT Detection on polyacrylamide gel of a diagnostic nucleic acid from tissue infected with potato spindle tuber viroid. America Potato Journal, 52: RAMMAH, A. & H HIRSCHMANN Meloidogyne mayaguensis n. sp. (Meloidogynidae), a root-knot nematode from Puerto Rico. Journal of Nematology 20: YANG, B. & J.D EISENBACK Meloidogyne enterolobii n. sp. (Meloidogynidae), a root-knot nematode parasitising pacara earpod tree in China. Journal of Nematology 15: XU, J., P LIU, Q MENG & H. LONG Characterisation of Meloidogyne species from China using isozyme phenotypes and amplified mitochondrial DNA restriction fragment polymorphism. European Journal of Plant Pathology 110: Vol. 33(2)

75 COMUNICAÇÃO Primeiro Relato da Ocorrência de Meloidogyne paranaensis em Cafeeiro no Estado de Goiás Primeiro Relato da Ocorrência de Meloidogyne paranaensis em Cafeeiro no Estado de Goiás Rodrigo V. Silva, Rosângela D.L. Oliveira* & Laércio Zambolim Laboratório de Nematologia, Departamento de Fitopatologia, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa (MG) Brasil. * Autora para correspondência: rdlima@ufv.br Recebido para publicação em 05 / 11 / Aceito em 09 / 12 / 2008 Editado por Claudio Marcelo G. Oliveira Resumo - Silva, R.V., R.D.L. Oliveira & L. Zambolim Primeiro relato da ocorrência de Meloidogyne paranaensis em cafeeiro no Estado de Goiás. Relata-se a primeira ocorrência de Meloidogyne paranaensis no Estado de Goiás parasitando o cafeeiro. As plantas severamente infectadas, com sintomas do parasitismo do nematoide-das-galhas, foram procedentes de uma lavoura de café irrigado, localizada do município de Catalão. Realizou-se a identificação por meio da eletroforese de isoenzimas confirmando os fenótipos de esterase (P1) e malato desidrogenase (N1) característicos de M. paranaensis. Esta ocorrência deve servir de alerta aos produtores e autoridades do Estado, de modo a prevenir a sua disseminação. Faz-se ainda necessário, a realização de um levantamento nas áreas cultivadas com cafeeiro, para a detecção de possíveis novos focos desse e de outros fitonematoides. Palavras-chaves: nematoide das galhas, café, disseminação. Summary - Silva, R.V., R.D.L. Oliveira & L. Zambolim First record of Meloidogyne paranaensis on coffee plants in Goiás State, Brazil. Meloidogyne paranaensis is reported for the first time in Goiás State (GO), Brazil, attacking coffee plants. Plants severely infected by the root-knot nematode were collected in an irrigated coffee plantation from Catalão (GO). The identification was performed using isozyme characterization for esterase (P1) and malate dehydrogenase (N1) phenotypes, characteristic for this nematode. The occurrence of M. paranaensis should serve as an alert to the growers and authorities of the Goiás State in order to prevent its dissemination. It is still necessary to survey coffee growing areas for the detection of new possible foci of this nematode as well as other species. Key words: root-knot nematode, coffee, dissemination. Conteúdo Meloidogyne paranaensis é a mais recente espécie de nematoides-das-galhas relatada parasitando o cafeeiro no Brasil, descrita como nova espécie por Carneiro et al. (1996) a partir do conhecido biótipo IAPAR de M. incognita, cuja ocorrência até então estava limitada ao Estado do Paraná. Em condição de alta infestação, M. paranaensis reduz a produtividade de cultivares suscetíveis, como o Mundo Novo e Catuaí, a níveis antieconômicos já na primeira produção (Mata et al., 2000). A sua disseminação é ampla nos Estados do Paraná e São Paulo, onde causa grandes prejuízos e torna inviável a atividade cafeeira (Gonçalves & Silvarolla, 2007). Em Minas Gerais, principal polo cafeeiro do país, há relatos de sua ocorrência apenas em três municípios: Patrocínio e Serra do Salitre, na região do Alto Paranaíba (Castro et al., 2003) e Piumhi, no sul do Estado (Castro et al. 2008). Além dos três estados brasileiros, esse nematoide já foi detectado na Guatemala e nos Estados Unidos (Havaí) (Carneiro et al., 2004). Cafeeiros Catuaí 99 de uma lavoura irrigada, Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 187

76 Rodrigo V. Silva, Rosângela D.L. Oliveira & Laércio Zambolim localizada no município de Catalão (GO), apresentavam plantas subdesenvolvidas com folhas pequenas e amareladas, com aspecto de deficiência nutricional (Figura 1). O sistema radicular apresentavase completamente infectado e danificado, com poucas raízes finas, nas quais havia a formação de galhas com menos de um centímetro de diâmetro. Raízes secundárias exibiam engrossamentos coalescentes, de formato irregular com até 5 cm, além de descorticamento, rachaduras e necroses oriundas da degradação dos tecidos corticais (Figura 2). A propriedade em questão, com mais de 300 ha, apresentava cerca de 10 % das plantas nessa situação. O estado avançado de degradação das raízes não permitiu a imediata análise do nematoide, e tal população foi mantida em tomateiro Santa Cruz Kada por 40 dias. Foi avaliada a configuração perineal de 20 fêmeas (Taylor & Netscher, 1974), e os perfis das enzimas esterase (EST) e malato desidrogenase (MDH) foram obtidos pela técnica de eletroforese vertical em sistema descontínuo, conforme Ornstein (1964) e Davis (1964) e revelados conforme metodologia descrita em Alfenas et al. (1991). Pela análise da região perineal das fêmeas ficou difícil separar M. paranaensis e M. incognita, já que ambas as espécies exibem configurações com arco dorsal elevado, trapezoidal e estrias lisas a onduladas com algumas bifurcações nas linhas laterais. Embora essa descrição se refira ao padrão típico, observaram-se também algumas configurações com arco dorsal mais baixo. No entanto, os fenótipos de esterase (EST - P1) e malato desidrogenase (MDH - N1) foram os característicos de M. paranaensis (Figura 3). O quadro sintomatológico do ataque de M. paranaensis em cafeeiro é semelhante ao da infecção causada por M. incognita. Praticamente todo o sistema radicular é atacado pelo nematoide, inclusive a raiz principal, ocasionando engrossamentos, descorticamentos, rachaduras e necroses dos tecidos do córtex (Campos & Villain, 2005), além de massas de ovos externas. Essas características, também são semelhantes às observadas em raízes de cafeeiro infectados por M. coffeicola (Castro et al., 2004). Entretanto, diferem dos sintomas ocasionados por M. exigua, que induz a formação de galhas típicas, geralmente pequenas, arredondadas, quase sempre nas extremidades das raízes finas e com massas de ovos internas (Mendes et al., 1977), sem, contudo, causar a destruição do sistema radicular. Até o presente, são relatadas 17 espécies de Meloidogyne em associação com o cafeeiro no mundo (Campos & Villain, 2005), mas no Brasil, apenas cinco foram encontradas parasitando esse hospedeiro (Tabela 1). Destaca-se M. exigua, M. incognita e M. paranaensis por serem as mais prejudiciais à cafeicultura nacional. M. javanica, embora seja relatada como patogênica ao cafeeiro, não apresenta evidências científicas de que parasite a planta (Oliveira et al., 1998; Carneiro et al., 2005). Todas as espécies que aqui ocorrem podem ser identificadas pelos fenótipos isoenzimáticos da esterase e malato desidrogenase, o que trouxe praticidade e segurança à sua identificação. O uso de caracteres morfológicos nem sempre é seguro, pois é subjetivo, requer experiência dos identificadores e ainda pode levar a resultados inconclusivos. Pela morfologia da região perineal foi impossível diferenciar M. paranaensis de M. incognita, o que foi fácil pelo fenótipo EST (P1) em comparação com os fenótipos EST (I1, I2 e S1) de M. incognita (Oliveira et al., 2006). Este constitui o primeiro relato de M. paranaensis no Estado de Goiás e deve servir de alerta aos produtores e à defesa fitossanitária, de modo a prevenir a sua disseminação. Ressalta-se que o controle de M. paranaensis em cafezais é difícil e, na maioria das vezes, é ineficiente (Gonçalves & Silvarolla, 2007). Essa consideração advém de sua notável agressividade ao cafeeiro, alta persistência no solo, ampla gama de hospedeiros e a ausência de fontes de resistência em Coffea arabica. Outro ponto relevante é que variabilidade fisiológica já fora detectada em M. paranaensis. Roese et al. (2007) observaram que uma população oriunda de campos de soja apresentou maior taxa reprodutiva em tomateiro Santa Clara e em soja MS/BR 34 e Fepagro RS 10, enquanto a população proveniente de cafeeiro reproduziu-se melhor nesse hospedeiro. Vale salientar que a soja, amplamente cultivada no cerrado, é uma boa hospedeira de M. paranaensis (Roese et al., 2007). O plantio de soja em áreas de cultivo de café, contaminadas pelo nematoide, poderia aumentar o nível de inóculo no solo e favorecer a sua disseminação, provocando um grande impacto na 188 Vol. 33(2)

77 Primeiro Relato da Ocorrência de Meloidogyne paranaensis em Cafeeiro no Estado de Goiás Figura 1 - Sintomas induzidos por Meloidogyne paranaensis em cafeeiro Catuaí 99, Catalão GO. Plantas subdesenvolvidas com folhas pequenas e amareladas (detalhe). Figura 2 - Raízes de cafeeiro Catuaí 99 exibindo os sintomas de parasitismo de Meloidogyne paranaensis: (A) necrose e rachadura em raiz secundária, (B) descorticamento e galhas. Figura 3 - Fenótipos isoenzimáticos de Meloidogyne paranaensis: (A) fenótipo N1 de malato desidrogenase, (B) fenótipo P1 de esterase, (Mj) fenótipo de M. javanica utilizado como padrão de comparação. Nematologia Brasileira 189 Piracicaba (SP) Brasil